(72) 발명자 오좌섭 서울시관악구봉천동관악드림타운 103 동 1001 호 안은경 서울시성동구성수 1 가 2 동동아그린아파트 101 동 509 호 이정아 경기도수원시팔달구인계동 번지현대하이엘오피스텔 535 호 김인수 울산광역시울주군언양읍서부리서울산두산위브아

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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) A61K 31/13 ( ) A61K 31/04 ( ) A61P 3/04 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2010 년 01 월 27 일 심사청구일자 2010 년 01 월 27 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2011 년 08 월 03 일 (56) 선행기술조사문헌 US A (45) 공고일자 2011년10월18일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2011년10월12일 (73) 특허권자 재단법인경기과학기술진흥원 경기수원시영통구이의동 성균관대학교산학협력단 경기수원시장안구천천동 300 성균관대학교내 (72) 발명자 정영훈 경기도용인시기흥구보정동신촌마을포스홈타운아파트 212 동 804 호 지옥표 서울시관악구봉천 3 동대우아파트 122 동 1901 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 손민전체청구항수 : 총 10 항심사관 : 이수형 (54) (1S,2S,3S,4S) 5 아미노사이클로펜탄 1,2,3,4 테트라올을포함하는항비만조성물 (57) 요약 본발명은 (1S,2S,3S,4S)-5- 아미노사이클로펜탄 -1,2,3,4- 테트라올을포함하는항비만조성물에관한것으로, (1S,2S,3S,4S)-5- 아미노사이클로펜탄 -1,2,3,4- 테트라올이지방전구세포에서전구세포로의분화를억제하므로, 비만또는비만과관련된다양한질환의예방또는치료에유용하게사용될수있다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (72) 발명자 오좌섭 서울시관악구봉천동관악드림타운 103 동 1001 호 안은경 서울시성동구성수 1 가 2 동동아그린아파트 101 동 509 호 이정아 경기도수원시팔달구인계동 번지현대하이엘오피스텔 535 호 김인수 울산광역시울주군언양읍서부리서울산두산위브아파트 108 동 1103 호 이경일 경기도수원시장안구천천동 호 - 2 -

3 특허청구의범위청구항 1 하기화학식 1로표시되는화합물을유효성분으로포함하는항비만조성물. [ 화학식 1] 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기조성물은 PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor) 의활성을억제함으로 써지방전구세포가지방세포로분화되는것을억제시키는것을특징으로하는항비만조성물. 청구항 3 제 1 항또는제 2 항의조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는치료용약제학적조성물. 청구항 4 제3항에있어서, 상기약제학적조성물은정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제및좌제으로이루어진군으로부터선택되는어느하나의제형을가지는것을특징으로하는비만의예방또는치료용약제학적조성물. 청구항 5 제 1 항또는제 2 항의조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선용식품조성물. 청구항 6 제5항에있어서, 상기식품조성물은육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료및비타민복합제로이루어진군으로부터선택되는어느하나임을특징으로하는비만의예방또는개선용식품조성물. 청구항 7 제 1 항또는제 2 항의조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선용의약외품조성물. 청구항 8 제 7 항에있어서, 상기의약외품조성물은소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기충 - 3 -

4 진제, 마스크, 연고제및필터충진제로이루어진군으로부터선택되는어느하나의제조에사용되는것을특징 으로하는비만의예방또는개선용의약외품조성물. 청구항 9 제 1 항또는제 2 항의조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선용화장료조성물. 청구항 10 제9항에있어서, 상기화장료조성물의제형은유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이컵베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스및바디세정제로이루어진군으로부터선택되는어느하나의제형을가지는것을특징으로하는비만의예방또는개선용화장료조성물. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은 (1S,2S,3S,4S)-5- 아미노사이클로펜탄 -1,2,3,4- 테트라올 ((1S,2S,3S,4S)-5-aminocyclopentane- 1,2,3,4-tetraol) 을포함하는항비만조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] 배경기술비만은체내에지방이과잉축적된상태를말하며그원인으로는지나친열량섭취, 내분비장애, 운동부족, 유전적요인등이있지만그중에서도과잉에너지축적이가장직접적으로관계된다. 비만은다른특별한원인없이섭취에너지에비해소비에너지가적을때초래되는단순성 ( 본태성 ) 비만과내분비질환 ( 인슐린의존성당뇨병, 쿠싱증후군, 난소기능부전, 갑상선기능저하 ) 이나시상하부장애 ( 뇌의만복감중추장해시나타난다 ) 등의원인으로인해비만이되는증후성비만이있다. 또한, 비만의요인중에서유전자가관련된사실은여러연구를통해알려져있다. 비만은잘못된생활습관으로부터많이발생하지만, 식욕을스스로의의지로조절할수없는경우에는유전자등의물질적인근거가있다는연구결과가보고되었다. 즉, 유전성비만마우스로부터비만유전자 (ob 유전자 ) 가발견되었다. 상기비만유전인자는식욕을억제하는렙틴 (leptin) 이라는단백질을만든다. 유전성비만마우스에서는이렙틴구조에변이가생겨작용이안되어식욕을억제하지못하여과식을하게되어비만에이르게되는것이다. 사람에있어서도일반적으로비만자가혈중렙틴농도가상승하고있는데도불구하고식욕이억제되지않는것은렙틴에대한감수성이낮기때문이다. 병적인비만에서는체내에서만들어지는단백질구조가유전성비만마우스에나타난것과매우유사한결과가확인되었다. 최근에는아드레날린수용체에서이상을일으키는유전자가존재하고있음을추정하는연구결과도보고되었다. 지방조직의아드레날린수용체특히베타 3-수용체는지방을분해하고에너지로바꾸는데관여하고있는데, 여기에서유전자의이상이생기면소비에너지가저하되어살이찌게되는것이다. 현대는스트레스시대라고할만큼일상생활에서압박을많이받고있으며, 이러한정신불안과욕구불만을해소하기위해음식섭취를증가시키는반면에신체활동은감소하였으므로에너지대사에불균형이초래되어비만이될수있다. 피곤하거나화가났을때과식할수있고어떤문제가발생했을때도음식섭취를통해그문제를보상하거나도피하려는경향이있다. 이런행동은어렸을때습득된다. 즉, 음식과의관련여부를떠나서모든생리적, 심리적욕구를대신채워주기위해음식을제공받아온아이들의경우이런식으로음식을이용하는것을배우게된다. 비만인사람중에는의지력이나자제력이부족하여식욕과체중조절을못하는경우가많다. 인체의시상하부에는섭취중추와만복감을조절하는중추가있으며, 만약여기에어떠한기질적장애가생기면 - 4 -

