[지에프씨생명과학] 보고서 인쇄용( _수정).hwp

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1 발간등록번호 농림축산식품부

2 농림축산식품부장관귀하 본보고서를 수출전략기술개발사업 ( 개발기간 : ~ 의최 종보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 지에프씨 주관연구책임자 : 강희철세부 ( 협동 ) 연구책임자 : 이대영민은실김규일곽정원 국가연구개발사업의관리등에관한규정제 18 조에따라보고서열람에동의 합니다.

3 보고서요약서 과제고유번호 해당단계 연구기간 ~ 단계구분 3/3 단위사업 농식품기술개발사업 연구사업명 사업명 수출전략기술개발사업 대과제명 ( 해당없음 ) 연구과제명 세부과제명 태극삼, 흑삼, 인삼지상부를이용한수출국맞춤형연구를통한 고부가가치제품개발 연구책임자연구기관명및소속부서명위탁연구 정부 : 1,000,000 천원해당단계총 : 25명해당단계민간 : 333,400 참여내부 : 25명연구개발비천원연구원수계 : 1,333,400천원정부 : 3,000,000천원총연구기간총 : 25명참여내부 : 75명총연구개발비민간 : 1,000,200천원연구원수계 : 4,000,200천원참여기업명 ( 주 ) 지에프씨 ( 주 ) 지에프씨, 국립원예특작과학원, ( 주 ) 네추럴에프앤피, 진안홍삼연구소 ( 재 ), 고려인삼제조주식회사연구기관명 : 연구책임자 : 요약 ( 연구개발성과를중심으로개조식으로작성하되, 500자이내보고서면수 로작성합니다 )

4 국문요약문 최종목표 코드번호 D-01 - 인삼수출국맞춤형제품개발로인삼수출활성화도모 1. 인삼부산물을이용한기능성소재개발 가. 인삼부산물의기능성소재연구 농가로부터인삼부산물원료확보 인삼재배농가컨설팅및계약재배추진 제품생산에따른기업, 농가간상생협력방안구축 연구의 목적및내용 나. 화장품소재로서의인삼부산물의활용연구 인삼부산물로부터화장품활성성분분리, 동정및정량분석시스템확립 인삼부산물로부터발효조건시스템확립 새로운 zebrafish 배아모델시스템을이용한미백효능및안전성평가시스템확립 새로운멜라닌생합성저해제의기전연구 인삼부산물지상부및발효물을이용한주름개선전임상연구 인삼지상부를이용한화장품소재연구 수출형기능성화장품개발연구 중화권 ( 대만또는중국 ) 제품수출및국내수요처발굴을위한마케팅전략수립 다. 기능성식품소재로서의인삼부산물의활용연구 인삼열매의맞춤형유효성분추출기술및소재화기술개발 인삼열매추출물의원료화 동물모델을이용한기능성평가 ( 간기능개선 ) 인삼열매추출물의인체시험시제품제작및제품화 인삼열매추출물의개별인정허가및제품화 인삼열매추출물의고부가가치제품수출활성화마케팅전략수립 2. 태극삼, 흑삼을활용한수출형건강기능식품개발 가. 태극삼및흑삼의표준제조방법연구 태극삼및흑삼의제조공정개발 태극삼및흑삼추출물제조, 제품제조공정확립 태극삼및흑삼의지표성분및이화학적특성규명 태극삼및흑삼추출물의성분분석및표준화, 안정성확보 나. 태극삼및흑삼의기능성연구 태극삼, 흑삼의세포수준의기능성평가 ( 항스트레스, 혈행개선 ) 동물수준의기능성평가 ( 항스트레스, 혈행개선 )

5 대만또는중국수출국가국민대상인체적용시험 ( 항스트레스, 혈행개선 ) 태극삼추출물의혈행개선기능성 ( 개별인정형 ) 확보를위한동물시험추진 태극삼추출물의혈행개선기능성 ( 개별인정형 ) 확보를위한인체적용시험추진 다. 태극삼및흑삼을활용한제품개발 흑삼, 태극삼시제품제조 태극삼추출물의개별인정형원료ㆍ성분관련자료작성및신청 제품생산에따른기업, 농가간상생협력방안구축 연구개발성과 3. 데이터통합형지식관리시스템구축 지식기반연구및제품개발을위한웹시스템구축 태극삼, 흑삼의이화학적특성조사및기능성평가 - 태극삼, 흑삼제조표준화공정확립 - 태극삼, 흑삼제품제조관련특허출원 - 태극삼, 흑삼소재제품개발 국제인체적용시험 - 국제 ( 중국 ) 인체적용시험시험식품소재 : 태극삼, 흑삼기능성 : 2건 ( 혈행개선, 인지기능개선 ) 인삼열매추출물인체적용시험 - 간기능개선인체적용시험을통한기능성입증 태극삼인체적용시험 - 혈행개선관련기능성시험실시 인삼열매추출물식품제품개발 - 인삼열매추출물관련특허출원 - 인삼열매소재활용제품개발 인삼부산물의발효산물제조, 성분연구및전임상평가 - 인삼발효산물제조법특허 - 신규진세노사이드미백용조성물특허 - 인삼화합물분리방법내용외총 6건의기술거래 - 임상실험을통한화장품소재의안전성및기능성확인 - 인삼열매관련화장품소재및시제품제작 인삼부산물발효산물및태극삼화장품원료화 - 인삼잎 / 줄기 / 열매발효물의 CTFA 소재등록 / 한글전성분명등록 연구개발성과의활용계획 ( 기대효과 ) 기술적측면 - 고품질태극삼및흑삼제조를위한최적공정개발매뉴얼수립및신건강기능식품시장매출증대효과 - 태극삼, 흑삼등의특허분쟁시역사성, 유래등을제시하여선행기술자료로활용가능 - 기능성태극삼, 흑삼제품의활용범위확대 : 기능성평가를통한활성성분의지표물질로사용한 ginsegnoside의임상적효과를입증하여기존제품과차별화된고부가가치산업을창출할수있음

6 - 인삼부산물인열매및잎, 줄기로부터천연물유래기능성물질을선발하여 functional food의소재개발 - 인삼부산물인열매및잎줄기의활성기능성분을규명하여활성기작을밝히고과학적인근거로인한제품개발 - 저명전문학술지에연구결과게재하여기능성성분및활성공지및수출주도화 - 발효기법을이용한보다안전하고강화된진세노사이드고품격기능성식품소재로활용 경제적측면 - 과학적으로안전하고효능이있는식품임을증명하여경제적부가가치를향상시킬수있는초석이될수있음 - 참여기업에기술이전을실시하여산업화하고전국의홍삼및인삼제조관련업체에도홍보를통해기술이전을실시 - 해외에인삼의우수성을알리고, 수출을통한매출증대달성 사회적측면 - 태극삼, 흑삼가공제품도특정한약리효능을기대하는일종의기능식품임으로고기능성 고품질의태극삼, 흑삼제품개발은국내인삼산업발전은물론인류건강유지에중요한사업이될수있음 - 원천기술및특허확보로향후산업적으로다양한분야에적용이가능하며, 화장품등다양한분야에서신제형의개발이가능 - 인삼부산물을활용할목적으로개발된제품은기능성분함량이높아고부가식 의약, 화장품소재로적합하여새로운수요창출이가능함 - 개발기술을참여기업인인삼생산농협및생산농민에보급하여부산물유통활성화에기여함 - 인삼부산물상품화율제고로생산농민의소득증대에기여함 - 인삼부산물제품개발및홍보를통해생산농가및가공제품생산기업의경제적이윤확대 중심어 (5 개이내 )

7 코드번호 D-02 Final goal - Promotion of export of ginseng by development of customized products for exporting countries 1. Development of functional materials using ginseng by-products A. Study on functional materials of ginseng by-products Ginseng by-product raw material secured from farmhouse Consulting and cultivation of ginseng farmers Establishment of win-win cooperation plan between enterprises and farmers based on product production Purpose& Contents B. Use of ginseng by-products as a cosmetic material Establishment of separation, identification and quantitative analysis system of cosmetic active ingredients from ginseng by-products Establishment of fermentation condition system from ginseng byproduct Establishment of a whitening efficacy and safety evaluation system using a new zebrafish embryo model system Mechanism of new melanin biosynthesis inhibitors Wrinkle improvement pre-clinical study using ginseng by-product and fermented water Study of cosmetic materials using ginseng root Development of functional cosmetics for export Establish marketing strategy to export Chinese products (Taiwan or China) and find domestic demand C. Use of ginseng by-products as a functional food material Development of customized active ingredient extraction technology and materialization technology of ginseng fruit Raw materials of ginseng fruit extract Functional evaluation using an animal model (liver function improvement) Production and commercialization of human test prototype of ginseng fruit extract Individual approval and production of ginseng fruit extract Establishment marketing strategy for exports of high value-added products of ginseng fruit extract

8 2. Development of export-type health functional foods utilizing Taegeuk ginseng and black ginseng A. A Study on Standard Preparation Method of Taegeuk ginseng and Black ginseng Development of manufacturing process of Taegeuk ginseng and black ginseng Establishment of Taegeuk ginseng and black ginseng extract and product manufacturing process Identification of surface components and physicochemical characteristics of Taegeuk ginseng and black ginseng Analysis and standardization of ingredients of Taegeuk ginseng and black ginseng extract and secure stability B. Functional studies of Taegeuk ginseng and black ginseng Functional evaluation of cellular level of Taeguksang and black ginseng (anti-stress, blood circulation improvement) Functional evaluation at animal level (anti-stress, blood circulation improvement) Tests for human body application to Taiwanese or Chinese exporting nation (anti-stress, blood circulation improvement) Animal testing for securing blood circulation improving function (individual seal) of Taegeuk ginseng extract Propagation test for human body to secure blood circulation improvement function (individual seal) of Taegeuk ginseng extract Results C. Product development utilizing Taegeuk ginseng and black ginseng Manufacture of black ginseng and taegeum ginseng prototype Preparation and application of raw materials and ingredient data of individual Taegeuk ginseng extract Establishment of win-win cooperation plan between enterprises and farmers based on product production Physicochemical characterization and functional evaluation of Taegeuk ginseng and black ginseng - Establishment of Taeguksam and Black gum manufacturing standardization process - Patent application related to manufacturing of Taekgam and black ginseng products - Product development of Taeguk and black gums International human body test - International (China) human body test

9 Test food material: Taegeuksang, black ginseng Functionality: 2 cases (blood circulation improvement, cognitive improvement) Ginseng fruit extract human body application test - Liver function improvement Functional demonstration through human body application test Taegeuk ginseng human body application test - Conduct functional test for blood circulation improvement Development of ginseng fruit extract food product - Applied patent for ginseng fruit extract - Developed product utilizing ginseng fruit material Fermentation products of ginseng by-products, component studies and preclinical evaluation - Ginseng fermentation product manufacturing method patent - New patent for composition for ginsenoside whitening - Method of Separation of Ginseng Compounds Sixteen other technical transactions - Confirm safety and functionality of cosmetic materials through clinical experiment - Production of cosmetic material and prototype related to ginseng fruit Fermentation product of ginseng by-product and raw materials of Taeguk ginseng cosmetics - Registration of CTFA material of ginseng leaf / stem / fruit fermented product Technical aspects Expected Contribution - Establishment of optimal process development manual for manufacturing high quality Taegeuk ginseng and black ginseng and increase sales of new health functional food market - It can be used as prior art data by presenting history, origin, etc. in case of patent disputes such as Taegeuk ginseng and black ginseng - Expansion of application of functional Taegeuk ginseng and black ginseng product: It is possible to create high value-added industry differentiated from existing products by proving the clinical effect of ginsegnoside used as an indicator of active ingredient through functional evaluation - Selection of functional materials derived from natural products from

10 fruits, leaves and stems of ginseng byproducts to develop functional food materials - Identification of the active ingredients of the fruit and leaf stem of ginseng byproducts to reveal the active mechanism, - Publishes research results in famous professional journals, and promotes functional ingredients and active notification and export - Use of fermentation technique as safer and enhanced ginsenoside as high quality functional food material Economic aspects - It can be a cornerstone to improve economic value-added by proving that it is a scientifically safe and effective food. - Technology transfer to participating companies to industrialize, and technology transfer through public relations to red ginseng and ginseng manufacturing companies nationwide. - Promote excellence of ginseng in overseas and increase sales through export Social aspects Keywords - Taegeuk ginseng and black ginseng processing products are functional foods that expect specific pharmacological effects. Therefore, developing high quality and high quality Taegeuk ginseng and black ginseng products can be an important business not only for domestic ginseng industry development but also for human health maintenance. - It can be applied to various industrial fields in future by securing source technology and patent, and it is possible to develop new type in various fields such as cosmetics. - The products developed for the purpose of utilizing ginseng by-products are highly suitable for high value added foods, medicines and cosmetics due to high functional ingredient content, which can create new demand - Contributing to revitalization of by-product distribution by supplying development technology to participating nonghyup and producing farmers of ginseng - Contribution to income increase of the production farmers by enhancing the commercialization rate of ginseng - Increase economic profit of producing farmers and processing products through the development and promotion of ginseng

11 1. 연구개발과제의개요 1 2. 국내외기술개발현황 연구수행내용및결과 목표달성도및관련분야에의기여도 연구결과의활용계획등 연구과정에서수집한해외과학기술정보 연구개발성과의보안등급 국가과학기술종합정보시스템에등록한연구시설 장비현황 연구개발과제수행에따른연구실등의안전조치이행실적 연구개발과제의대표적연구실적 기타사항 참고문헌 401

12 영문목차 1. Introduction of research and development 1 2. Domestic and Overseas Technology Development Status Research Results and Results Achievement of goal and contribution to related field Use of research results Overseas science and technology information Security rating of R & D achievement Research facilities Performance of safety measure Representiative Research Result of R&D Other Matters Reference 401

13 1 장. 연구개발과제의개요 코드번호 D-03 1 절. 연구개발의목적 한 중 한 미 한 캐나다 등으로인한역수입대응및인삼산업을대중국 수출핵심산업으로육성하기위해서는원료표준화 제조공정표준화 첨단제형개발 중화 권국민을대상으로한인체적용시험등을통한기능성검증 신규건강기능식품등록등핵심기술에기반한글로벌제품개발이필요함 2 절. 연구개발의필요성 가 국내외인삼산업현황 국내인삼생산은최근건강에대한관심고조로재배면적및생산액등인삼산업규모확 대 재배면적 생산량 톤 생산액 억원 그림 국내인삼생산액 소비자소득증가에따라건강에대한관심이높아지고 인삼의효능에대한학술적검증 이확산되면서인삼소비가증가고있으며국내인삼소비량변화는 인증가함 세계인삼생산량은 만여톤 수삼기준 수준이며국가별생산량은중국 천톤 한국 천톤 캐나다 천톤 미국 천톤이며 국가별수출규모는캐나다 한국 미국 중국 홍콩 로조사됨 표 국가별수출규모 뿌리삼 구분 전체규모 천 캐나다 한국 미국 중국 홍콩

14 우리나라는인삼종주국 세계 위수준의많은생산량을기록하고있음에도불구하고세 계적으로인삼을이용한가장큰매출을올리는것은 로인삼원료에대한첨단분 석기법을이용한원료표준화기술을이용하여연매출 억불이상을기록하고있으며국내인삼류전체매출액보다도 배더큰규모임 인삼류수출은세계적인웰빙트렌드에따라증가추세이나수출국에대한임상시험 글로벌제형개발 가공표준기술개발등의부족으로성장세가둔화됨 수출액 백만불 중화권수출입현황을살펴보면수출은 년근홍삼위주로수출되고중국은뿌리삼의원 형을보아야만신뢰하는현황이며중국내에서뿌리삼은 년근홍삼만이의약품으로등록 됨 수출액 천불 점유율 일본 홍콩 대만 미국 중화권수출입전망은중국의경제발전에따른소득증가로약용뿐만아니라보건 미용 식품 음료등으로응용범위가확산되고있으며선물소비위주에서최근일반소비자들의 일상보건품으로소비증가로인삼수요증가하고중국산인삼류수입도시장접근물량 을중심으로늘어날전망이며수입품목은주로백삼정과백삼분으로수입액은약 백만불임 연도별인삼제품시장규모는 백만불로증가추세임 지역시장 잠재 수요점유율 유럽및중동 아시아 북미 남미 아프리카 오세아니아 합계 표 국가별인삼제품시장규모 한 중 한 미 한 캐나다 등으로인한역수입대응및인삼산업을대중국 수출핵심산업으로육성하기위해서는원료표준화 제조공정표준화 첨단제형개발 중화 권국민을대상으로한인체적용시험등을통한기능성검증 신규건강기능식품등록등핵심기술에기반한글로벌제품개발이필요함

15 나 국내외기능성식품및화장품시장현황 기능성식품사업의범위는인체에유용한기능성을가진원료나성분을사용하여제조 가공 을포함 한식품을의미 의약품과달리질병상태의치료가목적이아니라생체기능의활성화를통해질병발생위 험을감소시키거나건강유지 증진을목적으로함 기능성이라함은인체의구조및기능에대하여영양소를조절하거나생리학적작용등과같은 보건용도에유용한효과를얻는것을의미함 기능성식품산업의특성은원료로부터인체유용한기능성성분을추출또는정제가공하여 동물시험및인체적용시험등과학적 객관적자료를통해개별인정을받아건강기능식품으로제조 판매 유통되는가공식품을포함함 개별인정형기능성원료로인정받기위해서는원료의표준화 안전성 기능성에대한여러 가지시험평가가수반필요 기능성식품의세계시장현황및전망은글로벌기업의세계식품시장영향력점차증대 되고있으며세계식품시장의규모는약 조 천억달러 조원 로서연평균 로지속적인확대예상 세계식품시장은 조달러 철강 조달러 보다약 배큰시장 인구증가및신흥개발국성장으로오는 년 조 천억달러 조원 년 조 천억 달러 조원 로성장전망 자료 영국리서치 컨설팅기관 그림 기능성식품산업의시장규모 글로벌기업들은과감한 투자와유통네트워크 브랜드파워등을통해식품시장점 유율확대 세계 대기업중식품회사는 개로 가 천 억달러 위 가 억달러 위 가 억달러 위 가 억달러 위

16 식품산업의패러다임변화로나노 바이오등을접목한응용기술이빠르게전개되고식품 의기능과영역확대로건강기능식품 바이오식품등 융복합개발이강조되는등건강 미 용 화장품 치료용 맞춤형 식품등의영역까지확대 년 억불세계기능성식품시장중 억불에달하는총 를미국이차지하는 것으로나타났으며 유럽은 억불 를차지 의자료에따르면 년세계시장규모는약 억불 로추정되며 연평균 의성장을기록 유럽역시웰빙트렌드의꾸준한확산에따라식료품시장에있어서도기능성식품소재및건강식품시장이소비트렌드를주도할것으로여겨짐 자료 그림 세계기능성식품시장현황 세계화장품시장규모는 억달러이상임 년세계화장품시장규모는 억달러로전년대비 증가 지역별시장규모는전년대비 성장한유럽이 억달러로가장큼 중동및아프리카는 억달러로 를차지했으나 연평균 증가로미루어볼때 향후전망은밝은것으로기대됨

17 지역별세계화장품시장규모 화장품산업분석보고서 지역 년 년 년 년 년시장규모 단위 백만달러 유럽 아시아 태평양 북미 중남미 중동 아프리카 합계 주 의자료를이용하여우리나라화장품유형위주로자료를분석함 는전년대비증가율이며 은연평균증가율 을 의미함 자료 세계화장품산업시장규모및성장률 년 년동안의화장품시장연평균성장률은 수준이며 향후전년대비세 계경제성장률이다소높아질것으로전망하고있어화장품산업성장률도영향을받을 것으로예상 400, , , , , , ,000 50, , , , ,0186, , , , , , , , , , ,7294, 년 2003 년 2005 년 2007 년 2009 년 2011 년 2013 년 (E)2015 년 시장규모 ( 백만 $) 전년대비증가율 (%) 자료 주 자료를이용하여우리나라화장품유형위주로자료를분석함 년이후년도의시장규모는 의추정치임

18 세계화장품시장규모및성장률 년화장품산업분석보고서 한국보건산업진흥원 화장품유형별세계시장 화장품유형별로는 시장이 억달러로전체시장의 를차지함으로써화장품시장에서가장큰점유율을나타내고있음 그림 년세계화장품시장세부유형별점유율 년화장품산업분석보고서 년국내식품시장규모는 조원으로국내총생산 조원 의 제조업총생산 조원 의 를차지하고있으며 년대비 년평균 증가추세 임 건강기능식품 표 식품 생명소재산업시장규모 생산액 성장율 자료 식품의약품안전처 식품및식품첨가물생산실적 단위 십억 개 건강지향적인사회트렌드에힘입어 년 억원에서 년에는 조 억원으로 배가량증가하였으며 건강기능식품수출액은 년 억원에서 년 억원 으로 증가추세임 건강기능식품생산액기준연평균성장률은 로국내총생산 제조업 보다높은성장률을보이고있음 건강기능식품산업성장추세는고령화사회로진입하고자기건강관리 에대한관심증가로수요확대가전망됨 건강기능식품연구및투자는국제적으로증가하고있는상태이며최근우리정부 차원에서도건강기능식품을고부가가치산업으로인지하고국가적차원에서의투자가 증가하는추세임

19 국가적국내연구활용도는높이기위하여정부의적극적인지원이필요함국제기능성 식품시장이급성장하면서한방의건강기능식품소재로각광을받고있는상태이며 다양한제품화기술수준이발달하고있음 국내전통소재를활용한제품지원을통하여국내대표육성지원국내의건강기능 식품관련연구및기술개발육성을위한지원전략및체계적인프로그램이필요하며 새로운소재에대한높은해외의존도를감소시켜야함 국내중소기업의건강기능식품시장진입을도울수있는프로그램이필요함 년한국화장품시장규모 전세계화장품시장 위 국가별로는미국이 억달러로전체시장에서 를차지하며일본 억달러 중국 억달러순으로집계됨 우리나라의 년화장품산업시장규모는 억달러세계시장 위 세계시장의 를차지함 전년대비성장률은브라질 중국 인도 등신흥국이세계화장품시 장평균성장률보다높게나타남 표 세계화장품시장점유율 ( 단위 : 백만달러, %) 순위 국가 년 년 년금액점유율금액점유율금액점유율 미국 일본 중국 브라질 독일 프랑스 영국 이탈리아 러시아 스페인 한국 인도 멕시코 캐나다 호주 합계 개국 자료 기능성화장품의세부유형별로는자외선차단 복합유형 주름개선 미백 순으로점유율이큰것으로나타났고 년이후복합유형의생산액이크게증가하였음

20 기능성제품군의생산규모는 년 조 억원으로 성장함에따라전체 화장품생산실적에서차지하는비중이 로기초화장용제품류다음으로큰비중을차지하고있음 최근 년 년 년 동안기능성화장품은 의높은성장률을기록하였으며 시장점유율에대한연도별변동폭이다른유형에비해크게나타나고있어기능성화장품에대한수요가급증하고있음을간접적으로보여줌 그림 기능성화장품세부유형별생산실적현황 식품의약품안전청 화장품생산실적자료 기능성화장품중에서도천연소재를이용한제품에대한요구가확대되어가고있음 국내천연소재유래기능성화장품개발현황및전망 웰빙 의바람과함께건강과외모를중요시하는현대인의요구와자연성 식물성 천연성을선호하는심리가크게작용하여 화장품업계에서도천연소재화장품의개발이매년성장을거듭하고있음 아름다음과건강한삶을추구하고자하는현대인의성향으로안전하면서도미용효과가 우수한천연소재화장품의사용이지속적으로확대되고있는추세임 따라서식물 추출물의신규효능개발과새로운활성성분의분리 천연원료의다양화와함께화장료의제형에대한연구개발도더욱활성화될전망임 본과제를통해인삼수출활성화를위한태극삼 흑삼에대한연구와인삼잎줄기열 매들을활용한고부가가치기능성제품을개발하고자함

21 다 인삼자원을활용한필요성 인삼을활용한기능성식품소재의개발 ㆍ 태극삼은홍삼전매제시행으로민간가공이허용되지않을때인삼을가공하던기술로끓는물에살짝데치고건조하여제조되었으나끓는물에데치는공정을위한별도의열탕시설이필요하고열탕으로인한유효성분손실등으로현재는제조하는곳이매우적으며열탕온도및방법이잘알려져있지않아홍삼을제조하기위해구축된증삼기를이용하여고품질태극삼을제조하는방법에대한연구가필요함 흑삼은제조자에의해숙지황처럼아홉번찌고아홉번말리는구증구포의방법으로제조되고있으나증숙온도및시간 건조온도및시간등의차이로인해품질이천차만별이며구증구포시산업생산성이급격히떨어지는단점을보완하기위한구체적이고표준화된제조방법의개발이필요함 흑삼에서흡입시폐암을일으키는 등급발암성물질인벤조피렌등이검출되어소비자

22 의신뢰에문제점을야기하고있어소비자가안심하고복용할수있도록유해물질에대 한품질안전관리를위한기준및검사법의개발이필요함 스위스제약회사인파마톤사에서개발한 진사나 는인삼에서추출한원료내진세노사이 드함량을표준화한추출물을이용해및세계시장에서 억불의최고매출을기록하고 있으며흑삼의고부가가치기능성제품개발을위해서는활성지표물질에대한검사법확립및성분표준화가필수적임 ㆍ 에서 라는 로검색을하면 개의논문 현재 이검색되지만이들논문중에서인삼및 에대한논문은 편에지나지 않고인삼의고열스트레스에대한논문은국내외에서발표된바없음 특히고온스트레스에대한인삼논문은전무한실정임 또한 특허를검색하면미국및 유럽특허가검색되고있으나모두천연물및인공화합물에대한것이고인삼에대한것 은전무한실정임 따라서항스트레스제는앞으로인터넷의발달로인한지능화 자동화 사회로진행되면서미래에대한불확실성증가 자동화로인한해고불안감 스트레스증가에따라그수요가증가될것임 이미한국도점차온난화의영향권내에들어서경상북도이북의식물작황지도가바 뀌고있으며기후변화에따른대응및남중국 동남아지방 아랍권역 남미등의새로운시장개척을위해서는고온스트레스에대한고려인삼의효능연구가절실히필요함 이를위해서는고온스트레스에대한고려인삼의효능을입증하기위해서는체계적인국 제논문게재와국내및해외임상시험이요구됨 또한과학논문게재를통해고려인삼 구매자및거래처에객관적인근거를제시함으로써고려인삼의종주국으로서위상및신뢰도가제고될것임

23 인삼을활용한기능성화장품소재의개발 인삼은우리나라를대표하는약용작물로 지용성성분 지질 지방산 정유 유기산 폴리아 세칠렌 페놀계화합물등 함질소화합물 알칼로이드 단백질 아미노산 펩티드등 탄수 화물 다당류 당류 당류 조섬유펙틴등 비타민등다양한성분들이존재 인삼의사포닌이라고잘알려진 는당부분 과비당부분 으로구성된배당체 화합물의일종으로서인삼의가장중요한약리활성성분으로인정되고있음 한다 과거에는인삼의뿌리뿐만아니라줄기 잎 꽃봉오리등을잘라차로제조해유통했다 는기록이있으나현대에와서는인삼의뿌리만을식용으로이용하여지상부에대한관심 이낮았으며대다수그냥버려지는폐자원으로전락하였다 하지만 최근분석기술의발전 에따라인삼의다양한부위의성분연구가진행되었고그결과인삼잎및줄기 열매에도인삼의뿌리와같은 가존재하는것이밝혀져주목을받고있음 연구결과에따르면 인삼의다른부분보다도인삼잎과열매에 의함량이 가장높다고보고되었다 인삼의잎에는인삼뿌리보다 배 인삼줄기보다 배이상 함량이존재하는것으로알려졌으며 종류비교해보았을때도 인삼뿌리에존재하는대다수의 가잎에존재하는것으로나타났다 더불어인 삼잎에는인삼뿌리의 배에달하는 와 배이상의 가함유되어있는것으로조사되었다 잎뿐만아니라인삼열매에는뿌리에비해 함량이 배이상많다고알려졌으며특히 는뿌리보다 배많다고밝혀졌음 년동안재배하여이용하여야하는인삼뿌리와는달리인삼의지상부위는매년봄 에싹을틔워가을철퇴화되는부위로연중이용이가능하다는점에서원활한원료공급이가능할수있음 노지에서재배하는인삼은병충해를막기위해많은양의농약을사용함으로써 인삼지상 부에많은양의농약이잔존할수있다 따라서잔존하는농약으로인하여화장품소재 및식품소재로의활용이제한적일수밖에없다 하지만수경재배인삼은묘삼을이용하 여 개월재배 무농약으로인하여농약으로부터안전하다는가장큰장점이있다 수경재배기술로인삼을재배함으로써무농약청정재배와연중생산이가능하고 년근크기 의수삼을 개월만에생산할수있음 인삼부산물을활용할목적으로개발된수경재배인삼은세계에서최초로개발된고속 생산기술로써뿌리 잎 줄기를모두활용할수있고기능성분함량도높아고부가 식 의약 화장품소재로적합하며새로운수요창출이가능함

24 수경인삼잎줄기에는사포닌함량이 뿌리에는 이들어있으며 잎에는 등함량이뿌리에비하여월등히높아기능성식품이나화장품소재로적합함 일만에생산한수경인삼은사포닌함량이 으로토양재배한 년생 수삼의사포닌함량 보다높음 그림 인삼종류별사포닌함량비교 그림 토양인삼과수경인삼의사포닌성분별함량비교 수경재배방식을통해생산한인삼의잎 줄기 뿌리등을식품원료로사용가능함을인정 식약청식품기준과 호 토지인삼으로활성이있는성분분리 동정및활성에관한연구가수행되어다소의연 구결과가보고되어있지만 수경재배인삼의잎줄기의활성성분의연구를거의이루어지지않고있음

25 하지만 잎의경우토지인삼과유사한활성성분패턴을보이고있으며특정진세노사 이드경우 정도많을것을확인할수있음 그림 노지인삼및수경재배인삼잎의분석 인삼부산물인열매에서다양한진세노사이드를분리하고동정하였음 그림 인삼부산물 열매 에서분리동정된진세노사이드

26 인삼열매부산물은과실이매우작고 조직이연약함에따라수확직후부터품질의변화 가빠르게진행됨에따라생과로서는 일정도유통이가능하나유통중품질저하가 심각하며 유통기간을연장하기위해냉동처리및저장관리기술이필요한실정임 인삼열매의부산물인과육은최근에생산량이매년증가하는추세에있어효과적으로 이를소비할수있는방안이필요함 인삼부산물인잎줄기는생체중일때수확을하면 인삼뿌리에영향을미치므로수확을하지못함 또한잔류농약의문제때문에식용으로금지되어있음 식품의약품안전처 따라서 연중재배가능하고 식약처에식품으로등록되어있는청정인삼잎줄기를이 용할수있는수경재배인삼잎줄기가기능성식품소재및화장품소재에효과적으 로이용될수있으므로이에대한기능성검증및제품화가필요함

27 3 절. 연구개발범위 제 세부 주 지에프씨 인삼부산물및발효산물을이용한피부탄력개선전임상연구 전임상연구결과를통한피부탄력개선관련매커니즘연구 인삼부산물및발효산물의피부탄력개선및미백전임상연구데이터를활용한화장품 소재개발및제품화 제품수출을위한마케팅전략수립 제 협동 농촌진흥청 농가로부터인삼부산물원료확보 인삼부산물로부터화장품활성성분분리 동정및정량분석시스템확립 인삼부산물로부터발효조건시스템확립 인삼재배농가컨설팅및계약재배추진 동물모델을이용한기능성평가 항비만 항당뇨 간기능개선 인지능개선등 새로운 배아모델시스템을이용한미백효능및안전성평가시스템확립 새로운멜라닌생합성저해제의기전연구 제 협동 주 네츄럴 인삼열매의맞춤형유효성분추출기술및소재화기술개발 인삼열매추출물의원료화 인삼열매추출물의인체시험시제품제작및제품화 지식기반연구및제품개발을위한웹시스템구축 인삼열매추출물의개별인정허가및제품화 제 협동 진안홍삼연구소 태극삼및흑삼의제조공정개발 태극삼 흑삼의지표성분및이화학적특성규명 태극삼 흑삼의세포수준의기능성평가 항스트레스 항치매성 항혈압 항산화 혈행개선등 동물수준의기능성평가 항목이상 대만또는중국수출국가국민대상인체적용시험 항목이상 제 협동 고려인삼제조 주 흑삼 태극삼추출물제조 제품제조공정확립 추출물의성분분석및표준화 안정성확보 흑삼 태극삼시제품제조 태극삼추출물의혈행개선기능성을확보하기위한동물시험추진 태극삼추출물의혈행개선기능성을확보하기위한인체적용시험추진 태극삼추출물의개별인정형원료ㆍ성분관련자료작성및신청 제품생산에따른기업 농가간상생협력방안구축

28 2 장. 국내외기술개발현황 절 제품및시장분석 코드번호 D-04 가 생산및시장현황 국내제품생산및시장현황 국내인삼시장은국내소비량의증가로생산액은 년도기준생산액이 억원에 해당되는것으로나타났으며 세계적인웰빙트렌드에따라향후국내산업규모도확대 될것으로전망하고있음 출처 농촌진흥청국립원예특작과학원 인삼인재개발교육자료 국내홍삼시장의경우에는 년도 억원을기준으로 년까지매년 억원 가량의성장세를이루다가 년부터 년까지는성장세가하락한것으로나타남 출 처 한국경제 불황에기운없는홍삼시장 국내홍삼주요업체로는정관장을가장많 은매출을올리고있으며 한삼인 천지양 동원 롯데헬스원이그뒤를잇고있음 출처 한국경제 정관장잡아라 한삼인 천지인 뜨거운추격전 년기능성화장품의생산액은 조 억원으로전년 조 억원보다 증가했으며 년에비해상대적으로자외선차단의비중은작아지고복합유형의비중 이증가 년에는복합기능성화장품생산액이전체기능성화장품중 억원 를차지하여가장높았으며 그뒤를이어자외선차단화장품이 억원으로전체 주름개선화장품이 원 미백화장품 억원 을차지한것으로분석 또한 년대비성장률도복합기능성화장품이 로가장높았으며 년이후 지속적성장세를이어감에따라소비자들의다기능상품에대한선호도고상승 미백제품이전체기능성화장품중차지하는비율이가장낮지만전년대비 증 가한데다 년이후지속적상승세를보이고있어향후기능성화장품중점유율이상 승할것으로예측됨 반면 자외선차단제품과주름개선제의 년대비성장률은각각 와 감소한것으로나타나그간지속적성장세가한풀꺽인것으로분석되었다 자료 대한화장품협회 화장품생산실적 각년도 표 기능성화장품생산실적 단위 억원 구분 년 년 년 년 년 자외선차단 복합유형 주름개선 미백 기능성화장품

29 표 기능성화장품연도별생산개수추이 단위 천개 미백 주름개선 자외선 복합 계 년 년 년 년 년 년 표 기능성화장품세부유형별점유율현황 단위 자료 대한화장품협회 화장품생산실적자료 각년도 국외제품생산및시장현황 인삼시장은크게뿌리삼시장과인삼제품시장으로양분할수있음 세계교역규모를통해본뿌리삼시장규모는 년 개국수출금액기준약 억 천만 달러이며 인삼제품 에대한시장잠재수요는 억 만달러규모임 뿌리삼의주요생산국은캐나다 한국 중국 미국등으로이들 개국이세계뿌리삼수출에 를차지함 주요수입국은홍콩 대만 일본 중국 싱가포르 말레이시아등아시아국가들임 이상출처 인삼류해외시장동향및수출확대여건 농수산물유통공사 년

30 년도수출동향 주수출시장인중화권의점진적재고물량해소에따라 년하반 기부터중화권수출이회복세로전환되고 국경절등명절수요증가로 월 일현재 전년대비 증가한 백만불수출 주요국가별수출실적 중국은국경절등명절수요 중국내인삼가격상승에따른재고확보차원의물량매집등의영향으로수출실적상승 전년동기대비 주요국가별수출실적 홍콩은국내수출업체들의적극적인시장개척과중국으로우회수출물량의집중으로수출확대중 전년동기대비 주요국가별수출실적 경기침체로인한소비위축등으로대만 일본 은여전히수출회복이더디나 미국 캐나다 베트남 등 선시 장은지속적인수출성장세를보이고있음 이상출처 인삼류수출동향 농수산식품수출지원정보 나 개발기술의산업화방향및기대효과 산업화방향 제품의특징 대상등 인삼의이용형태별로비중을보면전체인삼생산량중수삼용과가공용이각각 로비슷한수준임 가공제품별전체인삼생산량에서차지하는원료사용비중은홍삼용이 로대부분을차지하고있고 그외백삼용과태그삼용은각각 에불가함

31 용도별수삼원료사용비중의변동을비교해보면수삼용은전체생산량의 약 내외수준이나 가공용의경우홍삼용원료사용량의비중이급증하는추세임 인삼가공사업의가장큰특성은가공업체의영세성이므로현재인삼가공제품의대기업독과점시장구조가개발기술의산업화에많은한계점으로지적되고있음 인삼산업의급변하는환경에따라기회요인또한나타나고있어 인삼의안전성이확보이확보된다면인삼수요는지속적으로증가할것으로전망됨 또한인삼을원료로이용하는고품질건강식품산업화와최첨단제약산업화가활성화추세에있으며 수요와시장이확대될것으로전망됨 추진으로인삼수출시장을확대할기회가제공되고있어 합리적인한중 의협상타결에따른새로운수출시장개척가능성도있음 다음은좀더상세한우리나라인삼산업의 분석내용임

32 표 우리나라인삼산업의 분석 이상출처 신성장동력발굴을위한원예특작산업발전전략 한국농촌경제연구원 산업화를통한기대효과 항목 산업화기준 단위 백만원 차년도 차년도 차년도 차년도 차년도계 직접경제효과 경제적파급효과 부가가치창출액 합계 직접경제효과 본연구과제개발기술의산업화를통해기대되는제품의매출액추정치 경제적파급효과 본연구과제개발기술의산업화를통한농가소득효과 비용절감효과등추정치 부가가치창출액 본연구과제개발기술의산업화를통해기대되는수출효과 브랜드가치등추정치

33 절 특허 논문 제품 분석을통한연구추진계획 가 분석결과향후연구계획 특허 논문 제품측면에서연구방향제시 특허분석측면 인삼 홍삼 태극삼 흑삼의효능및기능분석과관련된국내특허는최근 년간대략 여건 은대략 여건출원된것으로조사되었음 조사된내용들을살펴보 았을때 기존특허는건강식품이나화합물의제조방법에관한내용들에치중되어있으 므로 본연구과제에서는효능및기능분석방법에초점을맞춰연구를추진하여태극삼 흑삼최적공정개발특허등을국내및국외에출원할계획임 농축산물유래화장품조성물특허출원현황을세부기능별로살펴보면 항산화와관 련된특허출원점유율 이가장높게나타났으며 미백 주름개선 등도상대적으로높은점유율을기록함 전반적으로 년에서 년사이에가장활발히출원된후점점감소함 자외선차단기능의농축산물유래화장품조성물특허는 년가장활발히출원된후점점감소함 미백 주름개선 항염증기능의농축산물유래화장품조성물특허는 년가장활발히출원된후점점감소함 보습기능의농축산물유래화장품조성물특허는 년가장활발히출원된후점점감소함 항산화 세포재생기능의농축산물유래화장품조성물특허는 년가장활발히출원된후점점감소함 그림 기능성별 연도별특허출원동향

34 특허출원증가율및점유율이상대적으로높은 사분면에위치한기능으로는보습 항 염증 주름개선 미백분야로다른기능에비해상대적으로출원이활발히이루지고있 는분야임 그림 전세계기능별특허출원점유율및증가율 전세계적으로미백에대한특허의점유율과증가율이증가하고있는반면우리나라의 미백뿐만아니라기능성화장품전반에대한특허가감소되고있다 따라서세계의흐 름에맞춰미백에대한연구를활발히진행해특허를발표를증가되어야할것으로사료된다 인삼에대한미백특허가대부분단순추출물에대한특허가대부분으로써본연구팀 은인삼에서단일유용물질을분리하여보다과학적이고신뢰성있는특허를제출할수있다 또한기존의미백에대한특허는 에서의활성만미백에대한특허가대부분이 나본연구팀은제브라피쉬를이용하여제브라피쉬의멜라닌합성이저해되는것을보 는 미백활성을이용하여특허를제출함으로써보다신뢰성있는미백활성특허가될것이다 논문분석측면 기존논문들은잘알려진특정인삼성분을중심으로약리또는영양학적효능과생 물학적활성매커니즘을확인하는데치중되어있으므로 본연구과제에서는새로운인 삼성분의발굴및이의포괄적응용방법을모색하는방향으로연구를수행하여기능성평가를통한논문등을국제힉술지및국내학술지 등재지 등에게재하고자하였다

35 기존대부분의논문은인삼에서단순추출한물질을이용하여멜라닌합성에저해효 과에관한결과들로구성된논문이대부분으로써본연구팀은인삼부산물로부터단일 유효물질을분리하여미백효과에관한메커니즘을밝힘으로써인삼농업에서대부분이폐기되는자원에대한활용가치를높이고자하였다 표 피부미백기작과활성물질들 미백활성에대한연구방법은대부분 방법으로국한되어있고 방법은아 직논문상에서흔하지않다 제브라피쉬를이용한전임상연구방법을이용하여기존의 연구논문과는차별화를두고 전임상미백활성실험을수행하여 와 연구방법에서모두효과를갖는신뢰성있는연구를실시하고자하였다 뿐만아니라현재화장품개발에있어서동물실험은사회적으로거부감이증가되고 있으며특히유럽연합의경우동물실험을통해개발된화장품의판매가제한되고있는 시점이다 따라서본연구팀은인공피부조직을이용한미백활성방법을통해전임상 의연구결과를뒷받침하고차후이를통해상품화가되었을때동물실험을대체할수있는결과로사용할수있다 자외선에의한색소침착의과정에있어서초기단계의자외선에의한염증은각질세포 에서멜라노사이트를자극하는전달물질의방출을유발하기때문에항염증효과를갖는 물질은색소침착의예방에유효한것으로고려된다 본연구에서는피부기능성확대연 구를통하여미백과관련된직접적인작용기전과더불어각질세포내에서이루어지는염 증성인자들의조절에관한연구가수반되어서미백과색소침착이라는좀더광범위한영역에서의미백효과에관한연구를수행하고자하였다 또한미백활성에대한전임상연구도 연구방법을이용한기존의연구논문과 는차별화를둔제브라피쉬를이용한방법으로전임상미백활성실험을수행하여보다 와 연구방법에서모두효과를갖는신뢰성있는연구를실시하였다

36 제품및시장분석측면 국내및국외시장분석결과홍삼관련제품등의생산및판매가이루어지고있으나 본연구과제에서는태극삼 흑삼의최적공정개발을통한소재의기능성평가 인체적용시 험을수출국가인대만또는중국에서연구를추진하여수출맞춤형제품등을생산하여국내및국외에판매할계획임 국내시장분석결과기능성화장품시장은꾸준한성장을이루어져왔다 기능성화 장품중미백화장품이차지하는비율이가장낮지만꾸준한상승세를보이고있으며 생산실적또한지속적으로증가되어왔다 또한복합유형의기능성화장품이증가됨으로인한미백물질의수요가증가될것이다 따라서다양한미백활성물질을확보하고또한독성과부작용이없는천연물유래의새로운미백활성물질을개발할필요성더욱증대되고있는상황이다

37 3 장. 연구수행내용및결과 1 절. 인삼부산물을활용한기능성화장품소재개발 코드번호 D 인삼부산물을활용한소재활용성검토 (1) 인삼부산물의확보 인삼재배 10 여개소농가로부터인삼열매과육 3.75 톤, 지상부 1 톤을확보함 그림 12. 인삼열매 ( 과육 ) 수확및과피액확보과정 그림 13. 인삼지상부수확및확보과정 - 확보한인삼과육및지상부를 ( 주 ) 지에프씨 (1 세부 ) 와 ( 주 ) 네추럴에프앤피 (2 협동 ) 에제공

38 2. 인삼잎 / 줄기를활용한기능성화장품소재개발 (1) 인삼잎 / 줄기등의인삼지상부의유효성분확인 - 본실험에서사용한인삼은노지인삼밭에서재배된 4년생으로잎과줄기, 열매, 뿌리로나누어분석시료를조제하였다. 인삼은부위별로약 g 무게를잰후 80% (v/v) 메탄올수용액을가하여 1시간동안환류추출을하였다. 추출액을 Whatman 여과지 (No. 42 filter paper) 로걸러낸후동일한방법으로추출을 2회수행하였다. 추출액은감압회전진공농축기로건조시켜용매를제거하였다. 용매가제거된추출물을 2차증류수에녹인후수포화부탄올을가하여 votex mixer로섞었다. 클로로필이함유된잎과줄기는 2 차증류수에녹인추출물에에칠아세테이트를가하여 vortex mixer로섞었다. 에칠아세테이트층을제거하고남은물층에수포화부탄올을가하였다. 그후과정은위에서기록한부탄올분획과정과동일한방법으로수행하였다. 2회에거쳐모아진수포화부탄올층을모아감압회전진공농축기로 50 에서용매를제거하였다. 건조된추출물은다시 100% HPLC grade methanol에녹여서 TLC 및 HPLC 분석에사용되어졌다. 가. TLC 분석 - TLC 분석에는 silica gel 60 F254 TLC plate (Merck, Germany) 를사용하였으며, 부탄올추출액을 TLC plate에 spotting한후 CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10 v/v/v, lower phase) 의혼합용매를이용하여전개하였다. 전개한 TLC plate는 10% H2SO4을분사시킨후열을가해발색시켜사포닌변환양상을관찰하였다. 나. High-performance liquid chromatography(hplc) 를이용한 ginsenosides 분석 - 분석시료는 HPLC grade methanol에녹여 0.2μm membrane syringe filter를이용하여여과하고 HPLC를통해분석되어졌다. HPLC에장착된컬럼은 C18 ( mm, ID 5 μm) 으로 UV/Visible detector 203nm에서검출되었다. 이동상 water와 acetonitrile은유속 1.0m/min로비율은표와같이하였다. Ginsenoside 함량은평균 ± 표준편차값으로표시되었다.

39 표 11. HPLC 분석이동상의 water 와 acetonitrile 비율조건 Time Percentage of water Percentage of acetonitrile initial 인삼의뿌리와잎, 줄기, 열매를각각같은조건으로추출한후 HPLC 분석한결과, 인 삼의모든부위에서모두인삼의 ginsenoside 가존재함을 chromatogram 을통해다시한 번확인하였으며는각각의 ginsenoside 함량은아래의표와같다. 그림 14. 인삼의부위별 ginsenoside 분석 chromatogram 표 12. 인삼잎, 줄기, 열매와뿌리의 ginsenoside 함량차이분석 (mg/g)

40 - 함량적차이를비교해보았을때잎과열매에서가장많은 ginsenoside가존재함을알수있었다. 뿌리의경우주로 ginsenoside Rb1과같은 PPD type의 major ginsenoside이가장많은비율을차지하는반면잎, 줄기, 열매에서는 ginsenoside Re, Rg1과같은 PPT ginsenoside의비율이높은것으로확인되었다. 특히 ginsenoside Re는뿌리에비하여 8.75 배에가까운양을가지고있어이를활용할경우다량의 ginsenoside를획득할수있을것으로기대되었다. 인삼의잎과열매에는높은함량의 PPT 타입 ginsenoside 뿐아니라많은양의 ginsenoside Rd가존재함을확인할수있었는데 Rd는인삼뿌리에도다량존재하는 PPD 타입의대표적인 ginsenoside로알려져있다. HPLC 분석을통해확인한인삼잎, 줄기, 열매의 ginsenoside는주로 ginsenoside Rd, Re 그리고 Rg1으로이들은모두인삼뿌리에도존재하는 major ginsenoside 종류이지만인삼잎, 줄기, 열매에훨씬많은함유량을가진다. 특히, 여러부위중열매및잎에가장많은 ginsenoside 함유량을가진것을확인하였으며이에따라본과제에서는이들부위를이용하여사포닌을정제하고이로부터화장품소재로서의효능을평가하여표준효능물질을발굴하고자하였다. (2) 인삼잎 / 줄기로부터 ginsenoside 의분리및동정 - 인삼지상부건조물 5kg을이용하여 70% 에탄올을이용하셔상온에서일주일간추출한후이를여과하고남은잔사에 70% 에탄올을추가로첨가하여다시일주일간추출하고이를여과한후 1,2차추출물을합하여감압농축하였다. 얻어진농축물을 EtOAc (3 L 3)/H2O (3 L) 로분배추출하였으며, EtOAc 층을제하고남은 H2O층을 n-buoh(2.8 L 3) 로추출하였다. 각층을감압농축하여 EtOAc, n-buoh 및 H2O 분획물을얻었다. - 얻어진분획물은 TLC 를확인하였으며, 유효성분을분리하기위하여 silica gel 및 ODS column chromatography 를반복하여 saponin 을분리, 정제하였다. 그림 15. 인삼지상부를활용한추출및분획

41 - BuOH 분획물 30 g에대하여 Silica gel column chromatography (c.c.) (CHCl3-MeOH =8:1 7:1 4:1 CHCl3-MeOH-H2O=5:4:1 100% MeOH) 를실시하여, 10개의분획물 (G1~G10) 을얻었다. 이로부터 ginsenoside Re 및다양한 major 사포닌을분리하였으며, 일부 minor 사포닌이인삼지상부에서분리할수있었다. G3 분획물 685 mg을가지고 ODS c.c. 를실시하여 15개의분획물 (G3-1~G3-15) 을얻었고그중 G3-1 분획물을가지고 ODS c.c. 을실시하여 Ginsenoside Rh1을 G3-4 분획에서 ginsenoside F1을분리하였다. 그림 16. 인삼지상부의 BuOH 분획 - 분리한화합물에대해서 UV detection (254, 365 nm) 과 TLC plate상의 10%-H2SO4 또는 anisaldehyde H2SO4등의발색시약분무시나타나는양상에따라화합물의골격군을예상하였다.1H-NMR spectrum상의 chemical shift로부터수소관련화학적환경해석, coupling constant로부터인접수소와의입체배열해석, integration으로부터수소 signal의개수를확인하고 13C-NMR spectrum으로부터화합물을구성하는탄소수및탄소의주위환경을해석하였다. DEPT NMR data로부터탄소의다중도를확인및 1H-1H COSY spectrum으로부터인접수소의환경을해석하고부분구조를확인하였다. 1H-13C COSY spectrum으로부터수소와탄소의 direct 연결을확인한후 HMBC spectrum으로부터부분구조를포함한전체적인화학구조를확인하였다.

