대한치과보존학회지 : Vol. 33, No. 4, 2008 자기장저속냉동보관법을이용한쥐치아치주인대세포의활성도검사 ABSTRACT 안현정 김의성 * 김진 김덕원 김기열 이찬영 이승종연세대학교치과대학보존학교실 EVALUATION OF THE VIABILITY OF PERI

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준홍 구
4 years ago
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1 ABSTRACT 안현정 김의성 * 김진 김덕원 김기열 이찬영 이승종연세대학교치과대학보존학교실 EVALUATION OF THE VIABILITY OF PERIODONTAL LIGAMENT CELL IN RAT TEETH USING SLOW CRYOPRESERVATION METHOD WITH MAGNETIC FIELD Hyun-Jung Ahn, Eui-Seong Kim*, Jin Kim, Duck-Won Kim, Ki-Yeol Kim, Chan-Young Lee, Seung-Jong Lee Department of Conservative Dentistry, Yonsei University, Seoul, Korea The purpose of this study was to evaluate the viability of periodontal ligament cell in rat teeth using slow cryopreservation method with magnetic field through MTT assay and TUNEL test. For each group, 12 teeth of 4 weeks old white female Sprague-Dawley rat were used for MTT assay, and 6 teeth in TUNEL test. The Maxillary left and right, first and second molars were extracted as atraumatically as possible under tiletamine anesthesia. The experimental groups were group1 (immediately extraction), group 2 (cold preservation at 4 for 1 week), group 3 (rapid cryopreservation in liquid nitrogen), group 4 (slow cryopreservation with magnetic field of 1 G), and group 5 (slow cryopreservation). F medium was used as preservation medium and 10% DMSO as cryoprotectant. After preservation and thawing, the MTT assay and TUNEL test were processed. One way ANOVA and Scheffe method were performed at the 95 % level of confidence. The value of optical density obtained after MTT analysis was divided by the value of eosin staining for tissue volume standardization. In both MTT assay and TUNEL test, it had showed no significant difference among group 3, 4, and 5. And group 3 had showed higher viability of periodontal ligament cell than group 2. From this study, slow cryopreservation method with magnetic field can be used as one of cryopreservation methods. [J Kor Acad Cons Dent 33(4): , 2008] Key words: TUNEL, Periodontal ligament cell, MTT, Magnetic field, Cryopreservation - Received , revised , accepted * Corresponding Author: Eui-Seong Kim Department of Conservative Dentistry College of Dentistry, Yonsei University 134 Shinchon-Dong, Seodaemun-Ku, Seoul, , Korea Tel: Fax: andyendo@yuhs.ac Ⅰ. 서론 치아상실부위를대체하는방법으로임플란트, 치아이식, 보철치료가있으며이중치아이식은치주인대세포의생활력이유지되어골결손부에이식시골이자연생성되는장점을가지고있다 1). 그러나심한인접치우식이나교정치료 이논문은 2007 년정부 ( 교육인적자원부 ) 의재원으로한국학술진흥재단의지원을받아수행된연구임 (KRF E00508) 332