5 식욕조절을못하게됨으로써음식을과잉으로섭취하게되어비만이일어난다. 두부의전면에있는내분비선인갑상선에서만약호르몬내분비기능이저하되면기초대사가저하되어열량소비가감소되기때문에비만이된다. 그러나, 비만인의모두가갑상선기능에장애가있는것은아니다. 부신피질호르몬의과잉분비로인한비만은내분비성비만의대표적인비만으로신장또는간질환의치료에있어다량의부신피질스테로이드제를오랫동안사용했을때에발생되는경우가있다. 쿠싱증후군 (Cushing syndrome) 은부신피질자극호르몬 (ACTH) 분비를상승하게하여부신피질을자극함으로써코티솔이과잉으로생성되어중심부지방세포증식을초래한다. 여성은여성호르몬인에스트로겐에의해지단백분해효소 (lipoprotein lipase, LPL) 가조절되는데폐경이후에분비가감소되면피하지방합성이촉진되고인슐린의과잉분비로지방생성이촉진되며, 지방분해가억제되어지방이축적되므로비만이유발된다. 남성은 LPL이많기때문에복부비만이초래된다. [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] 경제가고도로발달함에따라식생활은윤택해지고활동량은줄어들고, 식습관도서구화되면서섭취칼로리과잉, 운동부족등으로섭취에너지와소비에너지간의불균형으로인해비만이증가하고있다. 운동부족과비만의관계는소비에너지저하도있지만, 그보다에너지가체내에서저장되기쉬운대사상태로변하는것이더중요하다. 운동부족은활동에너지량을감소시켜서잉여칼로리를체내에저장하게되며인슐린의활동이약해지면서인슐린이혈당을내리는작용이감소되며, 지방합성작용은감소되지않으므로지방축적작용을촉진시키는대사상태로변한다. 또한, 운동부족상태에서는기초대사도감소되므로저장에너지는더욱증가되기쉽다. 성장이끝난성인기부터는단백질도탄수화물도체내에들어온여분의영양은지방형태로몸안에저장된다. 이러한과잉영양이지방으로변할때운동부족은지방합성효소의작용을상승시키게된다. 이러한비만은성인병을유발시키는촉진제가되며대사장애로서제 2형당뇨병, 동맥경화증의발현위험을증가시키며, 심장의혈액공급에부담을주게되어심장병에걸리게되며, 남은지방은간에부담을주어지방간, 담석증, 간경변에걸리게된다. 몸무게가뼈와관절에부담을주어골격이상이생기며행동이둔화됨에따라활동력이제한되므로운동부족이되어비만이더욱심화되며, 특히여성비만은내분비이상을가져와월경불순, 성욕감퇴, 출산시합병증, 피부습진및많은땀을유발한다. 비만을측정하는지표로는여러가지가있는데, 체질량지수 (Body Mass Index; BMI) 는키와체중을이용하여비만의정도를평가하는방법중하나로서, 체중 ( kg ) 을신장 (m) 의제곱으로나눈값 (BMI = kg / m2 ) 이다. 허리둘레측정은복부지방량을반영하는아주유용한지표이며, 체지방측정은전체체중에서지방무게가차지하는백분율 (%) 로나타내고, 정상치는성인남자의경우 %, 여자의경우 % 이다. 이와같이, 과도한지방축적은정상적인생리학및생화학적신체기능에영향을미치며, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심혈관계질환및암등의발병과도밀접한관련이있다. 이러한비만에대해다이어트식품혹은항비만제품의개발이현대인의웰빙에대한관심고조와더불어많은연구자들에의해추진되고있다. 이러한제품개발의단계에서스크리닝이나간편한효능평가방법으로지방세포를이용하거나동물을이용하는방법이있다. 더구체적으로, 이러한비만의개선을위한기능성소재개발이최근폭넓게연구되고있는데, 다이어트오일을이용한비만의치료와예방효과를측정하는사례도많이알려져있다. 현재비만을치료하는치료제로는크게중추신경계에작용하여식욕에영향을주는약제와위장관에작용하여흡수를저해하는약물로나누어볼수있다. 중추신경계에작용하는약물로는각각의기전에따라세로토닌 (5HT) 신경계를저해하는펜플루라민, 덱스펜플루라민등의약물, 노르아드레날린신경계를통한에페드린및카페인등의약물및최근에는세로토닌및노르아드레날린신경계에동시작용하여비만을저해하는시부트라민등의약물들이시판되고있다. 이외에도, 위장관에작용하여비만을저해하는약물로는대표적으로췌장에서생성되는리파아제를저해하여지방의흡수를줄여주는, 최근비만치료제로허가된오를리스타트등이있다. 그러나, 기존에사용되어온약물중펜플루라민등은원발성폐고혈압이나심장판막병변과같은부작용을일으켜최근에사용이금지되었으며, 다른약물들도혈압감소나유산산혈증등의문제점이발생하여심부전, 신질환등의환자에는사용하지못하는문제점이있다. 이에따라, 부작용이작은비만의예방또는치료법으로서지방세포분화억제제가등장하게되었다. 지방세포에저장된지방은체내의중요한에너지원으로사용되나, 비만이진행됨에따라서지방세포는수적증가가일어날뿐만아니라과다한지방세포의분화에의한다량의트리글리세라이드합성은지방세포의크기증가를포함한형태적변화와여러유전자발현의변화를동반한다. 지방세포의크기증가는잉여에너지를중성지방의형태로합성및저장함으로써유발된다. 한편, 지방의저장에따라지방세포의크기증가는그직경이약 20배까지늘어날수있으며그결과세포용적은수천배까지증가되는것으로알려져있다. 이러한, 지방세포의크기는일반적으로식사조절로가능하지만새로운지방전구세포가지방세포로분화되는과정은식사조절로는효과가 - 5 -