42 그림 17. 분리된 ginsenoside F1 의 NMR 을통한동정

43 그림 18. 분리된 ginsenoside Rh1 의 NMR 을통한동정

44 (3) 인삼잎 / 줄기의소재화를위한차별화연구 가. 인삼사포닌의전환연구 - 인삼지상부는인삼뿌리보다더많은사포닌을함유하고있음이알려져있으며, 최근그관심도지속적으로증가하는추세이지만단순추출시특별한차별점이없으며더불어일부선행특허의침해가능성도존재하기에이를차별화하여차별화된소재로만들필요가있다. 따라서, 본연구에서는 1차년도에는이화학적방법에의한차별화전략, 2차년도에는발효등을통한신기능성물질발굴이라는로드맵을수립하여연구를수행하였다. 본 1차년도의연구에서는인삼지상부를이용하여산처리및열처리등의이화학적가공을통하여사포닌의전환을유도하고이로부터기능성물질을발굴하고자하였다. 열처리는 Autoclave에서 105 를설정하여 3시간처리하였고, 그결과다양한사포닌이생성된것을확인할수있었다. 그림 19. 열처리에의한인삼지상부사포닌의변환 - 산처리는기존연구에서 ph 0.85~2.34범위내에서 HCl에의한가수분해는큰차이가없지만많은부산물이생성되는것으로나타났고 1% 의초산 (acetic acid), 구연산 (citric acid), 젖산 (lactic acid), 타르타르산 (tartaric acid) 및염산으로가수분해를수행하였다. 이와같은연구를기초로 citric acid ph 2.7로설정하여처리하였으며분석결과사포닌전환이확인된바본샘플을이용하여활성연구를수행하였다.

45 그림 20. 산처리에의한인삼지상부사포닌의전환 - 열처리및산처리에의해서인삼지상부의사포닌의전환이이루어진것을확인할수 있으며이를통해효능의변화가있을수있음을예상할수있었다. 따라서본연구에서는 지상부의이화학적처리에의한사포닌전환산물의활성을비교하였다. 나. 사포닌전환산물의활성비교 - 지상부추출물의변환전후의주름억제활성을확인하기위하여, MMP-1에대한 assay 실험을진행하였다. UVA의조사에의하여발현되는 MMP-1의억제활성을 Real-time PCR을통하여확인하였으며, 변환전추출물과산처리추출물을 0, 10, 20, 50, 100ppm 농도로조제하여처리함으로써 MMP-1의억제활성에영향을주는지확인하였다. 그림 21. 인삼지상부의산처리에따른 MMP-1 저해활성

46 - 인삼지상부추출물의전환에따른활성비교시산처리를통한전환샘플이 collagen 생합성에도훨씬높은콜라겐생성활성을보이는것을확인할수있었다. 그리고발효전 후의직접비교시인삼추출물의발효후가발효전보다약 58% 이상의콜라겐생합성활성을가지는것을확인할수있었다. 그림 22. 인삼지상부의산처리에따른 Procollagen type1 생성능 - 이는일반적으로지상부에에서존재하는발효전의 major ginsenoside 보다발효후생성되어지는 minor ginsenoside에서보다좋은주름억제효과가있었다고사료되며이는기존의연구결과와유사한결과로인삼뿌리뿐아니라인삼지상부에서도발효를통해전환된 minor ginsenoside에의하여주름에보다뛰어난효과를가지는것으로보여주는결과이다. 이를통해발효인삼지상부는기존의화장품소재로이용되는인삼뿌리와더불어높은경쟁력을갖출수있는소재로이용할수있을것으로판단되어진다.

47 (4) 피부에효과적인 PPT 계열사포닌의대량분획제조기술개발 가. 화장품소재용고분획물의제조방안확립 - 본연구에서는인삼지상부의사포닌중피부효능효과가뛰어난 PPT 계열의사포닌을 화장품산업에서활용하기위하여대량으로고분획하는방법을확립하고자하였다. 그림 23. 인삼지상부의 PPT 고분획모식도 - 시험방법은 HP20을이용한컬럼 chromatography와액체상의분획방법을고려하였다. HP20의경우에탄올이외의유기용매를사용하지않아도되는장점이있었으나, 산업적으로대량화하기에는대용량의컬럼을구비하기어려운점과 resin의구입비용등의어려움이있는것으로확인되었다. 따라서본연구에서는용매액체상에서 PPD와 PPT를분획하는방법을활용하여고분획물을제조하고자연구를수행하였다. - 액체상을분획하면서 ph 조절을통하여 PPD계열의사포닌과 PPT 계열의사포닌을각각분리하였으며이를 HPLC 및 TLC를통하여확인한바, 60% 이상의 PPT계열고분획물을얻을수있었다.

48 그림 25. 액체상분획을통한고분획물의확인 나. 고분획물의발효를통한 algycone 의대량생산및이의효능효과 - 화장품으로활용가치가높은 PPT 분획을제외한 PPD 분획물은효능효과를증대시키기위해서앞서확립되어진발효기술을이용하여생물전환을유도하였다. 발효전후를각각비교한결과다음과같이발효후뛰어난효능활성을보여, PPT분획에비하여활성이비교적떨어져활용가치가낮을것으로생각되던 PPD 분획의활용이라는측면에서유용할것으로기대되었다.

49 (5) 인삼잎 / 줄기, 열매를이용한주름개선전임상연구 - 분리되어진물질을이용하여피부효능에대한효과를검정하기위한 in vitro효능활성연구를수행하였다. - 본연구팀에서는다양한소재로부터항염증및미백등의활성을확인할수있는 in vitro 효능검정 system을구축하고있다. 이에본연구에서개발되는소재들을효능평가 system에대입시켜보다효율적이고객관적인결과를도출하고자하였다. 가. Elastase 발현저해연구 - 분리된화합물중피부또는화장품소재로서활성을가지는소재를선발하기위하여 다양한사포닌을활용하여 Elastase 저해능력을평가하였다. 그림 26. 인삼사포닌의 elastase 저해활성 - 실험결과 elastase 저해능력의경우인삼사포닌에의한저해활성이나타나지않았 으며이를통한소재의탐색이어려울것으로사료되어다른지표인 MMP-1 저해활성 을탐색해보고자하였다.

50 나. MMP-1 발현저해연구 - 소재의 screening 단계에서콜라겐을분해하는효소인 MMP-1 의합성저해능력을평 가하였다. 그림 27. 인삼사포닌의 MMP-1 저해활성 - 실험결과 ginsenoside F1 에서유의적인 MMP-1 저해활성이나타났으며, 따라서본 연구에서는 ginsenoside F1 소재에활성지표로서의가능성을평가하기위해심화적인 활성검정연구를수행하였다. 다. 세포독성평가 - 인삼지상부유래추출물 ginsenoside F1의세포독성을측정하였다. 추출물에대한세포독성을알아보기위하여, 인간각질형성세포 HaCat(ACTT, CLS , USA) 을헤마사이토미터 (Hemacytometer) 를이용하여 96well plate에 1.5 x 104 cell/well 씩동일하게계수하여분주한후, 37 에서 5% 의이산화탄소조건으로 24시간동안배양하였다. 24시간배양한세포배양액을제거하였다. ginsenoside F1을 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4% 로농도로희석하여, 각농도별씩 40μl를취하여 DMEM 배지와혼합한뒤, 각 well에농도별로처리하였다. 이를다시 37 에서 5% 의이산화탄소조건으로 CO2 incubator에넣어 24시간배양하였다. 그후 well당 10% WST(high sensitive Water Soluble Tetrazolium salt) 를 100μl씩첨가하고동일한조건에서 2시간동안반응시켜주었다. 2 시간뒤, ELISA reader(thermo, Multiskan EX) 를이용하여 450nm에서흡광도를측정하였다.

51 그림 28. ginsenoside F1 의세포독성 - 인삼지상부유래분리화합물인 ginsenoside F1 을농도별로세포독성을측정하였으며 최고 50uM 농도에서까지 98% 이상의세포생존율을보인바 50µM 이하의농도를최대 사용농도로설정하고후속실험을진행하였다. 라. ginsenoside F1 콜라겐생성및 MMP-1 저해효과 - Collagen 합성능력을평가하기위하여 ginsenoside F1 을농도별로처리하여실험을콜 라겐의생성을확인하였다. 그림 29. ginsenoside F1 의콜라겐형성능력평가및 MMP-1 저해활성평가 - 실험결과 20uM 농도에서 MMP-1 저해및콜라겐생합성증대가관찰되었으며, 이로 보아본물질은주름개선에효과적임을확인할수있었다.

52 (6) 인삼잎 / 줄기, 열매의화장품원료화 가. 인삼잎 / 줄기의화장품원료화 - 본연구에서개발된인삼지상부의효능지표및활성결과를바탕으로지상부의인삼 사포닌을활용한화장품소재를개발하고자하였으며그공정은다음과같다. 그림 30. 인삼잎 / 줄기를활용한화장품소재원료화공정 (1 차원료공정 ) - 생산된제품은잔류농약검사및사포닌검정시험을통하여제품품질평가를수행하였 다. 수립된공정은과제의연차실적에맞추어기능성개선등의개선을할계획이다. 그림 31. 인삼잎 / 줄기를활용한 1 차원료개발

53 그림 32. 개발제품의검사성적서 나. 인삼잎 / 줄기원료화를위한 ICID 등재 - 인삼잎 / 줄기의원료화를위해서는 ICID 등재가우선시되어야하며, 이를위해 2 차년도 연구내용을먼저등재하여활용하고자하였다. 그림 33. 인삼지상부추출물관련 ICID 등재신청서류

54 (7) 인삼지상부원료의임상시험 ⓵ 피험자관리가. 피시험자선정기준만 30세이상 50세미만의성인여성중에서다음선정기준에만족하며제외기준에해당되는사항이없는사람을피시험자로선정한다. 1) 주시험자가설명한피험자에게알려주어야할사항에대하여충분히설명을듣고자발적으로임상시험참가동의서를작성하고서명한사람 2) 피부질환을포함하는급, 만성신체질환이없는건강한사람 3) 주시험자의판단에따라시험부위에주름을가지고있는사람 4) 시험기간동안원활한추적관찰이가능한사람 나. 피시험자제외기준피험자와의면담을통해다음사항에해당되는사람은피험자에서제외하였다. 1) 임신또는수유중인여성과임신가능성이있는여성 2) 피부질환의치료를위해스테로이드가함유된피부외형제를 1개월이상사용한사람 3) 동일한시험에참가한뒤 6개월이경과되지않은사람 4) 민감성, 과민성피부를가진사람 5) 시험부위에점, 여드름, 홍반, 모세혈관확장등의피부이상소견이있는사람 6) 연구시작전 3개월내에시험부위에동일또는유사한화장품또는의약품을사용한사람 7) 연구시작전 6개월내에시험부위에시술을받은사람 8) 그외주시험자의판단으로시험에부적합하다고생각되는사람 다. 피시험자중도탈락기준선정기준에합당하고제외기준에해당하지않는피험자라할지라도아래와같은경우피험자를중도탈락처리하였다. 1) 시험부위에소양감이나홍반등의이상반응이발생하는경우 2) 피시험자가실험진행과정중시험부위에과도한자외선노출을하거나지나친음주, 흡연등으로결과의평가에장애가발생한경우 3) 피시험자가실험진행과정중개인사정에의해추적관찰이어려운경우 4) 기타시험자의판단으로시험지속이어렵다고판단되는경우 라. 피시험자의숫자와이에대한근거식품의약품안전처 (MFDS) 에서발간한 [ 기능성화장품의유효성평가를위한가이드라인- 주름개선에도움을주는기능성화장품의유효성평가를위한가이드라인, ] 에근거하여통계적비교가가능하기위해 20명이상의유효데이터를확보하도록하였으며최종시험

55 자의 숫자는 20 명이었다. 마. 피험자관리본연구의의뢰자및시험자는헬싱키선언의근본정신을준수하고, 피험자의권익을보호하고자노력하였으며연구수행과결과기록등에있어인체시험관리기준 (GCP) 및관련국내법규를준수하도록노력하였다. 시험전모든피험자들의시험참여동의를받았으며, 식품의약품안전처가발간한 [ 화장품 인체적용시험및효력시험가이드라인, 2011] 에따라피험자들의동의를얻는데마땅히 제공해야할모든정보들을성실히전달하였다. ⓶ 시험방법 가. 시험물질적용방법 실제사용법과동일하게하기위해시험의뢰자가제공한사용방법을피험자에게교육하였 다. 나. 사용장비 ANTERA 3DTM (Miravex, Ireland) Antera 3DTM 는다파장 LED 광원을이용하여표피와진피의상태를측정할수있는장비로서내장프로그램을이용하여이미지의 2차원및 3차원재구성이가능하며파장대별분석을통해다양한목적의분석이가능하다 다. 시험순서 1) 첫번째방문 : 방문일 12시간전부터기초제품의사용을금지하였다. : 피험자는시험방법과일정및위험성과가능한이상반응등에대해설명을듣고기초정보를작성하고동의서에서명하였다. : 시험자가제공하는기준세안제를이용하여세안후페이퍼타올로가볍게두드려물기를제거한후 30분간항온항습조건 (20~24, 40~60%RH) 에서안정을취하였다. : 양측눈가주름부위에서 Antera 3D를이용한화상측정을실시하였다. Antera 3D 촬영구역설정은안와전체및양측눈가를포함하는 6cm X 6cm 크기의정방형구역으로하였다. : 피험자주의사항과제품사용법을교육한후제품을배포하였다. : 시험기간동안매일전화등의방법으로제품사용의순응도를체크하였다. 2) 두번째방문 (2주차) / 세번째방문 (4주차)

56 : 첫방문일과동일한방법으로동일한부위에서기기평가를시행하였다. : 피부과전문의가이상반응유무를평가하였다. : 마지막방문일에는제품을수거하고, 피험자에게피험비를지급하였다. : Antera 3D winkle index 분석은측정오차를줄이기위해모든이미지촬영이완료된마지막방문일에실시하였다. 라. 평가및분석방법 1) Antera 3D를이용한눈가주름개선효과평가 : 제품사용전, 사용 2주후, 사용 4주후에측정된눈가주름측정치간의통계학적유의성을 R (version 3.1.0, 2014 The R Foundation for Statistical Computing) 프로그램의 Wilcoxon 부호순위검정을이용해분석및검증하였다. : 통계적유의성을확보하기위해 P-value가 0.05보다작은경우유의한차이로인정하였다. 2) 피부과전문의에의한안전성평가 : 시험기간중제품사용에의한부작용 ( 홍반, 부종, 인설, 가려움, 자통, 작열감, 뻣뻣함, 따끔거림및기타이상증 ) 발생여부를평가하였다. ⓷ 시험결과 좌측과우측눈가에서모두사용 2 주후부터통계적으로유의한수준에서주름개선효과 를확인할수있다.

57 그림 34. 인삼지상부추출물의주름관련임상효과 총 20명의피험자를대상으로총 4주간인삼지상부추출물제품의눈가주름개선효능평가시험을실시하였으며, 중도탈락자없이 20명의피험자가모두시험을완료하였다. 시험부위의눈가주름개선율은사용 2주후에좌측과우측눈가각각 5.26%, 5.18% 로확인되었고, 사용 4주후에는각각 9.62% 과 9.29% 로확인되었으며제품사용 2주후부터지속적으로사용전과비교해서통계적으로유의한수준의눈가주름개선율을보이는것으로확인되었다. 또한 4주간의시험기간동안모든피험자에서특별한이상반응이관찰되지않았다. 결론적으로인삼지상부추출물제품은사용 2주차부터통계적으로유의한수준의눈가주름개선효과를보였으며, 사용중특별한이상반응이관찰되지않아안전한제품으로판단된다.

58 3. 인삼열매 ( 과육 ) 를활용한기능성화장품소재개발 (1) 인삼열매 ( 과육 ) 으로부터유효성분의분리및동정 - 인삼열매를동결건조한액기스약 20 kg을 100% MeOH 수용액에 24시간담가서실온에서추출하고 2차 80%, 3차 70% MeOH 수용액에 24시간담가서실온에서추출하였다. 얻어진여액을각각합쳐감압농축하여 MeOH 추출물 (550 g) 을얻었다. 추출물을 EtOAc(3 L) / H2O(3 L) 로 4회분배추출하였고, 다시 H2O층을 n-buoh(2.7 L) 로 4회분배추출하였다. 각층을감압농축하여, EtOAc 분획과 n-buoh 분획및 H2O 분획을얻었다. 각분획에대한성분을 TLC로확인한결과, EtOAc 분획에비극성사포닌으로확인되는물질들이많았기때문에 EtOAc 분획에서화합물들을분리하고자하였다. 그림 35. 인삼열매로부터추출및용매분획과정 (2) 인삼열매 ( 과육 ) 으로부터이차대사산물의분리 가. EtOAc 분획물로부터활성물질분리 - EtOAc 분획 (36 g, PGFE) 에대하여 SiO2 column chromatography (C.C) 를실시하여 Ø 10 cm X 15 cm 조건을사용하고 n-hexane-etoac = 20:1 10:1 5:1 3:1 1:1 CHCl3-MeOH-H2O = 25:3:1 23:3:1 17:3:1 14:3:1 12:3:1 10:3:1 7:3:1 65:35:10 6:4:1까지순차적으로용출하여 21개로분획 - 소분획으로부터 SiO2, ODS 등의각종 matrix를적절히이용하고, 다양한용출용매로소분획 column chromatography (c.c.) 를실시하여활성물질분리함. GFE-10 (3.54 g) 에대하여 ODS C.C. 를실시하였으며 Ø 5.5 cm X 9 cm 조건을사용하여 MeOH-H2O = 1:1 3:1로용출하여총 41개의분획을얻음. 얻어진41개의분획중 23번분획에서 CHCl3-MeOH-H2O = 18:3:1 16:3:1로용출하여 8개의분획물을얻음. 얻어진 8개의

59 분획중 23번분획 (PGFE-10-23, 91.9 mg) 에서단일물질 ginsenoside RG2 (1) 를얻음. - PGFE-11과 12번분획 (PGFE-11+12, 1.18 g) 에대하여 ODS C.C를실시하였으며 Ø 4 cm X 14 cm 조건을사용하여 MeOH-H2O = 1:1 3:1로용출하여 10개의분획물을얻음. 얻어진 10 개의분획물중 6번분획과 7번분획 (PGFE , 88 mg) 에대하여 SiO2 C.C. 를실시하였으며 Ø 4 cm X 14 cm 조건을사용하여 CHCl3-MeOH-H2O = 16:3:1로용출하여 14개의분획을얻음. 그중 10번분획 (PGFE , 57.6 mg) 에대해단일물질 ginsenoside Rf (2) 를얻음. 나 n-buoh 분획물로부터활성물질분리 - n-buoh 분획 (137 g, PGFB) 에대하여 SiO2 column chromatography (C.C) 를실시하여 Ø 12 cm X 15 cm 조건을사용하고 CHCl3-MeOH = 3:1 CHCl3-MeOH-H2O = 65:35:10 6:4:1까지순차적으로용출하여 13개로분획 - 소분획으로부터 SiO2, ODS 등의각종 matrix를적절히이용하고, 다양한용출용매로소분획 column chromatography (c.c.) 를실시하여활성물질분리함. - PGFB-3 (6.59 g) 에대하여 ODS C.C. 를실시하였으며 Ø 8 cm X 10 cm 조건을사용하여 MeOH-H2O = 3:2 2:1 5:1로용출하여 15개의분획을얻음. 그중 2번분획 (PGFB-3-2, 878 mg) 에대하여 SiO2 C.C. 를실시하였으며 Ø 5.5 cm X 11 cm 조건을사용하여 CHCl3-MeOH-H2O = 8:3:1로용출하여 11개의분획을얻었다. 그중 4번분획 (PGFB-3-2-4, 550 mg) 에대해단일물질 ginsenoside Rg1 (3) 를얻음. 위의분획중 9번분획과 10번분획 (PGFB , 55 mg) 에서단일물질 ginsenoside Re (4) 를얻음. - PGFB-3-7 (729 mg) 에대하여 SiO2 C.C를실시하여 Ø 4.5 cm X 13 cm 조건을사용하여 CHCl3-MeOH-H2O = 8:3:1로용출하여 11개의분획을얻음. 얻어진 11개의분획중 9번분획 (PGFB-3-7-9, 100 mg) 에서단일물질 ginsenoside Ia (5) 를얻음. - PGFB-3-11 (434 mg) 에대하여 SiO2 C.C를실시하여 Ø 4 cm X 10 cm 조건을사용하여CHCl3-MeOH-H2O = 11:3:1로용출하여 11개의분획을얻음. 얻어진 11개의분획중 8번분획 (PGFB , 56.3 mg) 에서단일물질 notoginsenoside Fe (6) 를얻음. - 위의분획중 10번분획 (PGFB , 81.4 mg) 에서 ginsenoside Rd (7) 를얻음. - PGFB-6 (9.4 g) 에대하여 ODS C.C. 를실시하여 Ø 8 cm X 9 cm 조건을사용하여 MeOH-H2O = 3:1로용출하여 14개의분획을얻음. 얻어진 14개의분획중 12번분획 (PGFB-6-12, 120 mg) 에서단일물질 ginsenoside Rd2 (8) 를얻음.

60 그림 36. 인삼열매로부터진세노사이드의분리과정 (3) 인삼열매에서분리한 ginsenoside 의 NMR Data 및구조동정 - ginsenoside Rg2 : 1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5, δh) 5.28 (1H, dd, J=7.2, 7.2 Hz, H-24), 5.19 (1H, d, J=6.0 Hz, H-1), 4.87 (1H, br q, J=6.4 Hz, H-5''), 4.72 (1H, br s, H-3''), 4.60 (1H, dd, J=9.2, 3.2 Hz, H-2''), 4.46 (2H, dd, J=11.6, 3.2 Hz, H-6' a), 4.32 (2H, m, H-6' b), 4.31 (1H, m, H-2'), 4.3 (1H, m, H-3'), 4.25 (1H, m, H-4''), 4.14 (1H, dd, J=9.2, 8.4 Hz, H-4'), 3.92 (1H, m, H-5'), 3.43 (1H, dd, J=11.2, 4.8 Hz, H-3), 2.04 (3H, s, H-28), 1.72 (2H, d, J=6.4 Hz, H-6'), 1.64 (3H, s, H-26), 1.60 (3H, s, H-27), 1.36 (3H, s, H-21), 1.30 (3H, s, H-29), 1.16 (3H, s, H-19), 0.93 (3H, s, H-18), 0.91 (3H, s, H-30). 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5, δc) (C-25), (C-24), (C-1'), (C-1''), 79.2 (C-2'), 78.5 (C-3'), 78.1 (C-5'), 74.3 (C-6), 74.0 (C-4''), 72.9 (C-20), 72.2 (C-2''), 72.1 (C-3''), 70.9 (C-12), 69.3 (C-5''), 63.0 (C-6'), 60.7 (C-5), 54.5 (C-17), 51.6 (C-14), 49.7 (C-9), 48.1 (C-13), 45.9 (C-7), 41.0 (C-8), 39.8 (C-4), 39.5 (C-10), 39.3 (C-1), 35.7 (C-22), 32.0 (C-28), 31.9 (C-11), 31.2 (C-15), 27.6 (C-2), 26.9 (C-21), 25.7 (C-26), 22.8 (C-23), 18.5 (C-6'').

61 그림 37. ginsenoside Rg2 의구조동정 - ginsenoside Rf: 1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5, δh) 5.83 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1''), 5.30 (1H, dd, J=6.0, 5.6 Hz, H-24), 4.89 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1'), 4.42 (1H, m, H-2'), 4.30 (1H, m, H-6), 4.28 (1H, m, H-3'), 4.18 (1H, m, H-3''), 4.17 (1H, m, H-2''), 4.14 (1H, m, H-4''), 4.10 (1H, m, H-4'), 3.88 (1H, m, H-5'), 3.87 (1H, m, H-12), 3.80 (1H, m, H-5'), 3.44 (1H, m, H-3), 2.53 (2H, m, H-23a), 2.38 (2H, m, H-7a), 2.27 (2H, m, H-23b), 2.27 (1H, m, H-17), 2.02 (3H, s, H-28), 1.92 (2H, m, H-7b), 1.64 (3H, s, H-26), 1.61 (3H, s, H-27), 1.42 (3H, s, H-29), 1.37 (3H, s, H-21), 1.14 (3H, s, H-18), 0.94 (3H, s, H-19), 0.80 (3H, s, H-30). 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5, δc) (C-25), (C-24), (C-1''), (C-1'), 79.8 (C-2'), (C-6), (C-3'), 78.6 (C-3), 78.3 (C-3''), 77.9 (C-5''), 77.7 (C-5'), 75.9 (C-2''), 72.9 (C-20), 72.3 (C-4''), 71.7 (C-4'), 70.9 (C-12), 63.3 (C-6''), 62.9 (C-6'), 61.4 (C-5), 54.7 (C-17), 51.6 (C-14), 50.1 (C-9), 48.2 (C-13), 45.1 (C-7), 41.1 (C-8), 40.1 (C-4), 39.6 (C-10), 39.4 (C-1), 35.8 (C-22), 31.2 (C-11), 32.0 (C-28), 31.2 (C-15), 27.7 (C-2), 27.0 (C-21), 26.8 (C-16), 25.7 (C-26), 22.9 (C-23), 17.6 (C-27), 17.5 (C-19), 17.3 (C-18), 16.8 (C-30), 16.6 (C-29).

62 그림 38. ginsenoside Rf 의구조동정 - ginsenoside Rg1: 1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5, δh) 5.23 (1H, dd, J=6.4, 6.0 Hz, H-24), 5.12 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1''), 4.97 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1') 4.46 (2H, dd, J=11.6, 2.8 Hz, H-6''a), 4.42 (2H, dd, J=12.0, 2.8 Hz, H-6'a), 4.38 (2H, m, H-6), 4.32 (2H, dd, J=11.6, 5.6 Hz, H-6''b), 4.26 (2H, dd, J=12.0, 5.2 Hz, H-6'), 4.19 (1H, m, H-3'), 4.17 (1H, m, H-5'), 4.14 (1H, m, H-4'), 4.12 (1H, m, H-4''), 4.1 (1H, m, H-12), 3.93 (1H, dd, J=8.8, 8.0 Hz, H-2''), 3.89 (1H, m, H-3''), 3.85 (1H, m, H-5''), 3.47 (1H, dd, J=11.2, 4.8 Hz, H-3), 2.46 (1H, m, H-17), 2.44 (2H, m, H-23a), 2.43(2H, m, H-7a), 2.38 (2H, m, H-22a), 2.21 (2H, m, H-23b), 2.05 (2H, m, H-11a), 1.98 (3H, s, H-28), 1.95 (1H, m, H-13), 1.93 (2H, m, H-2a), 1.91 (2H, m, H-2b), 1.90 (2H, m, H-7b), 1.79 (2H, m, H-22), 1.59 (3H, s, H-26), 1.58 (3H, s, H-27), 1.56 (3H, s, H-21), 1.55 (3H, s, H-29), 1.38 (1H, d, J=10.8 Hz, H-5), 1.14 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, s, H-19), 0.81 (3H, s, H-30). 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5, δc) (C-25), (C-24), (C-1'), 98.1 (C-1''), 83.2 (C-20), 80.0 (C-6), 78.6 (C-3), 70.1 (C-12), 61.3 (C-5), 51.5 (C-17), 51.3 (C-14), 49.9 (C-9), 49.1 (C-13), 45.1 (C-7), 41.1 (C-8), 40.2 (C-4), 39.6 (C-10), 39.4 (C-1), 36.0 (C-22), 31.6 (C-28), 30.9 (C-11), 30.6 (C-15), 27.8 (C-2), 26.5 (C-16), 25.6 (C-26), 23.1 (C-23), 22.2 (C-21), 17.7 (C-27), 17.5 (C-19), 17.4 (C-18), 17.1 (C-30), 16.2 (C-29).

63 그림 39. ginsenoside Rg1 의구조동정 - ginsenoside Re: 1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5, δh) 5.49 (1H, br s, H-1''), 5.22 (1H, s, H-24), 5.19 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1'''), 5.18 (1H, d, J=5.6 Hz, H-1'), 4.90 (1H, dt, J=6.1 Hz, H-5''), 4.75 (1H, br s, H-2''), 4.64 (1H, s, H-3''), 4.47 (1H, s, H-6'b), 4.43 (1H, s, H-6'''b), 4.35 (1H, s, H-2'), 4.32 (1H, s, H-3'), 4.31 (1H, s, H-6'a), 4.27 (1H, s, H-6'''a), 4.28 (1H, s, H-4''), 4.17 (1H, s, H-3'''), 4.16 (1H, s, H-4'), 4.12 (1H, s, H-4'''), 3.94 (1H, s, H-2'''), 3.92 (1H, s, H-5'), 3.87 (1H, s, H-5'''), 3.41 (1H, dd, J=5.3, 11.7 Hz, H-3), 2.45 (1H, s, H-17), 2.43 (1H, s, H-23b), 2.29 (1H, s, H-22b), 2.19 (1H, s, H-7b, 23a), 2.01 (2H, s, H-11b, 28), 1.90 (2H, s, H-7a, 13), 1.83 (1H, s, H-2b), 1.75 (1H, s, H-2a), 1.74 (1H, d, J=6.1 Hz, H-6''), 1.72 (2H, s, H-16b, 22a), 1.63 (1H, s, H-1b), 1.57 (2H, s, H-26, 27), 1.53 (1H, s, H-21), 1.49 (1H, s, H-15b), 1.46 (1H, s, H-9), 1.44 (1H, s, H-11a), 1.34 (1H, d, J=11.2 Hz, H-5), 1.30 (1H, s, H-29), 1.20 (1H, s, H-16a), 1.14 (1H, s, H-18), 0.94 (1H, s, H-19), 0.91 (2H, s, H-1a, 11b), 0.87 (1H, s, H-15a). 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5, δc) (C-25), (C-24), (C-1'), (C-1''), (C-1'''), (C-20), (C-5'''), (C-3'''), (C-2'), (C-3), (C-3'), (C-5'), (C-2'''), (C-6), (C-4''), (C-4'), (C-2''), (C-3''), (C-4'''), (C-12), (C-5''), (C-6'), (C-6'''), (C-5), (C-17), (C-14), (C-9), (C-13), (C-7), (C-8), (C-4), (C-10), (C-1), (C-22), (C-28), (C-11), 30.70

64 (C-15), (C-2), (C-16), (C-26), (C-23), (C-21), (C-6''), (C-27), (C-29), (C-19), (C-18), (C-30). 그림 40. ginsenoside Re 의구조동정 - ginsenoside Ia: 1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5, δh) 5.23 (1H, dd, J=6.4, 6.8 Hz, H-24), 5.12 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1''), 4.93 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1'), 4.29 (1H, m, H-6), 4.14 (1H, m, H-12), 3.42 (1H, dd, J=4.4, 10.8 Hz, H-3), 2.00 (3H, s, H-28),

65 1.57 (3H, s, H-21), 1.57 (3H, s, H-26), 1.57 (3H, s, H-27), 1.36 (3H, s, H-29), 0.96 (3H, s, H-30), 0.91 (3H, s, H-19). 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5, δc) (C-25), (C-24), (C-1'), 98.1 (C-1''), 89.4 (C-3), 83.2 (C-20), 79.1 (C-3''), 78.6 (C-3'), (C-5'), (C-5''), 75.8 (C-2'), 75.0 (C-2''), 71.9 (C-4'), 71.6 (C-4''), 70.1 (C-12), 67.5 (C-6), 63.1 (C-6'), 62.8 (C-6''), 61.7 (C-5), 51.5 (C-17), 51.3 (C-14), 49.7 (C-9), 49.1 (C-13), 47.4 (C-7), 41.1 (C-8), 40.4 (C-4), 39.1 (C-1), 38.8 (C-10), 36.0 (C-22), 31.3 (C-28), 30.8 (C-11), 30.7 (C-15), 26.5 (C-16), 26.5 (C-2), 25.6 (C-26), 23.1 (C-23), 22.3 (C-21), 17.7 (C-27), 17.5 (C-18), (C-19), (C-30), 16.9 (C-29) 그림 41. ginsenoside Ia 의구조동정 - notoginsenoside Fe: 1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5, δh) 5.58 (1H, s, H-1'''), 5.06 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1''), 4.87 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1'), 4.23 (1H, m, H-12), 3.96 (1H, m, H-12), 3.32 (1H, dd, J=11.6, 3.6 Hz, H-3), 1.63 (3H, s, H-27), 2.54 (1H, t, J=10.0 Hz, H-17), 2.46 (1H, br s, H-23), 2.17 (1H, d, J=4.8 Hz, H-26), 1.95 (1H, t, J=10.4 Hz, H-9), 1.79 (1H, m, H-2, 22), 1.59 (6H, s, H-21, 26), 1.47 (1H, d, J=13.2 Hz, H-16a), 1.37 (1H, d, J=13.2 Hz, H-16a), 1.33 (3H, s, H-28), 0.95 (3H, s, H-29), 0.93 (6H, s, H-18, 30), 0.78 (3H, s, H-19). 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5, δc) (C-25), (C-24), (C-ara(f)-1), (C-3-glc-1), (C-20-glc-1), (C-3), (C-ara(f)-4), (C-ara(f)-2), (C-20), (C-3-glc-3), (C-20-glc-3), (C-ara(f)-3), (C-3-glc-5), (C-20-glc-5), (C-3-glc-2), 74.93

66 (C-20-glc-2), (C-3-glc-4), (C-20-glc-4), (C-12), (C-20-glc-6), (C-3-glc-6), (C-ara(f)-5), (C-5), (C-17), (C-14), (C-9), (C-13), (C-8), (C-4), (C-1), (C-10), (C-22), (C-7), (C-15), (C-11), (C-28), (C-2), (C-16), (C-26), (C-23), (C-21), (C-6), (C-27), (C-30), (C-29), (C-18), (C-19). 그림 42. ginsenoside Fe 의구조동정 - ginsenoside Rd: 1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5, δh) 5.32 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1''), 5.24 (1H, t, J = 6.0 Hz, H-24), 5.16 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1'''), 4.89 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1'), 4.25 (3H, m, H-3', 3''', 5'''), 4.20 (1H, s, H-5''), 4.14 (1H, s, H-3''), 4.10 (1H, s, H-2'), 4.01 (1H, s, H-12), 3.92 (1H, t, J=8.0 Hz, H-2''), 3.85 (1H, t, J=5.6 Hz, H-5''), 3.25 (1H, dd, J=4.0, 11.6 Hz, H-3), 2.54 (1H, t, J=10.0 Hz, H-17), 2.46 (1H, br s, H-23), 2.17 (1H, d, J=4.8 Hz, H-26), 1.95 (1H, t, J=10.4 Hz, H-9), 1.79 (1H, m, H-2, 22), 1.60 (9H, s, H-21, 26, 27), 1.45 (1H, d, J=12.4 Hz, H-6), 1.35 (1H, d, J=12.4 Hz, H-13), 1.27 (3H, s, H-28), 1.20 (1H, d, J=12.0 Hz, H-28), 1.09 (3H, s, H-29), 1.00 (1H, s, H-15), 0.96 (6H, s, H-18, 30), 0.82 (3H, s, H-14), 0.67 (1H, d, J=11.2 Hz, H-5). 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5, δc) (C-25), (C-24), (C-1''), (C-1'), (C-1'''), (C-3), (C-2'), (C-20), (C-3''), (C-3'''), (C-3', 5'''), (C-5'), (C-5''), (C-2''), (C-2'''), (C-4', 4'', 4'''), (C-12), (C-6', 6''), (C-6'''), (C-5),

67 51.50 (C-17), (C-14), (C-13), (C-9), (C-8), (C-4), (C-1), (C-10), (C-22), (C-7), (C-11, 15), (C-28), (C-2), (C-16), (C-26), (C-23), (C-21), (C-6), (C-27), (C-30), (C-29), (C-19), (C-18). 그림 43. ginsenoside Rd 의구조동정 - ginsenoside Rd2: 1H-NMR (400 MHz, pyridine-d5, δh) 5.30 (1H, br s, H-24), 5.90 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1''), 4.95 (1H, d, J=6.0 Hz, H-1'''), 4.89 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1'), 4.63 (1H, dd, J=13.2, 0.8 Hz, H-6''b), 4.53 (1H, dd, J=13.2, 6.0 Hz, H-6'b), 4.53 (1H, s, H-2'''), 4.40 (1H, br s, H-6'a), 4.31 (1H, d, J=11.2 Hz, H-4'''), 4.21 (1H, d, J=24.0, 3.2 Hz, H-5'''b), 4.20 (1H, br s, H-6''a), 4.19 (1H, s, H-3'), 4.19 (1H, s, H-4'), 4.18 (1H, s, H-2''), 4.15 (1H, s, H-12), 4.12 (1H, s, H-3''), 4.01 (1H, s, H-5''), 3.99 (2H, s, H-2', 4''), 3.97 (1H, s, H-5'), 3.96 (1H, t, J=6.0 Hz, H-3'''), 3.75 (1H, dd, J=9.2, 3.2 Hz, H-5'''a), 3.25 (1H, dd, J=4.0, 11.6 Hz, H-3), 2.54 (1H, t, J=10.0 Hz, H-17), 2.46 (1H, br s, H-23), 2.17 (1H, d, J=4.8 Hz, H-26), 1.95 (1H, t, J=10.4 Hz, H-9), 1.79 (1H, m, H-2, 22), 1.64 (3H, s, H-27), 1.58 (3H, s, H-21), 1.57 (3H, s, H-26), 1.49 (1H, d, J=12.4 Hz, H-6), 1.35 (1H, d, J=12.4 Hz, H-13), 1.28 (3H, s, H-28), 1.20 (1H, d, J = 12.0 Hz, H-28), 1.09 (3H, s, H-29), 1.00 (1H, s, H-15), 0.96 (6H, s, H-18, 30), 0.82 (3H, s, H-14), 0.67 (1H, d, J=11.2 Hz, H-5). 13C-NMR (100 MHz, pyridine-d5, δc) (C-25),

68 (C-24), (C-3-Glc-1'), (C-6'-ara-1'''), (C-20-Glc-1''), (C-3), (C-20), (C-20-Glc-3''), (C-3-Glc-3'), (C-3-Glc-5'), (C-20-Glc-5''), (C-3-Glc-2'), (C-6'-ara-3'''), (C-20-Glc-2''), (C-6'-ara-2'''), (C-3-Glc-4'), (C-20-Glc-4''), (C-12), (C-20-Glc-6''), (C-6'-ara-4'''), (C-6'-ara-5'''), (C-3-Glc-6'), (C-5), (C-17), (C-14), (C-9), (C-13), (C-8), (C-4), (C-1), (C-10), (C-22), (C-7), (C-11), (C-15), (C-28), (C-2), (C-16), (C-26), (C-23), (C-21), (C-6), (C-27), (C-30), (C-29), (C-18), (C-19).

69 그림 44. ginsenoside Rd2 의구조동정

70 (4). 인삼열매 ( 과육 ) 으로부터분리및확보한물질리스트 표 13. 인삼열매로부터분리물질리스트 (5). 인삼열매추출물제조공정확립연구 - 인삼열매를추출및온도조건에따라제조공정을확립하고자하였다. 각샘플의추출조건은 PGGF-1( 상온 30% 주정 ), PGGF-2( 상온 70% 주정 ), 2기압압력에서 40 온도조건으로 PGGF-3(0%), PGGF-4(30% 주정 ), PGGF-5(50% 주정 ), PGGF-6(70% 주정 ), 2 기압압력에서 70 온도조건으로PGGF-7(0%), PGGF-8(30% 주정 ), PGGF-9(50% 주정 ), PGGF-10(70% 주정 ) 번으로결정하여추출을진행하였다. 조건별로발효주정 7.3L 을넣어잘혼합후 30분후에 Ethyl alcohol 측정용 ( 일본산 ) 기기를사용하여주정 % 수치를확인하여실온에서 24시간방치하여반응시킨후여과후대형농축기를이용하여진공감압하여설정한온도에서 2L가될때까지농축하였으며, 얻어진농축액을냉동건조기 (Freeze pryer) 로 4일간 (96시간) 동결건조하여샘플을얻었다. 그림 45. 인삼열매추출공정

71 (6) 인삼열매추출물제조공정별사포닌함량측정 - 제조공정별추출된인삼열매추출물을 HPLC 를이용해서진세노사이드정량분석을실 시하였으며, 조건은아래와같다. 그림 46. 인삼열매추출물정량분석조건 표 14. 조건별진세노사이드함량

72 (7) 인삼열매열매를이용한미백관련전임상연구 - 멜라닌의세포내생합성저해활성을알아보기위해 C57BL/6 마우스에서유래한 immortalized cell line 인 melan-a 세포를이용하였다. Melan-a 세포에인삼열매 compounds 와 extracts 를 50µM 의농도로처리한후멜라닌의양을측정하였다. 그림 47. 인삼열매추출물및분획물의멜라닌합성저해효과 가. 인삼열매으로부터분리된 single compound들의미백효능을검증 - 분리된 single compounds의미백효능을검증하기위하여 melan-a세포를이용하여 in vitro 효능을검증하였으며, in vitro상에서의세포증식과멜라닌합성에미치는각각 single compound들의효능은아래와같다.

73 그림 48. 인삼열매로부터분리된 compound 의세포증식및멜라닌합성저해효과 - C15, C2, C27 물질의경우 160uM의처리농도까지세포독성이나타나지않았고, C2와 C28, C29 화합물은 80uM까지는세포독성을나타내지않았지만, 160 um의처리농도에서는 melan-a 세포에대한화합물의독성을약하게보였다. 그러므로미백효능을연구하기위한화합물의처리농도는 0에서 80uM로정하였고, 이농도범위에서 melan-a 세포배양시멜라닌합성에미치는영향들이연구되었다. 그결과 5개의화합물모두에서농도의존적으로멜라닌의합성이감소됨을보여주었다. 이중에서먼저 C15번과 C27번화합물을이용하여멜라닌합성저해를연구하였다.

74 나. C27 (Ginsenoside Rb2) 의멜라닌합성저해효능연구 그림 49. Ginsenoside Rb2 의세포독성및멜라닌합성저해효과 - C27번화합물인 ginsenoside Rb2 (Gin-Rb2) 의농도별세포독성과멜라닌생성억제활성을 PTU를양성대조군으로사용하여 melan-a세포배양에서확인하였다. 160uM 처리농도까지세포독성을보이지않았고, 80 um 처리시에무처리군에비해서약 20% 의멜라닌합성이저해됨을확인할수있었다. - 이들결과들을 in vivo모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였다.

75 그림 50. 제브라피쉬모델에서 ginsenoside Rb2 (Gin-Rb2) 의멜라닌합성저해효과 - Gin-Rb2sms 농도의존적으로제브라피쉬성체에서의멜라닌스팟이줄어드는경향을나타내었다. 또한실험농도범위에서는어떤어독성도보이지않았으며, 제브라피쉬의멜라닌생합성저해실험에서사용되는대표적인양성대조군인 PTU에비해서는멜라닌생성저해활성이낮았지만, 멜라닌합성이줄어드는경향을보였다. 제브라피쉬체내에서의 tyrosinase활성저해능을확인하기위하여제브라피쉬에서 tyrosinase를분리하였고, L-DOPA를기질로하여효소의활성을측정하여본결과 80 um 처리농도에서 control 그룹과 P value 0.05이하의유의적인결과를나타내었다.

76 다. C15(Picrinoside A) 의멜라닌합성저해능연구 - Megastigmane glucosides인 picrinoside A를인삼잎으로부터분리하여멜라닌합성저해활성을연구하였다. 먼저양성대조군으로 PTU와 albutin과함께 in vitro 멜라닌합성조절에서핵심효소인 tyrosinase의활성저해에미치는영향을확인하였다. 표에서보는바와같이 PTU의 IC 50 값은 2.3 um이고 arbutin의값은 100이상으로나타났다. 테스트화합물인 picrinoside의 IC 50 값은 9.8 um로써강력한멜라닌생성억제제인 PTU보다는낮지만, 화장품산업에서미백기능성원료로많이사용되는 arbutin에비해서는현저히높은저해활성을나타냄을보여준다. 표 15. Picrionoside A 의 mushroom tyrosinase activity - 그림 51의 A는 picrinoside의구조를나타내고있으며, B는농도에따른세포독성을보여주고있다. 실험결과 80 um까지의실험농도에서세포독성을나타내지않았으며, melan-a 세포내의 tyrosinase의활성은농도의존적으로감소하는경향을보여주었다. Melan-a 세포에서의멜라닌합성저해활성은농도의존적으로감소하였으며, 80 um 처리군에서대조군대비 P value 0.01이하의유의적인결과를나타내었다.

77 그림 51. Picrionoside A의멜라닌합성저해활성 (A) Structure of picrionoside A, (B) Cytotoxicity, (C) Tyrosinase activity, (D) Melanin contents was measured in melan-a cells. The results are averages of triplicate experiments, and the data are expressed as means ± S.D., Each values are expressed a mean ±SD of triplicate determinations. ** P<0.01versusof the control group. - Picrinoside A의생체내멜라닌합성저해활성을연구하기위하여앞선실험과같이제브라피쉬배아모델을이용하여활성을연구하였다. 양성대조군으로 PTU를사용하였으며 picrinoside A는 40 과 80 μm농도로제브라피쉬배아에처리하여제브라피쉬내에서의멜라닌스팟을확인하는방법으로멜라닌합성저해활성을측정하였다. 80 μm을처리한그림 52에서는대조군인 A와비교하여서머리부분 (a) 배아부분 (b) 과배아와꼬리부분의경계부분 (c) 에서현저한차이를보여주고있다.

78 그림 52. 제브라피쉬모델에서 Pricrinoside A 의멜라닌합성저해활성 라. 기타연구결과 - C32번 (panasenoside), C33번 (ginsenoside Ia), C34번 (ginsenoside Rd2) 와 C35번 (notoginsenoside Fe) 의 melan-a 세포상에서의멜라닌생합성저해연구들이수행되었으며, 미백활성의활성기작에대한연구들이수행될예정이다.

