애질런트사용안내서 크기배제크로마토그래피 (SEC) 를이용한생체분자분석
성공적인 SEC 를위한안내서 생체분자의용액내크기에기초한크로마토그래피분리를크기배제크로마토그래피 (SEC: Size Exclusion Chromatography) 라합니다. 다른크로마토그래피모드와달리, SEC 분리는분석물질과컬럼에충진된고정상사이의상호작용에의존하지않습니다. SEC 는오염물질 ( 응집체 (aggregates), 부형제 (Excipients), 세포조각 (cell debris) 및분해로인한기타불순물포함 ) 에서원형단백질 (intact proteins) 을분리및분석하는데이상적인솔루션입니다. 그리하여 SEC 는바이오치료용분자의개발과제조과정의분자특성화에널리사용됩니다. 본안내서에서는 SEC 분리, 용질크기와분자량의영향, 컬럼선택옵션, 중요한이동상고려사항, SEC 사용에관한일반규칙등등에대해설명합니다. 2
간단한분리 SEC 를이용하면분자는용액내분자크기에비례하여제일큰것부터작은것까지차례로분리됩니다. 큰분자는충진베드에서배제되어틈새부피 (void volume) 에서제일먼저용출됩니다. 작은분자는크기에따라각기다른정도로 pore 에스며들며 ( 그림 1), 분자크기가작을수록 pore 구조에더깊게확산되어더늦게용리됩니다. 작은분자일수록 pore 에더오래머물러나중에용리됩니다. 큰분자는 pore 에머무는시간이상대적으로짧아더빨리용리됩니다. 그림 1: 분자는크기에따라다양한정도로고정상의 pore 에스며듭니다 SEC 용애질런트바이오컬럼에대한자세한내용은 www.agilent.com/chem/biohplc 에서확인하실수있습니다. 3
크기배제크로마토그래피는단백질혼합물의분리와정량화에적합하며, 따라서재조합단백질제조의품질관리에중요한기법입니다. 응집체 (dimers, trimers, tetramers 등 ) 를측정하거나큰분자량단백질에서저분자량부형제와불순물을분리하는작업이이에해당합니다 ( 그림 2). 치료용단백질에서응집은효능과저장수명에영향을미치며, 심지어심각한면역원성반응을보일수있기때문에이를이해하고제어할수있어야합니다. ICH(Q6B) 와같은규제에서는반드시목표산물내응집체를분리및정량화하여야한다고명확하게규정합니다. 8 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 1. 큰응집체 2. 이합체 (Dimer) 3. 단량체 (Monomer) 4. Fragments 5. 부형제 (Excipients) 2 4 6 8 1 12 14 5 min Intact lgg Monomer 및 Dimer 의분리 컬럼 : 장비 : 유속 : 온도 : 검출기 : Agilent AdvanceBio SEC, 3Å 7.8 x 3mm, 2.7µm (p/n PL118-531) Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템 1.mL/ 분 실온 주입량 : 5µL 시료 : UV, 22nm 다클론성 IgG 시료농도 : 15mM 인산나트륨완충액, ph 7. 그림 2: IgG 응집체및부형제의분리 용리순서는일반적으로분자량에의해결정됩니다. 분자량이큰분자가먼저용리됩니다. 그러나진정한 SEC 분리메커니즘은용액내크기에기초하는것입니다. 대부분단백질은컴팩트한모양을가집니다. 하지만일부단백질분자는원통형이기때문에, 용액내에서의수력학적반경 (hydrodynamic radius) 이상대적으로크므로예상보다더일찍용리될수있습니다 ( 그림 3). 또한, 서로다른이동상은용액내분자크기 ( 수력학적반경또는회전반경 ) 를변화시킬수있기때문에용리순서에영향을줄수있습니다. 그림 3: 콤팩트한구상단백질대원통형단백질의비교 4
SEC-UV/DAD 분석법개발안내서 생체분자, 응집분석, 펩타이드, 폴리펩타이드및단백질의크기기반분리를위한초기컬럼및조건선택 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, mabs MW >.1-1,25kDa 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, mabs MW >.1-1,kDa 분자량범위와 pore 크기에기반한컬럼선택 AdvanceBio SEC(2.7µm) pore 크기 분자량범위 (kda) 13Å.1-1 3Å 5-1,25 Agilent Bio SEC-5(5µm) pore 크기 분자량범위 (kda) 1Å.1-1 15Å.5-15 3Å 5-1,25 5Å 15-5, 1Å 5-7,5 2Å >1, 권장초기분리조건 컬럼 : AdvanceBio SEC 또는 Agilent Bio SEC-5 이동상 : 15mM 인산염완충액, ph 7.