6 없기때문에비만의근본적치료또는억제를제어하기위해서는지방세포의분화과정을조절하는것이중요하다. 지방세포분화는인슐린이나인슐린성장인자-I (insulin like growth factor-1), 성장호르몬등의자극에의하여촉진되며, 이과정에 CCAAT enhancer-binding protein (C/EBP) family, PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor) 등의전사인자들의증가가관찰된다. 이들, 전사인자들은지방세포조절인자와더불어지방세포의분화를촉진시키며지방산결합단백질인 ap2나지방산생합성효소 (fatty acid synthase) 와같은효소들의발현량을증가시킨다. 한편, 지방간의진행에도과다한중성지방의축적이관여되고있음이보고되고있다 [J. Clin. Invest., 98, (1996)]. [0012] [0013] 최근, 지방세포의분화를억제하면생성되는지방세포의수를조절할수있으며, 그에따라축적되는여분의에너지를배출할수있다는아이디어를바탕으로하여지방세포분화를저해하는물질들을탐색하고자하는연구가활발히진행되고있다. 일반적으로새로운성분의약제를개발하기위한여러가지방법중에서기존약제의실험적변형또는새로운물질의합성과기능검색은매우많은시간과투자가필요하다. 이에본발명자들은기존에공지된화합물인 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올이지방전구세포에서지방세포로의분화를억제하는효과가있음을밝혀내고, 이를비만의예방또는치료용도로사용할수있음을확인하여본발명을완성하였다. 발명의내용 [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] 해결하려는과제본발명의목적은지방세포의분화를억제함으로써그와관계되는질환의치료에이용할수있는항비만조성물을제공하는것이다. 본발명의다른목적은비만의예방또는치료를위한약제학적조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은비만의예방또는개선을위한식품조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은비만의예방또는개선을위한의약외품조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은비만의예방또는개선을위한화장료조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기비만의예방또는치료를위한약제학적조성물을약제학적으로유효한양으로비만의발병또는발병가능성이있는개체에게투여하는단계를포함하는비만의치료방법을제공하는것이다. [0020] [0021] 과제의해결수단상기의목적을달성하기위한본발명의일양상으로서, 하기화학식 1로표시되는화합물을유효성분으로포함하는항비만조성물이제공된다. [ 화학식 1] [0022] [0023] [0024] [0025] 본발명의또다른양상에따르면, 전술한조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는치료용약제학적조성물이제공된다. 본발명의또다른양상에따르면, 전술한조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선용식품조성물이제공된다. 본발명의또다른양상에따르면, 전술한조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선용의약외품 - 6 -

7 조성물이제공된다. [0026] [0027] 본발명의또다른양상에따르면, 전술한조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선용화장료조성물이제공된다. 본발명의또다른양상에따르면, 전술한비만의예방또는치료를위한약제학적조성물을약제학적으로유효한양으로비만의발병또는발병가능성이있는개체에게투여하는단계를포함하는비만의치료방법이제공된다. [0028] [0029] [0030] 이하, 본발명을상세히설명한다. 본발명의일양상에따르면, 하기화학식 1로표시되는화합물을유효성분으로포함하는항비만조성물을제공한다. [ 화학식 1] [0031] [0032] [0033] [0034] 본발명의조성물은 PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor) 의활성을억제함으로써지방전구세포가지방세포로분화되는것을억제시키므로비만의예방또는치료에사용될수있다. 비만은당뇨병이나고지혈증의발병가능성을증가시킬수있으며, 성기능장애, 관절염, 심혈관계의질환의발병위험또한커질수있다. 또한비만으로인하여담석증이유발될수있으며, 일부의경우에는암도야기될수있는것으로알려져있으므로, 상기조성물은비만이외에도비만과관련된다양한질환의예방또는치료에유용하게사용될수있다. 상기화학식 1로표시된화합물은공지된방법에의하여합성할수있다. 예를들면, 하기반응식 1에나타낸합성과정을거쳐높은수율의 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올을수득할수있다

8 [0035] [ 반응식 1] [0036] [0037] 반응시약및조건 : (a) NaH, DMSO, BnPPh 3 Cl, THF, 45 ; (b) (i) Dess-Martin periodinane, CH 2 Cl 2, 0 ; (ii) NaHMDS, MePPh 3 Br, THF, 0 ; (c) (i) CSI, Na 2 CO 3, toluene, 0 ; (ii) 25 % Na 2 SO 3, rt; (d) 5 mol% (IMesH 2 )(PCy 3 )(Cl) 2 Ru=CHPh, toluene, 80 : (e) cat. OsO 4, 50 % NMO, 80 % acetone, rt; (f) (i) 2,2- dimethoxypropane, PPTS, CH 2 Cl 2, rt; (ii) separation; (iii) p-tsoh, MeOH, 40 ; (iv) 10 % Pd/C, H 2, 6n HCl, MeOH, rt; (v) DOWEX-50w X 8 (H + form, 0.5m NH 4 OH as an eluent). [0038] 상기반응식 1 에서, "Bn" 은벤질기 (benzyl group) 를나타내며, "Cbz" 는카복시벤질기 (carboxybenzyl group) 를 나타낸다. [0039] [0040] [0041] 본발명의다른양상에따르면, 하기화학식 1 로표시되는화합물을유효성분으로포함하는항비만조성물을유 효성분으로포함하는비만의예방또는치료용약제학적조성물을제공한다. [ 화학식 1] [0042] [0043] [0044] [0045] 본발명에서용어, " 예방 " 이란조성물의투여에의해비만을억제하거나발병을지연시키는모든행위를의미한다. 본발명에서용어, " 치료 " 란조성물의투여에의해비만에의한증세가호전되거나이롭게변경되는모든행위를의미한다. 이때, 본발명의상기화학식 1로표시되는화합물은약학적으로허용가능한염의형태로사용될수있으며, 염으로는약학적으로허용가능한유리산 (free acid) 에의해형성된산부가염이유용하다. 산부가염은염산, - 8 -