79 그림 53. new compounds (C32, C33, C34 and C35) 의세포독성및멜라닌합성저해연구

80 4. 발효를통한고기능성인삼부산물소재개발 (1) 인삼지상부발효를위한사포닌전환균주의선발 인삼의뿌리와잎, 줄기, 열매를각각같은조건으로추출한후 HPLC 분석한결과, 인 삼의지상부에는다량의 major ginsenoside 가존재하며특히, PPT type 의 ginsenoside Re 가뿌리에비하여 10 배이상많은것으로확인되었다. 표 16. 인삼잎, 줄기, 열매와뿌리의 ginsenoside 함량차이분석 (mg/g) - 함량적차이를비교해보았을때, 인삼의지상부인잎과열매에서가장많은 ginsenoside가존재함을알수있었다. 뿌리의경우주로 ginsenoside Rb1과같은 PPD type의 major ginsenoside이가장많은비율을차지하는반면잎, 줄기, 열매에서는 ginsenoside Re, Rg1과같은 PPT ginsenoside의비율이높은것으로확인되었다. 특히 ginsenoside Re는뿌리에비하여 8.75 배에가까운양을가지고있어이를활용할경우다량의 ginsenoside를획득할수있을것으로기대되었다. 인삼의잎과열매에는높은함량의 PPT 타입 ginsenoside 뿐아니라많은양의 ginsenoside Rd가존재함을확인할수있었는데 Rd는인삼뿌리에도다량존재하는 PPD 타입의대표적인 ginsenoside로알려져있다. - 하지만, 이들 major ginsenoside의경우대다수가화장품소재에중요시되는미백, 주름개선, 항염등에는뚜렷하게뛰어난약리적효과를나타내지못하고있어이를직접적으로활용하기에는기존소재대비경쟁력이떨어질것으로판단된다. 따라서본 2차년도과제에서는기존의 major ginsenoside를피부에효과가있는특정 minor ginsenoside로전환시키고자연구를진행하였다. 가. 인삼사포닌전환미생물의 screening - 김치및막걸리를비롯한국내의발효식품군을지역별로수집하여미생물을분리하기위한시료로활용하였다. 수집한시료를멸균증류수에 10-1부터 10-3 까지희석하여 MRS agar plate에 100 μl씩 smear한후 37, 190 rpm 3-4일배양하였다. Colony를취하여 esculin agar 배지에 streaking하여배지내의색깔변화를관찰하였다. β -Glucosidase는 esculin의 β-glucose를절단하고, 이때생성된 esculetin이배지내에

81 있던 ferric ammonium citrate와반응하여 plate상의 colony 주위에 black complex를형성하게된다. 따라서 colony 주위에 black complex가형성된균주들을 β-glucosidase 활성을가지는균주라고판단하였으며이를다시 37, MRS agar plate에계대배양하여순수하게분리하였다. 그림 54. 균주의 screening 및단일 colony 로계대 그림 55. β-glucosidase 활성균주의선발

82 나. 인삼사포닌전환활성분리균주의동정 - β-glucosidase의전환활성이확인된균주중실제로인삼사포닌과반응하여 minor 사포닌을생성하는균주가존재하는지확인하기위하여 major 사포닌과반응을시켜사포닌전환활성균주를재선발하였다. 그림 54. 인삼사포닌과균주와의반응을통한사포닌전환활성확인 - 균주를각각최적배양조건을이용하여배양한후이의배양액을이용하여인삼 ginsenoside와반응하였다. 인삼 ginsenoside과의반응시, 37 에서 5일간반응시킨후반응액에부탄올을첨가하여 ginsenoside 분획을얻어이를 TLC 혹은 HPLC를활용하여분석을하였다. Esculin agar 법을이용하여 glucosidase 활성이있는것으로확인되어진각각의 250개의균주를각각인삼 ginsenoside에반응시켜이를확인해본결과특이적으로 ginsenoside와의반응을통해 minor ginsenoside으로의전환이확인되었다. 이들균주는다른균주에비하여비교적 ginsenoside 전환활성이강한것으로확인된바본연구에서는이들균주중본과제목적에부합하는 minor ginsenoside를생산하는균주를선발하여후속연구를진행하였다.

83 다. 분리균주를이용한인삼 minor 사포닌의생성 - 분리균주의 16S rrna gene sequencing은제노텍에의뢰하였으며, NCBI data base를이용하여분리된균주와 type strain의 similarity(%) 를확인하였다. 균주들의 16S rrna 염기서열을 Clustal X program(thompson et al., 1997) 을이용하여일정하게정렬하고, gap는 BioEdit program으로편집하였다. 그림 55. 인삼사포닌전환활성균주의 16s rdna sequence - 균주들의진화과정을추적하는작업은 Kimura two-parameter model(kimura, 1983) 을 이용하였으며, MEGA 3 Program(Kumar et al., 2004) 의 neighbor-joining(saitou & Nei, 1987) 방법으로계통분류학적위치를결정하였다.

84 그림 56. 인삼사포닌전환활성균주의계통도 - 본균주의최적전환활성을알아보기위하여생장및반응조건별 β-glucosidase 활성 을확인하였다. - 분리균주는 L. pentosus와 98.9% 상동성을지닌균주로확인되었으며, 본연구팀에서는 strain GFC09로명명하여기존의균주와의분류학적특성비교검정을통한균주의신종으로서가능성여부를검증하고있다. 본균주는뛰어난 β-glucosidase 활성및사포닌전환활성을가진것이확인된바산업화적용을위한최적화연구를수행하였다. 본균주의배양에따른 β-glucosidase 활성의최적조건을확립하기위하여 p-nitrophenyl-β -D-glucopyranoside(p-NPG) 를 assay를실시하였으며, 균주의효소를함유한 20 mm sodium phosphate(ph 7.0) 에 p-npg를가하여 37 에서 10분간반응시킨후 1 M sodium carbonate 를첨가하여반응을중지시켜유리되는 p-nitrophenol(p-np) 의양을 405 nm에서흡광도를측정하였다. 효소활성 1단위 (unit) 는반응시간분당생성되는 p-nitrophenol 1umol을생성하는효소의양으로정의하였다. - Lactobacillus pentosus GFC09 균주를 colony를취하여 MRS에서 24시간배양한현탁액을 LB, NB, TSB, MRS에 1%(v/v) 씩접종한후 190 rpm, 37 조건에서배양하여 4시간마다 O.D. 600 값을측정하여균주의생장을확인하였다 (Fig. 16). L. pentosus LH6 균주는 LB, TSB, MRS에서배양 4시간까지는유사하였지만 8시간이후부터는 MRS에서가장잘생장하였으며균주의생장속도는 MRS>TSB>LB>NB 순으로나타났다.

85 그림 57. 배양조건별균주생장분석 - L. pentosus GFC09 균주를 MRS broth에접종하여배양온도를각각 22, 25, 30 및 3 7 로 24시간배양하여 O.D 600 값을측정하였다그결과 L. pentosus LH6 균주의생장은온도의영향을많이받았다. L. pentosusgfc09균주는 30 와 37 에서가장높은생장속도를보였고 25, 22 순으로생장속도가느려지는것을확인할수있었다. - MRS broth를 HCl과 NaOH를이용하여 ph를조절한후 L. pentosus GFC09 균주를접종하여 24시간배양하였다. L. pentosus GFC09 균주는 ph 5.5에서부터 8.0 범위내에는큰차이없이모두잘생장하는것을알수있었다. MRS broth 자체의 ph가 6.7이기때문에아래의실험에서 ph를조절하지않고직접균배양에사용하였다. - L. pentosus GFC09 균주를 MRS broth에서호기성조건하에서 37, 190 rpm에서배양하면서균의생장정도를관찰하였다 (Fig. 17A). L. pentosus GFC09 균주를 MRS broth에서각각 O.D 600 값 (0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0) 별로배양한후조효소액을조제하여 0.2 mm ginsenoside Rd와 72시간반응시켜 TLC로분석한결과 ginsenoside Rd는 O.D ~2.0에서는 O.D 600 값크기에관계없이모두분해가잘되

86 어 L. pentosus GFC09의강한 ginsenoside Rd의분해능력을나타내었다. O.D , 1.25, 1.5, 1.75, 2.0에서는주로 F 2 와 compound K band를관찰할수있고 O.D 와 1.0에서는대부분 compound K로전환되는것을관찰할수있으며그중 O.D 에서가장강한 compound K로의전환능력을나타냈다 (Fig. 17B). 따라서 ginsenoside Rd로부터 F 2 로의전환효소는 O.D 600 값 0.5부터 2.0사이에서큰차이가없이잘생산이되고 ginsenoside F 2 로부터 compound K로의전환효소는 O.D 사이에서가장많이생산되었다. 그림 58. 최적조건탐색에따른사포닌전환확인

87 (2) 인삼잎발효추출물로부터활성성분의분리및동정 - 본실험에사용한인삼잎발효추출물은 1세부에서발효한것을사용하였다. Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60 (Merck, Germany) 을 octadecyl silica (ODS) gel은 Waters ODS 125 A Å μm를사용하였다. Thin layer chromatography (TLC) 는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254S(Merk) 를사용하였고, 실험에이용한모든시약은특급시약을사용하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400 (Varian, USA) 으로측정하였고, UV lamp는 Spectrolone (Model EVF-240 C/F, Spectronics Corporation, USA) 을사용하였다. 가. 인삼잎발효추출물고합유분획물의제조 - 건조하여분쇄한후가루상태의인삼잎발효추출물 300 g을제공받아실험을진행하였다. 건조상태의가루추출물을 n-hexane (660 ml) /H2O(660ml) 로 1회분배추출하였고, 다시 H2O층을 EtOAc : n-buoh (20:2) (660 ml)/ H2O(660ml) 로 1회분배추출하였다. 각층을감압농축하여, n-hexane 분획과 EtOAc : n-buoh (20:2) 분획 (FPLE, 16 g) 및 H2O분획을얻었다.(Fig. 1). - 각분획에대한성분을 TLC 로확인한결과, EtOAc : n-buoh (20:2) 분획에비극성사 포닌으로확인되는물질들이많았기때문에 EtOAc : n-buoh (20:2) 분획 ( 고함유분획 ) 에 서화합물들을분리하고자하였다. Fig. 59. Franctionation procedure of extracts from the Fermented Panax ginseng leaf

88 나. 인삼잎발효물 EtOAc : n-buoh (20:2) 분획물로부터활성성분의분리및정제 - 위에서얻어진 EtOAc : n-buoh (20:2) ( 이하 EB) 분획 16 g 을 SiO2 column chromatography( 이하 c.c.) (Ø 7.5 cm x 15 cm, n-hexane-etoac = 10:1 5:1 1:1 1:3 CHCl3-MeOH=8:1 5:1) 를실시하여 180 ml씩분취하였다. 각분취액을 TLC(CHCl3-MeOH=7:1,5:1) 로확인하여, 유사한부분을함께모으로, 농축하여 21개의분획물 (FPLE-1~FPLE-21) 을얻었다. FPLE-18 분획 [1.6 g, Ve/Vt ] 에대하여 SiO2c.c.(Φ cm, CHCl3-MeOH-H2O=36:3:1, 5.0L) 를실시하여총 12개의분획물 (FPLE-18-1~FPLE-18-12) 을얻었다. FPLE-18-7 분획 [726.0 mg, Ve/Vt ] 에대하여 Waters ODS c.c.(φ cm, MeOH-H2O=1:1, 11L) 를실시하여 FPLE (Rk1, mg) 단일물질을얻었다. FPLE 분획 [67.2 mg, Ve/Vt ] 에대하여 SiO2c.c.(Φ cm, CHCl3-MeOH-H2O=45:3:1, 8L) 를실시하여 FPLE (Rh3,7.1mg), FPLE (noto-F1, 15.9mg) 단일물질을얻었다.(Fig. 60.) Fig. 60. Isolation procedure of EtOAc : n-buoh fraction from the Fermented Panax.ginseng leaf

89 (3) 인삼부산물의진세노사이드프로파일링 - 인삼부산물에함유된극미량농도의목적성분및미지성분까지도정성적분석을할수 있는분석장비인 UPLC/Q-TOFMS 를이용하여분석법확립하였다. 확립한분석법을사 용하여발효부산물의잎과열매에서의추출물을분석하였다. - 1 차년도및 2 차년도에서인삼열매및지상부로부터분리및정제한 standard compounds 를이용하여각각의이온화조건을셋업하고부산물내주요대사체의최적 분리조건을설정하기위해 chromatography 최적분석조건설정함. 〇 LC conditions Instrument : Waters ACQUITY H-Class UPLC (Waters Corp.) Column : ACQUITY BEH C18 column (2.1 mm 100 mm, 1.7 µm) Column Temperature : 40 Injection Volume : 2 ul Solvent A : 5% acetonitrile + 0.1% formic acid (v/v) Solvent B : 95% acetonitrile + 0.1% formic acid (v/v) Flow rate : 0.45 ml/min Solvent gradient Table min B% 〇 MS conditions Ion Source: ESI negative mode Cone Voltage: 40 V Capillary: 3.0 kv Source Temperature: 120 Desolvation Temperature: 300 Cone Gas Flow: 30 L/h Desolvation Gas Flow: 600 L/h Mass range: m/z - 그결과, 인삼발효잎에서는 43 개의진세노사이드를효과적으로분리하고동정하였고, 인 삼발효열매에서는 33 종의진세노사이드를효과적으로분리하고동정하였다.

90 그림 61. 인삼발효부산물의내 2 차대사체크로마토그램 ( 상 : 발효인삼잎, 하 : 발효인삼열매 )

91 (4) 발효인삼부산물을이용한미백관련전임상연구 가. 발효인삼부산물 crude extract 들의미백효능검증 - 발효인삼부산물 crude extract 의미백효능을검증하기위하여먼저가장간단한 in vitro 활성측정법인 mushroom tyrosinase 의저해활성을아래와같이검증하였다. 평가방법 * 멜라닌합성저해능평가 - C57BL/6 마우스에서유래한 immortalized cell line 인 melan-a 세포를이용하였다. Melan-a 세포의배양은 10% fetal bovine serum, streptomycin-penicillin (100 mg/ml) 과 200 nm 12-ο-tetradecanoylphorbol-13-acetate가포함된 RPMI-1640 배지를사용하여 37, 5% CO2의환경에서세포주를배양하여사용하였다. - Melanin 생합성저해활성을보기위한구체적실험방법은 Melan-a 세포 1 105개를 24-well plate의각 well에분주하여하룻밤배양하여실험에사용하였다. 각샘플을농도별로배지에처리하여 4일동안배양했다. 이후 phosphate-buffered saline으로세척하고 0.85N KOH를 250 μl 씩각 well에처리하여용해시켰다. 용해된세포를 96 well plate로옮겨 microplate reader (Bio-Rad 3550) 를사용하여 optical density를 405 nm 에서측정하고 melanin 생성억제율은대조군과대비해 % 로계산한다. * Tyrosinase 저해활성측정 - Tyrosinase에대한저해활성은 96 well plate (SPL, Korea) 에 0.1 M phosphate buffer (ph 6.5) 150 μl, 1.5 mm L-tyrosine solution 25 μl와 2100 unit/ μl mushroom tyrosinase (Sigma, 0.05 M phosphate buffer, ph 6.5) 7 μl을넣은후, sample을 15 μl처리하여 25 에서 1시간반응시킨후, microplate reader (Bio-Rad 3550) 를사용하여 optical density를 490 nm에서측정하였다. Tyrosinase에대한저해율 (%) 은다음식에의하여계산한다. 저해율 A : 저해제를넣은것의반응전흡광도 B : 저해제를넣은것의반응후흡광도 흡광도 흡광도 C : 저해제를넣지않은것의반응전 D : 저해제를넣지않은것의반응후 * 제브라피쉬 (zebrafish) 멜라닌합성저해실험 - 형태학적관찰 성숙한제브라피쉬암수를알채취전날알채취용수조에넣고다음날광주기시기 1-2

92 시간이후에알을채취하였다. 채취된알은 zebrafish embryo medium에넣고 24시간발생시킨후각샘플을농도별로처리하였다. 샘플처리시코리온 (chorion) 의샘플투과정도를알수없기에각알의코리온에구멍을내어처리하였고, 샘플처리후 24시간이후샘플의독성이나타난알은제거하고, 나머지알의코리온을완전제거후 2번째샘플을처리하였다. 샘플처리 48 시간이후에대조구대비샘플처리구의색소발생정도를실체현미경으로관찰하였다. - 멜라닌함량및 tyrosinase activity 측정각그룹당 60mm dish에서 2일간자란 60 마리의 zebrafish 유충 (larva) 의코리온을제거하고샘플을처리한후 48 시간배양하였다. 배양후 zebrafish를수거하여 Protein extraction solution을첨가한다음 sonication을이용하여 lysis 시킨다. 원심분리후상등액은 L-DOPA를이용하여 tyrosinase activity 를측정하고남은 pallet은 NaOH를이용하여멜라닌양을측정한다. - 그결과, 양성대조군인 kojic acid 보다는저해활성이높지는않지만, NIHHS19 추출물을 제외하고모든샘플에서농도의존적으로 tyrosinase 활성이감소됨을관찰하였다. Figure 62. Inhibitory effect of crude extract from P. ginseng on the mushroom tyrosinase activity. Tyrosinase was preincubated with test compounds at 25 for 10 min prior to incubation with L-tyrosin for 30 min and the absorbance was determined at 490 nm.

93 - crude extract 의미백효능을검증하기위하여 melan-a 세포를이용하여 in vitro 효능을 검증하였으며, in vitro 상에서의세포증식과멜라닌합성에미치는효능은아래와같다. Figure 63. Effects of 11 crude extract isolated from P. ginseng on cytotoxicity and melanogenesis in melan-a cells. - 대부분의추출물은 200 µg/ml의처리농도까지세포독성이나타나지않았지만, 200 µg/ml의 15-2 추출물처리군과, 열매성숙, 열매발효 100, 200 µg/ml의농도에서독성을나타내었다. melan-a 세포를이용한멜라닌합성에미치는영향들이연구하였다. 잎발효, 잎미발효추출물은 200 µg/ml의농도에서각각 26.2, 19.7% 의높은멜라닌합성저해능이측정되어더추가적인멜라닌합성저해활성을비교하였다.

94 나. 발효인삼잎추출물의미백효능검증 - 발효인삼잎추출물의미백효능을검증하기위하여 melan-a세포를이용하여 in vitro 효능을검증하였으며, in vitro상에서의세포증식과멜라닌합성에미치는효능은아래와같다. Figure 64. Effects of leaves extracts of P. ginseng on melanogenesis in melan-a cells. Inhibition of melanin synthesis was measured with triplicate experiment. The cells were cultured with ug/ml of extracts for 3 days. - 발효인삼잎및인삼잎추출물의농도별멜라닌생성억제활성을 melan-a세포배양에서확인하였다. 세포독성이보이지않는 200 ug/ml 이하의농도까지처리하였을때발효추출물이 200 ug/ml의농도에서처리농도까지세포독성을보이지않았고, 200 ug/ml의농도로처리하였을 28% 의저해능을보여잎비발효물보다월등히높은멜라닌합성저해능을확인할수있었다. - 이들결과로보아가장활성이좋은발효추출물의멜라닌합성기전을연구하였다. Figure 65. Effects of fermented leaves on cell protein expression in melan-a cells. The cells were cultured with 0~200 µg/ml of for 0~8h. Whole-cell lyasate

95 were then subjected to western blot analysis using antibodies against p-akt, AKT, p-erk and ERK. - 발효추출물의멜라닌합성저해기전을알아보기위하여멜라닌합성에기전에관련한 AKT와 ERK 단백질의발현정도를 western blot을이용하여확인하였다 (Figure 20). 잎발효추출물을 melan-a 세포에처리하였을때 p-akt와 p-erk의 4시간처리시가장높은발현량을관찰하여잎발효추출물을농도별로 4시간처리하였다. 그결과농도의존적으로 p-akt의농도가증가됨을확인하여잎발효추출물은 phsphorlyation AKT 경로를통해서멜라닌합성을저해시키는것으로사료된다. Figure 66. Effects of fermented leaves on melanogenesis in zebrafish. Synchronized embryos were treated with melanogenic inhibitors at the indicated concentrations. 잎발효 were dissolved in 0.1% DMSO then added to the embryo medium. The effects on the pigmentation of zebrafish were observed under the stereomicroscope. - 이들결과들을 in vivo모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였다 (Figure 20). 모든잎추출물은처리하지않은대조군에비해멜라닌스팟이전체적으로감소되는결과를보였으며그중잎발효추출물이가장좋은멜라닌합성저해능을보였다.

96 다. 인삼발효부산물의항염증효과 - 인삼발효부산물들의항염효과를측정하기위해 Raw 세포를배양하고이들로부 터생산되는산화질소 (NO) 와염증성사이토카인들의발현에미치는영향을측정하였다. Figure 67. The effect of cell viability and nitric oxide production of crude extracts on the murine macrophage cell (Raw 264.7). Murine Raw cells were incubated for 24 hours with the indicated concentrations of extracts. - 인삼부산물추출물의 Raw264.7 세포에대한세포독성을실험해본결과, 15-9 (100 ug/ml), (100 ug/ml), 잎발효 (200 ug/ml), 15-7 (100, 200 ug/ml), 열매성숙 (100, 200 ug/ml), 열매발효 (300 ug/ml), 19 (100 ug/ml) 의고농도에서독성을나타내어독성이없는시료의농도까지 NO 생성능을측정하였다. 인삼부산물중잎비발효, 열매미성숙추출물을 200 ug/ml의농도로처리한군에서각각 25.2, 24.0 % 의 NO생성저해율을보였고농도의존적으로 NO 생성을저해하는활성을보였다.

97 Figure 68. The effect of crude extracts on the TNF-α and IL-6 production by macrophage. Murine Raw cells were incubated for 24 hours with the indicated concentrations of extracts. E. coli lipopolysaccharide (LPS: 0.2µg/ml) was used as a control. - Cytokine은감염, 면역반응, 염증등을매개하는조절자이다. Cytokines에따라서질병을악화시키거나 (proinflammatory cytokine), 혹은염증을약화시키고개선시키는 (anti-inflammatory cytokine) 작용들을수행한다. 이들중 Major proinflammatory cytokines은 Interleukin-6와 (tumor necrosis factor) TNF-α이다. 특히 TNF는생체내로주입되면발열, 염증과조직에상해를주며심하면쇼크와죽음에도이르게한다. - 본실험에서는염증반응의지표인자인 proinflammatory cytokine의생성에미치는시료들의영향을알아보기위하여 nitric oxide 생성저해능실험과동일한농도로처리하여분석하였다, 그결과 NO 생성저해능과같이잎비발효와, 열매미성숙추출물에서 proinflammatory cytokine의분비가거의일어나지않는것으로보아높은항염증효과를나타내었다.

98 라. 발효인삼잎추출물의항염효과 Figure 69. The effect of ginseng leaves on the nitric oxide, TNF-α and IL-6 production by macrophage. Murine Raw cells were incubated for 24 hours with the indicated concentrations of extracts. E. coli lipopolysaccharide (LPS: 0.2µg/ml) was used as a control. - 인삼잎비발효추출물에대한항염효과를실험해본결과농도의존적으로 NO 생성능, TNF-α, IL-6 생성능이현저하게저하됨을관찰하였다. 특히, proinflammatory cytokine 인대조군인 LPS로염증을자극한군에비해 TNF-α는 92.1%, IL-6는 100% 생성능이저해되었다. Figure 70. The effect of young berry on the nitric oxide, TNF-α and IL-6 production by macrophage. Murine Raw cells were incubated for 24 hours with the indicated concentrations of extracts. E. coli lipopolysaccharide (LPS: 0.2µg/ml) was used as a control. - 또한인삼열매미성숙추출물에대한항염효과를실험해본결과농도의존적으로 NO 생성능, TNF-α, IL-6 생성능이현저하게저하됨을관찰하였다. 특히, proinflammatory cytokine인대조군인 LPS로염증을자극한군에비해 200 ug/ml의처리농도에서급격하게 TNF-α는 96.4%, IL-6는 100% 생성능이저해되었다. 이와같은결과로보아열매미성숙추출물은 200 ug/ml이상의농도에서항염효과를보이는것으로사료된다.

99 19. 발효인삼부산물로부터분리된 Compound 의미백관련전임상연구 가. 발효인삼부산물로부터분리된 single compound들의미백효능검증 - 분리된 single compounds의미백효능을검증하기위하여 mushroom tyrosinase activity 및 melan-a세포를이용하여 in vitro 효능을검증하였으며, in vitro상에서의세포증식과멜라닌합성에미치는각각 single compound들의효능은아래와같다. Figure 70. Inhibitory effect of single compounds from fermented P. ginseng on the mushroom tyrosinase activity. Tyrosinase was preincubated with test compounds at 25 for 10 min prior to incubation with L-tyrosin for 30 min and the absorbance was determined at 490 nm. - Single compound 에대한 mushroom tyrosinase 의저해활성을아래와같이검증한그 결과, 양성대조군인 kojic acid 는높은저해활성을보였지만모든 single compound 가 mushroom tyrosinase 에대한저해활성을나타내지는않았다.

100 Figure 71. Effects of 8 single compounds isolated from P. ginseng (Rh3, Rk2, Rk1, Rh6, Rg6, XVII, F3 and PGSH-1) on cytotoxicity and melanogenesis in melan-a cells. - 대부분의단일물질들은 80 µm의처리농도까지세포독성이나타나지않았다. 그러나 Rk2는 80 µm의농도에서독성을나타내었고, PGSH-1은모든농도에서 Melan-a 세포에대해독성을나타내었다. 이들단일물질이 melan-a 세포를이용한멜라닌합성에미치는영향들을연구하였다. 그결과 Rh6와 PGSH-1을제외한모든화합물에서농도의존적으로멜라닌의합성이감소됨을보여주었다. 특히 Rh3, Rk1, XVII, Fe 단일물질은농도 80 µm의농도에서각각 31.8, 38.3, 27.9, 41.7 % 의멜라닌합성저해능을나타내었고 Rk2 80 µm에서의저해효과는독성으로인한효과라사료되어독성이없는범위인 40 µm에서 44.6% 의뛰어난멜라닌합성저해능을관찰하였다. 따라서효과가좋은 Rh3, Rk2, Rk1, XVII, Fe를이용하여멜라닌합성저해를연구하였다.

101 나. Ginsenoside Rh3 (Rh3) 의멜라닌합성저해효능연구 Figure 73. Effects of ginsenoside Rh3 (Rh3) on cell protein expression in melan-a cells. The cells were cultured with 0~80 µm of Rh3 for 8 or 72h. Whole-cell lyasate were then subjected to western blot analysis using antibodies against tyrosinase, TRP-1, TRP-2, p-akt, AKT, p-erk, ERK and MITF. Equal protein loading was confirmed using β-actin antibody. - Rh3의멜라닌합성저해기전을알아보기위하여멜라닌합성에관련한주요단백질인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF, p-akt, p-erk에대한단백질발현정도를 western blot을이용하여확인하였다 (Figure 3). 그결과 Tyrosinase, TRP-1, 2의발현이 40 µm의농도에서감소됨을확인하였다. 또한최근논문에의하면세포내신호전달단백질로알려져있는 AKT와 ERK의신호기전에의해멜라닌생합성의조절한다고알려져있다. 이에따라 Rh3가 melan-a 세포에서 AKT와 ERK를발현시키는지확인하였다. 그결과 Rh3의농도가증가할수록 phsphorlyation AKT 만증가되었고 ERK의변화는보이지않았다. 따라서 Rh3는 phsphorlyation AKT를통해서멜라닌합성을저해시키는것으로사료된다. Figure 74. Effects of ginsenoside Rh3 (Rh3) on melanogenesis in zebrafish. Synchronized embryos were treated with melanogenic inhibitors at the indicated concentrations. Rh3 were dissolved in 0.1% DMSO then added to the embryo medium. The effects on the pigmentation of zebrafish were observed under the

102 stereomicroscope. - 이들결과들을 in vivo모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였다. Rh3의멜라닌생성저해효과는 Figure 4와같이나타났다. Rh3 는농도의존적으로제브라피쉬성체에서의멜라닌스팟이줄어드는경향을나타내었다. 또한실험농도범위에서는어떤어독성도보이지않았다 다. Ginsenoside Rk1 (Rk1) 의멜라닌합성저해능연구 Figure 75. Effects of ginsenoside Rk1 (Rk1) on cell protein expression in melan-a cells. The cells were cultured with 0~40 µm of Rk1 for 8 or 72h. Whole-cell lyasate were then subjected to western blot analysis using antibodies against tyrosinase, TRP-1, TRP-2, p-akt, AKT, p-erk, ERK and MITF. Equal protein loading was confirmed using β-actin antibody. - Rk1의멜라닌합성저해기전을알아보기위하여멜라닌합성에관련한주요단백질의발현정도를 western blot을이용하여확인하였다 (Figure 5). 그결과 Tyrosinase, TRP-1, 2의발현이 40 µm의농도에서약간감소됨을확인하였다. 멜라닌생합성기전을확인하기위해 melan-a 세포에서 AKT와 ERK를발현시키는지확인하였다. 그결과 Rk1 의농도가증가할수록 phsphorlyation AKT와 ERK가증가되었다. 따라서 Rk1은 phsphorlyation AKT와 ERK 두경로를통해서멜라닌합성을저해시키는것으로사료된다. Figure 76. Effects of ginsenoside Rk1 (Rk1) on melanogenesis in zebrafish.

103 Synchronized embryos were treated with melanogenic inhibitors at the indicated concentrations. Rk1 were dissolved in 0.1% DMSO then added to the embryo medium. The effects on the pigmentation of zebrafish were observed under the stereomicroscope. - 이들결과들을 in vivo모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였다. Rk1의멜라닌생성저해효과는 Figure 6와같이나타났다. Rk1는처리하지않은대조군에비해멜라닌스팟이약간감소하기는하였지만농도의존적인결과를보이지않아 in vivo에서는큰효과를보이지않았다. 라. Gypenoside XVII (XVII) 의멜라닌합성저해능연구 Figure 77. Effects of gypenoside XVII (XVII) on cell protein expression in melan-a cells. The cells were cultured with 0~40 µm of XVII for 8 or 72h. Whole-cell lyasate were then subjected to western blot analysis using antibodies against tyrosinase, TRP-1, TRP-2, p-akt, AKT, p-erk, ERK and MITF. Equal protein loading was confirmed using β-actin antibody. - XVII의멜라닌합성저해기전을알아보기위하여멜라닌합성에관련한주요단백질의발현정도를 western blot을이용하여확인하였다 (Figure 7). 그결과 Tyrosinase, TRP-1의발현이 40 µm의농도에서약간감소됨을확인하였다. 멜라닌생합성기전을확인하기위해 melan-a 세포에서 AKT와 ERK를발현시키는지확인하였다. 그결과 XVII의농도가증가할수록 phsphorlyation AKT와 ERK가증가되었다. 따라서 XVII는 phsphorlyation AKT와 ERK 두경로를통해서멜라닌합성을저해시키는것으로사료된다.

104 Figure 78. Effects of gypenoside XVII (XVII) on melanogenesis in zebrafish. Synchronized embryos were treated with melanogenic inhibitors at the indicated concentrations. XVII were dissolved in 0.1% DMSO then added to the embryo medium. The effects on the pigmentation of zebrafish were observed under the stereomicroscope. - XVII 단일물질에대한 in vivo 모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하 여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였다. XVII 는처리하지않은대조군 에비해멜라닌스팟이농도의존적으로현저하게감소되는결과를보였다. 마. Notoginsenoside Fe (Fe) 의멜라닌합성저해능연구 Figure79. Effects of notoginsenoside Fe (Fe) on cell protein expression in melan-a cells. The cells were cultured with 0~40 µm of Fe for 8 or 72h. Whole-cell lyasate were then subjected to western blot analysis using antibodies against tyrosinase, TRP-1, TRP-2, p-akt, AKT, p-erk, ERK and MITF. Equal protein loading was confirmed using β-actin antibody.

105 - Fe의멜라닌합성저해기전을알아보기위하여멜라닌합성에관련한주요단백질의발현정도를 western blot을이용하여확인하였다 (Figure 9). 그결과 Tyrosinase, TRP-2의발현이 40 µm의농도에서약간감소됨을확인하였다. 멜라닌생합성기전을확인하기위해 melan-a 세포에서 AKT와 ERK를발현시키는지확인하였다. 그결과 Fe의농도가증가할수록 phsphorlyation AKT와 ERK가증가되었다. 따라서 Fe는 phsphorlyation AKT와 ERK 두경로를통해서멜라닌합성을저해시키는것으로사료된다. Figure 80. Effects of notoginsenoside Fe (Fe) on melanogenesis in zebrafish. Synchronized embryos were treated with melanogenic inhibitors at the indicated concentrations. Fe were dissolved in 0.1% DMSO then added to the embryo medium. (A) The effects on the pigmentation of zebrafish were observed under the stereomicroscope. (B) Total melanin content was quantified using a spectrometer. For measurement of tyrosinase activity, 250 ìg of total protein was incubated with L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (final 0.5 mm) and then quantified using a spectrometer. Each value is expressed a mean ± SD of triplicate determinations. - 이들결과들을 in vivo모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였다 (Figure 10). Fe를처리하지않은대조군에비해멜라닌스팟이농도의존적으로현저하게감소되는결과를보였다. 제브라피쉬의멜라닌생합성저해실험에서사용되는대표적인양성대조군인 PTU에비해서는멜라닌함량이높았으나, 아무것도처리하지않은대조군에비해서는멜라닌함량이약간줄어들었다. 또한제브라피쉬체내에서의 tyrosniase 활성을측정하기위해제브라피쉬에서 tyrosinase를분리하여 L-DOPA를기질로효소활성을측정해본결과 Fe 40 µm 처리한

106 그룹에서 22.7% 의 tyrosinase 저해활성을보여높은멜라닌저해활성에미치는것을 사료된다. 바. Ginsenoside Rk2 (Rk2) 의멜라닌합성저해능연구 - 인삼부산물유래의 single compound 중가장활성이좋은 Rk2 에대한멜라닌합성저 해능을연구하였다. Figure 81. Effects of ginsenoside Rk2 (Rk2) on tyrosinase activity in melan-a cell. 100 µg of total protein was incubated with L-3,4-dihydroxyphenylalanine and then quantified using a spectrometer. Each value is expressed a mean ± SD of triplicate determinations. - 멜라닌합성에관여하는효소인 tyrosinase 의활성을 Rk2 에의해세포내에서저해하는 지를조사하였다. 그결과농도의존적으로 Rk2 에의해서 tyrosniase 활성의저해됨을확 인하였다. 따라서 tyrosinase 활성저해에의해서멜라닌합성이저해된다고사료된다. Figure 82. Effects of ginsenoside Rk2 (Rk2) on cell protein expression in melan-a

107 cells. The cells were cultured with 0~40 µm of Fe for 8 or 72h. Whole-cell lyasate were then subjected to western blot analysis using antibodies against tyrosinase, TRP-1, TRP-2, p-akt, AKT, p-erk, ERK and MITF. Equal protein loading was confirmed using β-actin antibody. - Rk2의멜라닌합성저해기전을알아보기위하여멜라닌합성에관련한주요단백질의발현정도를 western blot을이용하여확인하였다 (Figure 12). 먼저 melan-a 세포에 72h동안 Rk2를처리한후Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의발현을조사해본결과, Tyrosinase와 MITF의발현이감소됨을확인하였다. 멜라닌생합성기전을확인하기위해 melan-a 세포에서 AKT와 ERK를발현시키는지확인하였다. Rk2를 melan-a 세포에처리하였을때 p-akt와 p-erk의 8시간처리시가장높은발현량을관찰하여 Rk2를농도별 8시간처리하였다. 그결과농도의존적으로 p-akt와 p-erk의농도가증가됨을확인하여 Rk2는 phsphorlyation AKT와 ERK 두경로를통해서멜라닌합성을저해시키는것으로사료된다. Figure 83. Effects of ginsenoside Rk2 (Rk2) on melanogenesis in zebrafish. Synchronized embryos were treated with melanogenic inhibitors at the indicated concentrations. Rk2 were dissolved in 0.1% DMSO then added to the embryo medium. (A) The effects on the pigmentation of zebrafish were observed under the stereomicroscope. (B) Total melanin content was quantified using a spectrometer. For measurement of tyrosinase activity, 250 ìg of total protein was incubated with L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (final 0.5 mm) and then quantified using a spectrometer. Each value is expressed a mean ± SD of triplicate determinations.

108 - 이들결과들을 in vivo모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였다 (Figure 13). Rk2를처리하지않은대조군에비해멜라닌스팟이농도의존적으로현저하게감소되는결과를보였다. 또한제브라피쉬의멜라닌생합성저해실험에서사용되는대표적인양성대조군인 PTU에비해서는멜라닌함량이높았으나, 아무것도처리하지않은대조군에비해서는멜라닌함량이농도의존적으로감소하였으며, 제브라피쉬체내에서의 tyrosniase 활성을측정하기위해제브라피쉬에서 tyrosinase를분리하여 L-DOPA를기질로효소활성을측정해본결과도농도의존적으로 tyrosinase 활성이저해되는결과를보였다. (5) 인삼지상부발효물의주름관련 in vitro 효능검정 가. 세포생존율시험 - 살아있는세포내의미토콘드리아에존재하는탈수소효소는 Tetrazolium Salt(WST) 에서 formazan이라는발색물질을생성한다. 따라서이를측정하여살아있는세포의수를측정할수있다. 96 well cell culture plate에 cells/well 농도의 RAW264.7 세포를 seeding하고 10% fetal bovine serum(fbs), 1% Penicillin/ Streptomycin이첨가된 DMEM 배양액으로 24시간배양한다. 그후시료가농도별로포함된 DMEM (1% Penicillin/Streptomycin) 배지로교체하여 24시간배양한다. 배양이끝난세포에 EZ-CYTOX 시약을이용하여세포생존율을측정하였다. *cell viability(%) = 시험물질첨가군흡광도 / 무첨가군흡광도 ) 100 그림 85. 인삼지상부발효물의세포독성 - 세포독성농도를분석한결과발효전후모두 200ug/ml 까지의모든농도에서세포독 성이나타나지않아안전한원료임을확인하였다.

109 나. DPPH assay ( 항산화분석 ) - 시료의항산화활성측정을위해 DPPH 라디컬소거활성시험을수행하였다. 시료를농도별로희석하여준비하며, 대조군으로 Ascorbic acid를사용한다. 각시험물질 50μl에 0.1mM DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 250μl, EtOH 200μl을넣고 4 에서 30 분간반응시킨후 520nm에서흡광도를측정하여 DPPH라디칼의농도를확인한다. 소거활성 시험물질첨가군흡광도무첨가군흡광도 * IC50 : DPPH 라디칼 50% 를소거하는데필요한시료의농도 그림 86. 인삼지상부발효전후의 DPPH 소거능 - DPPH 라디컬소거활성시험을수행결과인삼지상부의발효후항산화효과가비약적으로증대되는것을확인할수있었다. 인삼지상부일반추출물또한높은항산화활성을가지는것이관찰되었지만두처리구의 IC50값을비교하여볼때약 2배이상의농도차이를보여, 인삼지상부를발효하였을때가보다높은활용가치를가지는것으로사료되었다.

110 다. Elastase inhibition - 엘라스아타제 (Elastase) 는진피내피부탄력을유지시키는데중요한기질인 elastin을분해하는효소이다. 또한 elastase는다른중요한기질단백질인 collagen을분해할수있는비특이적가수분해효소이다. 따라서 elastase 저해제는피부주름을개선하는작용을한다고볼수있다. Elastase는동물결합조직의불용성탄성섬유단백질인 elastin을분해시켜피부의진피조기의그물망구조결합을끊어줌으로서주름생성의주원인인효소로알려져있다. 피부의진피조직속에는 collagen과피부의탄력성에관련된 elastin이그물망구조를형성하고있는데, 이러한그물망구조가깨어지면서즉 elastin이 elastase 에의해분해되어피부가처지고주름이생기므로내인성피부노화가발생한다. 그러므로피부노화의주원인중의하나인 elastin 분해효소인 elastase의활성을저하시킴으로서피부노화를억제할수있다. 인삼지상부추출물및발효물을농도로희석하여시료를 40μl를 E-tube에취하고, 10mM Tris-HCl buffer(ph8.0) 에녹인 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide (S4760, Sigma) 1.6 mm 농도의기질 200μl를가한후, 10mM Tris-HCl buffer(ph8.0) 에녹인 Elastase from porcine pancreas Type Ⅳ (E0258, Sigma) 0.4U/mL의효소를 40μl첨가하여 25 에서 5분동안반응한후 Multireder기를이용하여 410 nm에서흡광도를측정하였다. *Elastase inhibition(%) = 100-( 시험물질첨가군흡광도 / 무첨가군흡광도 ) 100 그림 87. 인삼지상부발효전후의 Elastase inhibition 활성 - Elasatse 억제시험을수행결과인삼지상부추출물및발효물모두농도의존적으로항주름활성이증대되는것을확인할수있었다. 특히, 10ug/ml 농도하에서는발효후샘플이발효전에비하여약 30% 이상활성이증대되는것을확인할수있었다. 이에인삼지상부추출물의발효시항주름활성이증대되는것을확인할수있었다.

111 라. Nitric Oxide test - RAW264.7 세포를 24well cell culture plate에 cells/well 농도로 seeding 한후 10% fetal bovine serum(fbs), 1% Penicillin/ Streptomycin이첨가된 DMEM 배양액으로 24시간배양한다. 그후 lipopolysaccharide(lps, 1ug/ml) 와시료가농도별로포함된 DMEM (1% Penicillin/Streptomycin) 배양액으로교체하여 24시간배양한다. 배양이끝난후세포배양액만수거하여 Nitric Oxide Detection kit (intron 21021) 시약을이용하여 NO 생성량을산출하였다. 그림 88. 인삼지상부발효전후의 NO inhibition 활성 - 시험결과 10ug/ml 농도에서부터 NO 저해효과가관찰되었다. 특히, 발효시에는저농도를사용하였을때도뛰어난억제효과를보여기존의 postive control로사용되는 dexa 5uM의효과와유사한활성을가지는것을확인할수있었다. 이에, 발효시효능증대효과로인하여저농도의사용으로도높은활성을기대할수있다.

112 마. MMP-1 Assay - 인삼지상부추출물의발효전 후의주름억제활성을확인하기위하여, MMP-1에대한 assay 실험을진행하였다. UVA의조사에의하여발현되는 MMP-1의억제활성을 Real-time PCR을통하여확인하였으며, 인삼열매발효추출물을농도별로조제하여처리함으로써 MMP-1의억제활성에영향을주는지확인하였다. 그림 90. 인삼지상부발효물의 MMP-1 억제활성평가 - 그결과, 인삼지상부추출물의발효전 후비교시발효를통한샘플이 MMP-1 억제활 성이보다뛰어난것을확인할수있었다. 바. Procollagen Type Ⅰ C-peptide(PIP) Assay - Collagen 들은세포내에서 Procollagen 이라는전구물질로합성된후세포외로분비되어 collagen 섬유로중합된다. procollagen 은아미노말단과카르복시말단에프로펩티드라는 펩티드염기서열을포함하고, 프로펩티드는 endopeptidase 에의해분리된다. - 본실험에서시료가인체진피섬유아세포의 procollagen 합성에미치는영향을조사하였다. 인삼지상부추출물을 hff 세포에각각의농도로처리하고 24시간배양후 Procollagen TypeⅠC-peptide(PIP) kit인 96well plate에각각농도별로처리한배양액을 100μl씩분주해주고 37 incubator에넣고 2시간동안반응시켜주었다. 그리고 D-PBS 로세척해준뒤, antibody-pod conjugate solution을각각 100μl씩분주해주고 37 incubator에넣고 1시간동안반응시켜주었다. 다시 D-PBS로세척해준뒤, substrate solution (3,3',5,5'-Tetrametylbenzidine) 을각각 100μl씩분주해주고상온에서 15분간반응시켜주었다. 15분뒤, multi-reader기를이용하여 450nm에서흡광도를측정하였다. procollagen 양을조사한결과는그림과같다.

113 그림 91. 인삼지상부추출물의발효전, 후콜라겐생성활성결과. - 인삼지상부추출물의발효전 후비교시발효를통한샘플이 collagen 생합성에도훨씬높은콜라겐생성활성을보이는것을확인할수있었다. 그리고발효전 후의직접비교시인삼지상부추출물의발효후가발효전보다약 58% 이상의콜라겐생합성활성을가지는것을확인할수있었다. 이는일반적으로인삼뿌리에서존재하는발효전의 major ginsenoside 보다발효후생성되어지는 minor ginsenoside에서보다좋은주름억제효과가있었다는기존의연구결과와유사한결과로인삼뿌리뿐아니라인삼지상부에서도발효를통해전환된 minor ginsenoside에의하여주름에보다뛰어난효과를가지는것으로보여주는결과이다. 이를통해발효인삼지상부는기존의화장품소재로이용되는인삼뿌리와더불어높은경쟁력을갖출수있는소재로이용할수있을것으로판단된다.

114 (6) 인삼잎 / 줄기 / 열매발효물의화장품소재등록및임상시험. 인삼지상부발효물원료화를위한 ICID 등재 - 인삼지상부발효물의화장품원료화를위해서는 ICID 등재가우선시되어야하며, 이를 위해 PCPC 에화장품원료로서인삼지상부발효물을등록완료하였다. 그림 92. 인삼지상부발효물의 ICID 등재서류

115 (7) 인삼지상부를이용한화장품시제품개발 가. 인삼발효추출물을이용한크림제형제조 - 본연구를통하여확보된인삼지상부발효추출물을이용하여실제크림에적용하고이의안정성과효능을평가하고자하였다. 실험군으로인삼발효추출물이첨가된크림을대조군으로인삼추출물을첨가한크림을각각제조하여실험에이용하였으며각각에이용된제조처방은다음과같다. 표 19. 실험에이용된인삼지상부발효추출물크림제조처방 Trade Name INCI 함량 % MYRJ52S PEG-40 Stearate 0.60 Rheodol AS-10 Sorbitan Strearate 0.60 GMS 105 gylceryl Strearate 2.00 Rheodol MS-165 Glyceryl strearate/peg-100 stearate 2.00 A Kalcol 6870 Cetearyl alcohol 1.40 Stearic acid Stearic acid 2.00 C.E.H Cetyl Ethyl Hexanoate 6.00 Rheodol AO-15 Sorbitan sequioleate 3.00 Vitamin E acetate Tocopheryl Acetate 0.05 Soya SPL-75H Hydrogenated soybean Lecthin 0.10 A-1 KF-96-10CS Dimethicone 3.00 D.I Water Water D-EDTA EDTA 0.05 B 1.3-Butylene glycol Butylene glycol 3.00 Glycerin Glycerin % sodium hyaluronate Sodium hyaluronate 5.00 C 1% carbopol Carbomer D D.I water Water 2.00 T.E.A Trietanolamine 0.20 E 인삼발효추출물 1.00

116 표 20. 실험에이용된대조군크림제조처방 Trade Name INCI 함량 % MYRJ52S PEG-40 Stearate 0.60 Rheodol AS-10 Sorbitan Strearate 0.60 GMS 105 gylceryl Strearate 2.00 Rheodol MS-165 Glyceryl strearate/peg-100 stearate 2.00 A Kalcol 6870 Cetearyl alcohol 1.40 Stearic acid Stearic acid 2.00 C.E.H Cetyl Ethyl Hexanoate 6.00 Rheodol AO-15 Sorbitan sequioleate 3.00 Vitamin E acetate Tocopheryl Acetate 0.05 Soya SPL-75H Hydrogenated soybean Lecthin 0.10 A-1 KF-96-10CS Dimethicone 3.00 D.I Water Water D-EDTA EDTA 0.05 B 1.3-Butylene glycol Butylene glycol 3.00 Glycerin Glycerin % sodium hyaluronate Sodium hyaluronate 5.00 C 1% carbopol Carbomer D D.I water Water 2.00 T.E.A Trietanolamine 0.20 E 인삼추출물 공정방법은 A,B를각각 Water bath에중탕하여용해하고 A의용해가완료된후 A-1 계량하여혼합후가온용해한다. B를용해하여 Homomixer로혼합하여 C를첨가한다. 80 에서 A를첨가하여혼합하고 55 에서 D를첨가한다. 마지막으로 45 이하에서 E를첨가하여실험군을제조하고인삼추출물을첨가한것을대조군으로하였다. 나. 인삼지상부발효추출물이첨가되어진크림의안정성확인 - 제형을 1g을정밀하게달아 D.W 25ml을이용하여희석하고이에동량의부탄올을첨가하여 mixing 한후부탄올층만분획하였으며이과정을 2회반복하였다. 얻어진부탄올은감압농축하여다시 HPLC grade MeOH에용해시킨후이를 filtering 하여분석시료로이용하였다. 이는제조일로부터약 6개월간 ginsenoside 함량안정도를분석했으며, HPLC 분석은인삼산업법에서고시한방법을통해진행하였다. 본연구를통하여확보된인삼발효추출물을이용하여실제크림에적용하고이의안정성과효능을평가하고자하였다. 실험군으로인삼발효추출물이첨가된크림을대조군으로인삼추출물을첨가한크림을각각제조하여실험에이용하였다. 인삼발효추출물을이용하여제형에적용되었을때저장기간에따라인삼 ginsenoside의분해등의변화가있는지안정성을검사한결과 6개월까지제형이안정한것을확인하였다. 제조일로부터약 6개월이지난인삼발효추출물함유크림에들어있는 ginsenoside가일정하게유지되는것을확인할수있다. 이를제조직후대비하여함량 (%) 을계산하여표에나타내었다.