2 의전략상치아이식에제공될치아를미리발거하여이식이필요할때사용할수없는경우몇달이상치아를외부에서보관할수있는냉동보관법이유용한방법이다 2). 세포를장기간보관하는방법에는저온냉동법과냉동보존법이있다. 저온냉동법은얼음이어는온도전까지온도를낮춤으로써세포대사율을감소시켜세포를보관하는방법으로심장과같은전체기관의단기간보존에흔히사용된다. 전체기관의단기간운송중에는저온냉동법으로보존하는것이낫다 3). 냉동보존법은세포를장기간보관할때많이사용되지만세포를냉동보존하는과정이나다시원상으로복귀시키는해동과정중에세포를손상시킬수있다는문제점이있다 3). 그래서세포의냉동보관시손상을줄이기위한여러시도가있었는데특히동해방지제의사용과다양한냉동방법의개발을들수있다. 동해방지제는냉동시전해질의농도를감소시키고낮은온도에서삼투압에의한세포수축의양을감소시킨다. Dimethyl sulfoxide (DMSO) 는 glycerol 과함께침투성동해방지제로많이사용된다. 이것은세포막을통과해서세포내의 DMSO-NaCl-water 용액의상평형상태를변화시켜냉동점이하의온도에서세포내얼음의형성으로상대적으로높아진염의농도를낮추어세포손상을방지한다 4). 또한세포내얼음형성을막아세포막파괴를방지한다 5). 그러나동해방지제의농도가증가하면독성이생기는문제점이있다 6). 세포를 -196 의액화질소에서바로얼리는급속냉동방법은급속한온도변화에의해서조직과세포가파손되는경우가많아이를줄이기위한프로그램냉동방법에관하여다양한시도가있었다. Kawasaki 등 6) 은치아를냉동시 -7 까지는 -1 /min, -40 까지는 -6.6 /min, -80 까지는 -0.5 /min 의속도로냉동되는속도조절냉동기를사용하여냉동했을때정상치아와유사한결과를보였음을보고하였다. 최근일본에서는온도조절기와미소자장을이용하여얼음을균일하게얼리는프로그램냉동고가개발되었다. 미소자장을걸어주면핵내, 세포내, 세포외와냉동보존액의물분자가각각자장에의해진동하고보통의빙점보다낮은온도에서과냉각상태가유지된다는이론에근거한다. 또한자기장에의해물분자와의거리가일정하게유지되어과냉각된치아와냉동보존액이빙점을통과시동시에얼게된다. Kawata 7) 는쥐치아를이용하여 -30 까지 15 ma 로자기장을걸어 -0.5 /min 속도로냉동한후 -150 에 3 일간보관했을때급속냉동을하는것보다좋은결과를보였음을보고하였다. 이전의연구에서는냉동시사용된자기장의세기를정확하게기술하지않았고액화질소를이용한급속냉동법과저속냉동법및냉장보관법으로냉동시치주인대세포의활성도를비교하지않았다. 이에본연구에서는치주인대세포를 1gauss (G) 의자기장을 이용한저속냉동보관법, 저속냉동법, 급속냉동법, 냉장보관법으로냉동시치주인대세포의활성도를비교하고자하였다. 세포의활성도를측정하기위한검사로 Tetrazoliumbased colorimetric assay (MTT) 가유용하게사용된다. MTT검사는살아있는세포에있어미토콘드리아에있는탈수소효소가노란색의수용성의 tetrazolium salt [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide](mtt) 를물에녹지않는어두운보라색 formazen 침전물로전환시키는능력에착안하여사용하는방법이다. Kim 등 8) 은쥐치아를냉동후재식했을때 MTT 검색법으로치주인대세포의활성도를평가하여조직학적소견과비교시일치함을보고하면서 MTT 검색법은치주인대세포의활성도를평가하는데유용한방법이라고하였다. 본연구에서도 MTT 검사를이용하여치아에붙어있는치주인대세포의활성도를평가하고자하였다. 또한 MTT 검색법과병행하여냉동후치주인대세포의활성도를평가하는방법으로 Terminal deoxynucleotidyl transferase(tdt)-mediated dutp-biotin nick end labeling (TUNEL) 검사를이용하였다. 냉동과해동은필연적으로세포사멸과관련된유전자전위와 DNA 분절의증가와같은손상을야기하는데 9) TUNEL 검사는이것을면역화학적기법에의해신호를증폭한후관찰하는방법이다. 본연구의목적은흰쥐의상악대구치를발거후 1G의자기장을이용한저속냉동보관법을이용하여냉동한후치주인대세포의활성도를저속냉동법, 급속냉동법, 냉장보관법과비교하여평가하는데있다. 1. 실험대상및전처치 Ⅱ. 연구재료및방법 생후 4 주된암컷 Sprague-Dawley 계흰쥐를사용하였고발치를용이하게하기위해 0.4% β-aminoproprionitrile (β-apn, Sigma, St. Lousis, MO, USA) 를발치전 3 일간공급하였다. 마취는 Tiletamine (Zoletil50, Virbac, Carros, France) 을이용하여 1 cc 정도를피하주사하여시행하였다. 마취가유도된후조직겸자를이용하여치관을잡고협구개측으로최소한의외상을가하면서발치를시행하였으며흰쥐의상악제 1, 2 대구치를발거하였다. 2. 실험군의분류 실험에사용한보관용액으로 F medium 은 Dulbeco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL, NY, 333