9 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산또는아인산과같은무기산류와지방족모노및디카르복실레이트, 페닐-치환된알카노에이트, 하이드록시알카노에이트및알칸디오에이트, 방향족산류, 지방족및방향족설폰산류와같은무독성유기산으로부터얻는다. 이러한약학적으로무독한염류로는설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐포스페이트, 디하이드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트또는만델레이트를포함한다. [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] 본발명에따른산부가염은통상의방법, 예를들면, 상기화학식 1로표시되는화합물을과량의산수용액중에용해시키고, 이염을수혼화성유기용매, 예를들면메탄올, 에탄올, 아세톤또는아세토니트릴을사용하여침전시켜서제조할수있다. 또한, 본발명의상기화학식 1로표시되는화합물은염기를사용하여약학적으로허용가능한금속염을만들수있다. 알칼리금속또는알칼리토금속염은예를들면화합물을과량의알칼리금속수산화물또는알칼리토금속수산화물용액중에용해하고, 비용해화합물염을여과하고, 여액을증발, 건조시켜얻는다. 이때, 금속염으로는나트륨, 칼륨또는칼슘염을제조하는것이제약상적합하다. 또한, 이에대응하는은염은알칼리금속또는알칼리토금속염을적당한은염 ( 예, 질산은 ) 과반응시켜얻는다. 또한, 상기약제학적조성물은약학적으로허용가능한담체를추가로포함할수있다. 약학적으로허용가능한담체를포함하는상기조성물은경구또는비경구의여러가지제형일수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는하나이상의화합물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에스테아린산마그네슘, 탈크등과같은윤활제들도사용된다. 경구투여를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테로등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴등이사용될수있다. 상기약제학적조성물은정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제및좌제으로이루어진군으로부터선택되는어느하나의제형을가질수있다. 상기본발명의조성물은약제학적으로유효한양으로투여한다. 본발명에서용어 " 약제학적으로유효한양 " 은의학적치료에적용가능한합리적인수혜 / 위험비율로질환을치료하기에충분한양을의미하며, 유효용량수준은개체종류및중증도, 연령, 성별, 감염된바이러스종류, 약물의활성, 약물에대한민감도, 투여시간, 투여경로및배출비율, 치료기간, 동시사용되는약물을포함한요소및기타의학분야에잘알려진요소에따라결정될수있다. 본발명의조성물은개별치료제로투여하거나다른치료제와병용하여투여될수있고종래의치료제와는순차적또는동시에투여될수있다. 그리고단일또는다중투여될수있다. 상기요소를모두고려하여부작용없이최소한의양으로최대효과를얻을수있는양을투여하는것이중요하며, 당업자에의해용이하게결정될수있다. [0052] 본발명의조성물은비만의예방또는치료를위하여단독으로, 또는수술, 호르몬치료, 약물치료및생물학 적반응조절제를사용하는방법들과병용하여사용할수있다

10 [0053] [0054] [0055] 한편, 본발명은상기비만의예방또는치료용약제학적조성물을약제학적으로유효한양으로비만의발병또는발병가능성이있는개체에게투여하는단계를포함하는비만의치료방법을제공한다. 본발명에서용어, " 개체 " 란이미비만이거나비만에걸릴수있는인간을포함한모든동물을의미하고본발명의화학식 1로표시되는화합물을포함하는조성물을개체에게투여함으로써, 상기비만을효과적으로예방및치료할수있다. 예를들어, 본발명의조성물로비만인인간을치료할수있다. 본발명의조성물은기존의비만치료제와병행하여투여할수있다. 상기조성물의투여경로는목적조직에도달할수있는한어떠한일반적인경로를통하여투여될수있다. 본발명의조성물은목적하는바에따라복강내투여, 정맥내투여, 근육내투여, 피하투여, 피내투여, 경구투여, 비내투여, 폐내투여, 직장내투여될수있으나, 이에제한되지는않는다. 또한상기조성물은활성물질이표적세포로이동할수있는임의의장치에의해투여될수있다. [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] 아울러, 본발명은전술한항비만조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선용식품조성물을제공한다. 즉, 본발명의상기화학식 1로표시되는화합물을포함하는항비만조성물은비만의예방또는개선용식품조성물에첨가될수있다. 본발명의상기화학식 1로표시되는화합물을포함하는항비만조성물을식품첨가물로사용할경우, 상기조성물은그대로첨가되거나다른식품또는식품성분과함께사용될수있고, 통상적인방법에따라적절하게사용될수있다. 유효성분의혼합양은사용목적 ( 예방, 건강또는치료적처치 ) 에따라적합하게결정될수있다. 일반적으로, 식품또는음료의제조시에는본발명의조성물은원료에대하여 0.01 ~ 10 중량 %, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량 % 의양으로첨가된다. 그러나건강및위생을목적으로하거나또는건강조절을목적으로하는장기간의섭취의경우에는상기양은상기범위이하로도사용될수있다. 상기식품의종류에는특별한제한은없다. 상기물질을첨가할수있는식품의예로는육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를포함한낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료및비타민복합제등이있으며, 통상적인의미에서의건강식품을모두포함한다. 본발명의건강음료조성물은통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물은포도당, 과당과같은모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와같은디사카라이드, 및덱스트린, 사이클로덱스트린과같은폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이다. 감미제로서는타우마틴, 스테비아추출물과같은천연감미제나, 사카린, 아스파르탐과같은합성감미제등을사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는약 0.02 ~ 0.03 g 이다. 상기외에본발명의조성물은여러가지영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의조성물은천연과일쥬스, 과일쥬스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은크게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. 이들성분들은독립적으로또는조합하여사용할수있다. [0061] [0062] [0063] 아울러, 본발명은전술한항비만조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선용의약외품조성물을제공한다. 즉, 본발명의조성물은비만의예방또는개선을목적으로의약외품조성물에첨가될수있다. 본발명의상기화학식 1의화합물을포함하는항비만조성물을의약외품첨가물로사용할경우, 상기조성물은그대로첨가되거나다른의약외품성분과함께사용될수있고, 통상적인방법에따라적절하게사용될수있다. 유효성분의혼합량은사용목적 ( 예방, 건강또는치료적처치 ) 에따라적합하게결정될수있다. 바람직하게는, 상기의약외품조성물은소독청경제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기충진