117 표 21. Gingsenoside 의 HPLC 함량분석 raw data 시간 표준품대비함량비 제조직후 개월경과후 개월경과후 - 분석결과초기 ~6개월까지의안정성에큰변화가없는것으로나타났다. Ginsenoside F1, C-K의경우 99% 대의제형안정성을보여주었고변환 Ginsenoside인 Rg2의경우에서도 99% 의높은안정성을보여본개발원료가장기간의보관에도안정적임을확인하였다. 다. 마스크팩제품개발 시제품및인삼원료가첨가된액상개발 - 본과제기간동안인삼을이용한액상 2 건을개발하여이것을시제품 2 종에적용하여 시제품 2 종을개발함. 1) Gold Supernova 및 Bio-Goldginseng 을이용한액상개발 - 마스크팩의실제효능을결정하는액상을 지에프씨에서는인삼원료를이용하여두가 지의원료로구분지어개발함 - Gold Supernova : 항산화와항주름기능이강화된원료기능성을강조 - Bio-Goldginseng : 항산화와미백효능을강조한원료기능성을강조 그림 93. 황금인삼을활용한원료 A. Gold Supernova B.Bio-Goldginseng>

118 2) 액상개발 - 마스크팩의기능성을결정하는액상에다음의처방을기본처방으로하여각각의원료를다양한농도로처리후최적농도인 3% 로결정하여최적농도로설정하고액상을제조함. 그러나차후지속적인품평을통하여사용감개선을위하여수정할예정임. 표 22. 마스크팩액상처방 마스크팩액상처방 Ingrediants INCI Name %w/w Phase 1 D.I Water Water D-EDTA Disodium EDTA Glycerin Glycerin D-Panthenol Panthenol Phase 2 70% 1,3-BG Butylene Glycol 원료 Phase 3 1,3-BG Butylene Glycol HCO-60 PEG-60 Hydrogenated Castor Oil Phase 4 Sodium hyaluronate (1% aq sol.) Water, Sodium hyaluronate Phase 5 Keltrol F (1% aq sol.) Water, Xanthan gum Total

119 3) 시제품제조 - 지에프씨는개발된액상을바탕으로실제마스크팩에적용하여시제품을개발을위하여 엔코스를통하여시제품제작을위탁함. 개발된액상을바이오셀룰로오스마스크팩에적용하고다양한마스크시트에적용하여샘플화를진행함. 그림 94. 다양한형태의시제품진행 4) 개발된시제품의사용감품평진행 마스크팩은사용시사용감과시트의착용감이매우중요한제품임. 따라서개발된액상을 적용한마스크팩시제품을실제사용후사용감을자체기준내에서품평함. - 실시예 : 바이오셀룰로오스시트를사용하여피부와시트의밀착력이매우높으며이 로인해사용후액상의잔여도가매우낮음. 그림 95. 마스크팩시제품및액상사용전후. - 마스크팩사용품평 : 실제 15분이상피부와접촉하는마스크팩의사용특성상사용자에따른품평이매우중요함. 따라서 5명의사용자를바탕으로사용감을품평함. 바이오셀룰로오스시트는사용시특유의답답함을느낄수없었으며밀착도가높아사용감을모두좋은평가를함. 액상역시사용후흡수도가높아잔존감을많이느낄수없었으며자극도가낮았다표품평함. 단향의경우인삼원료를사용하여인삼향이느껴지는데이것은선호도의차이가생길수있을것품평함.

120 표 23. 시제품의시트및액상의사용감. 평가항목 사용자1 사용자2 사용자3 사용자4 사용자5 사용감 A B A B A B A B A B 시트 밀착도 A B A B A B A B A B 자극도 A B A B A B A B A B 흡수도 A B A B A B A B A B 액상 자극도 A B A B A B A B A B 잔여도 A B A B A B A B A B 향 A B A B A B A B A B

121 라. 임상시험을위한발효인삼소재함유크림제품제품개발 본연구를통하여확보된인삼발효추출물을이용하여실제크림에적용하고이의안정성과효능을평가하고자하였다. 인삼발효추출물을이용하여제형에적용되었을때저장기간에따라인삼 ginsenoside의분해등의변화가있는지안정성을검사한결과 6개월까지제형이안정한것을확인하였다. < 표 24> 임상시험용시제품의처방 Trade Name INCI 함량 % MYRJ52S PEG-40 Stearate 0.60 Rheodol AS-10 Sorbitan Strearate 0.60 GMS 105 gylceryl Strearate 2.00 Rheodol MS-165 Glyceryl strearate/peg-100 stearate 2.00 A Kalcol 6870 Cetearyl alcohol 1.40 Stearic acid Stearic acid 2.00 C.E.H Cetyl Ethyl Hexanoate 6.00 Rheodol AO-15 Sorbitan sequioleate 3.00 Vitamin E acetate Tocopheryl Acetate 0.05 Soya SPL-75H Hydrogenated soybean Lecthin 0.10 A-1 KF-96-10CS Dimethicone 3.00 D.I Water Water D-EDTA EDTA 0.05 B 1.3-Butylene glycol Butylene glycol 3.00 Glycerin Glycerin % sodium hyaluronate Sodium hyaluronate 5.00 C 1% carbopol Carbomer D D.I water Water 2.00 T.E.A Trietanolamine 0.20 E 인삼발효추출물 1.00 위의표에따른임상시험용화장품 ( 크림타입 ) 의시제품을제조하였으며, 이때의인삼발 효물은 3 협동기관에서대량생산한발효인삼농축물을활용하였다.

122 < 그림 96> 임상시험용크림시제품의생산 본연구에서는위의크림을이용하여, 개발된인삼발효물에대한주름개선에대한 비고시기능성을식약처로부터인증받을계획이며이를위하여 3 차년도에주름개선및 피부안정성을위한임상시험을실시하였다.

123 가. 피부자극테스트 인삼발효물을함유한크림을 8 시간동안피부에첩포후각각 30 분, 24 시간, 48 시간경 과후시험부위의피부자극여부를판정하였으며일차자극테스트결과피험자모두피 부자극을나타내지않았으며, 이는 무자극 물질로판단된것을확인할수있었다. < 그림 97> 임상안정성평가

124 나. 피부주름개선효능테스트 준비단계시험부위인안면 ( 눈가 ) 부위의주름을측정하기위하여피험자들의측정조건을동일하게하고자시험부위를깨끗하고마른상태를유지하였으며최소 30분간항온항습 (22±2, R.H. 40~60%) 이유지되는곳에서피부안정을취한후진행하였다. 측정단계눈가주름측정주름측정은 PRIMOS(Phaseshift Rapid In-vivo Measurement Of Skin) 를이용하여눈가부위를측정하였고, 시험부위에대한정확한재현성을위해기존측정부위와새로운측정부위가동일할수있도록 overlay 기능을사용하여측정하였다. PRIMOS는미세주름을측정하기위한장비로 DMD(Digital Micromirror Device) 에서만들어진미세한줄무늬 (fringe fraction) 가피부에투영된다. 투영된영상은 3차원 profile 정보로나타나며필터과정을통해 PRIMOS프로그램 (GFM, Germany) 으로분석된다. PRIMOS 분석변수로는 Ra와 R3z를선정하였다. - Ra(Arithmetic roughness average) PRIMOS 로측정된주름의거칠기단면 peak 에대한산술평균값으로 Ra 값이작아질수록 피부주름의깊이가낮아져주름이개선됨을의미하며, 단위는μm이다. - R3z(Base roughness depth) R3z는 R3z1부터 R3z5까지 5가지의단일거칠기깊이에대한산술평균으로나타낸다. 단일거칠기깊이는거칠기단면의단일평가거리 (Ir) 에서세번째로높은단면 peak과세번째로깊은곡선사이의수직거리를의미한다. R3z의값이작아질수록피부의주름깊이가낮아짐을의미하며주름개선이되었음을의미한다. 단위는μm이다.

125 < 그림 98> 임상주름개선

126 < 그림 99> 임상주름개선

127 < 그림 100> 임상효능설문조사결과

128 < 그림 101> 임상효능설문조사결과 그결과, 시험제품사용전후에따라눈가주름에변화가있음을확인할수있었다. 변수 Ra는제품사용전 (0주) μm에서제품사용 2주후 μm, 제품사용 4주후 μm로, R3z는제품사용전 (0주) μm에서제품사용 2주후 μm, 제품사용 4주후 μm로수치변화를확인할수있었으며, 시험제품의사용전 (0주) 과비교하여제품사용 4주후 Ra, R3z 모두에서통계적으로유의한수준의눈가주름개선효과를나타내었다 (p<0.05). 또한시험제품사용전 (0주) 과비교하여제품사용 2 주후 Ra 1.127%, R3z 2.488%, 제품사용 4주후 Ra 6.888%, R3z 5.736% 의눈가주름개선율을나타내었다. 피부자극평가는피험자에의한자가평가및연구자의육안평가를토대로실시하였으며, 그결과제품에대한이상반응은관찰되지않았다. 이상의결과로 락토바실러스 / 인삼발효여과물함유크림 은눈가주름개선에효과가있는것으로사료된다 (p<0.05).

129 5. 흑삼및인삼열매의화장품소재개발 (1) 가공인삼 ( 흑삼 ), 인삼열매 ( 금풍 ), 발효인삼열매 ( 금풍 ) 추출물및지표성분의미백효능 검증 미백효능을검증하기위하여 mushroom tyrosinase activity 및 melan-a 세포를이용하 여 in vitro 효능을검증하였으며, in vitro 상에서의세포증식과멜라닌합성에미치는각 각 single compound 와 extracts 의효능은아래와같음. 그림. 가공인삼, 인삼열매 ( 금풍 ), 발효인삼열매 ( 금풍 ) 추출물및지표성분의티로신억제 활성 Single compound 와 extract 에대한 mushroom tyrosinase 의저해활성을검증한결과, 양성대조군인 kojic acid 는저해활성을보였지만모든 single compound 와 extract 는 mushroom tyrosinase 에대한저해활성을나타내지는않았음.

130 그림. 진세노사이드 Re, 금풍, 발효인삼열매, 흑삼의멜라닌억제활성 발효열매는 100 μg / ml의농도에서독성을나타내었고, Re는 400 μg / ml의농도에서 Melan-a 세포에독성을나타내었음. Melan-a 세포를이용한멜라닌합성저해연구에서는모든시료에서농도의존적으로멜라닌의합성이감소됨을보여주었음. 특히금풍은 200 μg / ml의농도에서 29.8 % 의멜라닌합성저해능을나타내었고발효열매 200 μg / ml에서의저해효과는독성으로인한효과라사료됨. 따라서발효열매를제외한 Re, 금풍, 흑삼을이용하여멜라닌합성저해를연구하였음.

131 (2) 흑삼의멜라닌합성저해효능연구 흑삼의멜라닌합성저해기전을알아보기위하여멜라닌합성에관련한주요단백질인 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF 에대한단백질발현정도를 western blot을이용하여확인하였음. 그결과 TRP-2와 MITF의발현이조금이지만농도의존적으로감소됨을확인하였음. 그림. 흑삼의멜라닌합성단백질저해기전연구 흑삼의멜라닌합성저해효능을확인하기위해멜라닌세포가포함된인공피부모델을사용하여실험을진행하였음. 흑삼을 100, 250, 500 μg / ml의농도로처리하였을때멜라닌합성저해능이 33.8 %, 21.5 %, 21.9 % 로농도의존적으로감소하진않았지만양성대조군인 PTU를처리한조직보다효능이뛰어났으며현미경을통해조직의표면을관찰한결과흑삼을처리하였을때멜라닌분포의감소를확인할수있었음.

132 그림. 인공피부모델을이용한흑삼의멜라닌합성저해효능 이결과를 in vivo 모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였음. 흑삼의멜라닌생성저해효과는 Figure 6과같이나타났음. 흑삼은아무것도처리하지않은대조군에비해멜라닌스팟이감소하였지만농도의존적인결과는보이지않았음. 그림. 제브라피쉬배아모델을이용한흑삼의미백효능

133 (4) Ginsenoside Re (Re) 의멜라닌합성저해효능연구 그림. 진세노사이드 Re 의멜라닌합성단백질저해기전연구 Re의멜라닌합성저해기전을알아보기위하여멜라닌합성에관련한주요단백질인 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF 에대한단백질발현정도를 western blot을이용하여확인하였음. 그결과 Tyrosinase, TRP-2, MITF의발현이농도의존적으로감소됨을확인하였음. 그림. 인공피부모델을이용한진세노사이드 Re 의멜라닌합성저해효능

134 Re의멜라닌합성저해효능을확인하기위해멜라닌세포가포함된인공피부모델을사용하여실험을진행하였음. Re를 100, 250, 500 μg / ml의농도로처리하였을때멜라닌합성저해능이 32 %, 37.9 %, 44.7 % 로양성대조군인 PTU를처리한조직보다효능이뛰어났으며현미경을통해조직의표면을관찰하고 Fontana-Masson으로조직을염색하여멜라닌분포를확인한결과 Re를처리하였을때멜라닌분포의감소를확인할수있었음. 조직학적인변화는 H&E로염색된피부단면에서는관찰되지않았음. 그림. Fontana-Masson 으로조직을염색하여멜라닌분포확인결과 그림. 제브라피쉬배아모델을이용한진세노사이 Re 의미백효능

135 이들결과들을 in vivo 모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였음 (Figure 9). Re을처리하지않은대조군에비해멜라닌스팟이농도의존적으로감소되는결과를보였음. 제브라피쉬의멜라닌생합성저해실험에서사용되는대표적인양성대조군인 PTU에비해서는멜라닌함량이높았으나아무것도처리하지않은대조군에비해서는멜라닌함량이약간줄어들었음. 또한제브라피쉬체내에서의 Tyrosinase 활성을측정하기위해제브라피쉬에서 Tyrosinase를분리하여 L-DOPA를기질로효소활성을측정해본결과 Re를 100 μg / ml처리한그룹에서 32.4 % 의 Tyrosinase 저해활성을보여높은멜라닌저해활성에영향을미치는것으로사료됨.

136 (5) 인삼열매특이품종금풍의멜라닌합성저해능연구 가장활성이우수한금풍에대한멜라닌합성저해능을연구하였다. 그림. 금풍의멜라닌합성단백질저해기전연구 금풍의멜라닌합성저해기전을알아보기위하여멜라닌합성에관련한주요단백질의발현정도를 western blot을이용하여확인하였다 (Figure 10). 먼저 melan-a 세포에 72h동안금풍을처리한후 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의발현을조사해본결과, Tyrosinase와 TRP-1, TRP-2의발현이감소됨을확인하였다. 멜라닌생합성기전을확인하기위해 melan-a 세포에서 AKT와 ERK를발현시키는지확인하였다. 금풍을 melan-a 세포에처리하였을때 p-akt는변화가없었고 p-erk는 8시간처리시가장높은발현량을관찰하여금풍을 8시간처리하였다. 그결과농도의존적으로 p-erk의발현이증가됨을확인하여금풍은 phosphorylation ERK 경로를통해서멜라닌합성을저해시키는것으로사료된다.

137 그림. 인공피부모델을이용한금풍추출물의멜라닌합성저해효능 그림. Fontana-Masson 으로조직을염색하여멜라닌분포확인결과 금풍의멜라닌합성저해효능을확인하기위해멜라닌세포가포함된인공피부모델을사 용하여실험을진행하였음. 금풍을 100, 250, 500 μg / ml의농도로처리하였을때멜라닌 합성저해능이 32 %, 37.9 %, 44.7 % 로양성대조군인 PTU 를처리한조직보다효능이뛰

138 어났으며현미경을통해조직의표면을관찰하고 Fontana-Masson 으로조직을염색하여멜 라닌분포를확인한결과금풍을처리하였을때멜라닌분포의감소를확인할수있었 음. 조직학적인변화는 H&E 로염색된피부단면에서는관찰되지않았음. 그림. 제브라피쉬배아모델을이용한금풍의미백효능 이들결과들을 in vivo 모델에서확인하기위하여제브라피쉬배아모델을이용하여생체내에서의멜라닌합성에미치는영향을연구하였음 (Figure 12). 금풍을처리하지않은대조군에비해멜라닌스팟이농도의존적으로현저하게감소되는결과를보였음. 제브라피쉬의멜라닌생합성저해실험에서사용되는대표적인양성대조군인 PTU에비해서는멜라닌함량이높았으나아무것도처리하지않은대조군에비해서는멜라닌함량이약간줄어들었음. 또한제브라피쉬체내에서의 Tyrosinase 활성을측정하기위해제브라피쉬에서 Tyrosinase를분리하여 L-DOPA를기질로효소활성을측정해본결과금풍을 200 μg / ml처리한그룹에서 23.1 % 의 Tyrosinase 저해활성을보여높은멜라닌저해활성에영향을미치는것으로사료됨.

139 2 절. 인삼부산물을활용한기능성식품소재개발 1. 인삼열매의맞춤형유효성분추출기술및소재화기술개발 가. 인삼열매과육동결건조물일반영양성분 - 본연구에사용된인삼열매 (Panax ginseng C.A. Meyer var. hwngsookjong) 는횡성에서생산하는횡성홍삼영농조합에서파쇄하여씨를제거시킨열매과육을 -20 에서냉동 저장하여제공받아사용하였으며, 사용된분말은본인삼열매과육을 -35 에서 3일동안동결건조하여인삼열매과육동결건조물을제조하여사용하였음. 그림 102. 실험에사용된인삼열매 - 일반영양성분은인삼열매과육동결건조물을식품공전제 9. 일반시험법에따라수분함량, 회분, 조단백, 조지방, 탄수화물, 칼로리, 나트륨및 β-카로틴을산출하여사용하였으며, 인삼열매과육동결건조물의일반영양성분을분석한결과는아래의표 1과같음. 분석결과탄수화물이 70.21% 로가장높은함량을나타냈으며, 조회분 12.82%, 조단백질 10.76%, 조지방은 1.57% 순으로나타났음. 성상은짙은노란색을가지는분말로황숙종특유의색을보였으며, 색소성분을분석한결과 β-카로틴에서도 0.03 mg/g으로나타났음. 표 25. 일반열매과육동결건조물일반영양성분 Test items Result Test items Result Images 짙은노란색의분말 Carbohydrate 70.21% Water content 4.64% Calorie Kcal Crude ash 12.82% Sodium content mg/100g Crude protein 10.76% β-carotene 0.03 mg/g Crud fat 1.57%

140 나. 인삼열매과육동결건조물중금속및잔류농약 - 우리가섭취하는식품에는여러가지금속물질이함유되어있는데이들중철분등일부무기질은인체에반드시필요하나납, 카드뮴등유해중금속들은영양학적으로무의미하며생체내에축적되어독성을나타내기도함. 이에대한대안으로국가적으로중금속에대한자료를요청하도록되어있으며, 본연구에서도중금속을분석하여안전성이확립된인삼열매추출물을제조하고자인삼열매자체중금속은식품공전제 10. 일반시험법 7.1 중금속시험법에따라납, 카드뮴, 총비소및총수은에따라분석하였으며그함량은표 2와같음. 납은 2.51 μg/g, Hg는 0.02 μg/g 검출되었으며, 총비소및카드뮴에서는검출되지않았음. 본인삼열매과육동결건조물을하루최대섭취량을 2 g으로선정하여납, 카드뮴섭취량은 FAO/WHO에서설정한잠정주간섭취허용량 (PTWI) 의 2.36%, 0.07% 로매우낮은수준으로나타났음. 표 26. 인삼열매과육동결건조물중금속함량 Test items Result Unit Test method Pb 2.51 μg/g As ND 1) μg/g Cd ND μg/g 시험소 SOP Hg 0.02 μg/g 1) ND : Not detected. 1) 2) 표 27. 인삼열매과육동결건조물로부터섭취되는납과카드뮴함량을 FAO/WHO 에서설정된잠정주간섭취허용량 (PTWI) 과비교 Metals Total weekly intake Mean(mg/kg) (PTWI 1), μg/kg b.w. 2) ) (μg/kg b.w.) PTWI(%) Pb(25 μg/kg b.w.) Cd (7 μg/kg b.w.) PTWI : Provisional Tolerable Weekly Intake. b.w. : body weight. - 인삼은일반작물과는달리비교적낮은광도를필요로하는반음지성식물로서해가림시설하에생육되기때문에내병성에약할뿐만아니라동일한경작지에서보통 4년에서 6년동안재배되는특성상인삼뿌리썩음병, 균핵병등의변해가발생할가능성이매우높아효과적인방제를위해서는전적으로농약에의존하고있는것으로알려져있음. 실제로인삼의안전성조사결과농약잔류허용기준이초과되어출하연기등고지한사례가많이발생하고있음. 본연구에서도식품공전제 10. 일반식품 4. 식품중잔류농약분석법 다종농약다성분분석법에따라약 200여종에대한검사를실시하였으며, 결과는표 4와같음. 인삼열매에서는 dimethomorph ppm, trifloxystrobin ppm, pyrachostrobin ppm, pyrimethanil ppm

141 4 개의잔류농약이검출되었음. 현재인삼열매의잔류농약허용기준치는고시되어있지 않아수삼의기준을따르고있으며, 인삼열매를건조하여분말화한경우가공계수를적 용하여할수있음. 가공계수 = (100- 건조물의수분함량 (%))/(100- 건조전의수분함량 (%)) 본연구물에서는가공계수를적용할경우잔류농약허용기준안에포함되어무리없이 추출물제조가가능할것으로판단됨. 표 28. 인삼열매과육동결건조물잔류농약함량 Test items Anilofos, bromopropylate, carbophenothion, chlofenvinphos, chlorobenzilate, cyflufenamid, cyhalothrin(lambda), deltamethin, diclofol, dimethenaid 등약 200 여종 Items Result(ppm) 잔류허용기준 (ppm) 가공계수적용치 (ppm) Dimethomorph Trifloxystrobin Pyrachostrobin Pyrimethanil

142 다. 인삼열매주정추출조건선별 - 인삼열매의알코올성간손상예방기능성성분을효율적으로추출하기위하여주정을이용하여추출조건을다음과같은방법으로설정하였음. 인삼열매냉동파쇄액 1 kg에주정 95% 를 100% (v/v) 첨가후 50 환류진탕수욕조에서 3, 5시간동안각각추출하여부직포여과한후여과액을동결건조하여분석시료로사용하였음. 주정을이용하여추출한인삼열매의항산화능특성을조사한결과는표 5와같음. 인삼열매자체과육의 DPPH radical 소거 IC 50 은 ppm으로나타났으며, 50 로온도를유지하여시간처리에따른변화를확인결과 3시간에서 IC 50 값이가장낮은 ppm으로나타났으며, 이후 5시간에서는 ppm으로약간증가하는경향으로나타남. 주정추출에서는 control과달리추출시간이오래될수록 IC 50 값이감소하는경향으로나타남. 표 29. 효소종류, 처리농도및시간에따른인삼열매의추출조건설정 Types of enzymes Treatment time(hr) The DPPH radical scavenging activity IC 50 (ppm) Control Control Control EtOH 라. 인삼열매가수분해효소제의선별 - 인삼열매의알코올성간손상예방기능성성분의효율적인추출을위하여다음과같은방법을이용하여효소추출조건을선별하였음. 인삼열매냉동파쇄액 1 kg에가온정제수를 100% (v/v) 첨가후효소종류를달리하여각각 0.05, 0.2% 첨가하여 50 환류진탕수욕조에서각각 3, 5시간가수분해하여부직포여과한후여과액을동결건조하여분석시료로사용하였음. 그림 105. 인삼열매가수분해추출물제조과정 - Pectin 및 cellulose 가수분해효소처리에따른항산화능특성을조사한결과는표 6 과같음. Enz. A 는적은시간으로효소처리를하였을때 IC50 값이낮은경향으로나타

143 났으며이후 5 시간처리한경우 control 과같이증가하는경향으로나타남. Enz. B 에서 도 3 시간처리구간에서낮은 IC 50 값을보였으나 control 에비하여높게나타나제외하 여진행하였음. 표 30. 효소종류, 처리농도및시간에따른인삼열매의추출조건설정 The DPPH radical Enzyme Enzyme treatment Types of enzymes scavenging activity concentration(%) time(hr) IC 50 (ppm) Control Control Control Enz. A Enz. B 마. 인삼열매효소가수분해및주정추출에따른진세노사이드성분변화 - 인삼열매에식품으로사용가능한효소및주정을이용하여추출하여진세노사이드함량을살펴보면전반적으로 Rg 1 함량이가장높게나타났으며 Re, Rd, Rb 2, F3, Rc, F2, F5, Rb 1, Rg 2, F 1, Rf, Rb 3, Rh 1 순으로높게나타났음. Control군에서 3시간추출하였을때총진세노사이드함량이 9.58% 로가장높게나타났으며, 주정추출군에서는 3시간, 5시간이 10.82~10.84% 로비슷한수치를나타내었음. 효소처리구간에서는 Enz. A 0.2%, 3시간구간에서 14.39% 로가장높게나타났으며 Enz.B 에서는 0.05%, 5시간구간에서 11.31% 로가장높게나타났음. 본연구결과 Enz. A에서 DPPH 라디컬소거 IC 50 값이가장낮게나타났으며, 진세노사이드함량이가장높게검출되어 Enz. A를이용하여인삼열매가수분해 pilot scale 추출및대량생산을진행하고자함.

144 표 31. 인삼열매효소가수분해및주정추출에따른진세노사이드성분변화 Sample Compound Rg1 Re Rf F5 F3 Rb1 Rg2 Rh1 Rc Rb2 Rb3 F1 Rd F2 Total Control Control Control EtOH 3hr ND EtOH 5hr Enz.A 0.05%, 3hr Enz.A 0.2%, 3hr Enz.A 0.05%, 5hr Enz.A 0.2%, 3hr Enz.B 0.05%, 3hr Enz.B 0.2%, 3hr Enz.B 0.05%, 5hr Enz.B 0.2%, 3hr

145 바. 인삼열매가수분해 pilot scale 추출 - 알코올성간손상보호에효능이있는인삼열매추출물을제조하고자앞선연구에서선발된효소 Enz.A의농도를달리하여 pilot 추출공정을그림 5와같이진행하였음. 본공정에서는실험실에서와달리생산및제품으로진행시품질관리에필요한공정인효소실활, 농축및살균공정을추가하였으며, 생산단가절감을위하여분무건조를실시하였음. 본원료에대해 pilot scale의생산결과수율이 3.5~4.8% 로효소첨가량이많을수록높게나타났으나, 생산효율을고려시낮게나타나대량생산진행시수율검토가필요할것으로판단됨.

146 그림 106. 인삼열매추출 pilot 생산공정 그림 107 인삼열매 pilot scale 생산에대한시험성적서 ( 성상, 일반세균, 대장균군 )

147 사. 인삼열매추출물효소가수분해조건에따른 in vitro - 인삼열매의알코올성간손상보호효과에대한효능을검증하고자알코올성간독성으로유도된 HepG2 세포에서, 인삼열매처리에따른간의효소 (ALT, AST) 의수치변화를확인하였으며, 그림 10과같음. in vitro에서의간독성확인은세포의배양배지내에 transaminase가방출된양을측정함으로확인할수있으며, HepG2와같은간세포에에탄올을 24시간처리하게되면세포내로 ALT(alanine transaminase) 와 AST(aspartate transaminase) 의방출이증가하게됨. 본실험에서는에탄올처리시 ALT와 AST의수치가증가하였으며, 인삼열매시료를선처리한후에탄올을처리한경우, 시료의추출조건에따라정도의차이가나타났지만, 알코올에대한간세포보호효과를확인할수있었음. 그림 108. 알코올성간독성으로유도된 HepG2 세포에서인삼열매처리에따른 간효소 (ALT, AST) 의수치변화확인

148 2. 인삼열매추출물의원료화 가. 대량생산제조공정확립및표준화 - 대량생산으로는인삼열매 500 kg을기준으로진행하여 pilot scale과같은방법으로추출, 효소실활, 여과및농축을진행하였으며건조에서는진세노사이드특성상보통사용되는분무건조온도보다낮게설정하여성분이파괴되는정도를낮추고자함. 이와같은방법으로대량생산을진행한결과, 원물 500 kg당추출물 18.3 kg으로수율 4.4% 로나타났으며, 분무건조시건조부형제 ( 말토덱스트린, 덱스트린등 ) 을첨가하지않고건조가가능하여, 기능성평가시낮은농도에서기능성활성이보일수있을것으로판단됨. 그림 109. 인삼열매대량생산제조지시및제조기록서 나. 인삼열매추출물원료의품목신고 - 대량생산공정을표준화한인삼열매추출물의품목보고신고를아래와같이완료함. 그림 110. 인삼열매추출물품목제조보고서

149 그림 111. 인삼열매가수분해추출물대량생산공정

150 3. 지식기반연구및제품개발을위한웹시스템구축 차별화되고경쟁력있는제품개발및연구추진을위해지식기반시스템구축 가. 위키기반데이터통합형지식관리시스템구축 - 아래와같은내용의데이터통합형지식관리시스템구축을완료하였음 Ÿ 세부과제별연구진도관리및결과와데이터의업로드및관리 Ÿ 인삼, 흑삼, 태극삼및인삼부산물 ( 잎, 줄기, 열매 ) 에대한문헌정보의수집및통합 Ÿ Web2.0 시대에부합되는새로운방식의통합형지식관리시스템구축 Ÿ 매크로, 파서등기본플러그인의구축및수정 그림 112. 위키기반의통합형지식관리시스템의장점 (a) 일반웹기반관리시스템 (b) 위키기반지식관리시스템 그림 113. 일반웹기반관리시스템과위키기반의지식관리시스템의비교

151 1) 구성요소 - 계정관리, 즐겨찾기, 최근변경, 도움말에쉽게접근할수있도록구성된유틸메뉴 - 빠른지식검색을도와주는검색창 - 시스템의주요컨텐츠를나타내는주메뉴 - 주메뉴에따른부메뉴 ( 보다세부적이고다양한컨텐츠를나타낼수있음 ) - 페이지의제목및내용 - 인쇄용화면, 히스토리, 수정, 편집, 즐겨찾기, 태그, 댓글등의유용한기능이모여있는에디트바 - 새글쓰기, 첨부파일관리, 권한설정이가능한옵션바 그림 114. 웹사이트기본화면구성

152 2) 과제소개 - 과제소개메뉴는 인삼수출활성화를위한기능성및제품개발 사업을위한연구개발과제에대한전반적인내용을다루고있음 Ÿ 연구개요 Ÿ 연구필요성 Ÿ 연구목표 Ÿ 연구개발추진체계 Ÿ 참여기관 그림 115. 과제소개메뉴 3) 진행사항및연구성과 - 각세부과제별진행사항또는연구산출물을연구자들사이에서로공유가능 Ÿ 제 1 세부과제 Ÿ 제 1 협동과제 Ÿ 제 2 협동과제 Ÿ 제 3 협동과제 Ÿ 제 4 협동과제

153 그림 116. 진행사항및연구성과화면 4) 참고자료 - 참고자료메뉴에는게시판형태로개발하여각부메뉴별관련자료를게시판자료로공유가능 Ÿ 연구동향및소식 Ÿ 문헌분석 Ÿ 특허분석 Ÿ 생물정보분석

154 그림 117. 참고자료메뉴 5) 관련사이트 - 관련사이트메뉴에서는해당연구개발과제에참여하는기관에대한정보확인가 능 그림 118. 관련사이트메뉴 6) 관리자기능 - 시스템기본관리 : 사이트명, 로고이미지, 고유이름, 사이트설명관리 - 메뉴구조관리 : 메인메뉴및부메뉴관리 - 사용자관리 : 가입된사용자목록관리 - 그룹관리 : 그룹생성및관리 - 기본허가관리 : 사용자나그룹, 또는모든사용자의기본권한설정

155 4. 인삼부산물 ( 인삼열매 ) 추출물의세포및동물모델을이용한간기능개선평가 가. 재료및연구방법 - 효소처리군인삼열매 (A) 및주정추출물인삼열매 (B), 양성대조군 : 헛개나무과병추출물 1) 세포독성시험 RAW 264.7세포에각시료를여러농도로희석하여 48시간배양후, MTT법에의해세포독성을측정함. 2) 마우스알콜성간질환모델 5주령의수컷 Balb/c 마우스에 25% ethanol을 5 g/kg의투여량으로 1일 1회총 7일간경구투여하여알코올성간질환을유발시킴. 3) 시료의투여양성대조군을비롯하여두종류의공시시료는, 에탄올투여개시 3일전부터각각 0.5 mg/mouse 혹은 1 mg/mouse의양으로 1일 1회총 10회경구투여함. 4) 생화학적분석에탄올투여종료후 1일째의혈청시료를이용하여혈중 GTP (ALT), GOT (AST) 및 LDH를정량하고, 에탄올투여종료후 1일째의간조직을 lysis하여간조직중의 SOD 및 catalase를정량함. 5) 시료의안전성 (in vivo 테스트 ) 마우스의체중측정과혈청학적분석을통한간독성테스트를통해시료에의한독성유도유무를판정하였음. 6) 통계학적유의성은에탄올만을처리한그룹에대해 Student s two tailed t-test를통해검토함. 나. 인삼열매의세포독성평가 - 공시시료의세포독성을 RAW 264.7세포를이용하여측정한결과, 헛개나무, 인삼열매 -A 및인삼열매-B 추출물은모두약 250 mg/ml의농도까지는안전한것으로확인됨 ( 그림 1). In vitro 실험에서의세포독성시험데이터를기초로 in vivo 실험에서사용할투여량을결정하는것은어려우나, 대략 2-3 mg/mouse의투여량까지는안전할것으로추정됨. 향후 in vivo 실험에서는 0.5 및 1 mg/mouse의양으로시료를투여함.

156 그림 119. 공시시료의세포독성시험 다. 에탄올투여에의한간독성유도시험 - 에탄올투여에의한간독성유도시험은 25% ethanol을 5 g/kg의양으로 1일 1회총 7일간투여하는방식으로실시하였음. 그결과간독성의지표인 GOT/AST, GPT/ALT 및 LDH의혈중농도가증가하여, 에탄올투여에의해간세포가손상되어독성이발현된것으로나타남 ( 그림 2). 그림 120. 에탄올투여에의한간독성유도

157 라. 동물모델에서공시시료의간독성억제효과 - 공시시료를에탄올투여 3일전부터경구투여한마우스에서, 혈청중의 AST 및 ALT를정량하여시료의간질환억제활성을판정한결과, 에탄올투여에의해상승한혈중 AST/ALT의수치가인삼A 추출물및인삼B 추출물투여에의해감소함. 특히인삼A 추출물은비교군인헛개나무추출물의동등혹은그이상의억제효과를나타내었음 ( 그림 3). 그림 121. 공시시료투여에의한혈중 AST/ALT 농도의억제효과 - 또한간질환발생시간세포의손상에의해간세포내에있던 LDH 효소의혈중농도가높아지는것으로알려져있음. 알코올투여에의해유도된간질환에서혈중 LDH 농도상승에대한공시시료의억제효과를관찰한결과, 에탄올투여에의한 LDH 혈중농도상승의억제효과는인삼A 및인삼B 추출물모두우수한것으로나타남 ( 그림 4). 그림 122. 알코올성간질환에서공시시료에의한 LDH 혈중농도억제효과

158 - 한편공시시료투여및공시시료전처리후에탄올투여에의해장기에대한독성이발현되는지의여부를측정하기위하여, 공시시료투여군과공시시료전처리후에탄올투여군에있어서간과비장의중량을계측함. 그결과, 본실험조건에서는공시시료투여에의한장기중량감소는물론, 에탄올처리에있어서도장기의중량에는유의한영향을미치지않는것으로나타남 ( 그림5). 또한시험기간중체중증가율에있어서도별다른변화는관찰되지않음 ( 그림 6). 그림 5. 각시험군에있어서간및비장중량의비교 그림 123. 각시험군의체중변화

159 마. 간조직내항산화활성분석 - 간조직중의항산화활성관련효소인 SOD와 catalase의발현량을정량해본결과공시시료투여에의해 catalase의발현량은약간상승하는경향을나타내었으나, SOD의발현량은그다지영향받지않는것으로나타남 ( 그림 7). 그림 124. 공시시료투여에의한간조직내항산화효소발현량변화 바. 간조직의염증인자분석 - 간조직을이용하여간세포중의 COX-2, inos, HO-1, TGF-b1 등염증관련인자의발현을 Western bot에의해측정함. 그결과, COX-2, inos 및 TGF-b1의발현량에는별다른변화가관찰되지않았으나, 염증억제작용을하는 HO-1분자의발현이공시시료처리에의해증가하는것으로나타남 ( 그림 8). 간조직내의염증매개인자분석에대해서는추후보다구체적인분석이필요한것으로사료됨. 그림 125. 간조직중의염증관련분자발현비교

160 사. 조직해부학적검사 - 공시시료의안전성을테스트하기위하여, 공시시료투여에따른혈중간수치의변화 를측정한결과공시시료는특이한독성이없는것으로나타남 ( 그림 9). 그림 126. 공시시료투여가간독성에미치는영향 - 한편간조직의해부학적소견을측정한결과, 에탄올투여군에서혈관주위조직에서약간의세포손상이관찰되었으나, 이조건에서는현저한조직상해는관찰되지않음 ( 그림 10). 각공시시료를단독으로투여한군에서도조직학적으로유의한변화는관찰되지않음.

161 그림 127. 에탄올투여및각시료의단독투여마우스의간조직

162 - 한편각공시시료를전처리한후에탄올을투여한마우스의간조직을조사한결과, 에탄올투여군에서현저한간손상이관찰되지않아판독에난해함이있었으나, 적어도 공시시료를전처리한마우스에서의간조직손상은관찰되지않음 ( 그림 11). 그림 128. 공시시료전처리후에탄올투여군의간조직 * 종합분석 - 효소처리군인삼열매 (A) 및주정추출물인삼열매 (B) 는알코올성간질환에의한 AST 및 ALT 상승을억제하는효과를나타냄. - 공시시료에의한알코올성간질환억제효과는간조직중의 catalase 효소발현의상승과관련이있는것으로보임. - 각조직내의염증관련인자의분석결과, HO-1 분자의발현증가가공시시료에의한간독성억제와관련있는것으로관찰됨. - 공시시료에서는간독성은물론체중감소나간및비장의중량감소등이관찰되지않아, 안전한것으로사료됨. 본실험결과를기반으로 알코올성간손상예방기능성성분을포함하는인삼열매 추출물및그제조방법 이라는제목으로농진청과공동특허출원완료 ( 출원번호 : )

163 그림 129. 인삼열매추출물관련특허출원

164 (5) 인삼열매추출물의원료화 1 차년도목표였던인삼열매추출물의원료화와관련하여기능성분의기준규격설정을 위한지표물질진세노사이드 Re 의밸리데이션실험을수행함. 가. 지표물질밸리데이션 - 인삼열매의지표물질 Re를대상으로한양대학교약학대학에서자사시험법으로밸리데이션을진행하였음. 진세노사이드 Re와추출물을각각 50% MeOH에녹여 HPLC (Waters alliance system, PDA detector) 를이용하여분석하였고, C18 5μm mm (Shiseido capcell pak UG-120) 컬럼을이용하여 203 nm에서측정하였음. 1. 장비와재료 1.1 실험실장비및소모품 부피플라스크 (100 ml) HPLC용유리병 용매용일회용실린지 여과용멤브레인필터 (PTFE, 0.2 μm) 초음파진탕기 Column : Shiseido C18 5 um 4.6 X 250 mm 1.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 (UV Detector) HPLC: Waters Alliance system with a PDA detector 2. 표준물질및일반시약 2.1 표준물질 진세노사이드 Re 분자식 : C48H82O18, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 아세토니트릴 (Acetonitrile, HPLC grade) 증류수 (Distilled water) 메탄올 3. 시험과정 3.1 표준용액제조 표준물질을 50% 메탄올로녹여 1mg/ml의농도로만듬 상기용액을 serial dilution 하여 0.5, 0.25, 0.125, mg/ml의 5가지농도로만듬 을필터링하여 HPLC에 10ul 주입 3.2 추출물제조 추출물을 10mg/ml의농도로메탄올에녹임 필터링하여 10ul 주입

165 4. 분석및계산 4.1 기기분석 다음표 1 의조건으로사용하되적용되는기기에따라조정이필요할수있다. 1) 특이성 : 불순물, 분해물, 배합성분등의혼재상태에서분석대상물질을선택적으로정확하게측정할수있는능력으로표준물질 1 mg/ml과추출물 10 mg/ml을 HPLC를이용하여분석하였을때, 첨가제및주변화합물들이지표물질의 retention time에영향을주지않았으며, 높은분리도를보임. 그림 130. 진세노사이드 Re 및인삼열매추출물의 HPLC 분석결과자료 2) 정확성 : 측정값이이미알고있는참값이나표준값에근접한정도를말하며, 인삼열매 에서근접정도 95.6 ~ 100.6% 를나타내어규격범위인 80~120% 내에있어적합한것 으로나타남. 표 32. 진세노사이드 Re 측정값의정확성 3) 정량한계와검출한계 : 정확성, 정밀성이확보된기기분석방법을통하여정량값으로표 현할수있는시료중분석대상물질의최소량인지확인하는것으로, 검량선은검출한계 에근접한분석대상물질을함유하는검체를가지고작성되어야함. 회귀직선에서잔차

166 의표준편차또는회귀직선에서 y 절편의표준편차를이용할수있음. 표 33. 진세노사이드 Re 분석값의회귀분석자료 4) 직선성 : 실험방법이일정범위에있는검체중분석대상물질의양 ( 또는농도 ) 에대하여직선적인측정값을얻어낼수있는능력을말하는것으로, 표준품을 5개농도별로희석하여검량선을확인하였을때, mg/ml ~ 1 mg/ml 내에서유효한직선성이나타남. 그림 131. 진세노사이드 Re 표준품의검량선 5) 정밀성 : 균일한검체로부터여러번채취하여얻은시료를정해진조건에따라측정하 였을때각각의측정값들사이의근접성 ( 분산정도 ) 을나타내는것으로, 인삼열매 Re 함 량 (%) 이아래와같이나타나, 측정값들사이의높은근접성을보임.

167 표 34. 인삼열매추출물의진세노사이드 Re 반복측정값 Con.(mg/ml) Retention time Area(UV sec) Height((UV) ) 범위 : 정밀성, 정확성및직선성을포함할수있는범위 ( 상한값, 하한값 ) 로설정범위는적절한정밀성, 정확성및직선성을제시할수있는검체중분석대상물질의양또는농도의하한값및상한값사이의영역 mg/ml ~ 1 mg/ml 농도를측정하여본결과 mg/ml ~ 1 mg/ml 범위에서직선성이나타나며, 정확성, 정밀성이유지됨.

168 5. 인삼부산물 ( 인삼잎 ) 추출물의항염증효과

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173 3 절. 인삼열매추출물의인체시험시제품제작및 수출용인삼열매추출물건강지향식품개발 1. 인체시험시제품의개발 가. 인삼열매추출물의인체시험시제품제작 1) 인체적용시험용시제품의배합비설정 - 인체적용시험에사용될시제품의배합비를아래와같이설정함. 표 35. 인체적용시험용시제품배합비 주약 1 (125 mg) 주약 2 (250 mg) 성분명 배합비함량배합비함량성분명 (%) (mg) (%) (mg) 인삼열매추출농축분말 인삼열매추출농축분말 위약분말 **.** **.** 위약분말 **.** **.** HPMC **.** **.** HPMC **.** **.** 자당지방산에스테르 **.** **.** 자당지방산에스테르 **.** **.** 합계 합계 위약 성분명 배합비함량 (%) (mg) 결정셀룰로오스101 **.** **.** 말토덱스트린 **.** **.** 유당혼합분말 **.** **.** 이산화규소 **.** **.** 스테아리산마그네슘 **.** **.** 식용색소황색 4호 **.** **.** 식용색소적색 40호 **.** **.** 히드록시프로필메틸셀룰로오스 **.** **.** 자당지방산에스테르 **.** **.** 합계 ) 인체적용시험용시제품제작 - 네추럴에프앤피는건강기능식품전문제조기업으로그간의약품제조에서만적용하고있던엄격한생산기준인 GMP를건강기능식품제조에도입하여국내에서는최초로식품의약품안전처에서 GMP 국내 1호지정업소로허가를획득한중소기업임. - 위의설정된배합비대로인삼열매추출물을이용한인체적용시험용시제품을총 120 병 ( 진약 80병, 위약 40병 ) 제작하였음.

174 그림 132. 인체적용시험용시제품사진 그림 133. 위약, 주약 1, 주약 2 시제품시생산제조기록서

175 나. 인삼열매추출물의건강지향식품으로의제품화 1) 인삼열매의제품화 : 개발사례 1 그림 134. 인삼열매추출물을함유한 청춘팔팔 제품 - 제품명 : 닥터문청춘팔팔 (2016년 10월출시 ) - 연간판매량및매출액 : 2184 set, 약 5,500만원 - 식품유형 : 건강기능식품 - 내용량 : 500 mg 180정 (90 g) - 원료및함량 : 인삼열매추출물분말, 산화아연, 옥타코사놀분말, 비수리추출분말, 결정셀룰로오스, 마카추출농축액분말, 자라분말, 하이드록시메틸렌셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 과라나추출물분말, 오미자농축액분말, 구기자추출물농축액분말, 산수유추출물분말, 복분자딸기과즙분말, L-아르기닌, 실크펩타이드, 이산화규소, 스테아린산마그네슘, 이산화티타늄, 자당지방산에스테르, 치자청색소 - 섭취량및섭취방법 : 1일 1회, 1회 3정씩물과함께섭취 - 영양및기능정보 1일섭취량당함량 % 영양소기준치열량 0kcal 1% 탄수화물 2g 0% 단백질 0g 0% 지방 0g 0% 나트륨 0mg 0% 기능성분또는지표성분 : 아연12 mg, 옥타코사놀 7 mg - 네추럴에프앤피는인삼열매추출물에아연과옥타코사놀등을넣어면역증진및간기능개선등에도움을줄수있는건강기능식품인청춘팔팔을제작하여현재갤러리아면세점에서판매중임. 소비자들의반응이좋아현재청춘팔팔2를기획중에있음.

176 2) 인삼열매의제품화 : 개발사례 2 그림 135. 인삼열매추출물을함유한 천기열매 제품 - 제품명 : 천기열매 (2016년 12월출시 ) - 연간판매량및매출액 : 700 set, 약 1,400만원 - 식품유형 : 액상차 ( 일반식품 ) - 내용량 : 60 ml 30포 (1 box) - 원료및함량 : 인삼열매추출물, 헛개나무열매추출농축액, 타우린, 시클로덱스트린시럽, 황금혼합추출농축액, 무수구연산, 구연산삼나트륨, 정제수 - 섭취량및섭취방법 : 하루 1~2회, 1회 1포 - 네추럴에프앤피는인삼열매추출물과강장성분을함유한건강음료를개발하여출시함. 타우린과헛개나무추출물도포함하는파우치형태의음료로서여름부터소구되는건강음료시장에성공적으로진입하여, 면세점및온라인및오프라인을통한판로를확보함.

177 다. 인삼의기능별, 효능별데이터베이스구축 1) 인삼의기능별, 효능별데이터베이스구축 - 기능별, 효능별정보의수집, 통합을위한데이터베이스설계 - 사포닌의타입별문헌정보수집및데이터베이스화 - 사포닌과인간질병및화학성분 (compound) 간의네트워크정보수집및추출 - 인삼의기능, 효능관련문헌정보수집및텍스트마이닝에의한유용정보추출 - 각 compound의효능및부작용에대한메커니즘확보 2) 수출대상국선호도 DB 구축 - 수출국맞춤형제품생산을위한현지소비자니즈및동향분석을통한소비자선호 도조사 Ÿ 해외협력네트워크구축을통한해외수출마케팅전략수립 ü 현재 네추럴에프앤피는중국, 대만, 러시아등세계적인유통망을갖고있는 NHT Global과네트워크를구축하여해외협력사를이용해중국, 대만, 베트남, 홍콩등으로제품을제안하여 TwinSlim Diet Jelly, Twinslim magic light, Herbalance, Essential probiotics 등다양한수출용제품을제안하여 2014년약 100만 $ 의제조이익을창출하였음. 그림 136. 네추럴에프앤피의해외협력네트워크 ü 인삼열매의간건강기능성소재개발에대한해외협력사와의사전미팅에서는 매우호의적인관심을보였으며, 본연구과제를통해중국, 대만, 러시아등수출 국맞춤형간기능개선기능성제품을판매할예정임.