* 이동상변화도 : 1-3분범위에서등용매 온도 : 권장온도 : 1-3 C, 최고온도 : 8 C 유속 : 시료크기 : 4.6mm id 컬럼의경우.1-.4mL/ 분 7.8mm id 컬럼의경우.1-1.25mL/ 분 총컬럼용적의 5% 이하 * 고염및저염의다른수용성완충액을사용할수있음 추가정보는응용자료참조 : 단백질의효율적인크기분리를위한최적의매개변수정의 (Defining the Optimum Parameters for Efficient Size Separations of Proteins)( 발행물번호 599-8895EN) www.agilent.com/chem/library 초기크로마토그램후, 분리를개선하거나단백질용해도를유지하거나크로마토그래픽미디어와시료의상호작용을줄이기위해추가적인변경이필요할수있습니다. 이동상의이온세기는최적의분리를얻을수있는세기로증가또는감소시킬수있습니다. ph 도보통 ±.2 단위로조정할수있습니다. 추가적인최적화가필요할경우, 상향또는하향범위를확대해야합니다. 이외에도온도를변화시키거나유기용매를추가할수있습니다. 염추가가필요한프로토콜의경우, 다음완충액이일반적으로사용됩니다 : 1-15mM 염화나트륨이포함된 5mM 인산나트륨 (ph 7.) 1-15mM 황산나트륨이포함된 5mM 인산나트륨 (ph 7.) 5-1mM 요소 (urea) 가포함된 5mM 인산나트륨 (ph 7.) 기타유사한염 ( 예 : KCl) 및염산구아니딘 (guanidine hydrochloride) 을사용할수있습니다. ph 범위 : 2.-8.5 추가가능한유기용매 : 5-1% 에탄올 ( 또는메탄올이나아세토니트릴같은기타유사한용매 ) 을포함한 5mM 인산나트륨 (ph 7.), 5% DMSO 를포함한 5mM 인산나트륨 (ph 7.). 점도가높은이동상을사용할경우, 최대작동압력이하로유지하기위해유속을낮출필요가있을수있다는점에유의하시기바랍니다. 온도 : 일반적으로, SEC 분리는 1-3 C 에서실행됩니다. 단백질과펩타이드의분리에서는단백질및소수성펩타이드의분리능과회수율을높이기위해더높은온도가필요할수있습니다. 온도에민감한단백질의생물학적활성을최대로유지하기위해냉장실에서 SEC 분리를실행해야할수있습니다. Agilent Bio SEC 컬럼의최대작동온도는 8 C 입니다. 고온에서는단백질변성을초래할수있다는점에유의하십시오. 5
SEC 에대한장비고려사항 SEC 분리메커니즘은용리부피또는머무름시간이분석에절대적으로중요하다는것을보여줍니다. 이를위해정밀도와재현성을보장하는고성능장비가필요합니다. 등용매모드작동에는등용매펌프나기울기펌프가적합하며, 굴절률 (RI) 검출기와더일반적인 UV 또는 DAD 검출기도사용할수있습니다. 바탕선 (baseline) 안정성을보장하기위해, 특히 RI 검출기를사용할때는이동상온라인탈기와항온장치가강력히권장됩니다. 고온에서작동하면확산계수가증가하여분해능과재현성이높아지고컬럼압력이줄어듭니다. 따라서항온장치는고성능시스템에필수적인요소입니다. 까다로운용매조건에서도가능한견고하고신뢰성있는작동 일반적으로생체분자분석에는 2M NaCl 또는 8M 요소 (Urea) 와같이염의농도가높고극단의 ph 값 (1~13) 을가진완충액이사용되며, 이러한조건은 LC 장비가해결해야할중요한과제입니다. 그러나 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 의전용설계는이와같은가혹한용매조건을손쉽게처리합니다. 또한, 내부식성티타늄재질의용매전달시스템과비금속재료로제작된시료유동경로는장비의완건성을크게향상시켜시료뿐아니라장비투자를보호해줍니다. 검출기는또한생체분자분리를위해고안되었으며단백질분석, 피크모양및회수율에영향을미치지않습니다. 분석중단백질보호 가열은단백질의변성을초래할수있으므로전체 LC 유동경로에서시료를일정온도로유지하는것이중요합니다. 비활성시료루프와세라믹니들을가진애질런트생체비활성자동시료주입기 (autosampler) 는추가항온장치를이용해냉각할수있습니다. 항온컬럼장치의생체비활성열교환기는온도를일정하게유지합니다. 애질런트는다양한조건에서신뢰성있는단백질분석이가능하도록여러가지생체비활성흐름셀을제공합니다. 흐름셀옵션에대한자세한내용은 www.agilent.com/chem/bioflowcells 에서확인하실수있습니다. Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템 RFID 태그가부착된생체비활성흐름셀, 1mm, 13µL(p/n G5615-622) 6
시야를넓혀주는소프트웨어솔루션 크기배제크로마토그래피로작업할때다음과같이여러가지소프트웨어옵션의지원을받을수있습니다. HPLC 소프트웨어 : Agilent OpenLAB CDS ChemStation 소프트웨어는크로마토그래피데이터를수집, 검토및관리하고정량분석을수행하는데도움을드립니다. GPC/SEC 소프트웨어 : Agilent GPC/SEC 시스템의일부로이용할수있으며, 분자량에기반한추가정보를제공합니다. Buffer Advisor 소프트웨어 : 염과 ph 기울기를빠르고쉽게작성하여완충액준비, 혼합및 ph scouting 등의지루하고오류가발생하기쉬운분석법개발단계를없앱니다. 종합적인분자특성화 SEC 는자연계에존재하는분자 ( 다당류, 녹말등 ) 와합성폴리머 ( 폴리에틸렌글리콜또는폴리에틸렌옥사이드 ) 를포함하는중합체분석물질의평균분자량을결정하기위해사용될수있습니다 ( 그림 4). 단백질이나백신같은더복잡한시료의경우, 일반적으로전용소프트웨어를이용한보다정교한형태의데이터분석이필요합니다. 적절한검출기를함께사용하여시료의형태에대한유용한정보를얻을수있습니다. 검출기선택에대한자세한내용은 17 페이지를참조하십시오. Mn Mw Mp. 2. 4. 6. 8. 1. 12. 14. 그림 4: 다당류 SEC 분리에서의 Mw, Mn 및 Mp 측정결과 7