3 USA) 과 Ham s nutrient mixtures F12 (Gibco-BRL, NY, USA) 를 3:1 의비로섞고 10% fetal bovine serum (FBS) 와항생제 ; penicillin (100 units/ μl ), streptomycin (100 μl / ml ), fungizone (0.3 μg / ml ) (Gibco- BRL) 을첨가하여제조하였다. 동해방지제로는 10% DMSO (Sigma Chemical Co., St.Louis, USA) 를사용하였다. 가. 실험군분류 1 군 : 즉시발치군치아를발거하자마자 PBS ( 직접제조 ) 에세척한후실험에이용하였다. 2 군 : 냉장군치아를발거하고 F medium 가 1 ml담긴 2 ml튜브에담아 4 냉장고에 1 주일간보관하였다. 3 군 : 액화질소군치아를발거한후 2.5%, 5%, 7.5% DMSO 에 5 분씩담근후 10% DMSO 와 F medium 1 ml가담긴 2 ml냉동튜브에넣어액화질소에넣어 -196 까지급속냉동하였다. 4 군 : 자기장군치아를발거한후 2.5%, 5%, 7.5% DMSO 에 5 분씩담근후 10% DMSO 와 F medium 1 ml가담긴 2 ml냉동튜브에넣어 21.7 ma, 60 Hz, 1 gauss 의자기장이발생되는코일중심부안쪽에위치시킨후냉동고 (SD-108, Korea Y.O.T.,Ltd, Incheon, Korea) 에넣고 -20 까지 -0.3 /min 의속도로서서히냉동한후 -196 까지액화질소에넣어급속냉동하였다. 5 군 : 저속냉동군치아를발거한후 2.5%, 5%, 7.5% DMSO 에 5 분씩담근후 10% DMSO 와 F medium 1 ml가담긴 2 ml냉동튜브에넣어냉동고에넣고 -20 까지 0.3 /min 의속도로서서히냉동한후 -196 까지액화질소에넣어급속냉동하였다 나. 냉동군의해빙방법급속냉동한치아 (3, 4, 5 군 ) 를액체질소냉동고에서꺼내 37 수욕조에넣어해빙하였다. 해빙후치아를꺼내어치아를 7.5%, 5%, 2.5%, 0% DMSO 가함유된각각의 F medium 용액에 5 분간씩담궈 DMSO 를제거한후실험에사용하였다. 3. [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT) 검사 각군당 12 개의치아를발거하여 60 개의치아를 MTT 검색법에사용하였다. 실험군의처리가끝난뒤에 96-well plate 에 MTT 용액 (0.05 mg / ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 200 μl를넣고각군별치아를 MTT 용액이있는 well 에담았다. 치아가담긴 96-well plate 를알루미늄호일에싼후 3 시간동안 37 회전진탕기에서배양하였다. 3 시간후 96-well plate 를꺼내어 MTT 용액에담궈진치아를꺼내어 DMSO 150 μl 를넣은 well 에치아를옮기고 15 분간회전진탕하여형성된 MTT formazan 결정을녹여내었다. 15 분후치아를제거하고 Dynatech MRX ELISA microplate reader (Dynatech laboratories, Chantilly, VA, USA) 에넣고 570 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 4. 치아치근면에붙어있는치주조직의양측정 실험에사용된치아의치근면에붙어있는치주조직의양을정량적으로측정하기위해 MTT 검색실험후각군의 well 에서제거된치아를각군별로 96-well plate 에치아를넣고 eosin (Accustain, Sigma-Aldrich chemie, Gmbh, Germany) 350 μl 를첨가하여 12 시간정도담궈서염색을한후치아를제거하고 1% acid alcohol (70% ethyl alcohol, 1% HCl) 350 μl 이든 96 well plate 에넣은뒤 30 분간담가두어치근면에염색된치주조직을탈색시켰다. 치아를각각의 96-well plate 에서꺼낸다음탈색된 well 내의용액을 microplate reader 에넣고 530 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 5. Terminal deoxynucleotidyl transferase(tdt)- mediated dutp-biotin nick end labeling (TUNEL) 검사 각실험군에의해준비된치아를 4% paraformaldehyde 가든 2 ml튜브에담근후조직을고정하여보관하였다가탈석회화한후파라핀에포매하였다. 4 μm두께로조직을절편한후 silane coating slide (Muto pure chemicals., Ltd, Tokyo, Japan) 에고정하였다. 각조직슬라이드를 Tris-HCl 용액 (ph 8.0) 에서 10 분동안전처리하고 20 분간 proteinase K (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 로처리하여조직을 digestion 하였다. PBS 용액으로수세한뒤 3% hydrogen peroxide 로조직에있는 peroxidase 를불활성시킨후 PBS 로다시수세하였다. 면역조직화학적관찰을위한양성대조군에대해 DNA buffer 로