178 그림 137. 해외바이어제품화사전미팅자료 라. 수출활성화마케팅전략수립 1) 해외수출을위한마케팅기본전략의수립 - 현재관련제품의일반현황조사 : 제품화, 시장내컨셉, 주요소비자, 주요수출국가등 - 수출시장세부조사 : 수출국가의관련제품의제품화현황및소비자접근 Process 조사 - 우선진입및접근해야할전략국가의선정 - 전략국가의문화, 지역및시장특성에대한조사 - 고객세분화및 Targeting - 국가별수출가능유통채널진입전략수립 : 직납, 간납등전경로에대한검토를통한수출현실화 ( 해외직납검토및 Contact 가능한신뢰성있는국내 Vendor 접촉등 ) - 각년차별단계별진입및확장전략 - 전략국가별차별화컨셉의도출및접근방향 2) 연구결과의소비자커뮤니케이션방안및전략제품카테고리의선정 - 예상되는연구결과의전략국가별소비자커뮤니케이션방안수립 - 개발가능한카테고리의예상선호도및소비패턴분석 - 전략국가의요구도를반영한최우선경쟁카테고리의선정 - 제품확장방향성설정및로드맵구축 3) 마케팅세부실행전략의수립 - 선정경쟁카테고리및제품의세부소비자 Needs & Un-met Needs 조사 - 기존제품및유사카테고리의 Key Un-met Needs 및제품의한계성조사 - Main, Sub Target의선정및소비자 Turning 전략수립 - 소비자관점에서의제품이갖추어야할필수요소도출 - 주요카테고리의가격범위, Type, 주력유통채널도출 - 제품사용문구검토 : 전체관련문구 - 전략국가의법적범위내위반사항 - 카테고리별패키지타입및 Main Selling Point 도출 - 생산효율화검토 : 보유공장및구색보유를위한 OEM등전범위검토 - 진입가능한전유통채널별접근전략및프로모션방안도출

179 마. 수출국맞춤형건강지향식품및건강기능식품개발을통한단계적수출전략구축 - 인삼열매추출물을이용한수출국맞춤형건강지향제품을개발하여중화권시장을선점하고, 국내간건강기능성개별인정허가진행을통해기능성과안전성이입증된과학적이고신뢰성높은건강기능식품생산을통해수출체계를마련함. - 일반식품의중국수출을위해 해외생산기업등록, 수출입포장식품라벨검사감독관리규정, 포장식품영양표기제 에따라제품생산및수출을진행할예정. - 건강기능식품은국가식품약품감독관리국에 수입산건강기능식품비준증서 를발급받아진행할예정이며, 이러한절차는대행업체를통해진행할예정임또한중국보건협회의정보및전문가를활용하여수출맞춤형건강기능식품개발예정임. 그림 138. 인삼열매추출물을이용한수출용건강기능식품제품개발계획

180 2. 인삼열매추출물의간기능개선인체적용시험모델개발 - 인삼열매추출물의간기능개선기능성및안전성을검증하기위한인체적용시험모델 개발 - 연구대상자 : 만 20 세이상, 만 70 세미만성인남녀 1) 선정기준 1 γ-gtp 65 이상 350 이하의소견을가지고있는자 2 특별한과거질환이없고, 평소다른약물을복용하지않은자 3 건강보조식품을섭취하고있지않은자 4 이연구의목적을충분히이해하고참여에동의하는자 2) 제외기준 1 임신부, 수유부및가임여성으로참여기간동안임신및수유의계획이있는피험자 2 3개월이내간기능관련약물, 건강기능식품을복용중이거나간염보균자, 신급성간염환자등심한간기능장애가있는환자 3 심질환, 신질환, 담도계질환, 위장관계질환, 암등으로약물을복용중인자 4 항결핵제나비스테로이드성소염진통제, 항생제및 CYP450에영향을줄수있는항전간제를복용하는자 5 정신적무능력자, 본연구에사용되는시험약이외에현재연구개발중인다른시험약을복용하고있는자 6 이전에약물과민의이력이있는자 7 다음의기저질환이확인된자 : 조절되지않는고혈압 ( 고혈압약물복용후에도수축기혈압 > 140mmHg 및이완기혈압 > 90mmHg), 제 1형당뇨병및인슐린치료를받는당뇨병환자, 악성종양, 결핵, 천식, 녹내장, 다발성경화증, 정신병의소견을보이는우울증, 양극성정서장애, 정신분열증, 치매, 지방간, 약물성 / 알코올성간염, 간경화증, 만성신부전증, 거식증, 이상식욕항진, 간질 8 시험제품에대한과민반응력이있는자 9 병용약물로인해심각한약물상호작용의위험성이있는자 10 갑상선기능저하증, 쿠싱증후군등체중에영향을미칠수있는내분비질환병력이있는자 11 3개월이내에식욕억제제, 식욕완화제, 경구용스테로이드, 갑상선호르몬, 암페타민, 싸이프로헵타딘, 페노다이아진등의약물을복용한경험이있는자 12 의학적, 정신적으로연구약물복용의금기사항을가지는자 13 법적으로임상시험에참가가불가능한자 14 본임상시험에비협조적인태도의가능성이있는자또는연구자가판단하여시험을진행할수없다고판단되는자

181 3) 시험디자인 구분실험대상자선정집단분류임상시험설계투여방법및기간임상시험방법자료분석결과보고서작성 내용 만 20 세이상만 70 세미만의성인남녀 100 명 1) 위약섭취 (PC; placebo group, n=33) 2) 저농도인삼열매추출물섭취 (LPG; low dose panax ginsen ingestion group, n=34) 3) 고농도인삼열매추출물섭취 (HPG; high dose panax ginsen ingestion group, n=33) 무작위배정, 이중맹검, 평행, 위약대조 1) 대조식품군 : 위약캡슐을 1 일 2 회 ( 아침, 저녁 ), 1 회 1 캡슐, 12 주간복용 (250 mg * 2 캡슐 = 1 일총 500mg 복용 ) 2) 시험식품군 : 1 저용량시험식품을 1 일 2 회 ( 아침, 저녁 ), 1 회 1 캡슐, 12 주간복용 (125 mg * 2 캡슐 = 1 일총 250mg 복용 ) 2 고용량시험식품을 1 일 2 회 ( 아침, 저녁 ), 1 회 1 캡슐, 12 주간복용 (250 mg * 2 캡슐 = 1 일총 500mg 복용 ) 피험자를총 100 명 [ 고용량시험식품군 33 명, 저용량시험식품군 34 명, 대조식 품군 33 명 ] 으로세군으로나누어임상연구를진행하였음. 본연구에참여할 것을서면으로동의한자로피험자를선정하고필요한임상검사및설문을받 음. Visit 1 에피험자를검사하여 Visit 2 에선정및제외기준에적합한피험자 에한하여시험책임자가무작위로대상자들을시험식품군과대조식품군으로 배정하여총 8 주간의 treatment period 를진행함. Visit 1-7d (-1wk) Screening Visit 2 1d (0wk+7) 무작위배정, 건강기능식품배포 모든검사결과를토대로자료분석실시 Double-blind treatment period Visit 3 42d (6wk±7) 건강기능식품반납 및재배포 자료분석을실시한결과를토대로결과보고서작성 Visit 4 84d (12wk±7) 건강기능식품복용 종료 4) 바이오마커 1. 유효성평가지표 1 γ-gtp 2 ALT, AST, 설문지 2. 안전성평가지표 1 일반혈액검사 : Hematocrit, Hemoglobin, RBC, WBC, Platelet Count, Differential Count

182 (Neutrophil, Eosinophil, Basophil, Lymphocyte, Monocyte), MCV, MCH, MCHC, Uric acid 2 혈청생화학검사 : Fasting plasma glucose, AST, ALT, Total Bilirubin, Creatinine, BUN, Alkaline Phosphatase, Albumin, Total protein, TG, HDL, LDL, Total cholesterol, LDH, SOD, GPx, Catalase 3 뇨검사 : ph, Specific gravity, Protein, Glucose, Ketone, Urobilinogen, Bilirubin, Nitrite, Blood, Leukocyte 4 혈청검사 : HBsAg test (Visit 1에서만실시 ) 3. 활력징후, 신체검사및계측 1 활력징후 : 혈압, 맥박, 체온 2 신체검사 : 영양상태, 소화기계, 피부 / 점막, 근골격계, 이비인후계, 갑상선, 호흡기, 심혈관계, 대사 / 내부비계, 비뇨생식기계, 신경 / 정신계, 척추 / 사지종양 3 신체계측 : 키, 체중, 체질량지수 5) 임상연구윤리심의위원회 (IRB) 심사 - 상기의인체적용시험디자인으로 IRB로부터의승인을받아, 인체적용시험수행을위한요건을갖춤. 그림 139. 인삼열매추출물을이용한인체적용시험 IRB 심의결과통지서 그림 140. CRO 기관의사업자등록증

183 3. 인체적용시험을통한안정성확보및효능규명 가. 인체적용시험의배경 1) 천연물기반의건강기능식품시장의성장 그림 141. 천연물의다양한활용사례 - 천연물로부터생리활성물질을찾아이를인체에긍정적으로적용하는연구는이미오래전부터많은연구자들에의해이루어져옴. 특히특정질환및질병에대한예방제제또는치료제로서, 그리고건강보조제의형태로식물자원이널리이용되고있는실정임 ( 김미경등, 2005; 이건순, 2005). 특히, 우리나라의경우, 경제성장및국민소득의증대와더불어각종성인병이증가추세에있기때문에특정타겟질환및질병의치료및예방을목적으로하는기능성식품및건강식품에대한관심도가급증함. 여기에, 근거중심의과학과의학의기술이발전하고여러약용식물의다양한형태를바탕으로발전시킨생리활성기능이밝혀짐에따라이들을추출 정제하여기능성식품및의약품으로개발함으로써많은관심이고조되고있음 ( 최혜미등, 2002; 김미경등, 2005; 강대일, 2011). - 국내의건강기능성식품시장은이미 2015년도에그순수규모가 2조3천억에육박하였으며, 이는전세계건강기능성식품시장의 10% 수준임. 세계기능성식품시장은미국이 99년 445억불로세계시장의 35% 를, 유럽이 422억불로 33%, 일본이 232억불로 18% 를점유하고있으며미국, 유럽, 일본이세계시장의 86% 를차지하고있음 ( 통계청, 2008). 또한, 현재유통판매되고있는건강기능식품들중식물추출물이 21.0% 로서가장높은비율을차지하고있음 ( 손숙미와박진경 2004; 이건순, 2005; 윤선등, 2006).

184 그림 142. 국내및세계의건강기능식품시장현황 2) 인삼열매추출물의특성 그림 143. 건강기능식품들중인삼 / 홍삼제품이차지하는비율 년까지조사된발표에따르면다양한건강기능성제품들이시판되고있으며그중 에인삼의형태의가공식품들이약 40% 를차지하는등현재까지도인삼자원을활용한 다양한기능성식품들이개발되고있음.

185 그림 144. 인삼열매의효능관련자료 - 인삼은우리나라를대표하는약용작물로, 지용성성분 ( 지질, 지방산, 정유, 유기산, 폴리아세칠렌, 페놀계화합물등 ), 함질소화합물 ( 알칼로이드, 단백질, 아미노산, 펩티드등 ), 탄수화물 ( 다당류, 2당류, 3당류, 조섬유펙틴등 ), ginsenoside, 비타민등다양한성분들을함유함. 인삼의사포닌이라고잘알려진 ginsenoside 는당부분 (glycone) 과비당부분 (aglycone) 으로구성된배당체 (glycoside) 화합물의일종으로서인삼의가장중요한약리활성성분으로인정되고있음. - 과거에는인삼의뿌리뿐만아니라줄기, 잎, 꽃봉오리등지상부를차로활용했다는기록이있으나현대에와서는인삼의뿌리만을주로이용하고있음. 현재인삼지상부의활용은미미하며, 그냥버려지는폐자원으로전락하였음. 하지만, 최근분석기술의발전에따라인삼의다양한부위의성분연구가진행되었고그결과인삼잎및줄기, 열매에도인삼의뿌리와같은 ginsenoside가존재하는것이밝혀져주목을받고있음. 그림 145. 인삼열매의다양한효능

186 - 연구결과에따르면, 인삼의다른부분보다도인삼잎과열매에 ginsenoside 의함량이가장높다고보고됨. 인삼의잎에는인삼뿌리보다 4~5배, 인삼줄기보다 9배이상 ginsenoside 함량이존재하는것으로알려졌으며 ginsenoside 종류비교해보았을때에도인삼뿌리에존재하는대다수의 ginsenoside 가잎에존재하는것으로나타남. 더불어인삼잎에는인삼뿌리의 10배에달하는 ginsenoside Re와 5배이상의 ginsenoside Rd 가함유되어있는것으로조사됨. 잎뿐만아니라인삼열매에는뿌리에비해 ginsenoside 함량이 2배이상많다고알려졌으며특히 ginsenoside Re는뿌리보다 30배많다고알려져있음. 4~6년동안재배하여이용하여야하는인삼뿌리와는달리인삼의지상부위는매년봄에싹을틔워가을철퇴화되는부위로연중이용이가능하다는점에서뿌리에비해원활한원료공급이가능함. - 노지에서재배하는인삼은병충해를막기위해많은양의농약을사용함으로써, 인삼지상부에비해많은양의농약이잔존할수있으므로, 이로인해화장품소재및식품소재로의활용이제한적임. 이에비해수경재배인삼은묘삼을이용하여 4개월재배하므로농약으로부터안전하다는장점이있음. 수경재배기술로인삼을재배함으로써무농약청정재배와연중생산이가능하고 2년근크기 (8-9g) 의수삼을 4개월만에생산할수있음. 또한인삼부산물을활용할목적으로개발된수경재배인삼은세계에서최초로개발된고속생산기술로서뿌리, 잎, 줄기를모두활용할수있고기능성분함량도높아고부가식품, 의약, 화장품소재로적합하며새로운수요창출이가능함. 3) 알코올성간손상의증가 - 전세계적으로알코올의소비량은점증하고있으며, 2013년도의발표에따르면우리나라는평균 12-21g의알코올을매일섭취하는것으로알려져있음. 알코올간질환은바이러스간질환에이은두번째흔한간질환의이유이며, 알코올관련사망자수도연간 10 만명당 9.6명으로위험군에속하는편임. - 입원환자를대상으로한연구에의하면우리나라에서알코올에의한간경변증은약 25-30% 였으며 (Kim YS et al, 2003), 알코올간질환환자 727명을평균 480일추적검사한결과사망률은 14.6% 였고, 주사망원인은정맥류출혈 (31.0%), 간부전 (24.5%), 간신증후군과패혈증 (11.3%) 순으로나타남. 특히, 만성알코올성간질환의경우비알코올성지방간의표현형과상당히비슷한손상이야기되며, 지방간형태의손상이일어남. 또한, 산화적손상과염증성손상이동시에일어나다발적으로간조직에영향을주어괴사및재생을더디게하는효과를가져옴. 이러한병리학적인상태가지속되면, 간성상세포가활성화되어섬유소및콜라겐과같은세포외기질등의물질을분비시켜서섬유화를초래하기도함. - 중증알코올성간손상에대해스테로이드, 영양요법, 펜톡시필린 (pentoxifylline) 을처방하는것이권장되나초기또는경도의알코올간손상에대해서는단주와절주외에보조적으로활용할수있는건강기능식품이나약물은뚜렷하게없는실정임 ( 대한간학회, 2013).

187 그림 146. 알코올성간질환의병리학적기전 나. 연구목표 1) 인체적용시험의목적 - 인삼열매추출물이알코올에의해손상된간기능개선및피로회복에미치는영향평가. - 시험군투여의안전성을확인. 2) 대상질환 - 만 20 세이상만 70 세미만성인남녀로서장기간알코올을습관적으로섭취하는인원 중특히간장질환에이상소견이있는자들을선정. 3) 인체적용시험디자인 - 단일기관, 무작위배정, 이중눈가림, 위약대조, 인체적용시험 - 시험군 : 고농도와저농도인삼열매추출물투여로, 총 2군 - 대조군 : 위약투여 - 본인체적용시험은만 20세이상만 70세미만성인남녀를대상으로알코올에의해손상된간기능개선및피로회복에미치는영향을평가하기위한시험임. - 인체적용시험을자발적으로동의한시험대상자는스크리닝이후시험대상자선정 / 제외기준에적합여부를확인후, 적합한경우에는무작위배정을통해시험군은인삼열매추출물을 12주간 1일 2회복용하고, 대조군은위약을복용하게됨. - 시험대상자는무작위배정후 12주간시험물질을복용한후외래방문하여인체적용시험계획서에따라안전성및유효성평가를위한의사의검진및실험실적검사를받게됨.

188 4) 대상자선정및제외기준 - 대상자선정기준 Ÿ 만 20세이상만 70세미만성인남녀 Ÿ 아래의기준중 1개이상해당하는경우 1 γ-gtp 60 이상 192 이하의소견을가지고있는자 2 AST(GOT) 가 40 이상 105 이하의소견을가지고있는자 3 ALT(GPT) 가 40 이상 135 이하의소견을가지고있는자 Ÿ 건강보조식품을섭취하고있지않은자 Ÿ 이연구의목적을충분히이해하고참여에동의하는자 - 대상자의제외기준 Ÿ 임신부, 수유부및가임여성으로참여기간동안임신및수유의계획이있는피험자 Ÿ 3개월이내간기능관련약물, 건강기능식품을복용중이거나간염보균자, 신급성간염환자등심한간기능장애가있는환자 Ÿ 심질환, 신질환, 담도계질환, 위장관계질환, 암등으로약물을복용중인자 Ÿ 항결핵제나비스테로이드성소염진통제, 항생제및 CYP450에영향을줄수있는항전간제를복용하는자 Ÿ 정신적무능력자, 본연구에사용되는시험약이외에현재연구개발중인다른시험약을복용하고있는자 Ÿ 이전에약물과민의이력이있는자 Ÿ 다음의기저질환이확인된자 : 조절되지않는고혈압 ( 고혈압약물복용후에도수축기혈압 > 140mmHg 및이완기혈압 > 90mmHg), 제 1형당뇨병및인슐린치료를받는당뇨병환자, 악성종양, 결핵, 천식, 녹내장, 다발성경화증, 정신병의소견을보이는우울증, 양극성정서장애, 정신분열증, 치매, 바이러스성간염, 간경화증, 만성신부전증, 거식증, 이상식욕항진, 간질 Ÿ 시험제품에대한과민반응력이있는자 Ÿ 병용약물로인해심각한약물상호작용의위험성이있는자 Ÿ 갑상선기능저하증, 쿠싱증후군등체중에영향을미칠수있는내분비질환병력이있는자 Ÿ 3개월이내에식욕억제제, 식욕완화제, 경구용스테로이드, 갑상선호르몬, 암페타민, 싸이프로헵타딘, 페노다이아진등의약물을복용한경험이있는자 Ÿ 의학적, 정신적으로연구약물복용의금기사항을가지는자 Ÿ 법적으로임상시험에참가가불가능한자 Ÿ 본임상시험에비협조적인태도의가능성이있는자또는연구자가판단하여시험을진행할수없다고판단되는자 5) 목표한대상자의수및그근거 - 본임상시험에서는시험식품투여군이대조식품투여군에비해알코올에의해손상된간기능개선효과가우월함을증명하는것으로, 인체를대상으로인삼열매추출물의알코올에의해손상된간기능개선에대해평가한자료가검색되지않아, 헛개나무

189 추출물과칡뿌리추출물을이용한알코올에의해손상된간기능개선에대한 γ-gtp 변화량을참고함 ( 박상욱등, 대한본초학회지 28(6):31-38, 2013). - 참고문헌에따라 γ-gtp 변화량의평균값이대조군은 9.3, 저용량시험군 ( 칡뿌리추출물 ) 은 0.2이고, 고용량시험군 ( 헛개나무추출물 ) 은 28.1, σ=27.0이라가정함. 이때, ( ) 를기준으로, 일원배치분산분석 (ANOVA) 을위한피험자수는군당 17명이며, 탈락률 (25%) 을고려하여군당등록할피험자수는 22명이나안정적인통계분석을위해군당 30이상으로선별하여총등록피험자수는총 102명으로함. - 목표유효성평가대상자수 : Ÿ 대조군 : 22명 Ÿ 시험군1( 저용량시험군 ): 22명 Ÿ 시험군2( 고용량시험군 ): 22명 - 무작위배정대상자수 Ÿ 대조군 : 34명 Ÿ 시험군1( 저용량시험군 ): 34명 Ÿ 시험군2( 고용량시험군 ): 34명 6) 건강기능식품복용방법 (1) 시험군 - 시험횟수는 1일당 2회, 12주간총 168회를투여함. - 무작위로배정되어시험순서눈가림된상태에서수령및투여방법을지시받음. - 복용하지않은추출물은회수하여기록함. - 시험기간동안일체의다른처치는시행하지않음. (2) 대조군 ( 위약 ) - 시험횟수는 1일당 2회, 12주간총 168회를투여함. - 무작위로배정되어시험순서눈가림된상태에서수령및투여방법을지시받음. - 복용하지않은추출물은회수하여기록함. - 시험기간동안일체의다른처치는시행하지않음. 7) 관찰항목, 임상검사항목및관찰검사방법 - 방문별관찰항목및임상검사항목 Ÿ 방문시마다임상실험실검사와유효성평가변수측정 (Kit 사용포함 ) 을위해최소 11ml (Visit 1) 에서최대 13ml (Visit 2 ~ Visit 4) 의채혈을실시하고, 10ml (Visit 1 ~ Visit 4) 의소변검사를진행함. (1) Visit 1 : -7d (-1wk) Ÿ 피험자방문및서면동의서취득 Ÿ Baseline Number ( 이하 BN) 부여 Ÿ 인구학적, 병력및치료력조사 Ÿ 활력징후, 신체검사및계측

190 1 활력징후 : 혈압, 맥박, 체온, 호흡수 2 신체검사 : 영양상태, 소화기계, 피부 / 점막, 근골격계, 이비인후계, 갑상선, 호흡 기, 심혈관계, 대사 / 내분비계, 비뇨생식기계, 신경 / 정신계, 척추 / 사지종 양 3 신체계측 : 키, 체중, 체질량지수 Ÿ 임상실험실검사 1 일반혈액검사 : Hematocrit, Hemoglobin, RBC, WBC, Platelet count, Differential Count (Neutrophil, Eosinophil, Basophil, Lymphocyte, Monocyte), MCV, MCH, MCHC, Uric acid, ESR 2 혈청생화학검사 : Fasting plasma glucose, γ-gtp, AST, ALT, Total Bilirubin, Creatinine, BUN, Alkaline Phosphatase, Albumin, Total protein, TG, HDL, LDL, Total cholesterol, LDH, SOD, Catalase, NK Cell activity, CRP 3 뇨검사 : ph, Specific gravity, Protein, Glucose, Ketone, Urobilinogen, Bilirubin, Nitrite, Blood, Leukocyte, hcg( 가임기여성 ) 4 혈청검사 : HBsAg test (Visit 1에서만실시 ) Ÿ 심전도 (ECG) 검사 (Visit 1에서만실시 ) Ÿ 만성피로 (Chalder s fatigue scale), 음주문제선별검사 (AUDIT-K), 우울증 (Beck Depression Inventory), 건강과관련된삶의질 (EQ-5D) 설문 Ÿ 병력과약물투여력조사 Ÿ 선정및제외기준판정 Ÿ 식사및복용방법교육 (2) Visit 2 : 1d (0wk+7, Visit 1 기준 ) - Visit 2 시점에검사한활력징후, 신체검사, 임상실험실검사, 유효성평가변수측정결과등은임상시험용건강기능식품투여후검사에대한기저치 (Baseline) 로이용됨. Ÿ 활력징후 ( 혈압, 맥박, 체온, 호흡수 ) Ÿ Randomization Number ( 이하 RN) 부여 Ÿ 임상시험용건강기능식품처방 Ÿ 병용약물변화 Ÿ 식사및복용확인및방법교육 (3) Visit 3 : 42d (6wk±7, Visit 2 기준 ) Ÿ 활력징후 ( 혈압, 맥박, 체온, 호흡수 ), 신체검사및계측 Ÿ 임상실험실검사 Ÿ 유효성평가변수측정 Ÿ 임상시험용건강기능식품처방 Ÿ 반납약회수및순응도평가 Ÿ 병용약물변화

191 Ÿ Ÿ Ÿ 이상반응평가식사및복용확인및방법교육보조평가변수측정 : 만성피로 (Chalder s fatigue scale), 우울증 (Beck Depression Inventory), 건강과관련된삶의질 (EQ-5D) 설문 (4) Visit 4 : 84d (12wk±7, Visit 2 기준 ) - Visit 4 시점에검사한활력징후, 신체검사, 임상실험실검사, 유효성평가변수측정 결과등은임상시험용건강기능식품투여후검사에대한최종평가시점 (endpoint) 로 이용됨. Ÿ 활력징후 ( 혈압, 맥박, 체온, 호흡수 ), 신체검사및계측 Ÿ 임상실험실검사 Ÿ 반납약회수및순응도평가 Ÿ 유효성평가변수측정 Ÿ 병용약물확인 Ÿ 이상반응평가 Ÿ 보조 평가변수 측정 : 만성 피로 (Chalder s fatigue scale), 우울증 (Beck Depression Inventory), 건강과관련된삶의질 (EQ-5D) 설문 Ÿ 인체적응시험의종료 / 중지 (5) Unscheduled Visit - 임상시험진행중시험책임자가이상약물반응이나중대한이상반응이라고판단할증상을피험자가호소하는경우또는그밖에필요한경우에는정규방문이외에 unscheduled visit을할수있음. - 시험책임자는피험자에대하여활력징후, 신체검사및계측, 임상실험실검사, 심전도 (ECG) 검사, γ-gtp, ALT, AST, Lipid parameters 평가, 병용약물확인, 이상반응평가등필요하다고판단되는검사를시행할수있고, 해당내용을증례기록서에기록함.

192 8) 평가계획표 표 36. 인체적용시험평가계획표 검사일정 항목 방문1 방문2 방문3 방문4 ( 선정방문 ) ( 투여전 ( 투여 6주후 ( 투여12주후 1차약물지급 ) 2차약물지급 ) 약물투약종료 ) 대상자동의서 선정기준 / 제외기준 Baseline Number 부여 인구학적조사, 병력및치료적조사 활력징후, 신체검사및계측 임상실험실검사 알코올성간손상검사 (γ-gtp, ALT, AST) Total cholesterol 평가및약물복용여부 심전도검사 만성피로, 음주문제선별검사, 우울증, 건강과관련된삶의질설문 이상반응, 병용약물확인 선정및제외기준판정 식사및복용방법교육 총괄적유효성평가 총괄적안전성평가 무작위배정 순응도검사 이상반응조사 제품지급 투여횟수 1일 2회 12주 * 1 차 screening 이후 2 차방문은 10 일이내로시행하며, 3 차방문까지의시기는 2 차 방문일로부터 6 주 ±3 일을, 4 차방문까지의시기는 3 차방문일로부터 6 주 ±3 일을허용 함.

193 9) 유효성평가기준및평가방법 (1) 평가기준 - 일차유효성평가 : 기초상태 (baseline) 에서 12주 (endpoint) 까지의 γ-gtp 변화량비교를통해시험식품을투여한군이대조식품투여군에비해알코올성간손상에대한간보호효과가우월함을증명하고, 알코올에의해손상된간기능에대한개선에효과적인적합한용량을찾아냄. - 이차유효성평가 : 기초상태 (baseline) 에서 12주 (endpoint) 까지의 ALT, AST의변화를통해시험식품을투여한군이대조식품투여군에비해알코올성간손상에대한간보호효과가우월함을증명하고, 알코올성간손상에대한간보호에효과적인지를평가하며, 만성피로 (Chalder s fatigue scale), 음주문제선별검사 (AUDIT-K), 우울증 (Beck Depression Inventory), 건강과관련된삶의질 (EQ-5D) 을평가함. (2) 통계분석방법 - 인구학적정보및기타치료전특성 Ÿ 인구학적정보 ( 연령, 신장, 체중등 ) 및기타임상시험용건강기능식품투여이전에실시한검사치에대하여연속형변수에대해서는분산분석 (ANOVA) 을실시함. 범주형변수에대해서는카이제곱검정 (chi-squared test) 및피셔의정확검정 (Fisher's Exact Test) 을실시하여비교함. - 일차및이차유효성자료의분석 Ÿ 시험식품투여군이대조식품투여군에비해개선효과의우월함과용량결정을위해기초상태 (baseline) 에서 12주 (endpoint) 까지의 γ-gtp 변화량을측정하여 Shapiro-Wilk 방법으로정규성을검정하고정규성을가정할수있으면분산분석 (ANOVA), 가정할수없으면 Kruskal-Wallis test 기법을적용하여세군의평균변화량의차이를검정함. 또한, 분산분석에서유의한차이가있는경우 Bonferroni 방법으로보정하여다중검정을실시함. Ÿ 투여전과투여후관측된세군의만성피로 (Chalder s fatigue scale), 음주문제선별검사 (AUDIT-K), 우울증 (Beck Depression Inventory), 건강과관련된삶의질 (EQ-5D) 설문점수변화량및 ALT, AST의변화량각각에대하여 Shapiro-Wilk 방법으로정규성을검정하고정규성을가정할수있으면분산분석 (ANOVA), 가정할수없으면 Kruskal-Wallis test 기법을적용하여세군의평균변화량의차이를검정함. 모든검정은양측검정으로유의수준은 0.05에서수행됨. - 안전성자료의분석 Ÿ 활력징후및신체계측, 임상실험실결과는각방문시점별평균및표준편차등의기술통계량과임상시험용건강기능식품복용전후변화량으로기술하고, 각치료군간의비교는분산분석 (ANOVA) 을실시하며, 치료전후비교는짝지은표본 t-검정 (paired sample t-test) 또는반복측정분산분석 (Repeated measure ANOVA) 으

194 Ÿ Ÿ Ÿ 로분석함. 신체검사결과는각방문별로증례수를계산하여카이제곱검정 (chi-squared test) 및피셔의정확검정 (Fisher's Exact Test) 을이용하여비교분석함. 임상시험전반에걸쳐발생한이상반응에대하여는신체기관별로구분해서증례수를계산하여카이제곱검정 (chi-squared test) 을이용하여비교분석함. 또한발생한이상반응을중증도, 투약과의관련여부별로증례수를산출하고카이제곱검정 (chi-squared test) 및피셔의정확검정 (Fisher's Exact Test) 을이용하여비교분석함. 약물복용력은임상시험기간동안임상시험용건강기능식품이외에피험자가복용한모든약물을기록하고, 기록된약물은계열별로분류하여평가함. 10) 이상반응을포함한안전성의평가기준및평가방법 (1) 평가대상 - 시험에참여한전례 (ITT군) 에대하여평가함. (2) 평가기준 - 간기능및신장기능등의악화와소화기장애발생여부 - 본시험에서이상반응은인체적용시험시작전에관찰되지않은증상이발생하는모든바람직하지않은의학적소견을이상반응으로분류함. (3) 평가방법 ( 통계분석방법 ) - 치료와연관성이있는이상반응발현건수를시험군별로기술하고 1회이상의이상반응을경험한시험대상자비율의군별비교는유의수준 0.05에서피셔의정확검정 (Fisher's exact test) 을이용하여수행함.

195 다. 연구계획 - 본인체적용시험계획을도식화하면아래의그림과같음. 그림 147. 인체적용시험연구절차

196 라. 연구결과 - 연구대상자는모두 102 명이등록하여이중 91 명이완료하였으며, 중도탈락은 11 명이었 으나인삼열매추출물의부작용과관련된건은없어서, 인삼열매추출물의안전성을검증 하였음. 1) 인삼열매추출물의항알코올성간질환효능연구 (1) 주평가인자인 γ-gtp 의혈청내변화관찰 - 연구기간동안혈청내 γ-gtp의변화를측정한결과, 시험식품군의경우시간이지날수록 γ-gtp의양이감소하는경향을나타내어 12주후측정결과 baseline 측정값보다유의하게감소하였으며이는농도의존적으로나타남. 특히고용량섭취군의경우 12주후측정결과에서대조식품군과비하여유의하게감소하였음을볼수있음. 그림 148. 시간에따른혈청내 γ-gtp 의변화량비교

197 (2) 부평가인자인간장전이효소의혈청내변화관찰 (AST, ALT, ALP) - 간장전이효소인 AST, ALT, ALP의변화를측정한결과 AST와 ALT 모두시험식품고용량섭취군에서만 baseline과비교하여유의적으로감소하였으며, 특히 AST의경우대조식품군과비교하였을때에도유의차를나타냄. ALP의경우에는군간에유의한변화가나타나지않음. 그림 149. 시간에따른혈청내 AST, ALT, ALP 의변화량비교

198 (3) 부평가지수인설문지조사결과현황 ( 한국형피로도조사 : CFS, 한국형음주관련 선별검사 : AUDIT-K, 우울증 : BDI, 건강관련삶의질조사 : ED-50) - 알코올섭취와관련하여피로도및우울증정도를알아보기위하여설문조사를실시한결과, 한국형피로도 (CFS-36) 설문조사에서는대조식품군에비하여시험식품저용량및고용량섭취군모두 baseline에비하여피로도가유의하게감소한것으로나타났으며, 이는대조식품군과비교하여서도유의하게감소함. 한국형음주관련선별검사 (AUDIT-K) 설문조사및한국형우울증관련 (BDI) 설문조사, 그리고건강관련삶의질 (ED-50) 설문조사에서는대조식품군및시험식품군모두 baseline에비하여유의하게감소하거나증가함을나타내어긍정적인결과를보였으며, 대조식품군도같은경향을나타내어플라시보효과가크게관찰됨. 그림 150. 설문지조사결과현황 (CFS, AUDIT-K, BDI, ED-50

199 (4) 기타평가요소인혈청내지질및지질대사체의변화량관찰 (Total cholesterol, triglyceride, HDL, LDL) - 혈청내의지질및지질대사체의변화량을측정한결과에서는, HDL cholesterol 의경우시험식품고용량섭취군에서대조식품군과비교하여유의하게증가하였으나, total cholesterol의경우대조식품군보다유의하게많은것으로나타나상반된결과를보임. Triglyceride 및 LDL cholesterol의경우군들간에유의한변화가보이지않음. 그림 151, 시간에따른혈청내 total cholesterol, triglyceride, HDL, LDL 의 변화량비교

200 (5) 기타평가요소인간장내지질및지질대사체의변화량관찰 (Total cholesterol, triglyceride, HDL, LDL) - 간장내에서의지질및지질대사체변화량을측정한결과, 군들간에유의한차 이가나타나지않음. 그림 153. 시간에따른간장내 total cholesterol,triglyceride, HDL, LDL 변화량 비교

201 (6) 기타측정요소인대상자혈액구성세포의분포변화결과 - 대상자들의면역력변화여부를알아보기위하여혈액세포내구성성분인백혈구의수치및적혈구, 헤모글로빈, 면역세포들의수치의변화를측정한결과, 군간에유의적인차이는나타나지않음. 그림 154. 혈액구성세포인백혈구, 적혈구, 헤모글로빈수치의변화 표 37. 혈구세포의하위분류인중성구, 단핵구, 임파구, 호산구및호염기구의분포 변화 Control Low (250 mg/day) High (500 mg/day) Week 0 Week 6 Week 12 Week 0 Week 6 Week 12 Week 0 Week 6 Week 12 NE (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ± 8.92 MO (%) 6.90 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1.69 LY (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ±8.04 EO (%) 2.61 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1.45

202 * 종합분석 - 혈청내 γ-gtp의경우시험식품섭취군에서시간이농도의존적으로 γ-gtp의양이감소하는경향을나타내어 12주후측정결과 baseline 측정값보다유의하게감소하였으며. 특히고용량섭취군의경우대조식품섭취군보다유의하게감소함. 또한시험식품고용량섭취군에서간장전이효소인 AST와 ALT의수치가 baseline과비교하여유의적으로감소하였으며, 특히 AST의경우대조식품군과도유의적인감소를나타냄. 이러한결과로인삼열매추출물의알코올성간에대한보호효과를알수있음. - 설문조사의경우한국형피로도설문조사에서시험식품섭취군이대조식품섭취군에비하여 baseline 보다피로도가유의하게감소한것으로나타나, 인삼열매추출물의섭취기간이늘어남에따라피로도가감소함을관찰할수있음. - 지질및지질대사체의경우혈청의 HDL 및 total cholesterol을제외하고는군들간에아무런경향이나유의한변화가보이지않음. 대조식품고용량섭취군에서혈청 HDL cholesterol 수준이유의하게증가하였으나 total cholesterol 또한증가하여상이한결과를나타냄. - 혈구및면역세포에서는군들간에유의적인차이를보이지않음 본실험결과를종합하여볼때, 인삼열매추출물의섭취가알코올에의해손상된간기능개선및피로회복에도움을준다는사실이확인되었으며, 12주간의실험기간동안시험식품과관련된부작용사례가나타나지않아안전성또한확인됨. 본인체적용시험결과는개별인정원료신청의기능성자료로사용됨.

203 ㅊ 가. 건강개별인정신청서류작성및신청 - 기능성식품원료로사용하기위한식약처의개별인정원료심사및허가절차는아래 와같음. - 그림 155. 식약처개별인정원료심사및허가절차 - 본과제를통하여수행된인삼열매추출물의표준화, 안전성, 기능성평가결과자료와수집분석된자료를종합하여식품의약처의건강기능식품기능성원료가이드라인에따라인정신청을위한제출자료를아래와같이작성하였음. 세포및동물실험의논문이게재완료되는대로 (Nutrients 학회지에현재심사중 ) 신청완료할예정임. 그림 156. 개별인정원료신청을위한작성서류의일부

204 - 개발소재인인삼열매에대해진행예정국가인중국, 대만, 홍콩, 베트남모두식품소재로서인정이되어있고국내의건강기능식품소재로서개별인정을받을경우안전성을인정받고있음. - 국내임상실험을통한건강기능식품기능성원료인정받은소재의제품은대만, 홍콩에건강기능식품으로수출이가능하며중국의경우중국내에서임상실험을진행해야만건강기능식품으로수출이가능하나현재일반식품과건강기능식품의차별성을크게부각시키지않은제품이유통되고있어일반건강식품으로수출을진행후시장상황등을고려후중국내임상진행가능성있음. 5. 수출형개별형제품개발 가. 수출용개별인정형건강식품시제품개발 1) 시제품제작을위한제형연구 - 현재시중에서인삼혹은홍삼을이용한식품으로판매되고있는제품으로는주로농축액, 환, 음료등이있음. 자사제품연구팀에서인삼열매추출물을이용하여생산할수있는여러가지제형을연구한결과음료, 정제, 고, 젤리등의형태가가능한것으로확인되었음. 2) 인삼열매를이용한식품시제품제조 - 상기의제형들중흔히유통되는제품과차별성을두면서간편하게섭취할수있는짜먹는젤리형태의제형을선정하였으며, 인삼열매분말원료자체에갱엿과유사한맛을지니고있어, 이를살리되인위적이지않은건강한단맛을내도록개발하였음. 이에, 휴대가간편하고손쉽게섭취할수있는젤리스틱포장형태의제형으로시제품 진생리버베리 를제조함. 그림 157. 진생리버베리 시생산제조기록서

205 3) 제품명 진생리버베리 : 간을보호해주는인삼열매라는의미의제품명으로, 인삼열매의 그림과함께열매의붉은색배경을바탕으로한패키지상자도안으로디자인함. 그림 158. 인삼열매를이용한시제품 진생리버베리 패키지상자도안 국문, 중문 그림 159. 진생리버베리 시제품패키지상자및제품 사진

206 4) 시제품 진생리버베리 의제품배합비설정 표 38. 진생리버베리 시제품배합비 성분명 배합비 (%) 함량 (g) 인삼열매추출물분말 시클로덱스트린시럽 **.** **.** 대추농축액 **.** **.** 결정과당 **.** **.** 아가베시럽 **.** **.** 배농축액 **.** **.** 검베이스혼합제제 **.** **.** 감마시클로덱스트린분말 **.** **.** 허브향 **.** **.** 무수구연산 **.** **.** 황금혼합추출농축액 **.** **.** 효소처리스테비아 **.** **.** 자옴종자추출물 **.** **.** 식물혼합분말 **.** **.** 스피루리나추출물분말 **.** **.** 빌베리추출물분말 **.** **.** 정제수 **.** **.** 합계

207 나. 시제품의안정성평가 : 유통기한설정 1) 본제품은, 1 공정중살균공정이있는제품으로자체의미생물생육이억제될수있고, 내면 PE 포장으로포장완료상태에서의외부로부터의공기유입이나수분흡수가방지되고자외선이차단된다는점 2 본제품과유사한자사의기존유통제품의유통기한이 18개월인점상기의두가지사항을감안하여 식품등의유통기한설정기준 III. 식품등의유통기한설정실험을생략할수있는경우 를적용, 유통기한설정실험을생략하고본제품의유통기한을 18개월로설정하였음. < 그림 160. 품목제조보고신청시제출한유통기한설정사유서 > 2) 진생리버베리 제품품목제조보고완료 < 그림 161. 인삼열매제품 진생리버베리 품목제조보고서 > 인삼열매추출물을포함하는 진생리버베리 제품을개발완료하여품목보고를완료하 였으며, 중국등의해외시장수출을겨냥하고있음

208 6. 태극삼, 흑삼및인삼부산물의통합데이터베이스및웹사이트구축 가. 1, 2차년도의수집된데이터의효율적인검색및서비스를위한시스템설계 1) 사용자편의성을기반으로한웹디자인설계 (1차년도에구축된웹사이트의업데이트 ) - 계정관리, 즐겨찾기, 최근변경, 도움말에쉽게접근할수있도록구성된유틸메뉴 - 빠른지식검색을도와주는검색창 - 시스템의주요컨텐츠를나타내는주메뉴 - 주메뉴에따른부메뉴 ( 보다세부적이고다양한컨텐츠를나타낼수있음 ) - 페이지의제목및내용 - 인쇄용화면, 히스토리, 수정, 편집, 즐겨찾기, 태그, 댓글등의유용한기능이모여있는에디트바 - 새글쓰기, 첨부파일관리, 권한설정이가능한옵션바 그림 162. 웹사이트기본화면구성 2) 각진세노사이드의상세정보및질병과유전자간의연결정보시각화구현 - 현재까지크로마토그래피분석에따라 30가지가넘는진세노사이드가확인및분류되어있음. 인삼내함유된진세노사이드의종류및구성성분은인삼의종및조직, 재배기간, 재배방법, 수확시기및보존방법에따라서도달라짐. Ÿ 국내학술발표및국가연구보고서 1,906건 질병관련 29건 Ÿ 진세노사이드관련특허출원 / 공개 ü 국내특허실용검색총 2,522건 질병관련 1,492건 ü 일본특허검색총 393건 질병관련 224건 Ÿ Pubmed/Scopus 등의학술지검색총 3,936건, 이중질병관련 1,124건 - 2차년도에구축된인삼의기능별, 효능별데이터베이스에진세노사이드관련정보추가업데이트를완료함. 3) 인삼의콘텐츠및생산이력정보등을포함한빅데이터설계. Ÿ 현재까지품목제조신고된국내인삼제품 8,190건 현재유통중 3,276건 Ÿ 제품정보및생산이력정보를포함하여데이터베이스에업데이트완료.

209 4 절. 태극삼, 흑삼을활용한기능성소재화 1. 태극삼, 흑삼제조공정개발연구 가. 시중유통태극삼과흑삼의진세노사이드및벤조피렌분석 1) 진세노사이드함량분석 - 시중에서판매되는태극삼 3종과흑삼 5종을구입하여진세노사이드성분을비교하였다. 시중에서판매되는흑삼에는진세노사이드 Rb1, Rg1 성분이거의존재하지않는것으로나타났으며 Rg3 성분은 0.6~1.7mg/g이함유되어있었으며평균적으로 1.0mg/g을함유하고있었다. 시중에서판매되는태극삼에는 Rg1, Rb1 성분이 5.1~10.4mg/g 함유되어있었으며평균 7.0 mg/g 함유하고있었으며 Rg3는극미량함유되어있는것으로나타났다. 표 38. 시중유통태극삼 (TG) 및흑삼 (BG) 진세노사이드함량 μ μ

210 μ μ μ μ a b 개별진세노사이드함량 mg g S 시료채취량 g μ

211 2) 벤조피렌함량분석 - 시중에서유통되는흑삼 5종을수거하여벤조피렌함량조사하였다. 시중에서판매되는흑삼에는벤조피렌함량이 0.6~0.9μg/kg을함유하는것으로나타났으며평균 0.8μg/kg을함유하고있어서식약처에서정한기준 (2.0 μg/kg) 은만족하였으나안정적인품질유지를위해꾸준한관리가필요할것으로판단되었다. 표 39. 시중유통흑삼의벤조피렌함량 μ μ μ μ μ 시간 (min) 증류수 Acetonitrile 0 20% 80% 30 20% 80%

212 μ

213 나. 태극삼, 홍삼, 흑삼제조공정확립연구 - 기존의홍삼, 태극삼및백삼과는다른새로운형태의제품인흑삼이출현함에따라이에대한체계적관리를하기위하여 인삼산업법 이개정, 공포 ( 법률제10948호, ) 됨에따라제조방법에따른분류규정을색상에따라구별하도록법개정이되었다 ( 시행규칙개정 ). - 진안지역에서재배된 4년근인삼을 10월에채굴하여크기와모양이비슷하게선별하고직삼 50~70g에해당하는인삼을채취하여흙이나비닐등이물질을완전히제거한뒤진안홍삼연구소에구축된증삼장치와건조장치를이용하여조건별태극삼, 홍삼과흑삼을제조하여산업적으로우수한경쟁력을갖을수있도록제조공정을확립하고자하였다. - 따라서본실험에서도태극삼제조에는물을사용하지않고수증기를이용하여익히고건조하였으며다음의제조조건에따라태극삼과흑삼을제조하였다. 그림 163. 증삼장치및건조장치

214 1) 태극삼표준제조공정 그림 164. 태극삼제조공정 1 세척 인삼을원통형세척기에넣고흙, 비닐등이물질이완전히제거되도록깨끗하게세척한다. 이때세척기로인행최대한인삼에상처가나지않도록주의한다. 2 예비건조 세척한인삼을채반에배열하고열풍건조기에서 30~40 로 3~10 시간건조하거나또는 햇볕에서 1~2 일정도건조한다. 3 증삼건조한인삼을채반에배열하여증삼기에넣고실온에서 60~70 까지빠르게승온하여 10~20분간유지하고목적온도 (90~98 ) 까지빠르게승온하여 20분 ~1시간증삼한다. 증삼후원하는성분함량과색택에따라 30분 ~1시간정도후숙한다. 4 건조 증삼한인삼을증삼기에서꺼내서 50~60 건조실에서건조하여표면의수분을제거하고 건조기또는양건장에서최종수분이 15% 이하가되도록건조한다.

215 2) 흑삼표준제조공정 그림 165. 흑삼제조공정 1 세척 인삼을원통형세척기에넣고흙, 비닐등이물질을완전히제거한다. 이때최대한인삼에 상처가나지않도록한다. 2 예비건조 세척한인삼을열풍건조기에서 30~40 로 3~10 시간또는햇볕에서 1~2 일정도건조한 다. 3 1 차증삼 건조한인삼을증삼기에넣고실온에서 60~70 까지빠르게승온하여 10~20 분간유지하 고목적온도 (90~98 ) 까지승온하여 2~5 시간증삼한다. 4 1 차건조 증삼한인삼을증삼기에서꺼내서 20~40 에서 1 일간건조하여표면의수분이제거되도록 건조한다. 5 2 차증삼 건조한인삼을증삼기에넣고실온에서목적온도 (90~98 ) 까지승온하여 2 시간 ~5 시간증 삼한다. 증삼후원하는성분별함량, 색택에따라 1~3 시간정도더증삼한다. 6 2 차건조 증삼한인삼을증삼기에서꺼내서 20~40 에서 1 일간건조하여표면의수분을제거한다. 7 3 차증삼 건조한인삼을증삼기에넣고실온에서목적온도 (90~98 ) 까지승온하여 2 시간 ~5 시간증 삼한다. 증삼후원하는성분별함량, 색택에따라 1 시간 ~3 시간정도더증삼한다. 8 3 차건조 증삼한인삼을증삼기에서꺼내서 50~60 건조실에서 1 일간건조하여표면의수분을제 거하고건조기또는양건장에서최종수분이 15% 이하가되도록건조한다.