크기배제특성화의단계 시료전처리 크기배제크로마토그래피의시료전처리절차는단백질 HPLC 분석의시료전처리절차와유사합니다. 가장중요한점은시료가용리액에용해될수있어야하며이동상에서이상적으로분리될수있어야합니다. SEC 분리는기타 HPLC 분석법에비해유속이느리기때문에컬럼치수가크고선속도가낮습니다 ( 아래 컬럼크기 참조 ). 그리하여소요되는시료농도와주입량이보통보다커야합니다. 컬럼의손상을막기위해, 사용하기전에시료를필터링하거나원심분리시켜미립자를제거하는것이좋습니다. 그러나필터링은시료용해도가낮은문제를해결할수없으며, 이경우용리액을교체해야합니다. 효과적인시료전처리를위해, 시료분해에사용되는분석법이시료자체의특성에변화를주지않도록해야합니다. 일부단백질은 stress 조건에서응집 (dimers 와고분자량 multimers 형성 ) 되거나분리 ( 저분자량 sub-units 형성 ) 될수있습니다. 여기에는반복적인냉동 - 해동, 극한온도, 초음파처리심지어농축등의조건이포함될수있습니다. 자세한내용은 5 페이지의분석법개발안내서를참조하십시오. Captiva 저단백질결합필터 수행하고있는시료전처리방법과관계없이, 저단백질결합필터를이용해시료를필터링하는것이좋습니다. Agilent PES 필터는단백질관련필터링에서우수하고일관된저단백질결합을제공합니다. 대부분의 LC 분석에서, PVDF 멤브레인보다 PES 필터멤브레인을선택하는것이좋습니다. Agilent PES 는일반적인 LC 용매에대해 PVDF 필터와유사한호환성을가지며, 단백질결합및청결도의측면에서는 PVDF 필터보다우수합니다. 자세한정보는 www.agilent.com/chem/filtration 에서확인하실수있습니다. Captiva PES 필터 직경 (mm) pore 크기 (µm) 인증 하우징 부품번호 4.45 LC 폴리프로필렌 519-595 4.2 LC/MS 폴리프로필렌 519-594 15.2 LC/MS 폴리프로필렌 519-596 15.45 LC 폴리프로필렌 519-597 25.2 LC/MS 폴리프로필렌 519-598 25.45 LC 폴리프로필렌 519-599 8
컬럼선택 컬럼크기 SEC 컬럼은일반적으로다른유형의크로마토그래피에사용된컬럼보다크며, 상대적으로낮은유속또는느린선속도에서작동합니다. SEC 표준컬럼크기는 7.8 x 3mm 이고유속은 1.mL/ 분이며, 역상컬럼의크기는일반적으로 2.1/4.6 x 15mm 이고선속도는 SEC 의 2-3 배입니다. 이는컬럼크기의영향이아니라 SEC 메커니즘자체에서비롯된것입니다. 흡수또는고정상과의상호작용으로인해다른크로마토그래피기법에서일반적으로나타나는시료농도의증가가 SEC 분리에서는발생하지않습니다. 따라서 SEC 분석시료는더높은농도 (1-4mg/mL) 및량 (5-2µL) 으로주입됩니다. 실행시간은일반적으로컬럼당 1-12 분이며 ( 기존 7.8 x 3mm 컬럼이 1. ml/ 분에서작동한다고가정 ), 피크는보통넓기때문에높은데이터수집속도가필요없습니다. 단백질응집의비교나정량화에는 HPLC 소프트웨어가사용되며, 다분산폴리머에대한분자량분포정보를얻기위해서는특별 SEC 소프트웨어를사용합니다. 정기적인검량을통해선택한컬럼의특성을파악하는것이매우중요합니다. 그어떤 pore 도통과하지못하는충분히큰분자를사용하여컬럼의배제한계를확인할수있습니다. 마찬가지로, 모든 pore 구조를통과할수있는충분히작은분자를사용하여컬럼의전체투과한계를확인할수있습니다. 그런다음수행하고자하는분리가이두한계사이에놓이도록해야합니다. 시료의크로마토그램에배제된물질이나전체투과포인트에서용리된물질을포함할경우, 이는분석수행을위해다른 pore 크기의컬럼을사용할필요가있음을나타냅니다. 더짧은컬럼으로분석속도향상 분석에필요한정도의분리능을획득하기위해보통길이가 3mm 인컬럼을사용해야합니다. 그러나분리속도를높이려면더짧은컬럼길이를고려할수있습니다. 길이가 15mm 인컬럼을사용하면절반의시간에분리를완료할수있지만, 분리능이저하됩니다. 처리량을높여야할경우, 역압 (backpressure) 한계를초과하지않는조건하에서컬럼길이가짧을수록유속이높아지며, 따라서분석시간을단축할수있습니다 ( 그림 5 참조 ). 컬럼 : 유속 : 시료 : 7 6 5 4 3 2 1 AdvanceBio SEC, 7.8 x 3mm 1.mL/ 분 다클론성 IgG 1 2 3 2 4 6 8 1 12 4 1. 큰응집체 2. 이합체 (Dimer) 3. 단량체 (Monomer) 4. Fragments 5. 부형제 (Excipients) 5 14 분실행시간 min 컬럼 : 유속 : 시료 : AdvanceBio SEC, 7.8 x 15mm 2.mL/ 분 다클론성 IgG 6 3 5 4 3 2 1 1 2.5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 3.5 분실행시간 min 그림 5: 3mm 컬럼과 15mm 컬럼을사용한분석을비교하여절약된시간표시 9