4 분간전처리하고 DNaseⅠ(F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland) 으로 20 분간반응시켜인위적으로 DNA 를단편화시켰다. 그다음 Transferase-mediated deoxyuridin triphosphated (TdT, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) buffer 에서 15 분간전처리한후 Terminal deoxytransferase 와 Biotin-16-2'-deoxyuridine-5'-triphosphate (dutp, F.Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland) 로 37 에서 2 시간 30 분동안반응시켜 dutp 를표지하였다. 음성대조군에서는 TdT 효소를처리하지않았다. TB buffer 에서 10 분간담가서반응을중지시킨후에 2% Bovine serum albumin (BSA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 로 15 분간 blocking 하였고, PBS 로수세후 streptavidinperoxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 로 30 분간반응시켜 3, 3 -diaminobenzidine (DAB, Vector laboratories, Inc. Burlingame, CA, USA) 로발색시켰다. 대조염색은 nuclear fast red 를이용하였으며다시 70%, 90%, 100% 에틸알코올로탈수하여봉입하였다. TUNEL 검사에양성인치주인대세포의각조직슬라이드에서 400 배크기의현미경 (Vanox-S; Olympus, Tokyo, Japan) 시야에서임의로세부분을지정하여양성세포수와전체세포수를계산하여백분율을구하였다. 6. 통계처리 MTT 처리와 eosin 염색에서얻은흡광도는대조군과각실험군의차이를 SPSS 12.0 을이용한 ANOVA 를사용하여분석하였으며사후검정으로는 Scheffe 의방법을썼다. TUNEL test 를시행한결과는 SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) 을이용한 one way ANOVA 를사용하여분석하였으며사후검정으로는 Scheffe 와 Tukey HSD 방법을사용하였다. Ⅲ. 결과 1. MTT 값을 Eosin 염색값으로나눈비율 치근면단위면적당치주인대세포의활성도를나타내는 MTT/Eosin 비율은모든군에서즉시발치군보다통계적으로유의하게낮은세포활성을보였으며 (p < 0.05) (Figure 1) 자기장군과액화질소군, 저속냉동군간에는통계학적으로유의한차이가없는것으로나타났다 (Figure 1). 그러나냉장군은모든군들과통계학적으로유의한차이를보이며 (p < 0.05) 가장낮은치주인대세포의활성을보였다. Figure 1. MTT/Eosin ratio. 1: immediately extraction 2: cold preservation at 4 3: rapid cryopresevation in liquid nitrogen 4: slow cryopreservation with magnetic field of 1G 5: slow cryopreservation : p < Figure 2. Average and standard deviation of percentage of positive cells by TUNEL test. 1: immediately extraction 2: cold preservation at 4 3: rapid cryopresevation in liquid nitrogen 4: slow cryopreservation with magnetic field of 1G 5: slow cryopreservation : p <

ANOVA 를시행한결과자기장군은즉시발치군보다통계학적으로유의하게많은세포사멸을보였다 (p < 0.

그러나냉장군은다른모든군들과통계적으로유의한차이가있었고세포사멸의정도가가장심했다 (p < 0.

Micrograph of experimental groups by TUNEL test.