216 3) 제조된태극삼과흑삼 백삼태극삼 (1 증 ) 홍삼 (1 증 ) 흑삼 (3 증 ) 그림 167. 상기제조방법에따라제조된태극삼과흑삼

217 4) 제조된태극삼과흑삼의절단면 태극삼 ( 단면 ) 흑삼 ( 단면 ) 그림 168. 제조된태극삼과흑삼의절단면 5) 태극삼과흑삼의대표적인주요결점요인 태극삼 ( 내백 ) 흑삼 ( 내공 ) 그림 169. 태극삼과흑삼의주요결점요인

218 6) 태극삼및흑삼의물추출농축액제조 - 태극삼및흑삼의물추출물농축액의제조는홍삼물추출물농축액의제조과정과유사하 게제조하여최종고형성분이 72Bx 가되도록농축하여 4 저온창고에서보관하면서성 분분석, 생리활성, 동물시험및인체적용시험용시료로사용하고자하였다. 그림 170. 태극삼및흑삼농축액제조방법 다. 흑삼가공조건별진세노사이드함량분석결과 - 흑삼제조공정개발을위해증삼 / 건조횟수별진세노사이드함량을분석하였다. 각단계별증삼은 90~95 온도범위에서 2~5시간가공시간으로제조하였다. - 진세노사이드 Rg1, Rb1은 2회증삼 / 건조까지는함량이큰폭으로증가하였으며 4회이상부터는현저히감소하여 8회이상에서는 Rg1이거의다사라지는것으로나타났다. 이결과는시중에서유통되는흑삼의검사결과와유사한결과를보여주는것으로 9증9포흑삼에서는인삼의지표물질인 Rg1이전혀검출되지않아인삼이라고말하기조차어려운상황이었다. 그러나 Rg3(s), F4, Rg5의경우에는 7증까지지속적으로증가하다 8증이후부터는별로증가하지않는결과를보였다 회 2 회 3 회 4 회 5 회 6 회 7 회 8 회 9 회 Rg1 Rb1 F4 Rg3(s) Rg5 Rg1+Rb1+Rg3 그림 171. 흑삼가공조건별진세노사이드함량

219 라. 흑삼가공조건별벤조피렌함량분석결과 - 벤조피렌은고온의열가공에의해서흑삼을제조할때증가하는발암성물질로매우유해한성분이다. 그래서우리는흑삼의진세노사이드성분의변화관찰과함께벤조피렌함량변화를관찰하였다. - 흑삼의가공온도 (90~95 ) 와횟수 (1~9회) 에따른벤조피렌함량변화를분석하였다. 증숙횟수에따라벤조피렌함량이증가한다는상념과는다르게벤조피렌함량은우리가가공한 90~95 조건에서는가온에의한벤조피렌증가가거의일어나지않는것으로나타났다. 가공차수별로차이는있었으나 0.4~0.5μg/g을값으로시판되는흑삼의벤조피렌보다는 50% 이상낮은값을보였다. 그림 172. 흑삼가공조건별벤조피렌함량 마. 태극삼및흑삼농축액의 ginsenoside 함량분석및패턴조사 - 건강기능식품공전에는인산류의기능성분 ( 또는지표성분 ) 함량기준은 ginsenoside Rb1과 Rg1의합이 mg/g으로규정되어있기때문에소량및대규모시설을이용한태극삼과흑삼물추출농축액을제조하여 ginsenoside 함량분석을공식검사기관에의뢰하여분석하였다. 태극삼농축액의경우 5.09, 5.91, 6.63 mg/g으로나타나그기준에적합하였다. 그리고흑삼농축액의경우 ( 표 4, Fig. 3) 태극삼농축액에비해서 ginsenoside-rg1은감소하였으나 Rb1은약 1.5배이상, Rg3(s) 함량은 3-6정도증가하였고 diol 그룹의분해산물인 ginsenoside-rk1은 0.24mg/g, Rg5는 0.34mg/g의농도로검출되었다. - 흑삼의특징적인사포닌이라고할수있는 Rk1과 Rg5 함량은증삼횟수에따라그양이증가하는경향이나 Jo 등 (31) 의결과에의하면 9회증삼했을경우에 Rk1 함량은 6.8mg/g, Nam 등 (30) 은약 4.07mg/g이며 3회증삼했을경우에는 1.28mg/g 정도라고보고하였다. 한편 Rg5의경우 Jo 등 (31) 은흑삼의경우에 28.1mg/g으로보고하였으나, 본실험에서는흑삼농축액의경우에 0.34mg/g과비교하면많은차이가난다. 이것은분석방법에의한차이가있을수도있으나 ginsenoside-rk1과 Rg5 자체가매우불안정하여액체상태로존재할경우에분해속도가빠르게진행될수있다고판단된다. - 그리고본연구에서는태극삼물추출농축액의경우에는동물시험과인체적용시험을추진하여기능성추가또는개별인정원료의등록이라는측면에서보면태극삼농축액의원료성분표준화가잘이루어졌으며, 이를동물시험과인체적용시험의시료로사용하여도

220 별문제가없다고판단된다. 소규모및대규모시설을이용하여제조한태극삼물추출농축액의 ginsenoside의 HPLC 패턴은거의같은 retention time에거의같은높이의 peak 로나타났다. 그러나 ginsenoside-rg3(s) 의경우육안으로도확인하기어려운정도의 peak가검출되어홍삼이나흑삼의농축액과다른형상으로나타났다. 표 39. 예비소규모실험에의한태극삼농축액의 ginsenosides 함량 태극삼농축액 Ginsenosides 함량 (mg/g) Rb1 Rg1 Rg3(s) Rb1 + Rg1 A B C 표 40. 본실험에의한태극삼농축액의 ginsenosides 함량 태극삼농축액 Ginsenosides 함량 (mg/g) Rb1 Rg1 Rg3(s) Rb1 + Rg1 A B C 표 41. 흑삼농축액의 ginsenosides 함량 Ginsenosides(mg/g) 항목 Rg1 Rb1 Rg3(s) Rk1 Rg5 흑삼농축액

221 그림 112. 태극삼농축액의 ginsenoside-rb1, Rg1 and Rg3(s) HPLC chromatogram (Lab scale)

222 그림 173. 태극삼농축액의 ginsenoside-rb1, Rg1 and Rg3(s) HPLC chromatogram (large scale) 그림 174. 흑삼추출물의 ginsenoside-rb1, Rg1, Rg3(s), Rk1, and Rg5 HPLC chromatogram

223 바. 태극삼및흑삼농축액의 TLC 에의한 ginsenoside 패턴분석 - 태극삼과흑삼의물추출물농축액의 ginsenoside의 TLC 패턴을조사한결과, 태극삼농축액에서는 ginsenoside-rb1과 Rg1은분명히나타났으나 Rg3(s) 는불명확하게나타났으며, 흑삼농축액에서는 ginsenoside-rb1, Rg1, Rg3(s) 및 Rk1은분명하게나타났으나 Rg5는불투명하게나타나다른전개용매를사용하여확인할필요성이있다고판단된다. 그림 175. 태극삼과흑삼추출물의인삼사포닌 TLC chromatogram

224 2. 태극삼, 흑삼이화학적특성분석 가. 태극삼, 홍삼, 흑삼의수분, 회분함량측정 1) 수분함량 ( 상압가열건조법 ) - 미리가열하여항량으로한칭량접시에시료약 3 g 을정밀히취하여 105 오븐에 넣고 8 시간건조후데시케이터에서 30 분간식히고무게를측정하였다. 다시칭량접시를 건조하여향량이될때까지같은조작을반복하였다. a : 칭량접시의무게 (g) b : 칭량접시와검체의무게 (g) 수분 c : 건조후항량이되었을때의무게 (g) - 수분함량은태극삼이 7.49%, 홍삼이 5.76%, 흑삼이 7.10% 이었다. 그림 177. 수분함량

225 2) 회분함량측정 - 회분의측정은식품공전시험법 직접회화법에따라시행하였다. 미리회화후가열건조하여항량으로한도가니에시료약 1 g을정밀히취하여 550 에서 8시간가열하고그대로식혀약 200 로되었을때데시케이터에옮겨식힌후칭량하고시료의회분량 (%) 을다음식에따라산출하였다. 회분 W W S W0 : 항량이된도가니에무게 (g) W1 : 회화후의도가니와회분의무게 (g) S : 검체의채취량 (g) - 회분함량은태극삼이 4.16%, 홍삼이 4.18%, 흑삼이 4.12% 로비슷하였다. 그림 178. 회분함량

226 나. 태극삼, 홍삼, 흑삼의아미노산함량측정 1) 표준용액의조제아미노산표준품 21종을각각을섞어 50 ml 부피플라스크에메탄올로녹여 200 ppm으로하여표준원액으로하였다. 이원액을 100 ppm, 50 ppm, 10 ppm, 2 ppm으로계열희석하여표준용액으로하였다. 2) 시험용액의조제시료 1 g을 falcon 튜브에넣고 50mL의물을가하고, 30분간 sonication한후여과하여물층을취했다. 다시 falcon 튜브에 50mL의물을가하고, 30분간 sonication한후여과하여물층을모아 60 에서감압농축하였다. 농축액을 0.02 N 염산에용해하여최종부피가 10 ml가되도록하였다. 10,000 rpm에서 5분간원심분리하고 0.45 μm syringe filter(a dvantec, PTFE) 로여과한후시험용액으로하였다. 3) 이동상의조제이동상의조제는아세토니트릴 : 메탄올 : 물 = 45:45:10으로하였고, Na HPO (Sigma, Germany) 5.47 g을물 1 L에녹이고, 5 mg Sodium azide(sigma, Germany) 를녹인후, ph 7.8이되도록하였다. 4) 아미노산 21 종함량측정 a) 고속액체크로마토그래피분석조건 μ b) 정량시험 : 표준용액과시험용액을각각 10 μl 씩주입하여앞의조건에서시험한다. 표준용액의피크의면적에의해구한검량선을사용하여시험용액중아미노산 21 종의농 도 (μg/ml) 를구하고, 다음의식에의하여시료중아미노산의함량 (mg/kg) 을구하였다.

227 a b 아미노산함량 mg kg S 시료채취량 g S : 시험용액중개별아미노산농도 (μg/ml) a : 시험용액의전량 (ml) b : 희석배수 - 생체에서합성되지않는필수아미노산인 valine, leucine, isoleucine, methionine, thre onine, lysine, phenylalanine, tryptophan은태극삼, 홍삼, 흑삼모두에서검출되었다. Tryptophan은태극삼이홍삼에비해 5% 정도적었고, valine, leucine, isoleucine, meth ionine, threonine, lysine, phenylalanine은 15 44% 정도더많았다. 성장기의유아에게필요한 arginine, histidine의경우에는태극삼이홍삼에비해 19% 와 39% 더많이함유하고있었다. 흑삼의경우필수아미노산의함량은태극삼이 % 정도더많이검출되었고, arginine, histidine의경우에는태극삼이흑삼에비해 288% 와 181% 더많이검출되었다. 아미노산함량은아미노산이열변성에약하기때문에증삼온도가낮고증삼시간짧은태극삼에서가장많이검출되었고, 홍삼, 흑삼의순으로많이검출되었다. 그림 179 아미노산함량 (mg/kg)

228 다. 태극삼, 홍삼, 흑삼의무기질함량측정 1) 표준용액의조제 표준품을 3% 질산으로묽혀 10 ppm, 5 ppm, 1 ppm, 0.1 ppm 하여표준용액으로하였 다. 2) 시험용액의조제균질화된시료약 0.5 g을마이크로웨이브용베셀에정밀히취한후질산 8 ml를넣고마이크로웨이브에서 190 에서 50분간전처리하였다. 이때반응공시료로마이크로웨이브용베셀에질산 8 ml를넣어같이전처리하였다. 마이크로웨이브에서꺼내어 3차증류수로 20 ml 부피플라스크에희석한것을시험용액으로하였다. 3) 기기분석조건 - 무기질함량은 Ca, K, Cu, Zn 은오차범위이내로검출되었고, Fe 는 pp m, Mn 은 ppm, Mg 는 1,367 1,497 ppm, S 는 1,235 1,475 ppm, P 는 2, 796 3,324 ppm, Na 는 ppm 이었다. 그림 180. 무기질함량 (mg/kg)

229 라. 태극삼, 홍삼, 흑삼의지방산함량측정 1) 표준용액의조제 37 종지방산표준품 (F.A.M.E. Mix C4-C24, Supelco, Germany) 앰플을 4 ml 헥산에 녹여조제하였다. 2) 시험용액의조제지방산측정은식품공전 지방산제2법에의하여실시하였다. 균질화된검체를약시료약 1.5 g을정확히칭량하여마조니어관에넣고약 100 mg의피로갈롤을첨가한후, 2 ml의내부표준용액을첨가하였다. 마조니어관에끓임쪽을넣고 2 ml 에탄올을첨가하여전체검체가잘섞일때까지혼합하고 8.3 M 염산용액 10 ml을넣고잘섞었다. 마조니어관의마개를밀봉한후, 80 의수조에서 40분간분해하였다. 분해후, 실온으로냉각하고에테르추출시분액이용이하도록마조니어관의아래부분을에탄올을첨가하여채운후부드럽게섞어주었다. 마조니어관의분해물에 25 ml 디에틸에테르를첨가하고마개를한후 5분간진탕하여추출하였다. 에테르혼합추출용매로마개를씻고 25 m L의무수석유에테르를추가하여 5분간다시진탕추출하고상층이깨끗해질때까지방치하여분리하였다. 에테르층을분액한후증발시키기위해 40 수조에서에테르를천천히증발시켰다. 2~3 ml 클로로포름과 2~3 ml 디에틸에테르로추출한지방을녹여 15 ml 시험관으로옮긴후, 40 수조에서질소농축하고 2.0 ml 7% 트리플루오로보란메탄올용액과 1.0 ml의톨루엔을첨가하였다. 마개로잘밀봉하여 100 오븐에서 45분간가열한후실온으로냉각하였다. 5.0 ml 증류수, 1.0 ml 헥산및약 1.0 g 무수황산나트륨를첨가한후진탕하여정치하고분리된상층액을취하여약 1.0 g의무수황산나트륨을담은다른바이알에넣고탈수한후시험용액으로하였다. 3) 가스크로마토그래피불꽃이온화검출기분석조건

230 - 지방산함량은리놀레산, 팔미트산, 올레산, 리놀렌산 (linolenic acid, palmitic acid, ole ic acid, linolenic acid ) 순으로높게나타났으며, 불포화지방산으로체내에서는합성되지않는필수지방산으로식품으로섭취하여야하는리놀레산, 리놀렌산및아라키돈산의경우태극삼이 6.52 mg/g, 홍삼이 6.61 mg/g, 흑삼이 7.77 mg/g으로흑삼에서가장많이검출되었다. 개별지방산의함량은태극삼, 홍삼, 흑삼의순으로많이검출되었다 (unit: mg/g). 그림 181. 지방산함량

231 마. 태극삼, 홍삼, 흑삼의색차측정 1) 주근색차측정 - 색차계 ( 코니카미놀타, CM-700d) 를사용하여태극삼, 홍삼, 흑삼시료를 Figure 182 과 같이주근의 2 부위 (A, B) 에서색차를측정하였다. 그림 182. 주근의색차측정위치 - 주근의색차값 L( 명도 ) 값은 A와 B부분모두에서태극삼, 홍삼, 흑삼의순으로감소하였다. a( 적색도 ) 값은 A와 B부분모두에서홍삼, 태극삼, 흑삼의순으로감소하였다. b( 황색도 ) 값은 A부분에서는홍삼, 태극삼, 흑삼의순으로감소하였고, B부분에서는태극삼, 홍삼, 흑삼의순으로감소하였다. de값은 A와 B부분모두에서태극삼, 홍삼, 흑삼의순으로감소하였다. 홍삼에비해흑삼이 1 mg/g 정도더함유하고있었다. 전체적인지방산함량에서는홍삼 이 1.00 g/100 g 이었고흑삼이 1.17 g/100 g 이었다. 그림 183. 주근의색차비교

232 2) 분말색차측정 - 색차계 ( 코니카미놀타, CM-700d) 를사용하여각조건별균질화된시료를 cell에넣고일정한밀도로분말시료를충진하여색차를측정하였다. - 분말색차값 L, a, b에서 L( 명도 ) 값은태극삼이 86.16, 홍삼이 84.93으로비슷하였고, 흑삼이 66.86으로감소하는경향을보였다. a( 적색도 ) 값은태극삼이 1.71, 홍삼이 2.37, 흑삼이 6.45로증가하였고, b( 황색도 ) 값은태극삼이 14.23, 홍삼이 16.18, 흑삼이 18.96으로증가하였다. de값은태극삼이 87.34, 홍삼이 86.49로비슷하였고, 흑삼이 69.80이었다. 표 42. 태극삼, 홍삼, 흑삼의색차비교

233 바. 태극삼, 홍삼, 흑삼의 ginsenoside 함량분석 1) 시험용액의조제 - 분말약 1 g에 50% methanol 25 ml를첨가한후 30분동안초음파추출한것을 μm syringe filter(advantec, PTFE) 하여 HPLC 분석에이용하였다. 2) 표준용액의조제 - 진세노사이드 14 종표준품각각을메탄올에녹여여과 (0.45 μm) 하여각각표준원액을 (1 mg/ml) 만들고, 표준원액을메탄올로적당히희석하여표준용액으로이용하였다. 3) 고속액체크로마토그래피분석조건 μ μ 시간 (min) 증류수 Acetonitrile 0 82% 18% 10 80% 20% 30 73% 27% 40 70% 30% 55 49% 51% 66 10% 70% 70 10% 90% 71 82% 18% 75 82% 18% 4) 정량시험 : 표준용액과시험용액을각각 10 μl씩주입하여앞의조건에서실험하였다. 표준용액의피크의면적에의해구한검량선을사용하여시험용액중진세노사이드의농도 (μg/ml) 를구하고, 다음의식에의하여시료중진세노사이드의함량 (mg/g) 을구하였다. a b 개별진세노사이드함량 mg g S 시료채취량 g S : 시험용액중개별진세노사이드농도 (μg/ml) a : 시험용액의전량 (ml) b : 희석배수

234 5) 태극삼, 홍삼, 흑삼의진세노사이드함량분석결과 - 표준화된제조공정으로제조된태극삼과흑삼에함유된진세노사이드를홍삼의진세노사이드함량과비교하여분석하였다. - 진세노사이드 Rg1, Rc, Rb2는태극삼에서홍삼으로가공시에함량이증가하는것으로나타났으며이는이들의전구체인말로닐진세노사이드 Rg1, Rc, Rb2가열처리에의해말로닐그룹이떨어져나가면서증가한것으로보인다. 태극삼에는말로닐진세노사이드가존재하였으나홍삼에는말로닐진세노사이드가존재하지않았다. - 진세노사이드 Rg3, F4, Rh1+Rg2는홍삼에서흑삼으로가공시에급격하게증가하는것으로나타났고진세노사이드 Rd, Rg5, Rk1은홍삼에서흑삼으로가공시에서서히증가하는것으로나타났다. - 진세노사이드 Rg1, Ra1은홍삼에서흑삼으로가공시에서서히감소하는것으로나타났고진세노사이드 Re, Rb1은홍삼에서흑삼으로가공시에급격하게감소하는것으로나타났다. 그림 184. 태극삼, 홍삼과흑삼의진세노사이드함량

235 사. 태극삼, 홍삼, 흑삼의벤조피렌함량분석 1) 시험용액의조제 - 분말약 2.5 g을정밀하게달아물 50 ml를넣어 30 분간초음파추출하였다. 여기에헥산약 50 ml 및내부표준액 1 ml을넣어 1 분간균질하게섞은다음 30 분간초음파추출하였다. 헥산층을분액깔때기에옮기고다시물층에헥산약 50 ml씩을넣고 2회반복추출하여헥산층을취하여분액깔때기에합하였다. 합한헥산층에물약 50 ml를넣어세척하고, 이헥산층을무수황산나트륨을넣은여과지를사용하여탈수여과한다음 4 5 의수욕상에서감압하여헥산약 2 ml가될때까지농축하였다. 플로리실카트리지는미리디클로로메탄 10 ml 및헥산 20 ml를순서대로초당 2~3 방울의속도로유출시켜활성화시킨후사용하였다. 활성화된카트리지에위의추출용액을넣어헥산 디클로로메탄혼합액 (3 : 1) 20 ml를초당 2~3 방울의속도로용출시켰다. 이용출된액을 35 이하의수욕상에서질소가스하에날려보낸후잔류물을아세토니트릴 1 ml에녹인다음 μm syringe filter로여과한것을시험용액으로이용하였다. 2) 표준용액의조제 - 벤조피렌표준품및 3-메틸콜란트렌표준품적당량을정밀하게달아각각아세토니트릴에녹여 ml당 1 μg을함유하는표준원액및내부표준원액을만들었다. 이표준원액과내부표준원액적당량을정확하게취하여아세토니트릴로 ml 당약 1~50 ng의벤조피렌과각각 50 ng의내부표준물질이함유되도록희석하여표준액으로하였다. 3) 고속액체크로마토그래피분석조건 μ μ

236 4) 정량시험 : 표준용액과시험용액을각각 10 μl씩주입하여앞의조건에서실험하다. 각표준액에서얻은내부표준물질피크면적에대한벤조피렌의피크면적비 [AS/AIS] 를 Y 축으로하고벤조피렌의농도를 X축으로하여만든검량곡선을작성하고, 검액의내부표준물질피크면적에대한벤조피렌의피크면적비 [ASAM/ASAMIS] 를 Y축에대입하여벤조피렌의농도를구하였다. 5) 태극삼, 홍삼, 흑삼의벤조피렌함량분석결과 흔히흑삼을제조할때가공횟수증가에따라벤조피렌이급격히증가하는것으로알려 져있으나실제로는 90~98 가공조건에서는벤조피렌이거의증가하지않는것으로나타 났으며태극삼, 홍삼, 흑삼중의벤조피렌함량은거의유사한경향을보였다. ( 단위 : µg/kg)

237 아. 태극삼, 홍삼, 흑삼의총폴리페놀함량분석 1) 시험용액의조제 - 분말약 1 g을정밀하게달아 50% ethanol, 50 ml를넣어환류추출 (85, 2 hr) 한후원심분리하여 (3000 rpm, 10분 ) 상층액만취하였다. 잔사에 50% ethanol, 40 ml 넣어반복추출하고원심분리후상등액만모아 100 ml로정용한액을시험용액으로이용하였다. 2) 시약 - 탄닌산 10 mg 을정밀히칭량하여 100 ml 부피플라스크에넣고증류수로표선까지채 운다. 위의표준원액을증류수로적정농도희석하여표준용액으로사용하였다. 3) 총폴리페놀함량측정 - 증류수 7.5 ml를시험관에취한후표준용액및시험용액을각각 1 ml씩첨가하였다. Folin-denis 시약 0.5 ml, 35% 탄산나트륨 1 ml를반드시순서대로가하여혼합하여암소에서 1시간방치후 760 nm에서흡광도를측정하였다. 4) 총폴리페놀함량측정결과 그림 185. 태극삼, 홍삼, 흑삼의총폴리페놀함량

238 자. 태극삼, 홍삼, 흑삼의항산화활성분석 1) 시험용액의조제 - 분말약 1 g을정밀하게달아 50% ethanol, 50 ml를넣어환류추출 (85, 2 hr) 한후원심분리하여 (3000 rpm, 10분 ) 상층액만취하였다. 잔사에 50% ethanol, 40 ml 넣어반복추출하고원심분리후상등액만모아 100 ml로정용한액을시험용액으로이용하였다. 2) 시약조제 - 1 mm DPPH 용액제조 : ethanol에녹여갈색병에보관하여사용하였다. - ABTS + 용액제조 7 mm ABTS 및 2.5 mm potassium persulfate 용액을증류수에녹여제조한후두용액을동량혼합하여 12시간동안방치 (4, 암소 ) 하여 radical을형성시켰다. ABTS radic al 용액을 735 nm에서흡광도값이 0.800±0.020 되도록 EtOH로희석하여사용하였다. 3) DPPH, ABTS 항산화활성측정 - 시험용액 2mL( 분말 10mg 상당량 /ml) 를시험관에넣고 ethanol 1.0mL 및 1mM DPP H 용액 1.0 ml를순차적으로가하였다. 위시험액을암소에서 30분간정치시킨후 517 nm에서흡광도를측정하였다. Control은추출물대신 ethanol을첨가하여흡광도를측정하였다. - 시험용액 100 μl( 분말 0.5 mg 상당량 /ml) 를시험관에넣고증류수 1.9 ml 및 1 AB TS radical 용액 2.0 ml를순차적으로가하였다. 위시험액을암소에서 30분간정치시킨후 735 nm에서흡광도를측정하였다. Control은추출물대신증류수를첨가하여흡광도를측정하였다. 4) DPPH 항산화활성평가결과 - DPPH 항산화활성은태극삼, 홍삼, 흑삼으로증숙도가증가함에따라증가함을확인하 였다. 태극삼에서홍삼으로의변화에서는소폭증가하였으나홍삼에서흑삼으로의변화에 서는두배이상큰폭으로증가하였다.

239 그림 186. 태극삼, 홍삼, 흑삼의 DPPH 항산화활성 5) ABTS 항산화활성평가결과 - ABTS 항산화활성은태극삼, 홍삼, 흑삼으로증숙도가증가함에따라증가함을확인하였다. 태극삼에서홍삼으로의변화에서는소폭증가하였으나홍삼에서흑삼으로의변화에서는두배이상큰폭으로증가하였다. ABTS 항산화활성은 DPPH 항산화활성과거의동일한경향을보였다. 그림 187. 태극삼, 홍삼, 흑삼의 ABTS 항산화활성

240 차. 태극삼, 홍삼, 흑삼의산성다당체함량분석 1) 시험용액의조제 - 분말 2 g을정밀하게달아증류수, 50 ml를넣어환류추출 (80, 3 hr) 한후 100 ml 로정용한다. 이액을원심분리하여 (4000 rpm, 20분 ) 상층액만취하였다. 상층액 2 ml 에 ethanol, 8 ml 넣어 1시간방치한후원심분리 (4000 rpm, 20분 ) 하여잔사를침전시킨다. 상층액은버리고잔사에증류수 20 ml를첨가하여희석시킨다. 이희석액을증류수를이용하여 5배추가희석한것을시험용액으로이용하였다. 2) 시약조제 - 0.1% Carbazole 시액 : Ethanol 에녹여냉암소에보관. - 표준용액제조 : Glucuronic acid 를물에희석하여 10~100 ppm 으로한것을이용 3) 산성다당체함량측정 - 시험용액 0.5 ml에 0.1% carbazole 시액 0.25 ml를첨가한후황산 3 ml를첨가하였다. 85 에서 5분간가열하고상온에서 15분간방치하여냉각시킨후 525 nm에서흡광도를측정하였다. 농도별로희석한표준용액도동일하게시험하여표준곡선을작성하였다. 그림 188. ginseng acidic sacharides 의 Calibratoion curve 4) 산성다당체함량측정결과 - 태극삼과홍삼에는산성다당체가거의동일하게함유되어있었으며흑삼에는더많은 산성다당체가함유되어있는것으로나타났다. 그림 189. 태극삼, 홍삼, 흑삼의산성다당체함량

241 카. 태극삼과흑삼농축액의일반성분함량 - 태극삼과흑삼의물추출물농축액의일반성분및조사포닌과산성다당체함량을분석한결과총당에있어서태극삼농축액이흑삼농축액보다약 10% 정도높게나타났으며조회분함량에있어서는흑삼농축액이태극삼농축액보다약 2.4% 정도높게나타났다. 그리고조지방, 조단백질, 조사포닌및산성다당체함량은태극삼과흑삼농축액이비슷하게나타났다. 흑삼농축액의회분함량이높게나타난원인에대해서는높은온도로계속하여열처리를받는제조과정에서태극삼농축액과달리회화가되지않는미지의물질들이생성된결과에의한것이아닌지좀의외의결과라고사료된다. 이를좀더명확하게구명하기위하여태극삼및흑삼농축액을공식검사기관에의뢰해서회분함량과각무기성분의함량을조사하고자한다. 표 43. 태극삼및흑삼농축액의일반성분함량 basis) (Unit : % dry 타. 태극삼과흑삼농축액의색상비교 - 태극삼및흑삼농축액의색상을적색관련파장인 490 및 550nm에서흡광도를조사한결과표 6과같이흑삼농축액이태극삼농축액에비해서약 5.8배정도로나타나흑삼제조과정중에열에의한비효소적갈변반응에의한결과라고판단된다. 표 44. 태극삼및흑삼농축액의색도비교 * 건조물 1% 수용액

242 파. 태극삼과흑삼농축액의총페놀화합물및총플라보노이드함량 - 총페놀화합물의함량은흑삼농축액이 1.64% 로태극삼의약 2배정도높게나타났으며총플라보노이드함량에서도흑삼농축액이약 2배이상높게나타나이들물질에의한항산화활성도흑삼농축액이높게나타날가능성이있다고판단된다. * ( μg /100g) 표 45. 태극삼및흑삼농축액의총페놀화합물및총플라보노이드함량 (Unit : % dry basis) 하. DPPH free radical에의한 scavenging activities - DPPH 용액 2mL와 2% 수용액의태극삼및흑삼물추출농축액 0.5mL를혼합하여 DPPH free radical에의한 scavenging activities를조사한결과는 Fig. 5와같다. 반응 1분후의활성은태극삼농축액이 34.5%, 흑삼농축액은 61.1% 로나타나흑삼농축액이태극삼농축액의 1.7배이상의활성을나타내었다. 한편 x 10-3 % 의농도의 vitamine C는 1분후 48.1% 의활성을보였다. 이러한결과는 5분후에 73.7% 의 DPPH 소거활성을보인본실험결과와 1,000 μg /ml의농도에서 30분경과시약 75% 의항산화활성을나타낸경우 (27) 와매우유사한결과였다. 그림 190. 태극삼, 흑삼추출물의 DPPH free radical scavenging abilities

243 표 46. 반응시간에따른태극삼및흑삼농축액의 DPPH radical scavenging activities * Scavenging activity(%) = (Absorbance of DPPH solution-absorbance of sample treatment / Absorbance of DPPH solution) x 100 ** Concentration of vitamin C was x 10-3 %.

244 3. 태극삼흑삼혈행개선기능성평가 ( 세포수준 ) 가. 혈전용해활성연구방법 1) 혈전용해활성시험 - Haverkate-trass의 fibrin 법을일부변형하여측정하였다. PBS로 fibrinogen의최종농도가 0.6% 가되도록완전히용해시킨용액 10mL를 Petri dish에옮기고 PBS 에녹인 thrombin용액 1unit/mL 를 30분이상상온에방치하여고화시켰다. 시료를직경 6 mm filter paper disc 에각농도별로 fibrin plate 상에점적하여사용하였으며, positive control 로 plasmin from human plasma 1unit/mL 사용하였다. 37 에서 4시간동안반응시킨후 fibrin plate 가용해되어형성된투명환의넓이를측정하여활성도를측정하였다. 혈전용해활성 (%) = ( 시료에의한영역 /plasmin 용해영역 )X 100 2) 세포배양 - HUVEC은 Lonza (Walkers ville, MD) 에서구입하여, EBM-2 Bullet kit growth medium에서 37 C humidified 5% CO 2 조건으로배양했다. 실험하는동안, HUVEC은 4 9회계대배양한것을사용했다. 배양접시에 HUVEC이 90 95% 정도채워졌을때, 각시료 ( 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물 ) 를농도별로처리한후 1시간동한전처치한뒤 LPS (1 μg/ml), TNF-α (10 ng/ml), palmitate, high glucose (50 mm) 를시간별로처리하였다. 3) 세포독성 - 각종시료추출물에대한세포독성은 MTT assay로시험하였다. 24 well plate에 well 당세포 ( cells) 를접종하여 5% CO 2, 37 에서 24시간배양하여세포단층을얻은후, 각시료추출물을농도별로처리한후 24시간배양하였다. 그후상층액을제거한후 MTT 용액 500 ul씩을각 well에가하여 5% CO 2, 37 배양기에서 4시간동안정치하였다. MTT 용액을완전히제거한후 1 ml dimethyl sulfoxide (DMSO) 로세포내에형성된 formazan 결정체를용해하여 ELISA plate reader로 570 nm에서흡광도를측정하였다. 4) ELISA - 24 well plate에 cell (5x10 5 cells/well) 을배양한후각각의처리조건에맞춰각추출물 ( 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물 ) 과 LPS (1 μg/ml), TNF-α (10 ng/ml), palmitate, high glucose (50 mm) 를처리한후상층액을항체가코팅되어진 96 well plate (ICAM-1, VACM-1, Seletin kit) 에 100 μl 넣은후실온에서 2시간동안반응시켰다.

245 Washing buffer (0.05% Tween 20 in d-pbs) 로 4회세척하고 biotin-conjugated anti-human antibody (ICAM-1), VCAM-1 그리고 Seletin) 를 blocking buffer에 1:500 으로희석하여 100μl씩첨가하여상온에서 1-2시간동안방치하였다. 그후 washing buffer로 4회세척하고 streptavidin-hrp를첨가한후 30분간반응시킨후 4회세척하였다. 그후 substrate를 100 μl첨가하여차광시키고 30분동안상온반응시킨후 stop buffer를첨가한후 microplate reader를이용하여 450nm에서흡광도를측정하였다. 5) Total RNA 분리및정량 - HUVEC세포를 100mm culture dish에 plate당 cell을분주하고다양한처리조건으로세포를배양하였다. 배양된세포로부터상등액을제거한후 d-pbs를이용하여세척하고 1ml의 Trizol reagent를가하여 culture dish 바닥에점도가사라질때까지 pipetting하고 microcentrifuge에옮겼다. 세포가완전히용해될때까지, 대략 5분간 inversion한후에 chloroformdmf200μl를가하고 15초동안교반하였다. 상온에서 10분정도방치한후원심분리 (12,000xg, 4, 15분 ) 하였다. 상등액을새로운 tube에옮긴후 isoprophanol을상등액과동량으로가하고 inversion한후원심분리 (12,000 xg, 4, 15분 ) 하였다. 상등액을버리고 pellet을 75% DEPC-treated cold ethanol로세척한후, RNA pellet이건조된상태에서 DEPC-treated dh 2 O에용해시켰다. 이때추출된 total RNA는 UV spectrophotometer를이용하여정량하고 1 mg/ml 농도가되도록보정하여 -70 에냉동보관하였다. 6) RT-PCR - RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) 을이용하여 VCAM-1 과ICAM-1의 mrna 발현량을측정하였다. 추출된 total RNA는 cdna synthesis kit (TaKaRa, USA) 를이용하여 cdna를합성하였다. VCAM-1과 ICAM-1을확인하기위한 PCR을위하여생성된 cdna mixture 1μl와 PCR mixture (dntp Mixture, 10 taq buffer, taq polymerase, PCR primer, DW) 를혼합하여총 25μl의반응액을 25~30회반복하는 PCR cycle로반응하였다. 이때각각의 RT-PCR에서동량의 RNA가사용되었음을확인하기위하여 housekeeping gene인 GAPDH를사용하여함께 PCR을진행하였다. - The following primers were used : ICAM-1 forward primer was 5-CAC AAG CCA CGC CTC CCT GAACCT A-3, reverse primer was 5-TGT GGG CCT TTG TGT TTT GAT GCT A-3, VCAM-1 forward primer was 5-TGA GCG GGA AGG TGA GGA GTGAGG-3, reverse primer was 5-CAG GAT GGA GGA AGG GCT GAC CAA-3, GAPDH forward primer was 5-TAT GAC AAC AGC CTC AAG AT-3, reverse primer was 5-AGG TCC ACC ACT GAC ACG TT-3. 7) 총단백질의분리및정량 - 세포를 100mm culture dish에 plate당 세포를분주하고다양한처리조건으로세포를배양하였다. 배양된세포를회수하여 d-pbs를이용하여세척하고세포침전물에 lysis buffer (20mM Hepes ph 7.0, 2mM EGTA, 1mM EDTA, 1% Triton X-100,

246 10% glycerol, 150mM NaCl, 20mM β-glycerophosphate, 5 ng/ml leupeptin, 0.1 unit/ml aprotinin) μl 넣고침전물을녹인후에 ice에 30~60분간방치해놓은후에원심분리 (4, 13000rpm, 10분 ) 하여상등액을취해 BCA protein assay kit를이용하여단백질의양을정량하였다. 8) Western blot analysis - 실험에이용할 20-50μg의단백질을적당한농도의 SDS-PAGE gel에전기영동한후 PVDF membrane에 transfer하였다. 단백질이옮겨진 membrane은 1시간동안상온에서 5% skim milk in TBST (Tris Buffered Saline with Tween; 25 mm Tris, 140mM NaCl, 3mM KCl, 0.05% Tween-20, ph 8.0) 를 blocking buffer로만들어처리한후 1 차항체를넣고 4 에서 overnight 처리하였다. 0.25% TBST로 3회세척후 HRP-conjugated secondary antibody in blocking buffer를 3시간동안상온에서처리하였다. 0.25% TBST로 3회세척후에 detection reagent (ECL) 를가한후 Kodak scientific imaging film에노출시켜각각의단백질발현을확인하였다. 9) ROS 측정 - HUVEC을 100mm culture dish에 2x10 6 cells을배양한후각각의처리조건에맞춰각추출물 ( 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물 ) 과 LPS (1 μg/ml), TNF-α (10 ng/ml), palmitate, high glucose (50 mm) 를처리한후상층액을제거한후 1 PBS로세척하였다. 세포에 cell lysis buffer (RIPA buffer) 를처리한후세포를녹인후원심분리하여상층액 ( 단백질 ) 을분리하였다. Total ROS 측정을위한항체가코팅되어진 96 well plate (ROS ELISA KIT, Cell Signaling) 에단백질을 100 μl 넣은후 37 에서 2시간동안반응시켰다. Washing buffer (0.05% Tween 20 in d-pbs) 로 4회세척하고 biotin-conjugated anti-human antibody를 blocking buffer에 1:500으로희석하여 100 μl씩첨가하여상온에서 1-2시간동안방치하였다. 그후 washing buffer로 4회세척하고 streptavidin-hrp를첨가한후 30분간반응시킨후 4회세척하였다. 그후 substrate 를 100 μl첨가하여차광시키고 30분동안상온반응시킨후 stop buffer를첨가한후 microplate reader를이용하여 450nm에서흡광도를측정하였다. 나. 혈전용해활성연구결과 1) 혈전용해활성연구결과 - PBS로 fibrinogen의최종농도가 0.6% 가되도록완전히용해시킨용액 10mL를 Petri dish에옮기고 PBS 에녹인 thrombin용액 1unit/mL 를 30분이상상온에방치하여고화시켰다. 시료를직경 6 mm filter paper disc 에각농도별로 fibrin plate 상에점적하여사용하였으며, positive control 로 plasmin from human plasma 1unit/mL 사용하였다. 37 에서 4시간동안반응시킨후 fibrin plate 가용해되어형성된투명환의넓이를측정하여활성도를측정하였다. 그결과인삼과태극삼물추출물에서는 10 mg/ml농도에서도용해도를나타내지않았다. 홍삼물추출물은농도의존적으로용해도가증가하였으며, 특히흑삼물추출물에서용해도가가장높게나타났다.

247 - 인삼물추출물 Fibrinolytic Area 시료 농도억제대활성도 그림 191. 인삼물추출물의혈전용해활성 - 태극삼물추출물 Fibrinolytic Area 시료 농도억제대활성도 그림 192. 태극삼물추출물의혈전용해활성

248 - 홍삼물추출물 Fibrinolytic Area 시료 농도억제대활성도 - 흑삼물추출물 Fibrinolytic Area 그림 193. 홍삼물추출물의혈전용해활성 시료 농도억제대활성도 그림 194. 흑삼물추출물의혈전용해활성

249 2) 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의세포독성 - HUVEC 에각시료 ( 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물 ) 를농도별로처리한후 MTT 방 법을이용하여측정하였다. 그결과 2 mg/ml 농도까지는세포독성이나타나지않은것을 확인할수있었다. 그림 195. 수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의 HUVEC 에대한세포독성

250 3) HUVEC 에서수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의 VCAM-1 발현효과 그림 196. 수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼추출물의 VCAM-1 발현효과 - HUVEC 에 LPS 를처리한후수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물을처리한후 ELISA 방 법을이용하여 VCAM-1 발현을확인한결과, 인삼물추출물은농도의존적으로억제효과를 보이지않았으나홍삼물추출물은농도의존적으로강한억제를보였다. 그림 197. LPS 가처리된 HUVEC 에인삼과홍삼물추출물을처리한후 VCAM-1 의발현 변화 - 태극삼과흑삼물추출물도농도의존적으로 VCAM-1 발현이억제되는것을확인하였다. 특히흑삼물추출물은 0.25 mg/ml 농도에서부터 35% 이상감소되었다. 그림 198. LPS 가처리된 HUVEC 에태극삼과흑삼물추출물을처리한후 VCAM-1 의발현 변화

251 4) HUVEC에서수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의 ICAM-1 발현효과 - HUVEC에고글루코스를처리한후수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물을처리한후 ELISA 방법을이용하여 ICAM-1 발현을확인한결과, 인삼물추출물은농도의존적으로억제효과를보이지않았으나, 홍삼물추출물은농도의존적으로강한억제를보였으며, mg/ml 농도부터 38% 정도감소하였다. 태극삼과흑삼물추출물도농도의존적으로 ICAM-1 발현이억제되는것을확인하였다. 그림 199. LPS 가처리된 HUVEC 에수삼과홍삼물추출물을처리한후 ICAM-1 의발현변 화 그림 200. LPS 가처리된 HUVEC 에태극삼과흑삼물추출물을처리한후 ICAM-1 의발현 변화

252 5) HUVEC에서수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의 IL-6 발현효과 - HUVEC에고글루코스를처리한후수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물을처리한후 ELISA 방법을이용하여 IL-6 발현을확인한결과, 인삼과홍삼물추출물은농도의존적으로강한억제효과를보였다. 태극삼과흑삼물추출물도농도의존적으로 IL-6 발현이강하게억제되는것을확인하였다. 그림 201. LPS 가처리된 HUVEC 에수삼과홍삼물추출물을처리한후 IL-6 의발현변화 그림 202. LPS 가처리된 HUVEC 에태극삼과흑삼물추출물을처리한후 IL-6 의발현변 화

253 6) HUVEC에서수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의 TNF-α 발현효과 - HUVEC에고글루코스를처리한후수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물을처리한후 ELISA 방법을이용하여 TNF-α 발현을확인한결과, 인삼과홍삼물추출물은농도의존적으로강한억제효과를보였다. 태극삼과흑삼물추출물역시농도의존적으로 TNF-α 발현이억제되는것을확인할수있었으며, 특히흑삼에서강한억제를확인하였다. 그림 203. LPS 가처리된 HUVEC 에수삼과홍삼물추출물을처리한후 TNF-α 의발현변 화 그림 204. LPS 가처리된 HUVEC 에태극삼과흑삼물추출물을처리한후 TNF-α 의발현 변화

254 7) HUVEC에서수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의 E-Selectin 발현효과 - HUVEC에고글루코스를처리한후수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물을처리한후 ELISA 방법을이용하여 E-Selectin 발현을확인한결과, 인삼과홍삼물추출물은농도의존적으로강한억제효과를보였다. 태극삼과흑삼물추출물역시농도의존적으로 E-Selectin 발현이억제되는것을확인할수있었으며, 특히홍삼과흑삼물추출물에서강한억제를확인하였다. 그림 205. LPS 가처리된 HUVEC 에수삼과홍삼물추출물을처리한후 E-Selectin 의발현 변화 그림 206. LPS 가처리된 HUVEC 에태극삼과흑삼물추출물을처리한후 E-Selectin 의 발현변화

255 8) HUVEC에서홍삼과흑삼물추출물의단백질발현 - HUVEC에 LPS를처리한후홍삼과흑삼물추출물을처리한후웨스턴블랏방법을이용하여 VCAM-1, ICAM-1, E-Selectin 단백질발현을확인한결과, 홍삼과흑삼물추출물처리시농도의존적으로단백질발현이억제되는것을관찰할수있었다. 그림 207. LPS 가처리된 HUVEC 에홍삼과흑삼물추출물을처리한후단백질발현 9) 혈전용해연구결론 - 다양한혈관질환은순환지질단백질, 혈역학요소및동맥혈관벽과면역시스템간의병리적인상호작용에의해발생하는만성염증질환으로이로인해혈관탄성과섬유화가진행되어지며, 혈중지질농도가증가되면혈전유발에원인이된다. 혈중 cholesterol수치가높아지면동맥내피세포와반응하여내피-백혈구부착인자를발현시키며, 이로인해단핵백혈구가내피에부착함으로써동맥경화및지질대사장애등대사성질환이유발되어진다. 이러한질환의초기단계에서순환하는면역세포들이증가되어지며, 이로인해다양한단백질발현 (VCAM-1, ICAM-1, E-selectin) 이증가되어진다. 이러한세포부착인자는염증성 cytokine류에의해활성화된다음, 혈관의내피에서분비되는분자로써, 혈관내불안정반을표지하는대표적인인자로알려져있으며, 이러한분자들은혈관내피의활성화및혈관의염증을평가하는표지인자로사용할수있다. - 본연구에서는수삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물을이용하여각종혈관염증관련인자의발현억제효과를관찰한결과, 홍삼과흑삼물추출물이혈전억제효과를나타내는것으로확인되었다. 또한, 다양한염증관련단백질발현도홍삼과흑삼물추출물에서더효과가좋은것으로확인되었다. 특히염증매개물인 LPS를처리했을때 TNF-α가높게증가되는것으로보아세포부착인자의발현에관여하는것으로사료되어진다. 그림 208. 다양한혈전용해연구결과

256 다. 진세노사이드 Rg3 의혈관염증억제연구 1) 세포독성 - HUVEC 에진세노사이드 Rg3 를농도별로처리한후 MTT 방법을이용하여측정하였다. 그결과 160 μg/ml 농도까지는세포독성이나타나지않은것을확인할수있었다. Fig Effect of ginsenoside Rg3 on cell viability of HUVECs 2) 세포부착분자발현효과 - HUVEC에 LPS를처리한후진세노사이드 Rg3를처리한후 ELISA 방법을이용하여 VCAM-1, ICAM-1, E-seletin 발현을확인한결과, VCAM-1과 E-seletin 발현이농도의존적으로강하게억제되는것을확인하였다. ICAM-1 발현역시농도의존적으로강하게억제되는것을확인하였으며, 24시간내에서더욱억제효과가높았다. Fig Effect of ginsenoside Rg3 on VCAM-1 secretion by LPS-stimulated HUVECs.

257 Fig Effect of ginsenoside Rg3 on ICAM-1 secretion by LPS-stimulated HUVECs. Fig. 212 Effect of ginsenoside Rg3 on E-seletin secretion by LPS-stimulated HUVECs. 3) HUVEC에서진세노사이드 Rg3의사이토카인발현효과 - HUVEC에고글루코스를처리한후진세노사이드 Rg3를처리한후 ELISA 방법을이용하여사이토카인생성변화를확인한결과, TNF-α은 48시간에서더높은억제효과를보였으며, IL-6와 IL-8 발현역시농도의존적으로강한억제효과를보였다. Fig Effect of ginsenoside Rg3 on TNF-αsecretion by LPS-stimulated HUVECs.

258 Fig Effect of ginsenoside Rg3 on IL-6 secretion by LPS-stimulated HUVECs. Fig Effect of ginsenoside Rg3 on IL-8 secretion by LPS-stimulated HUVECs. - HUVEC 에고글루코스를처리한후진세노사이드 Rg3 를처리한후 ELISA 방법을이용 하여사이토카인생성변화를확인한결과, MCP-1, G-CSF, GM-CSF 발현은농도의존적 으로높은억제효과를보였으며, 대체적으로 48 시간에서더높은억제효과를보였다 Fig Effect of ginsenoside Rg3 on MCP-1 secretion by LPS-stimulated HUVECs.

259 Fig Effect of ginsenoside Rg3 on G-CSF secretion by LPS-stimulated HUVECs. Fig Effect of ginsenoside Rg3 on GM-CSF secretion by LPS-stimulated HUVECs.

260 4) HUVEC 에서진세노사이드 Rg3 에의한세포부착분자단백질발현변화 - HUVEC 에 LPS 를처리한후진세노사이드 Rg3 를처리한후웨스턴블랏방법을이용하 여 VCAM-1, ICAM-1, E-Selectin 단백질발현을확인한결과, 농도의존적으로단백질발 현이억제되는것을관찰할수있었다. Fig Effects of Rg3 on ICAM-1, VCAM-1, and E-seletin expression in LPS-stimulated HUVECs for 24 or 48h. - HUVEC에 LPS를처리한후진세노사이드 Rg3를처리한후웨스턴블랏방법을이용하여 MAPKs의인산화를확인한결과, 진세노사이드 Rg3를처리시 p38단백질의인산화가농도의존적으로감소하는것을확인하였다. Fig Effects of Rg3 on MAPKs expression in LPS-stimulated HUVECs for 3h.

261 5) HUVEC 에서진세노사이드 Rg3 에의한 THP-1 단핵세포부착억제 - HUVEC 에서 LPS 처리시 THP-1 단핵세포의부착이증가하였으나, 진세노사이드 Rg3 를 농도별로처리시농도의존적으로 THP-1 단핵세포의부착감소결과를보였다. Fig Inhibitory effects of ginsenoside Rg3 on adhesion of THP-1 monocytes to LPS-activated HUVECs. 6) 진세노사이드 Rg3의혈관염증억제연구결론 - 본연구에서는진세노사이드 Rg3를이용하여각종혈관염증관련인자의발현억제효과를보였으며, 세포부착분자들의발현과 THP-1 단핵세포의부착역시억제효과를보였다. 흑삼물추출물의사이토카인발현의조절은 NF-κB와관련하여조절되는되는것으로생각되어진다.