11 제, 마스크, 연고제또는필터충진제일수있다. [0064] [0065] [0066] 아울러, 본발명은전술한항비만조성물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선용화장료조성물을제공한다. 즉, 본발명의조성물은비만의예방또는개선을목적으로화장료조성물에첨가될수있다. 본발명의상기화학식 1의화합물을포함하는항비만조성물을화장료첨가물로사용할경우, 상기조성물은그대로첨가되거나다른화장료성분과함께사용될수있고, 통상적인방법에따라적절하게사용될수있다. 유효성분의혼합량은사용목적 ( 예방, 건강또는치료적처치 ) 에따라적합하게결정될수있다. 바람직하게는, 상기화장료조성물의제형은유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 메이컵베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스또는바디세정제일수있다. [0067] 발명의효과본발명의 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올을포함하는조성물은지방전구세포가지방세포로분화되는것을억제하므로, 비만또는비만으로인해유발될수있는다양한질환의예방이나치료에유용하게사용될수있다. [0068] 도면의간단한설명 도 1 은 (1S,2S,3S,4S)-5- 아미노사이클로펜탄 -1,2,3,4- 테트라올에의한전구지방세포에서지방세포로의분화억 제효과를오일레드 O 염색및분석을통해그래프로나타낸것이다. 도 2는 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올에의한전구지방세포에서지방세포로의분화억제효과를오일레드 O 염색및분석을통해현미경관찰을한결과를나타낸사진이다. 도 3은 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올의세포독성 (cytotoxicity) 정도를측정한그래프이다. 도 4는 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올이 PPAR-γ의전사활성에미치는영향을나타낸그래프이다. 도 5는 C/EBPα및 GLUT4의 real-time PCR을실시한결과를나타낸그래프이다. 도 6은 Adiponectin 및 ADD1/SREBP1c의 real-time PCR을실시한결과를나타낸그래프이다. 도 7은 Resistin 및 ap2의 real-time PCR을실시한결과를나타낸그래프이다. 도 8은 PPAR-γ의 real-time PCR을실시한결과를나타낸그래프이다. 도 9는 PPARγ 및 C/EBPα의웨스턴블롯분석결과를나타낸것이다. [0069] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명을실시예및실험예에의해보다상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하는것일 뿐본발명의내용이하기실시예에한정되는것은아니다. [0070] 제조예 1 : (1S,2S,3S,4S)-5- 아미노사이클로펜탄 -1,2,3,4- 테트라올의제조 [0071] [0072] ( 가 ) (2R,3S,4S)-2,3,4- 트리스 ( 벤질옥시 )-6- 페닐헥스 -5- 엔 -1- 올 ( 화학식 2) 의합성 무수 DMSO (3.38 ml, mmol) 와무수 THF (53 ml) 의혼합용액에 0, 질소충전조건에서 NaH (1.14 g,

12 72.16 mmol, 60% in mineral oil) 를넣고실온에서 1시간동안교반한후, 0 에서 BnPPh 3 Cl (11.1 g, mmol) 을가하고실온에서 2시간동안교반하였다. 0 에서, (3R,4R,5R)-3,4,5-트리스( 벤질옥시 ) 테트라하이드로-2H-피란-2-올 (4.0 g, 9.52 mmol) 을상기에서생성된혼합액에가하고 45 에서 2시간동안교반하였다. 그후, 혼합물을냉각시키고 EtOAc (50 ml) 로희석한다음, NH 4 Cl 포화수용액, brine으로세척하였으며, 그후 에무수 MgSO 4 로건조시키고감압농축하였다. 이로부터얻은잔사를컬럼크로마토그래피를실시하여 (2R,3S,4S)-2,3,4- 트리스 ( 벤질옥시 )-6- 페닐헥스 -5- 엔 -1- 올을 80 % (Z:E = 3.4:1) 의수율로수득하였다. [0073] [ 화학식 2] [0074] [0075] R f = 0.37 (Hexane/EtOAc 3:1); [α] D (c 1.0, CHCl3 ); Z isomer: 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) δ 3.68 (t, 1H, J = 5.0 Hz), 3.73 (dd, 1H, J = 12.0, 5.0 Hz), 3.77 (dd, 1H, J = 12.0, 5.0 Hz), 3.94 (t, 1H, J = 5.0 Hz), 4.29 (d, 1H, J = 11.5 Hz), 4.31 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.48 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.56 (d, 1H, J = 11.5 Hz), 4.69 (dd, 1H, J = 10.0, 5.0 Hz), 5.81 (dd, 1H, J = 12.0, 10.0 Hz), 6.90 (d, 1H, J = 12.0 Hz), (m, 20H); 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) δ 61.42, 70.67, 71.97, 74.19, 74.47, 79.45, 81.17, , , , , , , , , , , , , , , , ; E isomer: 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) δ 3.64 (dt, 1H, J = 6.5, 4.0 Hz), 3.82 (d, 2H, J = 4.0), 3.96 (dd, 1H, J = 6.0, 4.0 Hz), 4.24 (dd, 1H, J = 7.5, 4.0Hz), 4.45 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.53 (d, 1H, J = 11.5 Hz), 4.63 (d, 1H, J = 11.5 Hz), 4.70 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.76 (d, 1H, J = 11.5 Hz), 4.88 (d, 1H, J = 11.5 Hz), 6.26 (dd, 1H, J = 16.0, 7.5 Hz), 6.43 (d, 1H, J = 16.0 Hz), (m, 20H); 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) δ 61.31, 70.35, 71.86, 74.19, 74.55, 78.82, 81.01, , , , , , , , , , , , , , , , , , ; HRMS (FAB) Calcd for C 33 H 35 O 4 [M+H + ] , found [0076] [0077] ( 나 ) (3S,4R,5R)-1- 페닐헵타 -1,6- 디엔 -3,4,5- 트리일 ) 트리스 ( 옥시 ) 트리스 ( 메틸렌 ) 트리벤젠 ( 화학식 3) 의합성 (2R,3S,4S)-2,3,4- 트리스 ( 벤질옥시 )-6- 페닐헥스 -5- 엔 -1- 올 (2.28 g, 4.61 mmol) 의무수 CH 2 Cl 2 (18 ml) 용액에 Dess-Martin periodinane (5.87 g, mmol) 을 0 에서가하고, 실온에서 1.5시간동안교반하였다. 그후반응혼합물을 CH 2 Cl 2 로희석하고 NaHCO 3 포화수용액, brine으로세척한다음무수 MgSO 4 로건조시키고감압농축하였다. 수득한알데하이드는정제과정없이다음반응으로진행시켰다. MePPh 3 Br (4.94 g, mmo l) 의무수 THF (15 ml) 용액에 NaHMDS (13.83 ml, mmol) 를넣고 0 에서 1시간동안교반한후, 알데하이드를 0 에서천천히가하고실온에서 15분동안교반시켰다. 반응혼합물을 EtOAc로희석하고 H 2 O와 brine 으로세척한다음무수 MgSO 4 로건조시키고감압농축하였다. 이로부터얻은잔사를컬럼크로마토그래피를실시하여 (3S,4R,5R)-1-페닐헵타-1,6-디엔-3,4,5-트리일) 트리스 ( 옥시 ) 트리스 ( 메틸렌 ) 트리벤젠을 56 % (Z:E = 3:1) 의수율로수득하였다