5 2. TUNEL test 각실험군당 6 개의치아를이용하여정상세포수에대한양성세포수의비율을구해각군별로평균및표준편차를구해 one way ANOVA 를시행한결과자기장군은즉시발치군보다통계학적으로유의하게많은세포사멸을보였다 (p < 0.05). 또한자기장군은세포사멸에있어서액화질소군, 저속냉동군과통계적으로유의한차이가없었다. 그러나냉장군은다른모든군들과통계적으로유의한차이가있었고세포사멸의정도가가장심했다 (p < 0.05) (Figure 2). A B C D E Figure 3. Micrograph of experimental groups by TUNEL test. Arrow shows positive cell. A. immediately extraction ( 400). B. cold preservation ( 400). C. rapid cryopreservation ( 400). D. slow cryopreservation with magnetic field ( 400). E. slow cryopreservation ( 400). 336

6 각실험군별로 400 배크기의현미경시야에서양성세포를관찰했을때즉시발치군은양성세포가거의관찰되지않았으며대조적으로냉장군에서는진하게염색되는양성세포가가장밀집되어있음을관찰할수있었다 (Figure 3). 자기장군과저속냉동군, 액화질소군에서는양성세포가국소적으로분포함을관찰할수있었다 (Figure 3). Ⅳ. 총괄및고안 치아를장기간보관하는방법으로냉동보존법이사용될수있다. 이경우치주인대세포는냉동과정중에손상을받게된다. 냉동시치주인대세포의생존율을가장높일수있는조건으로농도단계별로적용한 10% DMSO 를동해방지제로사용하고 -4 에서 -35 사이의온도에서는 -0.3 /min 의저속냉동을하며그이하의온도에서는액화질소에넣어급속냉동을한뒤해동시에는급속해동을하는것이라고 Schwartz 등이보고한바있다 9). -35 이상의온도에서는세포내부에얼음이형성되지않고세포외부의냉동상태에따라수축하게되어저속냉동으로냉동하면세포가손상을적게받는다 10). 본실험에서는자기장군과저속냉동군을냉동시킬때사용한냉동고가최저 -20 까지내려가는기능을가지고있어 -20 까지는 0.3 /min 의저속냉동을하였으며 -20 이하의온도에서는 -196 로급속냉동하였다. 비록동해방지제로 10% DMSO 를사용하였지만냉동전온도가 -20 였고, -20 와 -35 사이의온도에서급속냉동되었기때문에세포내얼음의급격한증가로손상을받았을것으로생각되며이로인해본실험에서저속냉동군의세포활성이급속냉동을한액화질소군과통계학적으로유의한차이를보이지않았을것으로사료된다. 최근일본에서는치아를냉동시치주인대세포의손상을줄이기위해자기장을이용한프로그램냉동고를사용하여좋은결과를보였다고보고하였다 7). 자기장의작용원리는세포의주된구성성분이물분자로되어있고수소원자는약한 (+) 전하를띄며산소원자는상대적으로 (-) 전하를띄고있는극성분자이기때문에전자기장을걸어주면물분자는전자기장과나란해지려고회전하게되어물분자의운동에너지가물분자들이결합하려고하는반데르발스결합에너지보다크게되어온도가내려가도얼지않고과냉각되어있다가더낮은온도에서균일하게얼게된다 11). 냉동기술에있어서자기장을이용하는것은심장과같은장기의냉동후해동시전체장기의온도가동시에같이상승할수있도록 300 MHz 이상의자기장을걸어조직을균일하게가열하는데이용되었다. 장기를열전도방식에따라가열하면조직가장자리의온도는올라가지만중심부는냉동된상태라기계적인스트레스와파절이발생하게된다. 낮 은주파수의자기장을걸면침투깊이가깊고균일한열이들어가게된다. 주파수가 300 MHz 이상이되면물분자를진동시켜에너지를침착시키며결과적으로온도가상승하게된다 12,13). 본연구에서는물분자를진동시키되열발생을최소화해야하기때문에열발생효과가없는극저주파인 60 Hz 의주파수를사용하여자기장을발생시켰다 12). Kaku 등 14) 은이러한자기장을이용하여냉동고를생산하는회사인 ABI Corporation Ltd 와공동작업으로 Cell Alive System (CAS) 을개발하였으며 75 ma 의자기장을이용한프로그램냉동고를사용하여냉동시세포활성이가장높았다고보고하였다. CAS 에의한냉동은세포를자기장환경안에넣어미약한에너지를가해물분자를진동시켜결정화를억제해과냉각상태를유지하며세포전체를동시에냉동하게되는방법을사용한다고설명한다. 치아를냉동시킬때 Kawata 7) 의실험에서는 15 ma 세기의자기장을이용했고 Kaku 등 14) 의연구에서는 75 ma 세기의자기장을걸었다고만기술했다. 그러나일반적으로자기장의세기는전류의크기에비례하나거리에반비례하여급격히감소하기때문에 11) 이런기술로는정확히몇가우스의자기장이작용했는지알수없다. 