262 4. 태극삼, 흑삼인지기능개선기능성평가 ( 세포수준 ) 가. 연구방법 1) SH-SY5Y neuroblastoma 세포배양 - SH-SY5Y neuroblastoma 세포는한국세포주은행에서구입하여, 10% fetal bovine serum (Hyclone, Logan, UT, USA) 와 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin을첨가한 MEM배지 (Hyclone, Logan, UT, USA) 에서 37 C humidified 5% CO2 조건으로배양했다. 실험하는동안세포는 4 9회계대배양한것을사용했다. 배양접시에 SH-SY5Y neuroblastoma 세포가 90 95% 정도채워졌을때, 각시료 ( 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물 ) 를농도별로 3시간처리한후 H2O2 (100 μm/ml) 를함께 24시간처리하였다. 2) 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의세포독성 - 각종시료추출물에대한세포독성은 MTT assay로시험하였다. 24 well plate에 well당세포 (2 105 cells) 를접종하여 5% CO2, 37 에서 24시간배양하여세포단층을얻은후, 각시료추출물을농도별로처리한후 24시간배양하였다. 그후상층액을제거한후 MTT 용액 500 ul씩을각 well에가하여 5% CO 2, 37 배양기에서 3시간동안정치하였다. MTT 용액을완전히제거한후 1 ml dimethyl sulfoxide (DMSO) 로세포내에형성된 formazan 결정체를용해하여 multi plate reader로 570 nm에서흡광도를측정하였다. 3) Acetylcholinesterase (AChE) 저해활성 - Acetylcholinesterase (AChE) 저해활성측정은 acetylcholine iodide 를기질로사용하여측정하였다. 효소는 SH-SY5Y 세포배양액을 2,000 rpm에서 5분간원심분리하여상등액을제거하고균질화를위한 buffer (1 M NaCl, 50 mm MgCl2,1% Triton X-100 혼합액에 10 mm Tris-HCl (ph 7.2) 2 ml를첨가하여균질화한후세포배양액을 rpm에서 30분동안원심분리하였으며, 그상등액을효소실험을위하여사용하였다모든추출공정은 4 에서수행하였으며추출한효소액의단백질함량을측정한뒤실험을진행하였다. - 효소 10 μl에추출물 10 μl를넣어 37 에서 15분간 pre-incbation 시킨후, 반응혼합물에 50 mm sodium phosphate buffer (ph 8.0) 에용해시킨 Ellman's reaction mixture (0.5 mm acetylthiocholine, 1 mm 5,5'dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) 70 μl 를첨가한후 10분동안반응후, 410 nm에서흡광도를측정하였다. 효소활성은 mol unit/mg protein 으로표현하였다.

263 나. 연구결과 1) 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의세포독성 - SH-SY5Y 뇌세포에각시료 ( 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물 ) 를농도별로처리한후 MTT 방법을이용하여측정하였다. 그결과 2 mg/ml 농도까지는세포독성이나타나지 않은것을확인할수있었다. 그림 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의 SH-SY5Y 뇌세포에대한세포독성

264 2) H 2 O μm 로 SH-SY5Y 뇌세포에산화적스트레스를준후인삼, 태극삼, 홍삼, 흑 삼물추출물의뇌세포보호효과 - SH-SY5Y 뇌세포에각시료 ( 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물 ) 를농도별로 3시간전처리후 H2O2 100 μm 처리하여 24시간배양하였다. 그후 MTT 방법을이용한세포독성을확인하였다. 그결과, H2O2 100 μm 처리한군에비해인삼과태극삼물추출물은농도의존적으로억제효과를보이지않았으며, 홍삼과흑삼물추출물을처리한군간의비교시농도의존적으로손상되었던세포들이시료물의최고농도 0.25 mg/ml에서 18% 정도회복되는것을확인할수있었다. 그림 223. 인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물뇌세포보호효과

265 3) Acetylcholinesterase(AChE) 저해활성효과 - SH-SY5Y 뇌세포에홍삼, 흑삼물추출물을 3시간먼저처리한후 H2O2 100 μm 함께 24시간처리하여 acetylcholinesterase 저해활성효과를확인한결과, 대조군에 (180±20 mu/mg protein) 비해홍삼과흑삼물추출물 ( mg/ml) 에서비슷한양상으로억제되는것을확인하였고특히홍삼물추출물이흑삼물추출물보다 0.25 mg/ml에서억제효과가뛰어난것을확인하였다 ( 그림 74.) 그림 224. 홍삼, 흑삼물추출물의 Acetylcholinesterase(AChE) 저해활성효과 다. 결론 - AChE의발현을억제하는것은치매치료에있어서현재가장큰비중으로실험에사용되고있으며, 아세틸콜린의농도를유지하는것은치매의일차적증상인기억력감퇴현상이진행되는것을막아주어병의진행을지연시키고인지기능을증진시킨다는점에서큰의미를가지고있다. AChE를농도의존적으로억제하였는데이는실제로혈관뇌장벽을통과한후뇌내 AChE 활성억제를통해뇌내아세틸콜린의농도를적절하게유지함으로써뇌의시냅스에서콜린성신경계의기능을높여주어학습과기억력감퇴를억제하여주었다는것을의미한다. - 본연구에서는홍삼, 흑삼물추출물을이용하여뇌세포에 H2O2 100 μm 손상을유도한후, 세포생존율로회복효과를확인한후 AChE 억제효과를관찰한결과홍삼, 흑삼물추출물이억제효과에뛰어난것으로확인되었다.

266 5. 태극삼, 흑삼항스트레스기능성평가 ( 세포수준 ) 가. 연구방법 1. 뇌세포배양세포배양 : 한국세포주은행에서분주받은 SH-5YSY cell은 culture dish에고착하여증식한다. 배양액은 10% FBS가포함된 α-mem (alpha-minimum Essential Media) media 에 100U/ml penicillin G, 100ug/ml streptomycin sulfate를첨가하여 37, 5% CO2가공급되는배양기에서배양하였다. 세포는 2일간격으로계대배양을수행하였다. 2. 세포생존율 : 시료단독으로세포의사멸에미치는영향과과산화수소를이용하여산화적스트레스를야기시킨후세포의사멸에시료가미치는영향을 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) assay를이용하여확인하였다. SH-5YSY 세포를 24well에 7 X 10 4 cells/well로분주하여, 5% CO 2 가공급되는 37 배양기에서 24시간배양하였다. 24시간뒤각각배앵액을제거하고, 신선한배양액에농도별 (0, 30, 100, 300, 1000, 3000ug/ml) 로시료를첨가한후 48시간배양하였다. 그후 100ug/ml의농도가되도록 MTT 용액을처리한후 2시간동안반응시켰다. MTT 용액제거후 DMSO에생존한세포미토콘드리아에서생성된 formazan을녹여 microplate reader로 590nm에서흡광도를측정하였다. 모든실험결과는 3회이상반복하여얻은결과를평균 ± 표준오차로나타내었다. 3. 산화적스트레스로인해야기된세포사멸에시료가미치는영향 : 과산화수소를이용하여세포에산화적스트레스를야기시킨후시료가세포보호에미치는영향을 MTT assay 를이용하여확인하였다. 먼저 SH-5YSY 세포를 24well에 7 X 10 4 cells/well로분주하여, 5% CO 2 가공급되는 37 배양기에서 24시간배양하였다. 24시간뒤각각배양액을제거하고, 신선한배양액에농도별 (0, 30, 100, 300, 1000, 3000ug/ml) 로시료를첨가한후 24시간배양하였다. 그후 400uM의과산화수소를첨가하여 24시간배양하였다. 배양후, MTT 용액을이용하여세포생존율을확인하였다.

267 나. 실험결과 1. 세포독성흑삼, 태극삼홍삼시료가가지는뇌세포보호효과를확인하기에앞서시료자체가가지고있는세포독성을 MTT assay를이용하여확인하였다. 그결과태극삼, 흑삼, 홍삼시료는 3000ug/ml까지세포독성이나타나지않았다. 그림 225. 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의세포독성평가 뇌세포에과산화수소로산화적스트레스를야기시켜세포사멸을유도한후시료가세포가지는세포보호효과를확인한결과 400uM의 hydrogen peroxidase에의해세포생존율은 30% 까지감소하였다. 홍삼 30, 100, 300, 1000, 3000ug/ml을함께처리하였을때세포생존율은각각, 31.3±1.3, 45.7±3.2, 48.4±0.8, 82.5±3.2, 68.8±1.4% 로홍삼농도의존적으로세포생존율이증가함을확인하였다. 태극삼 30, 100, 300, 1000, 3000ug/ml에서세포생존율은 31.5±0.8, 34.8±2.1, 75.7±2.3, 23.0±0.8% 로 1000ug/ml까지는세포생존율이태극삼농도의존적으로증가하였으나, 3000ug/ml에서는오히려감소하는경향이나타났다. 흑삼에서는 30, 100, 300, 1000ug/ml에서세포생존율은 30.7± ±2.0, 40.1±1.6, 69.6±2.3% 로 1000ug/ml까지는세포생존율이농도의존적으로증가하였으나태극삼에서와비슷한경향으로 3000ug/ml에서는 42.9±1.9% 의세포생존율을보여오히려감소하는경향을확인하였다.

268 그림 226. 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물의산화적스트레스에대한세포보호효과

269 6. 태극삼, 흑삼혈류개선기능성평가 ( 동물수준 ) 홍삼, 흑삼및태극삼투여농도결정을위한실험 가. 홍삼, 흑삼및태극삼의 C57BL/6 마우스에서의식후혈당억제능 - C57BL/6 마우스에홍삼, 흑삼및태극삼을각각저농도 (200 mg/kg) 와고농도 (400 mg/kg) 농도로투여후 sucrose를투여하여식후혈당억제능시험을수행한결과홍삼, 흑삼및태극삼을저용량및고용량으로투여한실험군이대조군에비해낮은혈당치를보였다. 대조군에서는 sucrose를투여한후 120분의혈당이초기에비해 139.5% 증가하였다. 반면저용량투여군은유의적으로혈당치가감소하지않았다. 반면홍삼, 흑삼및태극삼을고용량투여시는대조군에비하여유의적으로혈당치감소효능을보였다 (Table 1). 또한식후혈당억제능시험수행동안대조군에서최고혈당은 203 mg/dl이였으며, 저용량 BTD-1을투여한군에서는 mg/dl, 고용량 BTD-1을투여한군에서는 mg/dl로홍삼, 흑삼및태극삼의용량의존적으로최고혈당수치가낮은경향을보였다 ( 다만저용량에서는통계학적유의성은없었음 ). 따라서본실험에서 400 mg/kg 농도의홍삼, 흑삼및태극삼을투여하여당뇨병시나타나는혈행장애개선에대해효능을평가할계획이다. 표 47. C57BL/6 마우스에서의식후혈당억제능시험 - LETO rats을대조군으로하고 OLETF rats은무작위 (random) 하게 5군으로분류하며각군당동물의수는 OLETF 대조군 (n=5) 을제외하고군당 7마리로구성됨. 그룹 1 (LETO 대조군 ; N/C): 표준실험용사료와식수를자유롭게공급받는그룹으로고지방식이및평가하고자하는홍삼, 흑삼및태극삼시료를투여하지않음. 그룹 2 (OLETF 대조군 ): OLETF rats은당뇨병유발대조군으로사용되며, 고지방식이는투여하되홍삼, 흑삼및태극삼시료를투여하지않음. 그외표준실험용사료와식수는자유롭게공급받음. 그룹 3 (WGG 투여군 ): 400 mg/kg WGG( 백삼 ) 을사료에섞어 120일동안투여함. 그룹 4 (RGG 투여군 ): 400 mg/kg RGG( 홍삼 ) 을사료에섞어 120일동안투여함. 그룹 5 (BGG 투여군 ): 400 mg/kg BGG( 흑삼 ) 을사료에섞어 120일동안투여함. 그룹 6 (TGG 투여군 ): 400 mg/kg TGG( 태극삼 ) 을사료에섞어 120일동안투여함.

270 그림 227. 식후혈당억제능시험

271 - Body weight 변화량 총 6개그룹에대해 Body weight 변화량을비교하였다. 홍삼과흑삼을식이한그룹에서 60일이후유의한결과를보였다 Body weight (g) P values Baseline 30 days 60 days 90 days 120 days (Compared to OLETF) LETO 72.4± ± ± ± ±7.34 OLETF 75.6± ± ± ± ± WGG +OLETF 72.9± ± ± ±15.4* 564.6±15.3* * RGG +OLETF 74.8± ± ±13.7** 432.7±17.5** 552.6±14.7** ** BGG +OLETF 75.1± ± ±14.7* 442.5±12.9* 559.3±17.3* * TGG +OLETF 71.2± ± ±13.2* 445.6±14.1* 553.7±14.6* * Glucose 함량비교 총 6 개그룹에대해 Glucose 함량을비교하였다. 홍삼과흑삼을식이한그룹에서 60 일 이후유의한결과를보였다. Glucose ( mg / dl ) Baseline 30 days 60 days 90 days 120 days LETO 97.5± ± ± ± ±4.64 OLETF 99.6± ± ± ± ± WGG +OLETF 400RGG +OLETF 400BGG +OLETF 400TGG +OLETF 97.5± ± ±19.48 * P values (Compared to OLETF) 207.6±14.93* 214.8±19.28* *0.05, ** ± ± ±14.3** 188.4±17.6** 217.4±17.69* * ** ± ± ±25.5* 222.7±15.3* 225.8±23.46* * ± ± ± ± ±17.15* *0.05

272 - Total cholesterol 함량비교 총 6개그룹에대해 Total cholesterol 함량을비교하였다. 홍삼과흑삼을식이한그룹에 서 60일이후유의한결과를보였다. Total cholesterol( mg / dl ) P values Baseline 30 days 60 days 90 days 120 days (Compared to OLETF) LETO 125.4± ± ± ± ±13.4 OLETF 133.7± ± ± ± ± WGG +OLETF 129.7± ± ± ± ±12.7* * RGG +OLETF 138.3± ± ±12.5** 225.9±16.5** 237.7±19.4** ** BGG +OLETF 125.6± ± ±12.6* 242.6±17.9* 241.6±18.3** * TGG +OLETF 134.2± 137.6± ± ±13.6* 251.4±15.8* * Free fatty acid 함량비교 총 6개그룹에대해 Free fatty acid 함량을비교하였다. 홍삼은 30일, 흑삼은 60일태극 삼은 90일섭취한그룹에서유의한결과를보였다. Free fatty acid (μeq/l) P values Baseline 30 days 60 days 90 days 120 days (Compared to OLETF) LETO 518.5± ± ± ± ±14.6 OLETF 573.7± ± ± ± ± WGG +OLETF 556.4± ± ± ± ±18.5* * RGG +OLETF 569.7± ±22.4* 662.3±23.9* 707.3±19.6** 712.3±22.3** *0.05, ** BGG +OLETF 571.8± ± ±27.2* 711.4±23.6* 725.3±24.2* * TGG +OLETF 582.5± ± ± ±18.7* 732.5±25.6* *0.05

273 - enos, catalase 증가효과 Endothelial NOS (enos) 는 NOS3라고알려져있고혈관에서 NO를생성하여혈관기능에관여한다. NO(Nitrogen oxide) 합성효소 (enos) 의증가는혈관을이완하여혈류순환에도움이되는것으로밝혀져있다. 따라서해당시료의사용이 enos의분비를증가하는지에대한작용기전을규명하였다. 그결과는아래와같다. arbitrary unit (enos) LETO OLETF 400WGG 400RGG 400BGG 400TGG ** ** ** ** ** ** * * 0 Baseline Time (days) RGG 및 BGG(400 mg/kg) 투여 2 달이후부터투여는혈장의 Catalase (CAT) 를 유의적으로증가시킴 (Effect on plasma CAT levels)

274 Catalase (U/mL) LETO OLETF 400WGG 400RGG 400BGG 400TGG * ** ** * * Baseline Time (days)

275 나. 심초음파를이용한혈행기능개선효능연구 - 질환모델동물인 LETO/ OLETF rats에 400 mg/kg용량으로 4종시료를 4달동안투여후초음파측정에의한심장박출계수 (ejection fraction) 및좌심실단축율 (fractional shortening) 을계산함. - 실험종료후 (120일후 ) WGG, RGG, BGG, TGG의투여군에서심장박출계수 (ejection fraction) 및좌심실단축율 (fractional shortening) 을확인함. : 결과를보면 LETO 대조군 (LETO), OLETF 군, 400 mg/kg WGG, RGG, BGG, TGG투여군에서심장박출계수 좌심실단축율 (fractional shortening) 은각각다음과같았다. 즉 4달후 400 mg/kg RGG 투여군에서심장박출계수가가통계학적으로유의하게억제되었다 (**p<0.01). 그리고 400 mg/kg RGG 및 BGG 투여군에서좌심실단축율 (fractional shortening) 값의감소가통계학적유의적으로억제되었다. (*p<0.05, **p<0.01) 이결과로보아 400 mg/kg RGG 및 BGG 투여군에서혈행개선에효능이있는것으로평가된다 일후동맥을적출하여각군에서 norepinephrine에의해유도되는수축반응에서억제정도를측정하였다. 수축반응은 baseline을기준으로 KCl에대한수축을 100% 로하여, norepinephrine 에대한각농도에서의수축반응을기록하였음. 각군에대한수축억제반응은아래와같이나타남.

276 - 혈관수축능에있어서노르에피네프린을대동맥에 ~ 10-5 M 농도까지처리했을때, OLETF 군에서정상군에비해혈관의수축력이 10-9 M 부터농도의존적으로증가하였음. 그러나, 4 종시료투여군중 RGG 및 BGG군에서혈관의수축력이농도의존적으로유의성있게수축억제효능이있었음 ( 그림및표, ** P<0.01). 이와같은작용으로보아 400 mg/kg용량의 RGG및 BGG의장기간투여는동물에서혈행장해개선에효능이있을것으로판단됨. 다만사람에게적용시에는임상연구가먼저선행되어야할것으로사료됨 - 120일후동맥을적출하여각군에서 Carbachol에의해유도되는이완반응에서이완능을측정하였다. 이완반응은 baseline을기준으로 KCl에대한수축을 100% 로하여, Carbachol에대한각농도에서의이완반응을기록하였음. 각군에대한이완반응은아래와같이나타남. - 혈관이완능에있어서 Carbachol을농도의존적으로처리했을때, OLETF 군에서 LETO 군에비해혈관의이완력이 10-8 M 부터농도의존적으로억제되었음. 그러나, 4종시료투여군중 RGG 및 BGG군에서혈관의이완력이 OLETF 군에비해농도의존적으로유의성있게증가되었음 ( 그림및표, ** P<0.01). 이와같은작용으로보아 400 mg/kg용량의 RGG및 BGG의장기간투여는동물에서혈행장해개선에효능이있을것으로판단됨. 다만수축능과마찬가지로사람에게적용시에는임상연구가먼저선행되어야할것으로사료됨. * 결론 - 이상의실험에서 400 mg/kg RGG 및 BGG 투여군에서혈행개선에효능이있는것으로평가되며우리가제조한흑삼은홍삼과동등이상의혈행개선기능을가짐을동물수준에서확인하였으며태극삼과백삼은이보다는조금낮은기능성을보였다.

277 7. 태극삼, 흑삼항스트레스기능성평가 ( 동물수준 ) 본실험의목적은당뇨모델동물에서백삼, 홍삼, 흑삼, 태극삼의항스트레스및산화스트레스억제효능을평가하는것임. 항스트레스효능평가를위하여혈액및뇌에서스트레스지표분석, 혈청의corticosterone 분석및부신에서 hydroxytryptamine* 분석하여백삼, 홍삼, 흑삼, 태극삼의항스트레스및산화스트레스억제효능을평가하였음. * Chronic stress was found to increase adrenal gland weight and serum corticosterone and 5 HT levels (Gamaro GC et al., 2003) * 실험디자인 (Experimental design) * 실험그룹 : 6개군 ( 각군당 n=7) LETO 대조군 (LETO), OLETF 군 400 mg/kg WGG, RGG, BGG, TGG투여군 - 당뇨유도실험동물을이용하여 4 종의시료 (400mg/kg WGG, RGG, BGG, TGG) 투여 120 일동안혈액, 뇌조직및부신을분리하여스트레스억제효능에대한평가를수행하였 다. - LETO 대조군 (LETO), OLETF 군, 400 mg/kg WGG, RGG, BGG, TGG 투여군에서스 트레스지표인혈중 SOD, CAT, GSH-Px 및 MDA level 에서장기간시료투여시유의적 인스트레스억제효능을보였다 (*P<0.05, **P<0.01)

278 Plasma Levels Oxdative stress: superoxide dismutase (U/mL) Baseline 30 days 60 days 90 days 120 days LETO 27.65± ± ± ± ±2.25 P values (Compared to OLETF) OLETF 26.43± ± ± ± ± WGG +OLETF 400RGG +OLETF 400BGG +OLETF 400TGG +OLETF Plasma Levels - 혈중 CAT 지표를보면 400 mg/kg WGG 투여군및 400 mg/kg RGG 투여군에서투여 90 일이후부터유의적인증가효능을나타내었으며 (*P<0.05), 400 mg/kg BGG 투여군에 서는투여 60 일이후부터유의적인증가효능을나타내었다 (*P<0.05, **P<0.01). 다만 TGG 투여군에서는투여 120 일이후에 CAT 의증가효능을보였다. 이와같은결과로보아 4 종의시료는당뇨유발동물에서장기간투여시혈중 CAT 활성을증가시켜산화스트레스 에효능을보이는것으로평가된다. Oxdative stress: Catalase (U/mL) Baseline 30 days 60 days 90 days 120 days LETO 13.45± ± ± ± ±3.01 OLETF 14.83± ± ± ± ± WGG +OLETF 400RGG +OLETF 400BGG +OLETF 400TGG +OLETF 28.56± ± ± ±1.98** 28.46±2.71** **P< ± ± ± ±1.54** 29.82±3.01** **P< ± ± ±2.02* 28.97±2.05** 27.97±2.79** P values (Compared to OLETF) 13.79± ± ± ±2.75* 16.97±2.58* *P< ± ± ± ±2.95* 18.48±3.19* *P< ± ± ±2.52* 17.48±3.42* 19.69±3.04** *P<0.05, **P< ± ± ± ± ±2.10* *P<0.05 *P<0.05, **P< ± ± ± ± ±3.45* *P<0.05

279 Plasma Levels Oxdative stress: Glutathione peroxidase (U/mL) Baseline 30 days 60 days 90 days 120 days LETO ± ± ± ± ± OLETF ± ± ± ± ± WGG OLETF ± ± ± ±130.76* ±135.87** 400RGG OLETF ± ± ± ±154.98** ±129.58** 400BGG OLETF ± ± ±153.76* ±176.47** ±142.47** 400TGG OLETF ± ± ± ±165.09* ±164.38* P values (Compared to OLETF) *0.05, **0.01 **0.01 *0.05 * GSH-Px지표를보면 400 mg/kg WGG, 400 mg/kg RGG 및 400 mg/kg TGG투여군에서투여 90일이후부터유의적인증가효능을나타내었으며 (*P<0.05, **P<0.01), 400 mg/kg BGG 투여군에서는투여 60일이후부터유의적인증가효능을나타내었다 (*P<0.05, **P<0.01). 이와같은결과로보아 4종의시료는당뇨유발동물에서장기간투여시혈중 GSH-Px 활성을증가시켜산화스트레스에효능을보이는것으로평가된다. Plasma Levels Oxdative stress: Malondialdehyde (nmol/ml) Baseline 30 days 60 days 90 days 120 days P values (Compared to OLETF) LETO 7.38± ± ± ± ±1.58 OLETF 7.62± ± ± ± ± WGG *0.05, 8.31± ± ± ± ±1.96 +OLETF ** RGG +OLETF 7.97± ± ± ±1.76* 7.42±1.87** ** BGG +OLETF 7.16± ± ± ±1.94* 8.43±2.13* * TGG +OLETF 7.41± ± ± ± ±2.53 * MDA 지표를보면 400 mg/kg WGG 및 400 mg/kg TGG 투여군에서는 120 일동안유의 적인차이를보이지않았다 (P>0.05). 400 mg/kg RGG 및 400 mg/kg BGG 투여군에서 는투여 90 일이후부터유의적인증가효능을나타내었다 (*P<0.05, **P<0.01). 이와같은 결과로보아 2 종시료 (RGG 및 BGG) 는당뇨유발동물에서장기간투여시혈중 MDA 활

280 성을증가시켜산화스트레스에효능을보이는것으로평가된다. Brain Levels Dopamine (μg/g) 실험종료일 (120 days) P values (Compared to OLETF) LETO 0.68±0.08 OLETF 0.50± WGG +OLETF 0.56±0.06* *P< RGG +OLETF 0.69±0.07** **P< BGG +OLETF 0.65±0.08** **P< TGG +OLETF 0.60±0.09** **P< 뇌조직에서의스트레스와관련이있는 Dopamine levels, SOD 및 MDA지표를보면우 선 Dopamine levels에서 400 mg/kg WGG 및 TGG투여군의경우투여 120일이후에유 의적인증가효능을나타내었다. 반면 400 mg/kg RGG 및 400 mg/kg BGG 투여군에서는 투여 60일이후부터유의적인증가효능을나타내었다 (*P<0.05, **P<0.01). 이와같은결 과로보아 4종시료 (RGG 및 BGG) 는당뇨유발동물에서장기간투여시혈중 Dopaine 농 도를증가시켜스트레스억제효능을나타내는것으로평가된다. Brain Levels Oxdative stress: superoxide dismutase (U/mg protein) 실험종료일 (120 days) P values (Compared to OLETF) LETO 18.53±1.53 OLETF 11.42± WGG +OLETF 9.69±1.26* *P< RGG +OLETF 8.47±0.09** **P< BGG +OLETF 9.47±1.07* *P< TGG +OLETF 10.85± 뇌조직내 SOD levels에서보면 4종의시료에서모두 120일이후대조군과유의적인차 이를나타내었으며, MDA levels에서는 400 mg/kg RGG 및 400 mg/kg BGG 투여군에서 만유의적인증가효능을나타내었다 (*P<0.05, **P<0.01).

281 Brain Levels - 이와같은결과로보아 2 종시료 (RGG 및 BGG) 는당뇨유발동물에서장기간투여시뇌 조직내 SOD 농도증가및 MDA 농도가감소되어스트레스억제효능을나타내는것으로평 가된다. Oxdative stress: Malondialdehyde (nmol/g protein) 실험종료일 (120 days) P values (Compared to OLETF) LETO 4.38±0.89 OLETF 8.76± WGG +OLETF 8.03± RGG * ±0.95** +OLETF ** BGG +OLETF 7.28±1.03* * TGG +OLETF 8.04±0.99 Blood Levels Corticosterone (μg/100 ml) Baseline 30 days 60 days 90 days 120 days P values (Compared to OLETF) LETO 6.57± ± ± ± ±0.08 OLETF 6.89± ± ± ± ± WGG +OLETF 6.43± ± ±0.09* 10.89±0.09* 11.42±0.07* * RGG +OLETF 6.74± ± ±0.06* 9.68±1.02** 8.75±1.02* * BGG +OLETF 6.92± ± ± ±1.04* 9.96±0.09* * TGG +OLETF 6.85± ± ± ±0.09* 8.69±1.01* *0.05

282 Adrenal gland 5-hydroxytryptamine - 혈중스트레스호르몬인 Corticosterone 및 5-HT levels 에서도 4 종시료의장기간투여 시해당호르몬의억제작용을나타내었다. (5-HT) (μg/g) 실험종료일 (120 days) P values (Compared to OLETF) LETO 0.93±0.03 OLETF 1.65± WGG +OLETF 1.59± RGG +OLETF 1.37±0.22* * BGG +OLETF 1.34±0.17* * TGG +OLETF 1.56±0.15

283 8. 태극삼, 흑삼인지기능개선기능성평가 ( 동물수준 ) 실험동물은 7 주령의수컷랫트 (male Sparague-Dawley rat) 30 마리를샘타코 ( 오산 ) 에서구입하여사용하였다. 도입후 7 일간사육실에서실험실환경에대한적응기간을두었다. 사육실의사육환경은실내온도 22±1, 습도 50±5% 유지하였으며, 12 시간씩명암이조절되고 (12 h light/dark cycle), 물 ( 필터를이용한정수처리 ) 과사료 (rodent chow, 샘타코, 오산 ) 는충분하게공급하였다. CTR: 대조군으로서약물처지가없으며다른실험군과동일하게 vehicle 만경구투여 SCP: scopolamine 0.4 mg/kg 를복강투여 Substrate H: 홍삼 100 mg/kg 를경구투여 Substrate T: 태극삼 100 mg/kg 를경구투여 Substrate W: 백삼 100 mg/kg 를경구투여 Substrate B: 흑삼 100 mg/kg 를경구투여 실험군을나누어개체들의체중을측정하고, 체중증가에따른약물투약량을환산하여존대 (round tip feeding needle) 를이용하여경구로투여하였다. 본실험에서사용한약물은인삼추출물로서시험약물들은증류수 (DW) 에희석하여이용하였으며, scopolamine hydrobromide(sigmaco., USA) 는주사용생리식염수에희석하여복강내투여하였다.

284 II. 실험결과분석및고찰 기억력감퇴모델에서장기간시험약물의경구투여가학습과기억에미치는영향 (A) Esacape Latency (sec) * CTR SCP Substrate H (B) Esacape Latency (sec) * * CTR SCP Substrate T Time (day) Time (day) (C) (D) 60 CTR SCP Substrate B 60 CTR SCP Substrate W Esacape Latency (sec) * * Esacape Latency (sec) Time (day) Time (day) *p<0.05 vs the scopolamine by ANOVA (post hoc with Fisher's PLSD) 그림. 228 Scopolamine 투여에의한기억력감퇴모델에서장기간시험약물투여가 학습과기억에미치는영향 -perform trial 약물이학습과기억에미치는영향을알아보기위해약물을 3 주동안투여후 8 일동안 Morris water maze test 를실행하였다. 7 일간의 perform trial 과정에공간지각학습 (spatial acquisition, 그림 1) 의초기시작점은모든실험군에서 CTR(43.4±5.1), SCP(50.0±3.4), Substrate H(46.3±4.2), Substrate T(51.0±3.5), Substrate B(42.2±4.2), Substrate W(52.1±4.01) 로평균 47.4 초가량으로비슷하게출발하였으나, Substrate W 그룹을제외한나머지약물그룹은학습과정의중간인 4 일이후부터 SCP 그룹과유의한학습차이가확인되었다. (Substrate H, Substrate T, substrate B vs SCP) 학습능력저해를위한 scopolamine 을주사하였음에도불구하고장기간시험약물투여가선행된실험군의학습능력은 SCP 그룹에비해크게향상됨을확인하였다. *p<0.05 vs the scopolamine by ANOVA (post hoc with Fisher's PLSD)

285 (A) (B) Duration Time On Goal Quadrant (sec) CTR SCP Substrate H Duration Time On Goal Quadrant (sec) CTR SCP Substrate T (C) (D) Duration Time On Goal Quadrant (sec) * CTR SCP Substrate B Duration Time On Goal Quadrant (sec) CTR SCP Substrate W 그림 229. Scopolamine 투여에의한기억력감퇴모델에서장기간약물투여가학습과 기억에미치는영향 -probe trial(goal quadrant duration time) Acquisition phase 가종료된후시행한 probe trial 를시행하여학습의강도및장소에대한기억이유지되는강도 (memory retention and consolidation) 를살펴보았다. probe trial 결과에서 goal quadrant 에서머무른시간을비교하였을때, 시험약물그룹들이 SCP 그룹에비해 CTR 그룹과비슷한경향을확인하였으며, 그중 Substrate B 그룹은유의성있는차이를보여주었다 (CTR(21.6±5.5), SCP(14.2±3.6), Substrate H(20.2±0.5), Substrate T(21.4±2.7), Substrate W(21.2±2.8), Substrate B(26.2±2.8))( 그림 2).

286 (A) (B) Frequency on plat form * CTR SCP Substrate H Frequency on plat form * CTR SCP Substrate T (C) (D) Frequency on plat form * CTR SCP Substrate B Frequency on plat form * CTR SCP Substrate W *p<0.05 vs the control, p<0.05 the scopolamine by ANOVA (post hoc with Fisher's PLSD) 그림 3. Scopolamine 투여에의한기억력감퇴모델에서장기간약물투여가학습과기억에 미치는영향 -probe trial(frequency on plat form) Plat form 을제거한후 Plat form 이위치하고있던자리에정확하게찾아가는횟수를측정한결과에서는 Substrate T 그룹을제외한모든약물그룹들이 SCP 그룹에비해 CTR 그룹과통계적유의성을확인하였다 (CTR(2.6±0.9), SCP(1.1±0.4), Substrate H(2.6±0.2), Substrate T(2.4±0.2), Substrate W(2.8±0.5), Substrate B(2.6±0.2))( 그림 3). 이로써장기간약물투여가기억의강화및장기유지에효과가있는것을관찰하였다.

287 2. 기억력감퇴실험동물모델에서장기간약물투여가탐색활동에미치는영향 공간과연계된상황학습및불안을측정하기위해실험동물을개방된공간에노출시켜탐색활동도를 5 분동안노출하여보행활동도 (ambulation) 을측정하였다. CTR(4621.4±173.4), SCP(5299.2±104.5), Substrate H(5102.2±324.5), Substrate T(4987.8±369.8), Substrate B(5530.2±431.7), Substrate W(4534.0±567.8) 로그룹간의유의한차이는없었다. (A) (B) Ambulatroy Count for 5 min CTR SCP Substrate H Ambulatroy Count for 5 min CTR SCP Substrate T (C) (D) Ambulatroy Count for 5 min CTR SCP Subtrate B Ambulatroy Count for 5 min CTR SCP Substrate W 그림 230. Scopolamine 투여에의한기억력감퇴모델에서장기간약물투여가탐색활동에 미치는영향

288 3. 기억력감퇴실험동물모델에서뇌의콜린성회로에미치는영향 시험약물이기억력감퇴실험동물에서뇌의콜린성회로에미치는영향을알아보기위해 AChE 효소활성도를측정하였다. 기억의중추적역할을하는뇌의해마부위를균질화하여 AChE 효소활성도를측정하였다. CTR(131.8±4.4), SCP(110.3±5.8), Substrate H(139.6±14.2), Substrate T(133.0±15.5), Substrate B(129.0±11.0), Substrate W(129.5±8.5) 로 CTR 그룹에비해 SCP 그룹은 AChE 효소의활성이유의하게감소하였으며, 모든시험약물그룹에서는 AChE 효소의활성이회복됨을확인하였다 ( 그림 5). (A) AChE Concentration (ng/ml) * CTR SCP Substrate H (B) AChE Concentration (ng/ml) * CTR SCP Substrate T (C) (D) AChE Concentration (ng/ml) * CTR SCP Substrate B AChE Concentration (ng/ml) * CTR SCP Substrate W *p<0.05 vs the control, p<0.05 the scopolamine by ANOVA (post hoc with Fisher's PLSD) 그림 231. 시험물질경구투여후해마에서 acetylcholinesterase 효소활성측정

289 5. 기억력감퇴실험동물모델에서학습및기억에관련된신경화학적변화 그림 232. 시험물질경구투여후해마에서시냅스지표 Psd95 발현측정 기억력감퇴실험동물에서학습및기억에관련된신경화학적변화를살펴보기위해해마조직에서신경가소성및신경연접 (synapse; 시냅스 ) 의세기를확인하는지표인 Psd95(post-synaptic density protein 95) 의발현을전기영동 (Western blot) 으로확인하였다. CTR 에비해 SCP 는발현이감소하였으며, 모든시험약물그룹에서 Psd95 의발현이 SCP 보다증가하는것을확인하였다. * 결론 1. 기억력감소모델에서시험약물의장기간경구투여효과는 scopolamine 에의해유도된기억력감소모델에서학습효과개선을나타냈다. 2. 기억력감소모델에서시험약물의장기간경구투여효과는공간과연계된상황학습및불안을측정하는탐색활동에는영향을미치지않았다. 3. 기억력감소모델에서시험약물의장기간경구투여효과는뇌의해마조직에서수행한 acetylcholinesterase 효소활성도검사에서통계적으로유의성있는효소활성증가로관찰되었다. 4. 기억력감소모델에서시험약물은학습과기억의중추적역할을하는해마영역에서신경망의강화관련된 PSD95 단백발현이증가되는신경화학적변동을초래하였다.

290 5 절. 태극삼, 흑삼국제임상연구 ( 국제임상시험 ) 가. 시료제조및임상준비 - 태극삼과흑삼의혈류개선과인지기능개선에대해중국현지인을대상으로인체적용시험을실시하고자하였다. 중국심양에위치한 Shenyang Dasan Pharmaceutical에서임상관리를하고대련에위치한 Military 215 Hospital 에서임상시험을실시하였다. - 임상용시료는진안에서생산된 4 년근인삼을구입하여진안홍삼연구소에서직접제조한 태극삼과흑삼으로분말을제조하고제 4 협동기관인고려인삼제조 ( 주 ) 에서과립제형을제 조, 포장하여임상에사용하였다. - 임상시험은 35~60 세사이의피험자를모집하여그룹당 30 명씩배정하여시험을실시하 였으며, 현재혈행개선과인지기능개선에대한연구를실시하였다. 나. 혈행개선임상시험결과 Summary Request Agency 진안홍삼연구소 Study Title : 중국인의혈행개선에대한고려홍삼, 고려흑삼및고려태극삼의효과 무작위, 이중맹검법에 의한 인체적용시험 Responsible medical officer and investigator : 중국인민해방군제 215 병원 Test period : Apr. 25, 2016~Mar. 31, 2017 Phase of development : 인체적용시험 목적 : 본연구의목적은중국인대상무작위이중맹검법을통해한국산고려홍삼, 흑삼및태극삼의혈행개선에대한영향을검증하고 3 종간의혈행개선에대한차이를비교하였다. 시험방법 : 무작위, 이중맹검법으로시행하였다. 시험은모두두단계로나뉘어진행하고제1단계는첫번째복용시작전 1주이고주요내용은지원자를선별하는것이고제2단계는복용단계이며모두 8주복용하였다. 그중제4주와제8주각각관련지표에대한검사와평가를진행하였다.

291 연구대상자수 : 총 120 명 ( 홍삼군, 흑삼군, 태극삼군, 대조제품군각 30 명씩총 120 명 ) 선정기준 -건강성인, 간기능이정상이고혈압, 혈액지질검사에서실험실정상수치의 120% 를초과하지않는자 -연령은 35~60세, 성별제한없음. -중학교이상교육수준 -자발적으로참가하고피험자동의서를작성함. 제외기준 -신체질병, 뇌질환과약물을남용한자 -심리혹은정신질병이있는자 -임신및수유기여성 시험물정보 : 고려홍삼, 흑삼, 태극삼, 분말과립 ( 모두 2.5g/ 포, 2 포 / 일, 배치번호 : IJRG1601-1, 2, 3), 대조제품분말과립 (2.5g/ 포, 2 포 / 일, 배치번호 : IJRG1601-4) 사용법과복용주기 : 1 일 2 회, 1 회 1 포, 온수와함께복용. 복용기간 : 8 주 평가기준과 방법 안전성평가 -이상반응 -임상실험실검사와혈액학검사, 심전도, 소변검사 등 -자각증상 -신체검진유효성평가혈류에대한영향 : 주로 혈액점도 ( 전혈점도, 혈장점도, 카슨점도 ), 혈액응고 (PT, TT, APTT, FGR), 혈중지질 (CHO, TG, HDL, LDL, APO, POB) 등지표에 대한평가를포함하였다. -1차유효성평가 혈액점도 ( 전혈점도 ) -2차유효성평가 혈액점도 ( 혈장점도, 카슨점도 ), 혈액응고 (PT, TT, APTT, FGR), 혈중지질 (CHO, TG, HDL, LDL, APO, POB) 통계방법 : 1. 본연구는 SPSS 2.0 통계소프트웨어패키지를사용하여통계분석을진행하였다. 1. 평균, 표준편차, 최대치, 최소치, 백분위수등지표로분석하였다. 2. 같은군시험물을복용전 (0 주 ), 복용후 (8 주 ) 간에대하여비교할때대응표본 T- 검정을사용하였다. 예를들면홍삼제 0 주와제 8 주간의비교 3. 다른군시험물을복용전 (0 주 ), 복용후 (8 주 ) 간에대하여두군씩비교할때독립표본 T- 검정을사용하였다. 예를들면홍삼과대조식품제 8 주간의비교 4. 다른군시험물을복용전 (0 주 ), 복용후 (8 주 ) 간에대하여네군을동시에비교할때 one-way analysis of variance(anova), 즉 F 검증이다. 예를들면홍삼, 흑삼, 태극삼, 대조제품네군간의동시비교 5. 통계결과차이가현저한데관한해석 : 통상적으로시험결과유의성이 0.05 수준혹은 0.01 수준에도달해야데이터간에차이가현저

292 혹은매우현저하다고설명할수있다. 결론을지을때방향성을확실하게서술해야하였다 ( 예를들면현저하게크거나현저하게작다 ). 유의성은통상적으로 P>0.05는차이성이현저하지않다고표시하였다 ( 통계적으로유의하지않다 ). 0.01<P<0.05는차이성이현저하다는것을표시하였다 ( 통계적으로유의하다 ). P<0.01는차이성이매우현저하다는것을표시하였다 ( 통계적으로유의하다 ). 결론 : 고려 홍삼, 흑삼, 태극삼연구제품과대조제품을각각복용한 후혈행개선관련지표를조사 한바다음과같은결과를얻었다. 본연구는고려홍삼, 흑삼, 태극삼섭취가혈행개선에 미치는효과와안전성을평가하기위한 8 주, 무작위배정, 이중맹검법, 위약 - 대조연구이다. 본연구의목표연구대상자수는 108 명이며, 총 136 명의자원자가서면동의서를자발적으로작 성한후스크리닝검사를받았고, 연구대상자적합성평가를통해총 120 명이적격연구대상자 로선정되었다. 선정된연구대상자는무작위배정, 이중맹검법방법을통해고려홍삼군, 흑삼 군, 태극삼군, 대조제품군에 1:1:1:1 무작위배정되어본연구에참여하였다. 고려홍삼군, 흑삼군, 태극삼군, 대조제품군각각 30 명에서중도탈락자없이총 120 명의연구대상자가연구계획서 ( 프로토콜 ) 에명시한바에따라연구를정상적으로완료하였다. 연구자는모든연구대상자를대상으로 연구계획서에정해진바에따라, 혈액점도 ( 전혈점도 ), 혈 액점도 ( 혈장점도, 카슨점도 ), 혈액응고 (PT, TT, APTT, FGR), 혈중지질 (CHO, TG, HDL, LDL, APO, POB) 등유효성평가와임상병리검사를비롯한안전성평가를시행하였다. 계획서순응연구대상자군 (Per Protocol Set) 120 명을대상으로 1 차유효성 항목인혈액점도 ( 전혈점도 ) 를비교한결과고려홍삼군, 흑삼군, 태극삼군과대조제품군 네섭취군간통계적으로유의한 평가 차이가있었다 (P<0.05). 전혈점도는흑삼에서가장 큰감소경향을보였고홍삼, 태극삼순으로감소하였으나대조제품군과함께비교하면 전반적으로유의성있는 변화는없었으며대조제품의효과가대단히큰것으로 나타났다. 2 차유효성평가항목인혈액점도 ( 혈장점도, 카슨점도 ), 혈액응고 (PT, TT, APTT, FGR), 혈중지질 (CHO, TG, HDL, LDL, APO, POB) 변화에통계적으로유의한차이가 있었다 (P<0.05). 혈행과밀접한관계가있는 결과에관심을가질필요가있을것이다. 안전성평가를위해연구에참여하여최소 1 회이상 혈장점도측면을고려하여흑삼군의 연구용제품을섭취한 연구대상자 120 명 (Safety 군 ) 을대상으로이상반응, 임상병리검사 ( 혈액학적검사, 혈액생화학적검사, 소변검사 ), 활력징후등의측정결과를분석한결과, 총 120 명의 연구대상자는모두본제품과관련한직접적인이상반응은발생하지않았다. 네섭취군간이상반응발생에차이가없었으며, 연구용 제품섭취와인과관계가 없다고판단하였다. 임상병리검사항목중몇몇항목에서섭취군내의미 차이가있었으나 (P<0.05), 이는참고치범위내에서일어난변화로임상적의미가 없다고판단하였다. 활력징후등에서도네섭취군간에의미있는차이가 없었다 (P>0.05). 요약하면, 본연구를통해중국인연구대상자에서고려홍삼, 흑삼, 태극삼의 8 주섭취에 따른혈행개선효과를증명할수있었으며, 고려홍삼군, 흑삼군, 태극삼군 홍삼군이 있는 중에서 가장큰개선효과를보여주었다. 본연구가진행되는동안임상적으로의미 있는이상반응이나신체변화가 인체에안전하다고판단하였다. 관찰되지않아서고려홍삼, 흑삼, 태극삼의섭취가 Date of the report :

293 다. 인지기능개선임상시험결과 Summary Request Agency 진안홍삼연구소 Study Title : 중국인의인지기능개선에대한고려홍삼, 고려흑삼및고려태극삼의효과 무작위, 이중맹검 법에의한인체적용시험 Responsible medical officer and investigator : 중국인민해방군제 215 병원 Test period : Apr. 25, 2016~Mar. 31, 2017 Phase of development : 인체적용시험 목적 : 본연구의목적은중국인대상무작위이중맹검법을통해한국산고려홍삼, 흑삼및태극삼의인지기능개선에대한영향을검증하고 3 종간의인지기능개선에대한차이를비교하였다. 시험방법 : 무작위, 이중맹검법으로시행하였다. 시험은모두두단계로나뉘어진행하고제1단계는첫번째복용시작전 1주이고주요내용은지원자를선별하는것이고제2단계는복용단계이며모두 8주복용하였다. 그중제4주와제8주각각관련지표에대한검사와평가를진행하였다. 연구대상자수 : 총 120 명 ( 홍삼군, 흑삼군, 태극삼군, 대조제품군 각 30 명씩총 120 명 선정기준 - 건강성인, 간기능이정상이고혈압, 혈액지질검사에서실험실정상수치의 120% 를초과하지않는자 - 연령은 35~60 세, 성별제한없음. - 중학교이상교육수준 - 자발적으로참가하고피험자동의서를작성함. 제외기준 - 신체질병, 뇌질환과약물을남용한자 - 심리혹은정신질병이있는자 - 임신및수유기여성 시험물정보 : 고려홍삼, 흑삼, 태극삼, 분말과립 ( 모두 2.5g/ 포, 2포 / 일, 배치번호 : IJRG1601-1,2,3), 분말과립 (2.5g/ 포, 2포 / 일, 배치번호 : IJRG1601-4) 사용법과복용주기 : 1일 2회, 1회 1포, 온수와함께복용. 복용기간 : 8주 대조제품 평가기준과안전성평가 -이상반응 방법

294 -임상실험실검사와혈액학검사, 심전도, 소변검사 등 -자각증상 -신체검진 유효성평가 주로 WCST( 워스콘신카드 분류검사 ), ADAS-Cog( 알츠하이머병-인지평가척도 ) 중의단어회상능 력과단어식별테스트, 바이오마커 (Aß, ACT), 혈중지질 (CHO, TG, HDL, LDL, APO, POB) 등지 표에대한평가를포함하였다. -1차유효성평가 WCST( 워스콘신카드분류검사 ) -2차유효성평가 ADAS-Cog( 알츠하이머병-인지평가척도 ) 중의 단어회상능력과단어식별테스트, 바이오마커 (Aß, ACT), 혈중지질 (CHO, TG, HDL, LDL, APO, POB) 통계방법 : 1. 본연구는 SPSS 2.0 통계소프트웨어패키지를사용하여통계분석을진행하였다. 6. 평균, 표준편차, 최대치, 최소치, 백분위수등지표로분석하였다. 7. 같은군시험물을복용전 (0 주 ), 복용후 (8 주 ) 간에대하여비교할때대응표본 T- 검정을사용하였다. 예를들면홍삼제 0 주와제 8 주간의비교 8. 다른군시험물을복용전 (0 주 ), 복용후 (8 주 ) 간에대하여두군씩비교할때독립표본 T- 검정을사용하였다. 예를들면홍삼과대조제품제 8 주간의비교 9. 다른군시험물을복용전 (0 주 ), 복용후 (8 주 ) 간에대하여네군을동시에비교할때 one-way analysis of variance(anova), 즉 F 검증이다. 예를들면홍삼, 흑삼, 태극삼, 대조제품네군간의동시비교 10. 통계결과차이가현저한데관한해석 : 통상적으로시험결과유의성이 0.05수준혹은 0.01수준에도달해야데이터간에차이가현저혹은매우현저하다고설명할수있다. 결론을지을때방향성을확실하게서술해야하였다 ( 예를들면현저하게크거나현저하게작다 ). 유의성은통상적으로 P>0.05는차이성이현저하지않다고표시하였다 ( 통계적으로유의하지않다 ). 0.01<P<0.05는차이성이현저하다는것을표시하였다 ( 통계적으로유의하다 ). P<0.01는차이성이매우현저하다는것을표시하였다 ( 통계적으로유의하다 ). 결론 : 고려홍삼, 흑삼, 태극삼연구제품과대조제품을각각복용한후인지기능개선관련지표를조사한바다음과같은결과를얻었다. 본연구는고려홍삼, 흑삼, 태극삼섭취가인지기능개선에미치는효과와안전성을평가하기 위한 8 주, 무작위배정, 이중맹검법, 위약 - 대조연구이다. 본연구의목표연구대상자수는 108 명이며, 총 136 명의자원자가서면동의서를자발적으로 작성한후스크리닝검사를받았고, 연구대상자적합성평가를통해총 120 명이적격연구대상 자로선정되었다. 선정된연구대상자는무작위배정, 이중맹검법방법을통해고려홍삼군, 흑 삼군, 태극삼군, 대조제품군에 1:1:1:1 무작위배정되어본연구에참여하였다. 고려홍삼군, 흑삼 군, 태극삼군, 대조제품군각각 30 명에서중도탈락자없이총 120 명의연구대상자가연구계획서 ( 프로토콜 ) 에명시한바에따라연구를정상적으로완료하였다. 연구자는모든연구대상자를대상으로 연구계획서에정해진바에따라, WCST( 워스콘신카드 분류검사 ), ADAS-Cog( 알츠하이머병 - 인지평가척도 ) 중의단어회상능려과단어식별테스트, 바 이오마커 (Aß, ACT), 혈중지질 (CHO, TG, HDL, LDL, APO, POB) 등 를비롯한안전성평가를시행하였다. 계획서순응연구대상자군 항목인 WCST( 워스콘신 유효성평가와임상병리검사 (Per Protocol Set) 120 명을대상으로 1 차유효성평가 카드분류검사 ) 를비교한결과고려홍삼군, 흑삼군, 태극삼군과 대조제품군의복용전과복용후통계적으로유의한차이가있었다 (P<0.05). WCST( 워스콘신카드분류검사 ) 는홍삼에서가장큰감소경향을보였고태극삼, 흑삼, 순으로감소하였으나대조제품군과함께비교하면전반적으로 유의성있는변화는 없었으며대조제품의효과가대단히큰것으로나타났다. 2 차유효성평가항목인