컬럼미디어선택 시료의용해도와이동상 ( 물, 완충액또는유기용매 ) 을결정한후, 분리하려는분자유형과크기에적합한크기배제컬럼을선택합니다. 폴리머기반흡착제로충진된컬럼은일반적으로넓은분자량분포범위를가진폴리머분자 ( 헤파린, 녹말또는셀룰로오스등 ) 에사용됩니다. 실리카기반의고정상은단백질과분자량이서로다른분자의분석에적합합니다 ( 표 1). 단백질에는서로다른곁사슬 ( 산, 염기, 소수성및중성 / 친수성 ) 을가진다양한아미노산을포함하고있다는점에유의해야합니다. 실리카컬럼과의상호작용을방지하려면이동상에완충액을첨가해야합니다. 애질런트에서는컬럼의적절한분자량범위를제시하며, 이론적으로컬럼선택은작동범위의중간에속해야합니다. 크기배제크로마토그래피 (SEC) 응용분야애질런트컬럼참고 단백질 mabs, 단백질및펩타이드의 SEC-UV/DAD 또는 LS 분석 Agilent AdvanceBio SEC 최신혁신기술은분리능을개선하여시료재분석의필요성을없애고분석시간을단축함으로써실험실생산성을향상시킵니다. mabs, 단백질및펩타이드의 SEC-MS 분석 Agilent Bio SEC-3 MS 검출을통해안정적인바탕선 (baseline) 을제공합니다. 큰생체분자및다양한분자량성분을포함한시료 Agilent Bio SEC-5 Pore 크기옵션 (1Å, 15Å, 3Å, 5Å, 1Å, 및 2Å) 이다양하여보다많은분석물질을분석할수있습니다. 구상단백질, 항체 ProSEC 3S 고염조건에서의단백질분석을위한단일컬럼옵션입니다. 단백질, 구상단백질 ZORBAX GF-25/45 프로토콜에서 USP 지정 L35의사용을요구할경우기존 제품을사용해야합니다. 수용성분석물질 저분자량폴리머및올리고머, 올리고당, PEG, 리그노술폰산염 다분산바이오폴리머, 다당류, 셀룰로오스유도체 2 또는 3 PL aquagel-oh ü PL aquagel-oh 8µm ü PL aquagel-oh 2 5µm ü PL aquagel-oh MIXED-M 8µm 2 또는 3 PL aquagel-oh ü PL aquagel-oh MIXED-H 8µm ü PL aquagel-oh 6/5/4 8µm 초고분자폴리머, 히알루론산, 녹말, 검류 (gums) PL aquagel-oh 6/5/4 15µm 시리즈 PL aquagel-oh 분석컬럼의 ph 범위는 2-1 이고유기용매 ( 최대 5% 메탄올 ) 와호환되며, 최대 14bar(23psi) 의기계적안정성및낮은컬럼작동압력을가집니다. 표 1: 응용분야와시료크기에따른컬럼선택옵션 Agilent Bio SEC 컬럼은단백질응집을비롯한생체분자의분리에사용되고 Agilent GPC 컬럼은다당류분자량결정을비롯한천연폴리머분석에사용됩니다. 1
pore 크기 단백질은다른바이오폴리머에비해상대적으로작고컴팩트하여초기컬럼으로 pore 크기가 3Å 인컬럼을선택하는것이적합합니다. 그림 6 은서로다른 pore 크기를가지는컬럼에서 5 개의단백질혼합물참조표준물질과다클론성 IgG 시료의분리능을비교하였으며, 그결과를 통해분리능에대한 pore 크기의영향을명확하게보여줍니다. 3Å pore 를이용할경우가장큰단백질티로글로불린과 IgG dimer 를분리할수있습니다. 하지만 pore 크기가작아질수록가장큰단백질이배제되고분리가일어나지않습니다. BioRad 겔여과표준혼합물 2 175 15 125 1 75 5 25 컬럼 A: 컬럼 B: 컬럼 A 3 1 2 4 2 4 6 8 1 12 14 min AdvanceBio SEC 3Å 4.6 x 3mm, 2.7µm(p/n PL158-531) AdvanceBio SEC 13Å 4.6 x 3mm, 2.7µm(p/n PL158-535) 1. 티로글로불린 2. g- 글로불린 ( 소 ) 3. 오브알부민 ( 닭 ) 4. 미오글로빈 ( 말 ) 5. 비타민 B12 5 6 컬럼 B 1 5 4 3 2 2 3 4 5 1 2 4 6 8 1 12 14 장비 : Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템 이동상 : 15mM 인산염완충액, ph 7. 유속 :.35mL/ 분 검출기 : UV, 22nm 시료 : BioRad 겔여과표준혼합물 min 다클론성 IgG 분리 7 6 5 4 3 컬럼 A 3 1. 큰응집체 2. 이합체 (Dimer) 3. 단량체 (Monomer) 4. Fragments 5. 부형제 (Excipients) 1 8 6 4 컬럼 B 1 2, 3 2 1 1 2 4 2 4 6 8 1 12 14 min 5 2 5 4 2 4 6 8 1 12 14 min 컬럼 A: 컬럼 B: AdvanceBio SEC 3Å 4.6 x 3mm, 2.7µm(p/n PL158-531) AdvanceBio SEC 13Å 4.6 x 3mm, 2.7µm(p/n PL158-535) 장비 : Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템 이동상 : 15mM 인산염완충액, ph 7. 유속 :.35mL/ 분 검출기 : UV, 22nm 시료 : 다클론성 IgG 그림 6: BioRad 겔여과표준물질과다클론성 IgG 의분리에서 pore 크기의영향을비교. 녹색으로강조표시된영역은두 pore 크기사이의분해능차이를보여줍니다. 큰단백질분석에는 pore 크기가큰컬럼을사용해야합니다 11