같은전류라도코일이감긴수나자기장이작용하는곳까지의거리에따라자기장의세기가달라지기때문이다. 본연구에서는 21 ma, 60 Hz 의자기장을발생시켜세포에가한자기장의세기는 1± 0.05 G 이다. 1G 는 80 A/m 이며 1 m 당 80A 의전류가걸린다는의미이며이세기의자기장은일상생활에서본다면지구자계는 G, 헤어드라이기를 15 cm의거리에서사용한다면 0.7G 의자기장이발생한다는것에비교할수있다 15). 본연구에서자기장을이용한저속냉동법으로치아를냉동시치주인대세포의활성도가액화질소를이용한급속냉동법및저속냉동법과통계학적으로유의한차이를보이지않았다. 이는향후자기장의세기의조절을통해냉동시치주인대세포의활성도를높일수있는연구가필요하리라사료된다. 치아를냉동한후치주인대세포의활성을검사하는방법들중본연구에서사용한 MTT 검색법은냉동후세포활성도를측정하는검사로유용하게사용되어왔다 8,16,17). MTT 검색법은간편하며대부분의세포에적용이가능하고큰규모의실험에도사용할수있다는장점이있다. 또한실험의재현성이높아신뢰성이높은검사방법이다. In vitro 상의치주인대세포의활성도를검사하는방법들은수집된치주인대세포가치주인대세포의실제상태를반영하지못하고있으며수집된세포의성질이배양기간이나배양전단계에서변할수있다는단점을가지고있다 18). 그러나본실험에서는 96 well plate 에잠길정도로작은쥐치아를이용한 in vivo MTT 검색법을이용하여쥐치아치주인대세포의활성도를측정할수있었다 8). 337

7 치아가냉동과해동과정을거치게되면치주인대세포는세포사멸과관련된유전자전위와 DNA 분절의증가와같은손상을받게된다 10). 이러한세포사멸도를표지하는방법으로 TUNEL 검사가있다. 세포사멸 (apoptosis) 은 1972 년 Kerr 등에의해처음으로도입된개념으로괴사 (necrosis) 와는감별되는세포사망의한형태로괴사가 DNA 파괴전에세포막의소실이일어나는것이특징인반면, 세포사멸은 DNA 파괴후세포막이소실되며그병리소견으로는세포핵의분열, 염색체의응결및세포질의응축, 세포사멸체 (apoptosis body) 의형성등의특징적인양상을동반한다 19). 또한건강한조직이방사선조사, 항암제및세포독성물등 DNA 파괴성요인에노출되는경우세포사멸이발생되는것으로보고되어있다 20). 그러나 TUNEL 방법의문제는조직에따라양성, 음성의구분이명확하지않게되는경우가있다는것과 DNA 가분해되는상황즉세포손상후 DNA 가수리되거나세포괴사가되는경우에도모두양성으로나올가능성이있다는단점에도세포사멸을표지하는최적의방법으로이용되고있다 21). 사람치아를냉동한후치주인대세포의 DNA 손상을 MTT 분석과 TUNEL 검사로측정한시도도있었다. Oh 등 17) 은치아를발거후치근의치주인대세포를긁어관찰한군과액화질소에넣어 1 주일보관후해동한군에서 TUNEL 검사및 MTT 분석을시행한결과두군에서유의할만한차이를보이지않음으로급속냉동방법이유용함을보였다. 본연구에서도치아를냉동후치근에붙어있는치주인대세포의활성을검사했을때 TUNEL 검사와 MTT 검색결과모두자기장군, 액화질소군, 저속냉동군이유사한세포활성도를보였고냉장군에서세포활성도가가장낮은결과를얻었다. 본연구에서시행한자기장저속냉동보관법은쥐치아치주인대세포의활성에있어서저속냉동법과액화질소를이용한급속냉동법과유사한결과를보였다. 그러나치아를급속냉동시에는치아의파절과같은경조직손상이가해지므로자기장을이용한저속냉동보관법은급속냉동법보다치아를냉동보관하는데적합한방법이리고사료된다. Ⅴ. 결론 본연구는흰쥐상악대구치를발거후자기장하저속냉동법을이용하여치아냉동시치주인대세포의활성도를 MTT 검색법과 TUNEL 검사를이용하여측정하고자하였고다음과같은결과를얻었다. 1. 각실험군당 12 개치아에대하여 MTT 검사를시행하여나온흡광도를치근면의 eosin 염색을통해얻은흡광도로나눈값에서자기장군은즉시발치군보다세포활성이떨어졌으나액화질소군, 저속냉동군과유사한 세포활성을보였고냉장군보다높은세포활성도를보였다 (p < 0.05). 2. 각실험군당 6 개의치아에대하여 TUNEL 검사를시행하여단위면적당양성세포수를세어백분율을구해통계분석을시행한결과자기장군은즉시발치군보다세포사멸도가높았으며저속냉동군과액화질소군과는유사한세포사멸도를보였고냉장군보다세포사멸도가낮음을보였다 (p < 0.05). 이상의결과로자기장저속냉동보관법은쥐치아의세포활성에있어서저속냉동법과액화질소를이용한급속냉동법과유사한결과를보이나치아를급속냉동시에는치아의파절과같은경조직손상이가해지므로자기장을이용한저속냉동보관법은급속냉동법보다치아를냉동보관하는데있어적합한방법이라고사료된다. 