13 [0078] [ 화학식 3] [0079] [0080] R f = 0.38 (Hexane/EtOAc 15:1); [α] D (c 1.0, CHCl3 ); Z isomer: 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) δ 3.87 (dd, 1H, J = 6.5 Hz), 4.04 (dd, 1H, J = 8.0, 4.0 Hz), 4.13 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.22 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.47 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.55 (m, 2H), 4.84 (dd, 2H, J = 11.5, 11.5 Hz), 4.98 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 5.25 (dd, 1H, J = 11.5, 10.0 Hz), (m, 2H), 6.89 (d, 1H, J = 11.5 Hz), (m, 20H); 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) δ 70.06, 70.37, 73.84, 74.54, 81.84, 82.76, , , , , , , , , , , , , , , , , , , ; E isomer: 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) δ (m, 1H), 4.08 (dd, 1H, J = 9.0, 4.0Hz), (m, 2H), 4.43 (dd, 2H, J = 4.5, 11.5Hz), (m, 2H), (m, 2H), (m, 2H), (m, 20H); 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) δ 70.36, 70.93, 72.71,75.46, 80.23, 84.54, , , , , , , , , , , , , , , , ,138.56, , ; HRMS (FAB) Calcd for C 34 H 35 O 3 [M+H + ] , found [0081] [0082] ( 다 ) 벤질 (3S,4S,5R)-4,5- 비스 ( 벤질옥시 )-1- 페닐헵타 -1,6- 디엔 -3- 일카바메이트 ( 화학식 4) 의합성 (3S,4R,5R)-1- 페닐헵타 -1,6- 디엔 -3,4,5- 트리일 ) 트리스 ( 옥시 ) 트리스 ( 메틸렌 ) 트리벤젠 (3.6 g, 7.34 mmol) 의무 수 THF (29 ml) 용액에 CSI (1.95 ml, mmol) 와 Na 2 CO 3 (3.5 g, mmol) 을넣고 0 에서 24 시간동 안교반하였다. 그반응혼합물에 25 % Na 2 SO 3 (10 ml) 를넣고실온에서 24시간동안교반한후, EtOAc를넣어희석하고 H 2 O와 brine으로세척하였다. 그다음무수 MgSO 4 로건조시키고감압농축하였다. 이로부터얻은잔사를컬럼크로마토그래피를실시하여벤질 (3S,4S,5R)-4,5-비스( 벤질옥시 )-1-페닐헵타-1,6-디엔-3-일카바메이트를 80 % (Z:E = 2.6:1, anti:syn = 18:1) 의수율로수득하였다. [0083] [ 화학식 4] [0084] [0085] R f = 0.28 (Hexane/EtOAc 8:1); [α] D (c 0.1, CHCl 3 ); 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) δ (br, 0.56H), 3.80 (t, 0.72H, J = 7.0 Hz), (m, 0.72H), 4.29 (d, 0.28H, J = 11.5 Hz), 3.39 (d, 0.72H, J = 11.5 Hz), 4.47 (d, 0.28H, J = 11.5 Hz), 4.54 (d, 0.72H, J = 11.5 Hz), 4.57 (d, 0.28H, J = 11.5 Hz), 4.61 (d, 0.72H, J = 11.5 Hz), 4.63 (d, 0.28H, J = 11.5 Hz), 4.67 (d, 0.72H, J = 11.5 Hz), 4.77 (d, 0.28H, J = 11.5 Hz), 4.89 (br, 0.28H), (m, 2H), 5.25 (t, 0.72H, J = 8.0 Hz), (m, 2H), 5.76 (dd, 0.72H, J = 10.5, 10.0 Hz), (m, 1H), 6.17 (dd, 0.28H, J = 15.5,