SEC 투과범위평가 단백질의경우, SEC 분리메커니즘은용질의분자량이아니라용액내용질크기에기반한다는점을이해해야합니다. 그림 7 과같이, 단백질 / 펩타이드및풀루란 (pullulan)/ 다당류의검량곡선을 PEG/PEO 곡선과비교할경우, 이는더명확해집니다. 풀루란 (pullulan)/ 다당류와 PEG/PEO 의 calibrant 가제공하는검량곡선은상당히유사하지만, 단백질 / 펩타이드의검량곡선은이동하여다른모양을보입니다. 단백질은 3 차원구조를형성하는복잡한폴리펩타이드사슬로이루어져있습니다. 이러한구조는 ph 또는이온세기와같은노출된환경의영향을받습니다. 사슬은단백질에가장적합한모양을이루므로구조와크기가다를수있습니다. 분자량 (g/mol) 1,, 1, 1, 1, 다당류 PEG/PEO 펩타이드 / 단백질 1 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 머무름부피 (ml) 그림 7: 세가지유형의 calibrant에대한검량플롯의비교 용리시간은분자량보다는분자크기에의해좌우된다는것을증명하기위해, 약 5, 의분자량을가진 calibrant 의머무름시간을살펴보십시오. 거기에는분명한차이가있습니다 ( 그림 8). PEG 는단 7 분후용리되고다당류는 7.5 분을지나용리되지만, 단백질은약 9.5 분에용리됩니다. 4, 3, PEG 46,72( 공칭분자량 ) 다당류 48,( 공칭분자량 ) 이는 SEC 분리메커니즘이분자량이아니라실제크기에의해좌우된다는것을명확하게증명합니다. 그리하여검량선을사용할때, 사용된 calibrant 를지정하는것이중요합니다. 예컨대, 관심시료는분자량이 5, 인풀루란 (pullulan)/ 다당류에해당한다고설명할수있습니다. 이상대적영향을극복하는고급검출기는 16 페이지를참조하십시오. 2, 1, 단백질, 오브알부민 44,3 ( 공칭분자량 ) 2 4 6 8 1 min 그림 8: 비슷한분자량의 calibrants 의중첩크로마토그램 13Å AdvanceBio SEC 검량표준물질 (p/n 519-9416 13Å AdvanceBio SEC 검량표준물질, 2mL 바이알 ) Agilent 13Å AdvanceBio 크기배제컬럼을검량하기위해주의깊게선택한 5 가지단백질로이루어진단백질혼합물 ( 오브알부민, 미오글로빈, 아프로티닌, 뉴로덴신, 안지오텐신 II) 입니다. 이표준물질은컬럼을정기적으로검량하기위해사용할수있으며, 단백질정제및분석을비롯한다양한응용작업에서이상적인시스템성능을보장합니다. 3Å AdvanceBio SEC 검량표준물질 (p/n 519-9417 3Å AdvanceBio SEC 검량표준물질, 2mL 바이알 ) Agilent 3Å AdvanceBio 크기배제컬럼을검량하기위해주의깊게선택한 5 가지단백질로이루어진단백질혼합물 ( 티로글로불린, g- 글로불린, 오브알부민, 미오글로빈, 안지오텐신 II) 입니다. 이표준물질은컬럼을정기적으로검량하기위해사용할수있으며, 단백질정제및분석을비롯한다양한응용작업에서이상적인시스템성능을보장합니다. 12
입자크기 입자크기도컬럼선택에중요한고려사항입니다. 입자크기가작으면더효율적인분리를제공하지만단백질분해 ( 전단 / 변형 ) 의위험이있습니다. 그림 9 는 Agilent 3µm Bio SEC-3 과 5µm Bio SEC-5 컬럼의비교결과를보여줍니다. 만약시료와용리액을주의깊게전처리하지않을경우높은 역압 (backpressure) 과컬럼막힘의위험이증가합니다. 불용성물질과잔류물을제거하기위해필터링이권장됩니다. 또한가드컬럼이나인라인필터를사용하면컬럼수명을늘릴수있습니다. Agilent Bio SEC-3 과 Agilent Bio SEC-5 사이의비교결과 단일클론성항체분석 컬럼 : 컬럼 : 장비 : Bio SEC-3, 3Å 7.8 x 3mm, 3µm (p/n 519-2511) Bio SEC-5, 3Å 7.8 x 3mm, 5µm (p/n 519-2526) Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템 12 1 8 6 1 Rs 인수계산 2 3 1. 이합체 (Dimer) 2. 단량체 (Monomer) 3. Monomer fragment 3µm 이동상 : 15mM 인산나트륨, ph 7 유속 : 검출기 : 시료 : 1mL/ 분 UV, 22nm 인간화단일클론성항체 4 2 1 2 3 5µm 2 4 6 8 1 12 14 16 18 min 그림 9: Agilent Bio SEC-3 과 Agilent Bio SEC-5 컬럼의비교 3µm 컬럼이더높은분리성능을제공합니다 컬럼직경 시료의양에따른컬럼직경선택도아주중요합니다. 분석물질의양이제한될경우 4.6mm id 의컬럼 (.35mL/ 분에서작동 ) 이적합합니다. 그러나과도한분산및분리능손실을막기위해내경이더작은컬럼을사용할경우에는시스템부피를최소화하는것이중요합니다. 수용성용리액을사용할경우 SEC 는성질을변형시키지않는기법으로간주되며, 따라서복잡한시료의분획분리나추가분석을위한시료성분의분리에매우유용합니다. Agilent SEC-3 및 SEC-5 컬럼제품군의 21.2mm 같은큰직경의컬럼을사용하면, 분석용 HPLC 시스템을이용해실험실전처리분리를수행할수있습니다. Agilent AdvanceBio SEC 컬럼 7.8 x 3mm 및 4.6 x 3mm 13