참고문헌 1. Kristerson L, Johansson LA, Kisch J, Stadler LE. Autotransplantation of third molars as treatment in advanced periodontal disease. J Clin Periodontol 18: , Schwartz O. Cryopreservation as long-term storage of teeth for transplantation or replantation. Int J Oral Maxillofac Surg 15:30-32, Rubinsky B. Principles of low temperature cell preservation. Heart Fail Rev 8: , Lovelock JE, Polge C. The immobilization of spermatozoa by freezing and thawing and the protective action of glycerol. Biochem J 58: , Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol 247: C , Kawasaki N, Hamamoto Y, Nakajima T, Irie K, Ozawa H. Periodontal regeneration of transplanted rat molars after cryopreservation. Arch Oral Biol 49:59-69, Kawata T. Tooth transplantation by teeth bankapproach to human- Hiroshima. Thesis. Department of Orthodontics, Hiroshima University School of Dentistry Kim ES, Jeon IS, Kim JW, Kim J, Jung HS, Lee SJ. An MTT-based method for quantification of periodontal ligament cell viability. Oral Dis 13: , Schwartz O, Andreasen JO, Greve T. Cryopreservation before replantation of mature teeth in monkeys(ii). Effect of preincubation, different freezing and equilibration rates and endodontic treatment upon periodontal healing. Int J Oral Surg 14: , Ashwood-Smith MJ. Low temperature preservation of cells, tissues and organs. Pitman Medical 19-45, Stuart M. Wentworth. Fundamentals of electromagnetics with engineering application. 2 nd ed, Science & Technology, Chicago, p , Marsland TP, Evans S, Pegg DE. Dielectric measurements for the design of an electromagnetic rewarming system. Cryobiology 24: , Monica W, Martin R, David P. Vitrification of large tissues with dielectric warming: biological problems and some approached to their solution. Cryobiology 48: ,

8 14. Kaku M, Kamata H, Kawata T. Cryopreservation of PDL cells by use of program freezer with magnetic field for tooth banking. Dent Jpn 43:82-86, RAPID Report, home.htm. 16. Jeon IS. Evaluation of periodontal ligament cell viability in rat teeth according to various extra-oral dry time using MTT assay and a histologic verification. PhD Thesis. Yonsei University, Graduate School Oh YH, Che ZM, Hong