14 Hz), 6.49 (d, 0.28H, J = 15.5 Hz), 6.63 (d, 0.72H, J = 10.5 Hz), (m, 20H); 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) δ 50.32, 66.87, 70.47, 70.53, 74.49, 81.12, 81.34, 83.20, 83.50, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ; HRMS (FAB) C 35 H 36 NO 4 [M+H + ] , found [0086] [0087] ( 라 ) 벤질 (1S,4R,5S)-4,5-비스( 벤질옥시 ) 사이클로펜트-2-에닐카바메이트 ( 화학식 5) 의합성벤질 (3S,4S,5R)-4,5-비스( 벤질옥시 )-1-페닐헵타-1,6-디엔-3-일카바메이트 (3.13 g, 5.87mmol) 의무수톨루엔 (59 ml) 용액에 Grubbs Catalyst (0.24 g, 0.29 mmol) 을가하여 80 에서 4시간동안교반시켰다. 그후, 셀라이트 (Celite) 를통해여과및농축시킨다음, 컬럼크로마토그래피를실시하여벤질 (1S,4R,5S)-4,5-비스( 벤질옥시 ) 사이클로펜트-2-에닐카바메이트를 75 % 의수율로수득하였다. [0088] [ 화학식 5] [0089] [0090] R f = 0.18 (Hexane/EtOAc 4:1); [α] D (c 0.1, CHCl3 ); 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) δ 4.02 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 4.30 (dd, 1H, J = 5.0, 2.5 Hz), 4.64 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.65 (d, 1H, J = 12.0 Hz), (br, 1H), 4.72 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.79 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 5.12 (s, 2H), 5.29 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 6.05 (dd, 1H, J = 6.0, 2.0 Hz), 6.09 (dd, 1H, J = 6.0, 3.0 Hz), (m, 15H); 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) δ 54.65, 66.88, 72.31, 72.58, 78.42, 80.03, , , , , , , , , , , , , ; HRMS (FAB) Calcd for C 27 H 28 NO 4 [M+H + ] , found [0091] [0092] ( 마 ) 벤질 (1S,2S,3R,4S,5S)-2,3- 비스 ( 벤질옥시 )-4,5- 디하이드록시사이클로펜틸카바메이트 ( 화학식 6) 의합성 벤질 (1S,4R,5S)-4,5- 비스 ( 벤질옥시 ) 사이클로펜트 -2- 에닐카바메이트 (0.45g, 1.06 mmol) 의 80 % 아세톤용액에 50 % NMO(0.33 ml) 와 OsO 4 (1 crystal) 를가하여실온에서 3 시간동안교반시켰다. 그후에 EtOAc 를넣어희석 시키고 10 % NaHSO 3, Brine 으로세척한다음, 무수 MgSO 4 로건조시키고감압농축하였다. 이로부터얻은잔사를 컬럼크로마토그래피를실시하여벤질 (1S,2S,3R,4S,5S)-2,3- 비스 ( 벤질옥시 )-4,5- 디하이드록시사이클로펜틸카바 메이트를 82 % 의수율로수득하였다. [0093] [ 화학식 6] [0094]

15 [0095] 25 R f = 0.36 (Hexane/EtOAc 1:2); [α] D +7.3 (c 0.44, CHCl3 ); 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) δ 1.82 (br s, 1H), 3.09 (br s, 1H), (m, 3H), 4.17 (dd, 1H, J = 5.5, 4.5 Hz), 4.23 (br d, 1H, J = 3.0 Hz), 4.52 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.68 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.76 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 4.79 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 5.14 (d, 1H, J = 12.5 Hz), 5.10 (d, 1H, J = 12.5 Hz), 5.62 (d, 1H, J = 6.0 Hz), (m, 15H); 13 C NMR (125 MHz, CDCl 3 ) δ 58.34, 67.35, 72.63, 73.27, 73.59, 76.42, 77.58, 84.59, , , , , , , , , , , , ; HRMS (FAB) Calcd for C 27 H 30 NO 6 [M+H + ] , found [0096] [0097] ( 바 ) (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올 ( 화학식 7) 의합성벤질 (1S,2S,3R,4S,5S)-2,3-비스( 벤질옥시 )-4,5-디하이드록시사이클로펜틸카바메이트 (0.17 g, 0.38 mmol) 의 MeOH (3 ml) 용액에 6N HCl (1.5 ml) 를가하고, 10 % Pd/C 촉매, 수소가스조건하에실온에서 24시간동안교반시켰다. 그후에셀라이트로여과시키고농축한다음, 이온흡착교환수지를이용하여크로마토그래피를실시하여 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올을 95 % 의수율로수득하였다. [0098] [ 화학식 7] [0099] [0100] R f = 0.16 (CH 2 Cl 2 /MeOH 1:2); [α] D (c 1.0, MeOH); 1 H NMR (500 MHz, D2 O) δ 3.46 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 3.96 (t, 1H, J = 5.0 Hz), 4.00 (dd, 1H, J = 6.5, 6.0 Hz), 4.19 (t, 1H, J = 7.0 Hz), 4.22 (dd, 1H, J = 5.5, 4.5 Hz); 13 C NMR (125 MHz, D 2 O) δ 57.19, 67.83, 71.83, 73.85, 76.39; HRMS (FAB) Calcd for C 5 H 12 NO 4 [M+H + ] , found [0101] [0102] 실험예 1-1 : 3T3-L1 지방전구세포의준비 3T3-L1 지방전구세포는한국생명공학연구원으로부터얻어이용하였다. 3T3-L1은지방세포의대사과정을연구하는실험에널리이용되는것으로, 상기세포의분화가활발할수록지방세포내의지방축적이활발하여비만을유도하게된다. 항비만효과를가질것으로생각되는물질을상기세포에처리하였을때, 세포의분화가적을수록항비만효과가큰물질인것으로볼수있다. [0103] [0104] 실험예 1-2 : 3T3-L1 지방전구세포의지방세포로의분화유도 마우스전구지방세포인 3T3-L1 을 10 % BCS DMEM 배지를넣고 37, 5 % CO 2 의조건에서배양하였다. 3T3-L1 전구지방세포를 24 well plate에 /well의세포수로분주한후, 100 % confluency 시점이되자 2일동안더유지시켰다. 전구지방세포는 MDI (0.5 mm 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 um dexamethasone, 1 ug/ml 인슐린 ) 를포함하는 10% FBS DMEM 배지로지방세포분화를 2일동안유도하였고, 배양 48 시간후, 1 ug/ml 인슐린이함유된 10 % FBS DMEM으로이틀동안배양하였다. 그후 2일마다 4일동안 10 % FBS DMEM 배