분석법매개변수 유속일부응용분석에서분석속도는매우중요합니다. 더짧은컬럼을사용하거나 (15mm 컬럼으로 3mm 컬럼대체 ) 유속을증가시키는것모두분석시간을단축할수있습니다. SEC 분리는컬럼 pore 의안과밖으로드나드는분자의확산에의해생성된경로길이차에기반하여분리를실현하기때문에, 이방법은분리에부정적효과를가져올수있습니다. 그럼에도불구하고, 그림 1 에표시된것처럼, 15nm 컬럼을 2mL/ 분의유속에서사용할때 IgG dimer 및 monomer 를 4 분안에정량화하기에충분한분리능을얻을수있습니다. 14 12 1 8 6 4 2 A 2 4 6 8 1 12 14 min.5ml/min 1.mL/min 1.5mL/min 컬럼 : AdvanceBio SEC 3Å, 7.8 x 15mm, 2.7µm (p/n PL118-331) 용리액 : 15mM 인산염완충액, ph 7. 유속 : 검출기 : 주입량 : 5µL 시료 :.5, 1., 1.5mL/ 분 (52, 12, 152bar) UV, 22nm IgG(2mg/mL) Norm. 14 12 1 8 6 4 2 B 2 4 6 8 1 12 14 min 그림 1: 유속을높이면분석시간이 12 분에서 4 분으로단축됩니다 (A) 머무름시간이정규화되고중첩된경우 (B), 머무름시간이일정하게유지되며분리능감소는최소화되는것으로증명되었습니다 SEC 분석법문제해결 문제점원인용액 예상회수율보다낮음또는피크가넓어짐 소수성분석물질 이동상에소량의 (1-2%) 유기변형제 ( 아세토니트릴 또는메탄올 ) 추가 피크가나타나지않아야할지점에서나타나거나 ( 분자량에기반하여판단 ) 피크테일링이나타남 이온상호작용또는염기성단백질 5-1mM 간격으로이온세기 - 염농도증가, 인산염완충액에추가 피크모양불량 비특이적흡수 염농도를증가시키거나 Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템사용 분석물질의머무름 / 분리능부족 pore 크기가분자크기보다작음 pore 크기확인, 자세한내용은 11 페이지참조 14
이동상선택 이차상호작용은문제를일으킬수있음원하지않는 2 차상호작용을극복하려면분석법최적화를수행해야합니다. 그러한상호작용으로예상보다늦게분석물질이용리될수있고, 저분자량이나타날수있습니다. 이동상조성 (ph, 이온세기또는유기변형제 ) 을 약간조정하면그러한문제를극복하는데도움이될수있습니다 ( 그림 11). 또한원하는분리를위해 pore 크기선택을재정의하거나, 여러컬럼을조합하거나, 분석유속을낮추거나온도를변경하는등의조치가필요할수있습니다. 3 25 A 이온세기가너무낮음 : 리소자임이컬럼에서용리되지않음 컬럼 : 장비 : 유속 : Agilent Bio SEC-3 3Å 4.6mm x 3mm, 3µm (p/n 519-2513) Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템.35mL/ 분 2 15 1 검출기 : 주입량 : 5µL UV, 22nm A: 용리액 2mM 인산염완충액, ph 7 + 5mM NaCl B: 용리액 2mM 인산염완충액, ph 7 + 1mM NaCl C: 용리액 2mM 인산염완충액, ph 7 + 4mM NaCl 5 시료 : 단백질 (1mg/mL 2mM 인산염완충액, ph 7) 2 4 6 8 1 12 14 3 B 5mM NaCl, 2mM 완충액 25 2 리소자임과같은염기성단백질에적합한염농도선택 15 1 5 2 4 6 8 1 12 14 C 3 25 2 15 염농도를높여피크테일링감소리소자임미오글로빈오브알부민 1 5 4mM NaCl, 2mM 완충액 2 4 6 8 1 12 14 그림 11: 너무크거나작은이온세기가원하는분리달성에대한영향 15