JC, Lee EJ, Lee SJ, Kim J. Cryopreservation of human teeth for future organization of a tooth bank-a preliminary study. Cryobiology 51: , Ashkenazi M, Sarnat H, Keila S. In vitro viability, mitogenicity and clonogenic capacity of periodontal ligament cells after storage in six different media. Endod Dent Traumatol 15: , Fischer S, Maclean AA, Liu M, Cardella JA, Slutsky AS, Suga M, Moreira JF, Keshavjee S. Dynamic changes in apoptotic and necrotic cell death correlate with severity of ischemia-reperfusion injury in lung transplantation. Am J Respir Crit Care Med 62: , Kerr JF. History of the events leading to the formulation of the apoptosis concept. Toxicology 27: , , Park SY, Kim EY, Cui XS, Tae JC, Lee WD, Kim NH, Park SP, Lim JH. Increase in DNA fragmentation and apoptosis-related gene expression in frozen-thawed bovine blastocysts. Zygote 14: ,

9 국문초록 안현정 김의성 * 김진 김덕원 김기열 이찬영 이승종연세대학교치과대학보존학교실 본연구의목적은흰쥐상악대구치를발거하여자기장저속냉동보관법을이용하여냉동시치주인대세포의활성도및세포사멸도를 MTT 검색법과 TUNEL 검사를이용하여측정하고자하였다. 4 주령의암컷 Sprague-Dawley 계흰쥐의상악좌우제 1,2 대구치를발거하여각군당 12 개의쥐치아를 MTT 검색에이용하였고 6 개의치아를 TUNEL 검사에이용하였다. 실험군은 5 개군으로대조군은즉시발치군이며 4 냉장고에서 1 주일간보관한냉장군, 발치후동해방지제처리과정을거쳐 -196 의액화질소에넣어급속냉동한액화질소군, 21.7 ma, 60 Hz, 1 G 의자기장을이용하여 -0.3 /min 의속도로 -20 까지냉동후 -196 로급속냉동한자기장군, -0.3 /min 의속도로 -20 까지냉동후 -196 에급속냉동한저속냉동군으로나누었다. 보존액은 F medium 을사용했으며동해방지제로 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) 를사용하였다. 치근면을단위면적으로표준화하기위해 MTT 측정값을 Eosin 염색후 530 nm 에서측정한흡광도값으로나누었다. TUNEL 검사시각조직슬라이드에서 400 배크기의현미경시야에서임의로세부분을지정하여정상세포수와양성세포수를세어그비율을계산하여각실험군당평균치를구하였다. 통계분석을위해 one way ANOVA 를시행하였으며사후검정으로 Scheffe 와 Tukey HSD 방법을썼으며결과는다음과같다. MTT 검색에의한흡광도를 Eosin 염색후측정한흡광도로나눈값에서는자기장군은즉시발치군보다낮은세포활성을보였고 (p < 0.05) 액화질소군, 저속냉동군과는통계적으로유의성있는차이를보이지않았다. 그러나자기장군은액화질소군, 저속냉동군과함께냉장군보다는높은세포활성도를보였다 (p < 0.05). TUNEL 검사결과도자기장군은즉시발치군보다치주인대의세포사멸도가높았으나 (p < 0.05) 저속냉동군과액화질소군과는통계적으로유의한차이를보이지않았다. 자기장군은냉장군보다세포사멸도가낮았으며냉장군은모든군중에서세포사멸도가가장높았다 (p < 0.05). 주요어 : TUNEL, MTT, 냉동보존, 저속냉동, 자기장. 치주인대세포 340

012임수진

012임수진 Received : 2012. 11. 27 Reviewed : 2012. 12. 10 Accepted : 2012. 12. 12 A Clinical Study on Effect of Electro-acupuncture Treatment for Low Back Pain and Radicular Pain in Patients Diagnosed with Lumbar