16 양액으로교체하였다. 지방세포분화를유도하는동안제조예 1 에서제조한 (1S,2S,3S,4S)-5- 아미노사이클로펜 탄 -1,2,3,4- 테트라올시료를 60, 80 및 100 um 의농도로각배양에처리하였고, 분화가완성되는시점인 8 일째 에지방세포분화정도를관찰하였다. [0105] [0106] 실험예 1-3 : 오일레드 O (Oil red O) 염색및분석지방의축적정도를확인하기위해오일레드 O 염색을실시하였다. 상기실시예 1-2에서유도한지방세포의분화정도를오일레드 O 염색을통해 1차적으로현미경을통해확인하였고, 지방세포염색정도는 510 nm 흡광도에서세포의분화된지방의양을측정하였다. 그결과를도 1 및도 2에나타내었다. 도 1 및도 2로부터 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올시료를넣지않은경우에서부터 60, 80 및 100 um를넣은경우까지점차유의적으로억제효과가증가하는것을확인할수있었다. [0107] [0108] 실험예 2 : 세포독성실험 3T3-L1 세포를 96 well plate 에 /well 개를분주하여 37, 5 % CO 2 의조건에서하루동안배양하였다. 24 시간후 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올시료를각각 20 um, 40 um, 60 um, 80 um 및 100 um의농도로처리하여 24시간동안배양한후 MTT를통해세포독성을확인하였다. ELISA를통해 540 nm 흡광도에서측정하였으며, 그결과를도 3에나타내었다. 도 3을참고하면, 농도에따른세포독성은유발되지않은것으로관찰되었다. [0109] [0110] 실험예 3 : PPAR-γ의전사활성분석 HEK 293T cell에 pgl3-ppre luciferase reporter 유전자와 PPARγ, prl-sv-40 플라스미드를트팬스펙션 (transfection) 하였다. 유전자들을하루동안발현시킨후세포에 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄- 1,2,3,4-테트라올시료 60, 80 및 100 um과 PPARγ 유도물질인 10 um Troglitazone을 24시간동안함께처리하였다. 그후, (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올시료에의한 PPARγ의전사활성정도를 luciferase 발현강도를통해관찰하였으며, 그결과를도 4에나타내었다. 도 4로부터시료의농도가 0 um에서 100 um이되면서 PPAR-γ의전사활성이점차적으로감소됨을확인할수있었다. [0111] [0112] 실험예 4 : Real-time PCR 지방세포로분화단계에서 C/EBPα와 PPARγ는분화된지방세포에서발현양이증가한다. 대부분의아디포카인 (adipokine) 들의발현도증가하게된다. 지방세포분화유도방법과같이 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄 -1,2,3,4-테트라올시료를 60, 80 및 100 um 농도로처리한후 8일동안분화를시켜 C/EBPα와 PPARγ, 지방세포분화에관여하는유전자들 ( 표 1) 의발현정도를 Real-time PCR로확인하였다. 분화가완벽하게일어난 3T3-L1 세포를 PBS로두번세척한후, cell pellet을모아 RNA prep kit를사용하여 RNA만분리하였다. 추출된 RNA를 1 ug 사용하여 cdna를합성한후 SYBR green과 primer를이용하여 Real-time PCR을수행하였으며, 대조군유전자로는 GAPDH를사용하였다. 각각의 C/EBPα와 PPARγ, 지방세포분화에관여하는유전자들의발현정도의결과를도 5 내지도 8에나타내었다. 도 5 내지도 8로부터, 대체로 0 um에서 100 um로농도가증가하면서농도에유의적으로 C/EBPα와 PPARγ, 지방세포분화에관여하는유전자들의발현이억제됨을확인할수있었으며, 특히 ap2의경우에는 60 um만처리한경우에도유전자발현이크게억제되었음을확인할수있었다. [0113] Gene name Forward primer Reverse primer GAPDH GAGTCAACGGATTTGGTCGT GACAAGCTTCCCGTTCTCAG PPARγ CGCTGATGCACTGCCTATGA AGAGGTCCACAGAGCTGATTCC C/EBPα AGGTGCTGGAGTTGACCAGT CAGCCTAGAGATCCAGCGAC GLUT4 CTTCTTTGAGATTGGCCCTGG AGGTGAAGATGAAGAAGCCAAGC Adiponectin AGCCTGGAGAAGCCGCTTAT TTGCAGTAGAACTTGCCAGTGC 표

17 ap2 CATGGCCAAGCCCAACAT CGCCCAGTTTGAAGGAAATC ADD1/SREBP1c CAAACTGCCCATCCACCGAC TGCCTCCTCCACTGCCACAA Resistin TCAACTCCCTGTTTCCAAATGC TCTTCACGAATGTCCCACGA [0114] [0115] 실시예 5 : 웨스턴블롯분석 (Western blot assay) 지방세포분화유도방법과같이 3T3-L1 세포에 (1S,2S,3S,4S)-5-아미노사이클로펜탄-1,2,3,4- 테트라올시료를이틀간격으로처리한후세포를 PBS로두번세척하였으며, RIPA buffer (50 mm Tris-HCl, ph 8.0, 150 mm sodium chloride, 1 % NP-40, 0.5 % sodium dexycholate, 0.1 % sodium dodecyl sulfate, protease inhibitor) 를이용하여세포를용해시켰다 rpm에서 30분동안원심분리하여단백질을추출정량하고, 8 % SDS-PAGE gel을이용하여전기영동을수행하였다. 전기영동된 protein들을 membrane에이동시킨후 5 % skim milk를포함하는 TBST로 blocking 하였다. 1차항체 (PPARγ, C/EBPα) 와 2차항체로반응시킨후 ECL을통해 PPARγ 및 C/EBPα 단백질을규명하였으며, 그결과를도 9에나타내었다. 도면 도면 1 도면

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