검량 컬럼을선택한후, 알려진분자량의표준물질로검량을수행해야합니다. 컬럼을변경할때마다또는이동상을바꿀때마다, 검량을반복해야합니다. 검량선은분자량대비머무름시간을플롯하여얻어집니다 ( 그림 12). 표적분자에적합한표준물질을선택하는것이특히중요합니다. 단백질분리의경우단백질분자량표준물질을사용하고다당류분리의경우풀루란 (pullulan) 분자량표준물질을사용해야합니다. 컬럼 : 장비 : Agilent Bio SEC-5 7.8 x 3mm, 5µm (p/n 519-2521) Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템 이동상 : 15mM 인산염나트륨, ph 7. 유속 : 검출기 : 1.mL/ 분 UV 1,, 1, 머무름부피 단백질 MW 1Å 5Å 3Å 15Å 1Å 티로글로불린 67, 1.7 8.23 7.3 5.82 5.77 분자량 1, 1Å 5Å g-글로불린 158, 1.88 9.8 8.57 6.55 5.79 BSA 67, 11.13 1.44 9.44 7.29 6. 오브알부민 45, 11.28 1.83 9.89 7.9 6.4 1, 3Å 미오글로빈 17, 11.44 11.28 1.42 8.66 7.5 1 4 15Å 1Å 5 6 7 8 9 1 11 12 13 머무름부피 (ml) 리보뉴클레아제 A 12,7 11.52 11.41 1.58 8.93 7.32 비타민 B12 1,35 12. 12.59 11.78 11.49 1.3 우라실 112 12.8 12.68 12.21 12.13 11.41 그림 12: 검량곡선은분자량대비머무름시간을플롯하여얻어집니다 이상적인경우, 표준물질은이동상에용해되어야하며시료는이동상에충분히용해되어야합니다. 용액이혼탁해보이면추가조치를취해야할필요가있습니다. 주입전에불용성물질을제거하기위해원심분리나필터링을이용해야 합니다. 그러나, 물리적과정은분자량조성을바꿀수있기때문에시료용해도를높이는다른이동상조건을찾을필요가생길수있습니다. 16
고급검출기법 추가적인 SEC 고려사항에는검출기선택이있습니다. UV 또는다이오드어레이 (DAD) 는단백질분리에일반적으로사용됩니다. 펩타이드및단백질에대한최적의결과, 즉최고감도는보통 22nm 에서얻어집니다. 일부완충액이나유기변형제는낮은파장에서배경흡광도가너무클수있습니다. 이경우 254nm 또는 28nm 의파장을선택해야할수있습니다. UV 검출의단점은일부분자가발색단 (chromophore) 을가지지않는다는것입니다. 하지만, 분석물질이등용리조건으로용리되기때문에 RI 검출기를대신사용할수있습니다. 고급광산란검출을추가하면 SEC 의성능이크게개선됩니다. 정적광산란검출 (Static light scattering) 을통해컬럼검량및원치않는상호작용과관계없이정확한몰질량을결정하며, 동적광산란검출 (dynamic light scattering) 을결합하여분자크기연구에사용할수있습니다. 광산란검출은큰모이어티 (moieties) 에대한감도를증가시켰으며, 훨씬더낮은양에서응집을검출할수있습니다 ( 그림 13). 크로마토그래피성능을훼손하지않고이추가정보를얻기위해서는낮은무효부피 (dead volume) 를가진검출기를선택하는것이중요합니다. 컬럼 : Agilent AdvanceBio 3Å, 7.8 x 3mm, 2.7µm 45 장비 : Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템과 Agilent 126 Infinity Multi-Detector GPC/SEC 연동사용 이동상 : 15mM 인산나트륨, ph 7. 4 35 3 25 RI LS 9 UV, 28nm 유속 :.8mL/ 분 온도 : 3 C 검출기 : UV, 28nm + RI + LS 9 주입량 : 5µL 시료 : 분해된단일클론성항체 감응도 (mv) 2 15 1 5-5 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 RT( 분 ) 그림 13: 단백질분리에서서로다른검출기사용의결과 17
결합단백질 치료용단백질은발현, 재접힘, 다운스트림공정, 제형, 멸균및보관과같은모든개발단계동안에응집되고분해될수있습니다. 비록응집체 / 분해물이낮은농도로존재하지만, 생물학적치료제의품질에큰영향을주기때문에활성상실, 용해성감소및면역원성증가로이어질수있습니다. 크기배제크로마토그래피는단백질응집을특성화하기위해사용되는표준분석법이며규제기관제출및승인을위해서도필요합니다. 약물전달방식을개선하고반감기를증가시키고효능을높이기위해단일클론성항체등의단백질을결합할수있습니다. 폴리에틸렌글리콜같은수용성폴리머는단백질과결합하여약리작용을높여주며, 혈류에서의반감기를높여주고면역원성을낮추줍니다. 최근에항체약물결합체 (ADC) 에대한관심이날로높아지고있습니다. 여기서단일클론성항체가세포독성약제와결합되어표적약물을전달하고치료효능을개선합니다. 시료특성의변화가 SEC 분리에더큰문제를야기할수있기때문에결합후에도동일한응집시험이필요합니다. AdvanceBio SEC 와같이매우낮은비특이적결합을가지는컬럼은수용성이동상을이용해항체와 ADC 모두를분석하는데사용됩니다 ( 그림 14 참조 ). Norm. 175 15 125 1 75 5 25 DAD1 A, Sig=22, Intact Trastuzumab DAD1 A, Sig=22, Heat/pH stressed Trastuzumab 응집체 6.61 7.33 8.49 Intact Trastuzumab 2 4 6 8 1 12 14 min 11.584 12.74 13.114 Fragments 14.469 16 14 12 1 8 6 4 2 DAD1 A, Sig=22, Intact ADC DAD1 A, Sig=22, Heat/pH stressed ADC 응집된 ADC 6.654 7.141 8.16 8.67 Intact ADC 11.586 분해된 ADC 12.737 2 4 6 8 1 12 14 min 컬럼 : 장비 : 이동상 : TCC 온도 AdvanceBio SEC 3Å 7.8 x 3mm, 2.7µm Agilent 126 Infinity Bio-inert Quaternary LC 시스템 PBS, 15mM 염화나트륨이포함된 5mM 인산나트륨 (ph 7.4) 실온 주입량 : 1µL 유속 :.8mL/ 분 검출기 : UV, 22nm 그림 14: mab 와보다소수성강한 ADC 에대해동일한수용성이동상이사용되었습니다 성공적인결과를얻는방법은 www.agilent.com/chem/navigator 에서확인하실수있습니다 풍부한바이오컬럼및소분자컬럼을구비한 Agilent LC 컬럼및시료전처리 NAVIGATOR 는응용분야에적절한컬럼을선택하는데도움을드립니다. NAVIGATOR는 4개의간단한검색옵션을제공합니다. 부품번호기준검색, LC 컬럼과시료전처리제품을교차참조하여최적의애질런트교체품을찾습니다 화합물기준검색 ( 드롭다운목록사용 ) USP 분석법기준검색 컬럼기준검색 ( 분석법에기초한권장사항이용 ) 18
시료전처리 이상적인경우, 시료는이동상에용해되어야합니다. 시료가혼탁할경우, 이동상조건을변경할필요가생길수있습니다. 시료를맑게하기위해필터링또는원심분리를사용할수있지만, 이러한과정은시료의분자량조성을바꿀수있습니다. 시료분해하기위해때때로가열, 혼합또는초음파처리를적당히사용할수있지만, 이는분자량조성을바꿀수있기때문에주의를기울여야합니다. 또한보관중시료가변질되지않도록주의를기울여야합니다. 시료는새로준비해야하며, 가능한신속하게분석해야합니다. 완충액에서는세균성장이빨라질수있습니다. 고농도의시료는시간에따라변할수있어응집이나심지어침전이일어납니다. 컬럼선택 시료무결성을보장하기위해긴컬럼을사용하여천천히 SEC 분리를실행합니다. 컬럼길이는보통 25 또는 3mm 입니다. 정상유속은 7.5 또는 7.8mm ID 컬럼에서 1.mL/ 분이며, 4.6mm ID 컬럼에서는.35mL/ 분입니다 바이오폴리머분리일경우, 일반적으로여러컬럼을사용하여분리능을개선합니다. 단백질분리의경우, 작은미립자를사용하여분리능을개선합니다. 작은미립자로 15mm 컬럼에서분리를수행하면분석시간을단축할수있습니다. 컬럼미디어선택 분석물질과컬럼미디어사이에비특이적상호작용이없어야합니다. 펩타이드및단백질분석을위해실리카기반흡착제가사용됩니다. 바이오폴리머분석을위해폴리머기반흡착제가사용됩니다 컬럼매개변수 Pore 크기 시료의분자량범위에의해결정되며, 시료성분의배제를방지하고필요한분리영역에서부피를극대화합니다. 미립자크기 높은분해능을위해작은미립자를사용합니다 ( 하지만역압은높음 ). 컬럼길이 분리능과분석시간사이에서절충합니다. 컬럼 ID 용매소모를줄이고주입량을낮추기위해더작은컬럼을사용합니다. 이동상 이동상은이온상호작용을방지하기위해완충액 / 염을포함해야하지만너무많으면소수성상호작용을일으킬수있습니다. 분해 / 응집등을방지하기위해분석물질을변화시키지마십시오. 실온에서보관된희석완충액에서는세균증식이빨라지기때문에, 필요시이동상을새로만들고만든즉시사용하십시오. 완충액보관기간은냉장하지않을경우 7 일미만입니다. 물 ( 가능성낮음 ) 또는완충액염에서 ( 가능성높음 ) 미립자를제거하기위해사용전에필터링합니다. 실리카컬럼에서높은 ph 의인산염완충액 ( 특히고온에서 ) 을사용할경우컬럼수명을크게단축합니다. SEC 용애질런트바이오컬럼에대한자세한내용은 www.agilent.com/chem/biohplc 에서확인하실수있습니다. 19
성공적인결과를얻기위한협력 난이도가증가할수록더적절한해답이필요합니다. 애질런트솔루션은바이오의약품과학자들의질병연구에대한혁신에도움을드리고약물발견을가속화하며약물개발및제조전반과정의신뢰성을더한층개선합니다. 바이오의약품에대한애질런트솔루션의자세한내용은 www.agilent.com/chem/togetherbiopharma 에서확인하실수있습니다. 추가정보 www.agilent.com/chem/biohplc 국가별애질런트고객센터찾기 : www.agilent.com/chem/contactus 미국및캐나다 1-8-227-977 agilent_inquiries@agilent.com 유럽 info_agilent@agilent.com 아시아태평양 inquiry_lsca@agilent.com 이발행물은연구용으로만사용하십시오. 이발행물의정보, 설명및사양은사전공지없이변경될수있습니다. 애질런트테크놀로지스는이발간물에포함된오류나, 이발간물의제공, 이행또는사용과관련하여발생한부수적인또는결과적인손해에대해책임을지지않습니다. Agilent Technologies, Inc. 215 한국에서인쇄, 215 년 11 월 1 일 5991-3651KO 서울강남구역삼로 542 신사제2빌딩 2층우 )6187 한국애질런트테크놀로지스 ( 주 ) 생명과학 / 화학분석사업부고객지원센터 8-4-59 www.agilent.co.kr