295 ADAS-Cog( 알츠하이머병 - 인지평가척도 ) 중의단어회상능력과단어식별테스트, 바이오마커 (Aß, ACT), 혈중지질 (CHO, TG, HDL, LDL, APO, POB) 변화에통계적으로 유의한차이가있었다 (P<0.05). 이상지표의군간비교에서홍삼군, 흑삼군, 태극삼군은 대조제품군과비교하여복용전에비해복용후모두유의성있는변화는없었다 (P>0.05). 안전성평가를위해연구에참여하여최소 1 회이상연구용제품을섭취한연구대상자 120 명 (Safety 군 ) 을대상으로이상반응, 임상병리검사 ( 혈액학적검사, 혈액생화학적검사, 소변검사 ), 활력징후등의측정결과를분석한결과, 총 120 명의연구대상자는모두본 제품과관련한직접적인이상반응은발생하지않았다. 네섭취군간이상반응발생에차이가없었으며, 연구용제품섭취와인과관계가 없다고판단하였다. 임상병리검사항목중몇몇항목에서섭취군내의미 있었으나 (p<0.05), 판단하였다. 활력징후등에서도 있는차이가 이는참고치범위내에서일어난변화로임상적의미가없다고 네섭취군간에의미있는차이가없었다 (p>0.05). 요약하면, 본연구를통해중국인연구대상자에서고려홍삼, 흑삼, 태극삼의 8 주 섭취에따른인지기능개선효과를증명할수있었으며, 고려홍삼군, 흑삼군, 태극삼군 중에서흑삼군이가장큰개선효과를보여주었다. 본연구가진행되는동안임상적으로 의미있는이상반응이나신체변화가관찰되지않아서고려홍삼, 흑삼, 태극삼의섭취가 인체에안전하다고판단하였다. Date of the report :

296 라임상시험진행확인

297 가공기술지도교육실시 가. 가공기술지도 - 기업체애로및기존제조공정청취 ( 시간, 온도조건이서로상이함 ) - 흑삼색택등제조업체기준청취 (5증 ~9증사이의목표색택이다름 ) - 온도, 차수에따른흑삼제조공정지도 - 기존방법의성분, 효능의우수성증명은못하고주장만하는수준으로이들제조공정에대한추가적인기능성검증이필요할것으로생각됨 \

298 6 절. 태극삼의기능성소재화연구 본연구를수행함에있어서태극삼의기능성표방은면역력증진과피로회복으로제한되어있기때문에또다른기능성을인정받아내수촉진은물론국외수출증대를꾀하고자한다. 따라서이와같은목표에도달하기위해서는동물시험과인체적용시험을원활하게수행하기위해 GLP 기관과 GCP 기관에서수행하여야하며, CRO 기관과식의약처, 학계및업계의전문가와협의ㆍ협조를받아서연구를추진하고자한다. 관련자료조사 ( 특허및논문 ) 원료표준화및지표 ( 기능 ) 성분분석 제 3협동과제협조동물시험 GLP 기관인체적용시험을위한지표성분의농도및기준규격설정 ( 복용량결정 ) 인체적용시험용시료조제 GCP 기관제조공정의표준화 제품의제형연구유통기한설정 시제품제조 기능성입증자료작성 개별인정형원료ㆍ성분신청 혈류개선기능성확보 국내ㆍ국외판매증진방안모색 기업ㆍ농가상생방안모색 상품화

299 현시대를살아가고있는사람들은최신의료기술의발달과제약산업의발전및건강식품개발의도움으로고령화인구가계속증가하고있다. 통계청발표에의한 2012년사망원인통계에의하면총사망자수는 26만 7천명정도이고조사망율 ( 인구 10만명당 ) 명으로전년대비 3.3% 가증가하였다. 사망의원인은악성신생물 ( 암 ), 심장질환, 뇌혈관질환의순으로나타났으며, 암으로사망한경우가심장질환이나뇌혈관질환으로사망한경우보다절대적으로앞서고있다. 심장질환이나뇌혈관질환과같이혈행의이상으로발생하는심혈관계질환도미국, 유럽, 아시아등전세계적으로주요한사망원인이되고있다. 혈행장애가일어나는원인은여러가지가있겠지만그중에서혈소판응집반응에의해서일어나는혈행장애와 coagulation factor 들이 cascade 식으로활성화되어 thrombin 에의해불용성 fibrin이형성되어 blood clot이생성되는응고기작에의해서혈행장애가일어난다. 현재식품의약품안전처로부터인정받고있는홍삼의기능성은혈행개선, 면역력증진, 피로개선, 항산화작용, 기억력증진등 5가지이지만백삼, 태극삼과같은인삼류는면역력증진과피로개선기능성 2가지를인정해주고있으며, 흑삼은단한가지의기능성도인정받지못하고있다. 많은과학자들이지금까지홍삼의대한효능, 효과에대해서는여러가지분야에걸쳐서연구가수행되어왔으나백삼이나태극삼의효능에대해서는매우미미한수준이다. 태극삼과관련된연구는인삼의가공유형별주요기능구명 (1), 백삼, 태극삼및홍삼추출물이세포수준에서 glucose uptake에관한보고 (2), 인삼의가공방법에따른성분함량변화 (3), 인삼의가공별 phenolic 화합물과 ginsenoside 의함량변이 (4), 원적외선건조기를이용한태극삼의건조특성 (5), 백삼과태극삼의크기및연근별인삼사포닌함량 (6), 건조인삼제품의품질특성 (7), 태극삼제조공정의효율화를통한백삼의경쟁력제고방안 (8), 가공방법에따른백삼제품의성분변화 (9) 등의보고에불과하다. 한편, 최근에많은연구가수행되어온흑삼은 2012년 1월 26일부로개정되어시행되는인삼산업법에서흑삼은증기로쪄서말리는과정을 3회이상반복한삼으로규정하고있다. 아직까지흑삼의가공공정에있어서미흡한점도많고소비자가손쉽게선택할수있는제형의개발과복용량등의문제점이있을수있는상태이다. 그러나흑삼에대한연구는태극삼과달리상당히많은연구가수행되었다. 흑삼의효능과관련된연구로는아토피억제활성 (10), 항암활성 (11, 12), 기억력개선 (13-17), 항비만효과 (18-20), 항당뇨및합병증 (21-23), 증포횟수에따른흑삼의항산화활성 (24, 25), 신생혈관형성억제활성 (26), 흑삼추출물의면역, 암전이억제, 혈당조절, 항산화활성등의생리활성 (27), 흑삼성분이함유된한방화장품의주름개선효과 (28, 29) 등이보고되었다. 또한편으로는흑삼제조와관련되어성분변화 (3, 23, 25, 30-34) 와흑삼성분이함유된식품의품질특성 (35-41), 그리고흑삼의안전성문제로대두되고있는 benzo( )pyrene 과관련된연구 (42, 43) 등다방면에걸쳐서보고되고있다. 국내에서는어느정도흑삼의이미지가형성되어있으나백삼과홍삼에비하면미미한수준이다. 따라서흑삼에대한전반적인제조방법등이제도권내에서해결되고, 성분과효능ㆍ효과측면에서많은연구가이루어져서소비자가흑삼또는흑삼제품을구매할수있는계기가되었으면한다. 2013년농림축산식품부의인삼통계자료집에의하면태극삼의연도별검사실적을살펴보면표 1과같이전체 74톤을검사하였고그중에서 37톤이수출용이었다. 검사실적은약간씩증가하는경향이었으나 2013년기준홍삼의 461톤과백삼 282톤과비교하면상당히

300 적은양이었다. 그리고흑삼의경우는통계자료에잡히지도않는수준이었다. 표 1. 태극삼의연도별검사및수출실적 ( 단위 : 톤 ) 또본연구에서는태극삼에많이함유되어있는성분들과특이성분및비사포닌성분분획등을이용하여혈소판응집억제기능성과 thrombin 에의해일어나는혈액응고활성을저해하는활성등을동물시험과인체적용시험으로수행하고, 그결과를바탕으로태극삼의기능성추가또는개별인정형원료ㆍ성분으로식품의약품안전처에신청ㆍ등록해서태극삼의기능성을인정받고자한다. 이와같은상황에서본연구에서는흑삼의제품개발에있어서제형개발과관련하여성분분석에의한표준화를수행하고, 태극삼은동물시험과인체적용시험을통하여혈액의흐름에도움을주는기능성추가또는개별인정형원료로등록하고자한다. 이러한결과가도출되었을때태극삼과흑삼의소비를진작시키고, 국내소비뿐만아니라인삼의주요한소비지역인중국및동남아시장에서도태극삼과흑삼의소비가증가하고수출의길이넓어져인삼류제조업체및인삼재배농가수익에도도움이되고자한다. 다. 재료및방법 1) 인삼류본연구에사용된수삼은경상북도풍기군지역에서재배된 6년근중 소편급수삼을구입하여저온창고에보관하면서태극삼및흑삼제조용수삼으로사용하였다. 제조된태극삼, 흑삼은다시적정조건으로태극삼, 흑삼물추출농축액으로제조하고필요에따라시료로사용하였다. 2) 시약총당분석에사용된 glucose 및 phenol, 환원당분석에사용된 dinitrosalycilic acid(dns), 산성다당체분석에사용된 galacturonic acid 및 carbazole, 항산화활성측정에사용된 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 총 phenol 화물과총 flavonoid 화합물측정에사용된 gallic acid 및 rutin 등은 Sigma사시약을사용하였다. Ginsenoside-Rb1, Rg1, Rg3, Rg5 및 Rk1은 Ambo Institute(Daejeon, Korea) 사의제품을인삼성분확인용 TLC plate는 Merck사의제품을구입하여사용하였으며그외실험에사용된시약은 1급시약을사용하였다.

301 3) 일반성분분석및색상비교태극삼및흑삼물추출농축액에함유되어있는총당분석은 phenol-sulfuric acid 방법 (44), 환원당분석은 DNS 방법 (45), 산성다당체함량분석은 carbazole-sulfuric acid 방법 (46) 을이용하였고수분함량은 105 건조법, 지방함량은 diethylether 추출법, 회분함량은 550 에서 3 시간이상가온하여조사하였다 (47). 그리고태극삼과흑삼농축액의색상을비교하기위하여건조물량기준으로 1% 용액을조제하여 1,610 x g에서 15 분간원심분리하여 490 및 550 nm에서흡광도를조사하였다. 4) 조사포닌, ginsenoside 함량및 TLC 패턴조사조사포닌함량및 TLC에의한 ginsenoside pattern 조사는수포화 n-butanol 추출방법 (48-50) 에의해조사포닌분획을얻어서 5% methanol 용액으로제조하여약 10 μl씩 silica gel 60 F 254 TLC plate에점적한후전개용매로서는 chloroform/methanol/water(65:35:10) 하층으로전개시킨후 30% 황산용액을분무하고 110 에서 10분간발색시켜그패턴을조사하였다. 그리고 HPLC에의한 ginsenoside 함량분석은아래내용과같은조건으로수행하였다. - 검출기 : 자외부흡광검출기 (DAD), 203 nm - 칼럼 : Eclipse Plus C18 ( mm, 3.5 μm) - 이동상 : 물 / 아세토니트릴 82/18 %, - 유량 : 1.6 ml/min- 주입량 : 10 μl 5) 총페놀화합물및총플라보노이드함량조사총페놀화합물은 Folin-Denis 방법 (51) 에의해측정하였다. 시료 0.5 ml에 Folin-Ciocalteu reagent 0.5 ml를가하여혼합하고 3분간정치한후 2% sodium carbonate 용액을 10 ml를가하고 1시간동안실온에서반응시킨후 UV/VIS spectrophotometer 를사용하여 750 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로서 gallic

302 acid를사용하여총페놀화합물함량을구하였다. 총플라보이드함량은 Moreno 등 (52) 의방법에따라시료 1 ml에 10% aluminium nitrate 0.1 ml, 1M potassium acetate 0.1 ml 및 ethanol 4.3 ml를가하여암실에서 40분간반응시킨후 415 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로서 rutin을사용하여총플라보노이드함량을구하였다. 6) DPPH free radical을이용한 scavenging activity 조사 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) free radical을이용한 scavenging activity는 Blois의방법 (53) 에의해서조사하였다. DPPH 용액 (DPPH 12 mg을 100 ml ethanol에완전히용해시킨후증류수 100 ml를가한액 ) 2 ml에시료용액 0.5 ml를가하여반응시간에따른흡광도의차이를조사하여상대활성으로나타내었다. Scavenging activity(%) = ( 무첨가구의흡광도 - 시료첨가구의흡광도 / 무첨가구의흡광도 ) x 100 7) 태극삼및흑삼농축액의품질안전성조사태극삼과흑삼농축액의식품학적품질안전성을조사하기위하여잔류농약, 중금속, 일반세균, 대장균군및 benzopyrene 함량분석등의시험은공식검사기관에의뢰하여조사하였다. Benzopyrene 함량분석조건은다음과같다. - 칼럼 :Eclipse Plus C18, Agilent, ( mm, 5 μm) - 칼럼온도 : 30 - 이동상 : 아세토니트릴과물의혼합액 (8:2) - 이동상유량 : 1.0 ml/min - 검출기 : 형광검출기, 여기파장 294 nm, 형광파장 404 nm - 주입량 : 10 μl 8) 유동층과립기를이용한과립 (pellet), 장용성과립제품제조및품질안정성조사 유동층과립제조기를이용하여태극삼, 흑삼물추출농축액을직경 1.2 mm 내외의구형 의과립제품을제조하였다. 이과립제품을저장조건을달리하여보관하면서저장기간에 따라과립제품의응고유무를육안으로관찰하였다. 이때과립제조조건및저장조건은 다음과같다. 가 ) 과립제조조건 (1) 기기 : Fluid bed granulator batch model (2) 제조조건 : 농축액농도 45Bx, 흡입공기온도 90, 분무공기압력 2.0 bar, 투입관온도 60, 투입속도 300 g/min (3) 코팅제 : 1% Hydroxy propyl methyl cellulose(hpmc) (4) Pellet 크기 : 1.2 mm 내외 (5) 과립의수분함량 : 5% 이하 나 ) 과립저장조건 (1) 밀폐유무

303 (2) 25, RH 75%, 10시간노출 (3) 35, RH 80%, 10시간노출 (4) 40, RH 75%, 10시간노출 (5) 3 냉장보관 (6) 실온보관 (RH 40 ± 5%) 9) 붕해도측정태극삼및흑삼물추출농축액을과립제형으로제조한후흡습방지제인 HPMC를코팅하여식품공전방법에따라 Disintegation testor(kukje Engineering CO.) 로붕해도를측정하였다. 2. 태극삼, 흑삼의제조및성분분석, 생리활성, 제품제조 가 ) 태극삼및흑삼제조 기존의홍삼, 태극삼및백삼과는다른새로운형태의제품인흑삼이출현함에따라이에대한체계적관리를하기위하여 인삼산업법 이개정, 공포 ( 법률제10948 호, ) 됨에따라제조방법에따른분류규정을색상에따라구별하도록법개정이되었다 ( 시행규칙개정 ). 따라서본실험에서도태극삼제조에는물을사용하지않고수증기를이용하여익히고건조하였으며다음의제조조건에따라태극삼과흑삼을제조하였다. (1) 태극삼제조공정 è è è 예열 25 분 ( 실온 à95 ) 증삼 분 후숙 20 분 (95 à60 ) 60 4 시간 시간 시간 (2) 흑삼제조공정 è è èèè 증삼, 건조과정 3 회반복 예열 10 분 ( 실온 à98 ) 증삼 98, 80 분 후숙 30 분 (98 à60 ) 60, 16 시간 50, 16 시간

304 나 ) 태극삼및흑삼의물추출농축액제조 태극삼및흑삼의물추출물농축액의제조는홍삼물추출물농축액의제조과정과유사하게 제조하여최종고형성분이 72Bx 가되도록농축하여 4 저온창고에서보관하면서성분분 석, 생리활성, 동물시험및인체적용시험용시료로사용하고자하였다. è è è 1차추출 :75, 10시간 2차추출 :75, 10시간 3차추출 :85, 10시간 4차추출 :85, 10시간 è è è è Bx 다 ) 태극삼및흑삼농축액의 ginsenoside 함량분석및패턴조사 건강기능식품공전에는인산류의기능성분 ( 또는지표성분 ) 함량기준은 ginsenoside Rb1 과 Rg1의합이 mg/g으로규정되어있기때문에소량및대규모시설을이용한태극삼과흑삼물추출농축액을제조하여 ginsenoside 함량분석을공식검사기관에의뢰하여분석한결과는표 2, 3과같다. 태극삼농축액의경우 5.09, 5.91, 6.63 mg/g으로나타나그기준에적합하였다. 그리고흑삼농축액의경우 ( 표 4, Fig. 3) 태극삼농축액에비해서 ginsenoside-rg1은감소하였으나 Rb1은약 1.5배이상, Rg3(s) 함량은 3-6정도증가하였고 diol 그룹의분해산물인 ginsenoside-rk1은 0.24 mg/g, Rg5는 0.34 mg/g의농도로검출되었다. 흑삼의특징적인사포닌이라고할수있는 Rk1과 Rg5 함량은증삼횟수에따라그양이증가하는경향이나 Jo 등 (31) 의결과에의하면 9회증삼했을경우에 Rk1 함량은 6.8 mg/g, Nam 등 (30) 은약 4.07 mg/g이며 3회증삼했을경우에는 1.28 mg/g 정도라고보고하였다. 한편 Rg5의경우 Jo 등 (31) 은흑삼의경우에 28.1 mg/g으로보고하였으나, 본실험에서는흑삼농축액의경우에 0.34 mg/g과비교하면많은차이가난다. 이것은분석방법에의한차이가있을수도있으나 ginsenoside-rk1과 Rg5 자체가매우불안정하여액체상태로존재할경우에분해속도가빠르게진행될수있다고판단된다. 그리고본연구에서는태극삼물추출농축액의경우에는동물시험과인체적용시험을추

305 진하여기능성추가또는개별인정원료의등록이라는측면에서보면태극삼농축액의원료성분표준화가잘이루어졌으며, 이를동물시험과인체적용시험의시료로사용하여도별문제가없다고판단된다. 소규모및대규모시설을이용하여제조한태극삼물추출농축액의 ginsenoside 의 HPLC 패턴은그림 1, 2와같이거의같은 retention time에거의같은높이의 peak로나타났다. 그러나 ginsenoside-rg3(s) 의경우육안으로도확인하기어려운정도의 peak가검출되어홍삼이나흑삼의농축액과다른형상으로나타났다. 표 48. 예비소규모실험에의한태극삼농축액의 ginsenosides 함량 표 49. 본실험에의한태극삼농축액의 ginsenosides 함량 Ginsenosides 함량 (mg/g) 태극삼농축액 Rb1 Rg1 Rg3(s) Rb1 + Rg1 A B C 표 50. 흑삼농축액의 ginsenosides 함량 Ginsenosides(mg/g) 항목 Rg1 Rb1 Rg3(s) Rk1 Rg5 흑삼농축액

306 그림 233. HPLC chromatogram of ginsenoside-rb1, Rg1 and Rg3(s) from 3 Taegeuk ginseng water extracts prepared by laboratory scale.

307 그림 234. HPLC chromatogram of ginsenoside-rb1, Rg1 and Rg3(s) from 3 Taegeuk ginseng water extracts prepared by large scale.

308 Fig HPLC chromatogram of ginsenoside-rb1, Rg1, Rg3(s), Rk1, and Rg5 from Black ginseng water extracts 라 ) 태극삼및흑삼농축액의 TLC 에의한 ginsenoside 패턴분석 태극삼과흑삼의물추출물농축액의 ginsenoside 의 TLC 패턴을조사한결과는그림 4와같이태극삼농축액에서는 ginsenoside-rb1 과 Rg1은분명히나타났으나 Rg3(s) 는불명확하게나타났으며, 흑삼농축액에서는 ginsenoside-rb1, Rg1, Rg3(s) 및 Rk1은분명하게나타났으나 Rg5는불투명하게나타나다른전개용매를사용하여확인할필요성이있다고판단된다. 그림 236. TLC chromatogram of ginseng saponin from Taegeuk and Black ginseng extracts A : Taegeuk ginseng extract, B : Black ginseng extract C : Rb1, D : Rg1, E : Rg3(s), F : Rk1, G : Rg

309 마 ) 일반성분함량 태극삼과흑삼의물추출물농축액의일반성분및조사포닌과산성다당체함량을분석한결과표 5와같다. 총당에있어서태극삼농축액이흑삼농축액보다약 10% 정도높게나타났으며조회분함량에있어서는흑삼농축액이태극삼농축액보다약 2.4% 정도높게나타났다. 그리고조지방, 조단백질, 조사포닌및산성다당체함량은태극삼과흑삼농축액이비슷하게나타났다. 흑삼농축액의회분함량이높게나타난원인에대해서는높은온도로계속하여열처리를받는제조과정에서태극삼농축액과달리회화가되지않는미지의물질들이생성된결과에의한것이아닌지좀의외의결과라고사료된다. 표 51. 태극삼및흑삼농축액의일반성분함량 (Unit : % dry basis) 바 ) 색상비교 태극삼및흑삼농축액의색상을적색관련파장인 490 및 550 nm 에서흡광도를조사한 결과표 6 과같이흑삼농축액이태극삼농축액에비해서약 5.8 배정도로나타나흑삼제 조과정중에열에의한비효소적갈변반응에의한결과라고판단된다. 표 52. 태극삼및흑삼농축액의색도비교 사 ) 총페놀화합물및총플라보노이드함량 총페놀화합물의함량은흑삼농축액이 1.64% 로태극삼의약 2 배정도높게나타났으며 총플라보노이드함량에서도흑삼농축액이약 2 배이상높게나타나이들물질에의한항 산화활성도흑삼농축액이높게나타날가능성이있다고판단된다 ( 표 7).

310 표 53. 태극삼및흑삼농축액의총페놀화합물및총플라보노이드함량 (Unit : % dry basis, μg /100g) 아 ) DPPH free radical 에의한 scavenging activities 조사 그림 237. DPPH free radical scavenging abilities of water extract of Taegeuk and Black ginseng. DPPH 용액 2 ml 와 2% 수용액의태극삼및흑삼물추출농축액 0.5 ml 를혼합하여 DPPH free radical 에의한 scavenging activities 를조사한결과는 Fig. 5 와같다. 반응 1 분후의활성은태극삼농축액이 34.5%, 흑삼농축액은 61.1% 로나타나흑삼농축액이태 극삼농축액의 1.7 배이상의활성을나타내었다. 한편 x 10-3 % 의농도의 vitamine C 는 1 분후 48.1% 의활성을보였다. 이러한결과는 5 분후에 73.7% 의 DPPH 소거활성을보 인본실험결과와 1,000 μg /ml 의농도에서 30 분경과시약 75% 의항산화활성을나타낸 경우 (27) 와매우유사한결과였다. 표 54. 반응시간에따른태극삼및흑삼농축액의 DPPH radical scavenging activities

311 자 ) 품질안전성 태극삼및흑삼농축액의식품으로서의안전성을조사한결과잔류농약, 중금속, 세균수, 대장균군에있어서또흑삼의경우 benzo( )pyrene 함량등은기준치내로모두적합판정을받았다 ( 표 9, Fig. 6). PAHs(polycyclic aromatic hydrocarbons, 2개이상의벤젠고리를가지고있는다환방향족탄화수소 ) 그룹에속하는 benzo( )pyrene 은 의온도에서불완전연수시생성되어유전독성과발암성이강한것으로알려져국제암연구소 (International Agency for Research on Cancer, IARC) 는그룹 1( 발암물질 ) 로분류하였다. 본실험에서 3증 3포흑삼을제조하여농축액으로제조했을때 benzopyrene 의함량이 0.31 μg /kg으로나타났다. Cho 등 (42) 이보고한내용에의하면뿌리의경우 120 에서 60분간열처리하면 benzopyrene 량이 0.47 μg /kg에서 300분까지열처리를했을때는 2.29 μg /kg로증가하였고, 1회부터 9회까지증삼ㆍ건조과정을반복하여흑삼을제조했을때 1 회는 0.92, 3회는 1.20, 5회는 1.49, 7회는 1.97, 9회는 2.06 μg /kg로나타났다고보고하였으며시판흑삼의경우도 2 μg /kg 이상이라고보고하였다. 그러나 Cho 등 (43) 의보고에의하면 1 7회까지증삼ㆍ건조하여제조한흑삼의경우약 0.08 μg /kg, 9회까지증삼ㆍ건조하여제조한흑삼은약 0.15 μg /kg로매우낮은수준이라고보고하였다. 또 4번증삼ㆍ건조를반복하여제조한흑삼의동체와미삼에함유되어있는 benzopyrene 량은동체가 0.1, 미삼이약 0.4 μg /kg 정도였다고보고하였다. 표 55. 태극삼및흑삼농축액의식품학적위해요소분석 그림 238. Standard curve of benzopyrene.

312 차 ) 붕해도 태극삼및흑삼농축액의과립제품을식품공전의방법대로붕해도를조사한결과 5 분이내 모두붕해되어기준치인 30 분이내기준을통과하여적합한것으로나타났다. 타 ) 과립제조및과립의품질분석및저장안정성 태극삼및흑삼농축액과립을유동층과립제조기를이용하여과립을제조하고 HPMC를 1% 정도코팅하여그림 7과같은제품을완성하였다. 태극삼및흑삼농축액과립의자체기준안을만들고이에따른품질을분석한결과는표 10과같이일반식품의품질검사기준에적합하게나타났다. 그리고가속시험을포함한품질안정성조사를실시한결과표 11과같이 45일이경과한현재온, 습도를달리하여도밀폐된용기에서는응고현상 ( 과립과과립이흡습등에의하여엉겨붙는현상 ) 이나타나지않았다. 그러나온, 습도를높이고, 개방된병에보관된과립은모두 10시간이내에응고현상이나타났으나냉장보관이나실온에서개방한상태로보관하였을경우 45일경과후에도응고현상이나타나지않았다. 이러한결과는대기의습도가높지않는조건이나냉장상태의습도가매우낮은수준과과립의입자크기가작으면작을수록표면적이크기에따라수분의흡수량이결정되기때문이라고사료된다. 흑삼농축액과립 태극삼농축액과립 그림 239. 흑삼및태극삼농축액과립의외부형상

313 표 56. 태극삼및흑삼농축액과립의품질분석결과 표 57. 품질안정성조사결과 ( 가속시험 ) * 각 1, 2, 3 조건의시료는 10 시간처리후실온에서보관 ** - ; 비응고, + ; 응고

314 카 ) 장용성태극삼및흑삼농축액과립제조 장용성제제는제약학분야에서는약효성분이위산에의해서분해되어그효력이저하되거나위점막을강하게자극하는약품의경우에많이이용되고있다. 그러나식품분야에서는식품의쓴맛이나향미를싫어하는소비자나제품의색상이나광택을조정하여상품성을높힌다든지복용했을때위에부담감을준다든지또는거북함을느끼는소비자를위해서는장용성제제로제조하여판매하고있다. 장용성제제는 ph 1.2 정도에서 2시간이상붕해되지않고 ph 5.6 이상에서붕해되어장에서소화, 흡수되어야한다. 본실험에서는태극삼및흑삼농축액을과립제품으로제조한후식품가공용장용성제품제조에필요한첨가물인 Hydroxypropylmethyl cellulose Phthalate(HPMCP) 를 0, 5, 10, 15 및 20% 를첨가하여장용성제품을제조하였다. 이장용성제품의품질시험은공식품질검사기관에의뢰하여붕해도등을분석하고자한다. 이때실제코팅제인 HPMCP의양은표 12와같다. 이장용성제품의붕해도조사결과는표 13과같이 HPMCP를 10% 까지코팅하였을때에도약 30% 정도붕해가일어났으나 15% 이상코팅하였을때에는붕해가거의일어나지않아태극삼, 흑삼장용성과립을제조할때에는 HPMCP를 15% 이상코팅해야된다는것을알수있었다 ( 표 13, 14). 표 58. 장용성제품의 HPMCP 실제코팅량 * The ratio of HPMCP of Enteric coating pellets product 100g 표 59 육안에의한장용성제품의붕해도시험결과 HPMCP : Hydroxy propyl methyl cellulose Phthalate + : 붕해됨, - : 붕해되지않음 * NaCl 2.0 g 에묽은염산 24 ml 및물을가하여 1 L 로한다. 이액은무색투명하고 ph 는약 1.2 이다 분동안붕해되지않아야함 ** 0.2N-KH 2 PO 4 용액 250 ml 에 0.2N-NaOH 용액 118 ml 및물을가하여 1 L 로한 다. 이액은무색투명하고그 ph 는약 6.8 이다 분이내에붕해되어야함

315 표 60. 태극삼농축액장용성과립제품의붕해도 파 ) 과립및장용성과립제조공정 과립 (pellet) 제조공정은다음과같다. 농축액의농도는정제수로약 45~50Bx로조정하고유동층과립기로과립을제조하고흡습을방지하기위해서는 HPMC를 0.5~1.0% 정도코팅을한다. 장용성제품은 HPMCP를약 15% 이상코팅하고크기를선별하여포장한다. 이때실제로 HPMCP가코팅되는양은다음표와같다. è è 유동층과립 제조및코팅 è 선별 è 포장 45~50Bx HPMC 또는 #16 선별 HPMCP ( 직경 1.2 mm) 흡입공기온도는 미세과립 : 재투입 75~90 분무압력 :1~3 bar 제품온도 :48±5

316 하 ) Thrombin time 에미치는태극삼, 흑삼물추출농축액의영향 혈액응고의공통인자인 thrombin 활성에미치는영향을조사하기위해서태극삼, 흑삼물 추출농축액의여러가지유기용매분획물은다음과같이제조하였다 ( 그림 8). 그리고 80% EtOH 상징액분획을농축하고다시 EtOH 를가하여 90% EtOH 불용성분획, 99% EtOH 불용성분획및 99% EtOH 가용성분획을조제하여 Fig. 8 과같이분획하고각분획의 thrombin time 에미치는영향을조사한결과는표 15 와같다. 예비실험으로서조사하였지만 Ethyl acetate 분힉에서는태극삼농축액과흑삼농축액이혈액응고저해능이거의없었 으며, 조사포닌분획에서는약간의저해능이있었으나태극삼과흑삼농축액간에는별차 이가없었다. 또조사포닌의물세척분획에서도약간의저해능이있었으며 80% EtOH 침 전분획에서는희석을하였지만 thrombin time 에는별영향을주지못했으며, 90% EtOH insoluble 분획에서는태극삼농축액이흑삼농축액보다혈액응고를지연시켰다. 99% EtOH insoluble 분획과 99% EtOH soluble 분획에서는흑삼농축액이태극삼농축액보 다혈액응고저해활성이높게나타났다. 향후에는 prothrombin time(pt) 이나 activated partial thromboplastin time(aptt) 을조사하여외인성또는내인성혈액응고인자에미 치는영향을조사하고자한다. 5 grams of Taegeuk and black ginseng water extract Disolved in 50mL of D.W. 50mL of n-hexane x 4 times n-hexane layer Aqueous layer 50mL of ethylacetate x 4 times Ethyl acetate layer Aqueous layer 50mL of n-buoh x 4 times n-buoh layer 50mL DW x 2 times Evaporation Aqueous layer Evaporation Disolved in 20mL D.W. Added 80mL of EtOH Washing n-buoh fr. with D.W. PPT SUP Evaporation Evaporation 그림 240. Preparation of fractionations from Taegeuk and Black ginseng water extract by various organic solvents

317 표 61. 태극삼및흑삼물추출물의유기용매분획물이 thrombin time 에미치는영향 * Thrombin time of control : 19.3±0.1 sec. 1) 2) Disolved in 0.1M-phosphate buffer solution(ph 7.0). Each value is the means± SD of three times determinations. T : Taegeuk ginseng water extract, B : Black ginseng water extract Reaction mixture of 50 μl of thrombin(0.5 NIH unit/ml), 50μl of 25 mm CaCl 2, and 50 μl of sample solution was preincubated for 3 min at 37, and then 100 μl of human plasma was added and detected clotting time. 3) Not determined.

318 3. 태극삼, 흑삼의제품의개발 가 ) 제품개발 태극삼및흑삼물추출농축을사용하여다음과같이제품개발을완료하였고포장방법은다 양하게하고자한다. - 태극삼, 흑삼물추출농축액장용성 pellet 각 1개제품 - 태극삼, 흑삼물추출농축액 pellet 각 1개제품 - 태극삼, 흑삼물추출농축액각 1개제품 - 태극삼물추출농축액분말 1개제품 - 태극삼함유다기능제품 (5 高제품 ), 숙취해소제품각 1개제품 나 ) 태극삼성분이혼합된복합제품개발 태극삼이나흑삼단독으로제품의제형을달리한제품개발과더불어태극삼또는흑삼성 분에천연물이나다른성분을혼합한복합제품을개발, 제품화하여태극삼, 흑삼의국내 매출과국외수출을촉진하고자한다. (1) 태극삼물추출농축액이함유된다기능 ( 五高 ) 제품개발 - 혈압, 혈당, 혈행, 기억력, 항산화기능 - 과립또는타브렡제조방법 ( 특허출원예정 ) - 배합성분태극삼물추출물분무건조분말코엔자임 Q10 : 혈압조절, 항산화작용바나바잎주정추출물 : 혈당조절은행잎추출물 : 기억력개선, 혈행개선 - 일일섭취량 : 1,000 mg(500 mg x 2정 ), 2회 / 일, 1정 / 회

319 상기와같이태극삼물추출물분무건조분말을기본성분으로하고혈압조절과항산화작용의기능성이인정된코엔자임 Q10, 혈당조절기능성이있는바나바잎주정추출물, 그리고기억력개선, 혈행개선기능성이인정된은행잎추출물을혼합한다기능제품을개발하여상품화를시도하고자하며이와관련된내용은특허출원을하고자한다 ( 그림 9). 다기능 ( 五高 ) 제품 태극삼물추출농축액분말캅셀제품 그림 241. 다기능 ( 五高 ) 제품과태극삼물추출농축액분말캅셀제품의외관모습 (2) 육계 ( 계피 ) 및태극삼 ( 인삼류 ) 물추출물이함유된숙취해소제품개발 2013년사망원인통계 ( 요약 ) 에의하면사망자수는 266,257명이며간질환에의한사망원인순위는 8위로나타났다. 알코올관련사망자수는 4,476명으로 (1일평균 12.3명 ) 전체사망자의 1.68% 로나타났다. 남자가여자보다 7.59배높으며, 30세부터급증하여 50대를정점으로감소하고있다. 체내에섭취된알코올은위 ( 胃 ) 에서 20%, 소장 ( 小腸 ) 에서 80% 체내로흡수된다. 흡수되는속도는술의종류에따라다르나일반적으로알코올농도가높을수록빠르며, 특히장이비어있는공복시에빠르다. 위와장에서흡수된알코올은혈액을따라몸전체로퍼지게되는데도중에간장을통과하면서분해된다. 간에이르러알코올은먼저아세트알데히드 (acetaldehyde, CH 3 CHO) 로바뀌고, 아세트알데히드는아세트산 (acetic acid, CH 3 COOH) 으로분해돼간밖으로배출되며, 체내를돌며이는다시물 (H 2 O) 과이산화탄소 (CO 2 ) 로분해된다. 알코올은소화과정없이흡수된후바로대사된다. 체내에흡수된알코올은 90% 이상 98% 까지완전산화되는데, 1 g당 7 kcal의열량이생성된다. 이과정은매우빠르다. 산화되지않은 2%, 대량섭취한경우라도 10% 미만의알코올만이호흡, 땀, 소화선분비및소변등을통해그대로배설된다. 위와소장을통해흡수된알코올은간에서아세트알데히드 (acetaldehyde) 로바뀌게된다. 아세트알데히드는독성물질이다. 이분해과정에관여하는효소의이름은알코올탈수소효소 (ADH:Alcohol dehydrogenase) 와미크로솜에타놀산화계효소 (MEOS) 다. 알코올탈수수효소 (ADH) 는전체알코올처리의약 80 90% 를담당하는주력부대격이며, 미크로솜에타놀산화계효소 (MEOS) 는나머지 10 20% 를처리하는보조부대격이다. 여기에서흥미

320 있는사실은 ADH가술에강하고약함에관계없이일정한활성을지닌데비해 MEOS는음주량이나음주빈도에따라활성이강화된다는사실이다. 술에약한사람이자주술을마심에따라점차술에강해지는것은바로이 MEOS계통의효소활성이강해지기때문이다. 최근밝혀진바에따르면 MEOS가생산되지않거나또는그양이적은사람이있다고하는데, 술을전혀마시지못하는것은이와관련이있다. ADH는간장이외에위점막에도존재한다고밝혀졌다. 위점막 ADH의활성은간장 ADH에비하여는매우낮다. 그러나위점막 ADH는혈액으로흡수되는알코올의양즉알코올의생체내유용도를저하시킨다. 이위점막 ADH 활성은여자가남자에비해낮으며만성알코올중독자는정상인의반밖에되지않는다. 따라서같은양의알코올을섭취하더라도여성과알코올중독자에서혈중알코올농도는높아빨리취할수있다. 또위절제술을받은사람은위장에서의대사과정이없고소장에서빨리흡수되므로정상인보다빨리취한다. ADH와 MEOS에의해생성된아세트알데히드는인체에해를미치지않는초산으로바뀌어간장밖으로배출되는데이역할을하는효소가아세트알데히드탈수소효소 (ALDH) 다. 간에서분해과정을거친알코올 ( 아세트알데히드 ) 은심장에서대동맥을거쳐몸구석구석으로보내진다. 거미줄처럼촘촘하게짜여진혈관을거쳐우리몸곳곳에있는근육이나지방조직으로스며들게된다. 이과정에서알코올 ( 아세트알데히드 ) 은혈관에충격을준다. 적당히술을마셨을경우에는이런충격이혈관을확장시켜피의흐름을도와주지만, 흡수한알코올양이간의능력을초과해미처분해되지못한알코올과아세트알데히드가혈액을타고전신을돌게되면인체의여러장기에치명적인해를끼치게되는것이다. 아세트알데히드는독성이매우강한물질이다. 때문에간은 ALDH( 아세트알데히드탈수소효소 ) 를만들어이것을파괴한다. 그런데아세트알데히드가분해되지않고우리몸에독성을내뿜게되면심각한부작용이생기게된다. 분해되지못한아세트알데히드는혈관을타고온몸으로퍼져나간다. 아세트알데히드에의해혈관이확장되는데, 얼굴이붉어지는것도그런이유때문이다. 아세트알데히드는계속해서미주신경, 교감신경내의구심성신경섬유를자극해구토, 어지럼증, 동공확대, 심장박동및가쁜호흡등알코올영향 ( 숙취 ) 를유발하게된다. 연구결과에따르면아세트알데히드는매우독성이강해동물실험의경우암을일으키는것으로나타났다. 또알코올은간에서분해되어알데히드의형태로되며이알데히드는뇌속에서신경전달물질인생체아민의작용을변화시키는것으로알려져있다. 이와같은알데히드는혈중또는뇌조직중의알코올보다훨씬유독하며이러한알데히드의제거는일차적으로숙취의제거효과가있다. 이것은알데히드가뇌속에서신경전달물질의대사산화물과반응하여몰핀유사물질을형성하며현재까지알려진몰핀유사물질로는 tetrahydroisoquinoline, salsolinol, tetrahydroxypapaveroline 등이있다. 이러한물질들은음로인한숙취나알코올중독을유발하는것으로알려져있다. 현재까지이들물질을형성하는과정은효소적반응이아닌비효소적반응으로서알데히드와생체아민의대사물

321 이축합반응을하는것으로알려져있다 (55). 따라서태극삼, 흑삼등인삼류와 alcohol dehydrogenase의활성을저해하여 aldehyde 의생성을최소화할수있고생성된 aldehyde는빠른시간에대사시켜서생체내에무해한물질로전환시킬수있는천연물소재를선별하여숙취해소에도움이되는제품을개발하고자한다. 이와관련하여다음과같이특허출원과관련전문학술지에논문을투고하고자한다. Alcohol dehydrogenase 저해활성과 acetaldehyde dehydrogenase 활성은표와같이측정하였다. 표 62. Assay of alcohol dehydrogenase activity Activity(%) = {[(T-CC) - (T-TC)/C-CC]} x 100 T : 시료구의흡광도, TC : 시료대조구의흡광도 C : 효소반응구의흡광도, CC : 시료및효소반응대도구의흡광도 Inhibitory activity(%) = {1-[(T-CC) - (T-TC)/C-CC]} x 100 T : 시료구의흡광도, TC : 시료대조구의흡광도 C : 효소반응구의흡광도, CC : 시료및효소반응대도구의흡광도

322 표 62. Assay of acetaldehyde dehydrogenase activity Reaction Activity(%) = {[(T-CC) - (T-TC)/C-CC]} x 100 T : 시료구의흡광도, TC : 시료대조구의흡광도 C : 효소반응구의흡광도, CC : 시료및효소반응대도구의흡광도

323 (3) 인삼류의알코올분해효소에미치는영향 인삼류 ( 백삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼 ) 를 5 g 취하여 100 ml의정제수를가하고 80 에서 8 시간추출하여여과한뒤 alcohol dehydrogenase와 acetaldehyde dehydrogenase 활성에미치는영향을조사한결과는다음과같다. 백삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물은 alcohol dehydrogenase 활성에는큰영향을미치지않았다 ( 표 63). 그러나백삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물은 acetaldehyde dehydrogenase 활성을약 10% 정도촉진시켰다 ( 표 64). 표 63. 인삼류물추출물이 alcohol dehydrogenase(adh) 활성에미치는영향 표 64. 인삼류물추출물이 acetaldehyde dehydrogenase(aldh) 활성에미치는영향 육계 ( 계피 ) 를 5 g 취하여 100 ml의정제수를가하고 80 에서 8시간추출하여여과한뒤추출액양에따른 alcohol dehydrogenase와 acetaldehyde dehydrogenase 활성에미치는영향을조사한결과는다음과같다. 계피물추출물의 alcohol dehydrogenase 활성에미치는영향을조사한결과계피물추출액의건조물량으로서약 100 μg /1.5 ml의반응시스템에서약 80% 정도저해하였고 150 μg /1.5 ml의농도에서거의 100% 정도저해하였다. 그리나계피물추출액 85 μg /1.5 ml의반응시스템에서도 85% 정도의활성을나타내었다 ( 그림 10, 11).

324 계피물추출물이 alcohol dehydrogenase의활성을매우강하게저해하기때문에계피성분이정제되지않은상태에서저해형태 (inhibition type) 를조사한결과는 12와같다. 계피물추출물무첨가구와건조물량으로서 51 μg /1.5 ml 정도가첨가된상태에서 alcohol dehydrogenase에미치는영향을조사하여 Lineweaver-Burk plot 한결과비경쟁적저해, 그중에서혼합형 (mixed type) 으로나타났다. 여기에서계피물추출물무첨가구의 Km 치는약 0.13% 로나타났고, 계피물추출물첨가구 (51 μg /1.5 ml) 에서의 Km 치는 0.46% 로나타나기질 (alcohol) 친화력측면에서계피성분은전형적인 alcohol dehydrogenase의저해물질로확인이되었다. 그림 243. 육계물추출물의 alcohol dehydrogenase 에대한

325 (4) 육계부위별 alcohol dehydrogenase 활성에미치는영향국내에수입되는육계 ( 계피 ) 는거의베트남에서생산되는것으로서재배기간이나육질 ( 油細胞層의두께가 45% 정도이상은 YB1 등급, 베트남 YenBai 지방에서생산된계피에대해서등급을정함-YB1 YB4의등급으로구분 ) 의두께및계피의향에따라그등급이결정된다. 계피의 YB1 YB4 등급, 계지의직경과계피나무의엽병의물추출물이 alcohol dehydrogenase 활성에미치는영향을조사한결과는다음과같다. 계피의등급이우수할수록 alcohol dehydrogenase 활성을저해하는정도가큰경향이었고계지는계피의저해활성에비해서 3/1 1/2 정도에불과하였다. 한편엽병의 alcohol dehydrogenase 저해능은계피의 배, 계지의 3 3.7배정도로높았다 ( 표65). 표 65. Effect of grades and parts of cinnamon on the activity of alcohol dehydrogenase, and the comparision of contents of cinnamaldehyde from various cinnamon parts 각시료 ( 크기 : 0.5 cm 내외 ) 5 g 에 100 ml 의정제수를가하여 80 에서 8 시간추출한 후좀더정확한저해율을조사하기위하여 2 배희석하여 0.1 ml 를반응액에첨가하였음 ( 다른실험에서는희석하지않고첨가 )

326 한편계피와계지및엽병에함유되어있는 cinnamaldehyde의양을 HPLC를사용하여분석한결과 alcohol dehydrogenase 저해활성과아주밀접한연관관계가있는것을알수있었다. 계피에는약 2.4%, 계지에는 1.3%, 엽병에는 2.8% 의 cinnamaldehyde가함유되어있는것으로나타났다. 즉 cinnamaldehyde 함량이높을수록 alcohol dehydrogenase 활성을강하게저해하는경향이었다. 그리고계피내에함유되어있는 cinnamaldehyde의양의분석방법과조건및 HPLC 패턴은그림 244과같다. 가 Cinnamaldehyde 분석방법및분석결과 1 전처리방법육계를균질하게분쇄 ( mesh) 하고분말약 1.0 g을정밀하게취하여플라스크에넣고여기에메탄올 50 ml를넣어 1시간동안실온에서초음파추출한다음침전물을여과하여제거하고여액에메탄올을넣어정확하게 50 ml로정용한뒤적절히희석하여 Agilent 1200 series HPLC를사용하여분석하였다. 이때표준물질로사용된 cinnamaldehyde(sigma Co.) 는 methanol에 0.005, 0.025, 0.05% 단위로용해하여사용하였다. 그결과 cinnamaldehyde는 3분 30초이후에단일 peak로나타났다. 그리고계피나계지에서는나타나지않지만엽병에는 4분 30초부근에서미지의물질이함유되어있는것으로나타났다. ➁ 분석조건 - 기기명 : Agilent 1200 series HPLC(UV 280 nm) - 전개용매 A: Distilled water, B: Acetonitrile

327 그림 244. HPLC patterns of cinnamaldehyde standard, extracts from cinnamomi petiole, cinnamomi ramulus and cinnamon bark A; Cinnamaldehyde(0.025% in methanol), B; Cinnamomi petiole, C; Cinnamomi ramulus cm D; Cinnamon bark(cortex) YB4

328 (5) 태극삼과복합시알코올분해효소의활성에상승효과를나타내는천연물검색 태극삼 ( 백삼, 홍삼, 흑삼등포함 ) 추출물을기본으로하고 alcohol dehydrogenase 활성을강하게저해하는계피및당귀추출물과 acetaldehyde dehydrogenase 활성을증가시키는마늘, 바지락, 파래물추출물의양을달리하여 10가지의조성물을제조한뒤 alcohol dehydrogenase 저해활성과 acetaldehyde dehydrogenase 활성에미치는영향을조사한결과는표 21과같다. 1번조성물은약 83%, 10번조성물은 94% 정도의 alcohol dehydrogenase 활성을저해하였으나그외조성물은거의 100% 정도의 alcohol dehydrogenase 활성을저해하였다. 그리고이들조성물이 acetaldehyde dehydrogenase 활성에미치는영향은파래추출물이함유된혼합물에서 121% 정도의활성을나타내었고, 그다음이 2번조성물에서약 119% 정도로증가시키는것으로나타났다. 표 66. 천연물물추출물의혼합물들이 alcohol dehydrogenase 활성에미치는영향 * 육계성분이함유된예에서는 alcohol dehydrogenase 활성이거의 100% 저해되었음 당귀성분이함유된예에서도약 94% 정도가저해받았음

329 표 67. 천연물물추출물의혼합물들이 acetaldehyde dehydrogenase 활성에미치는영향 * 파래성분이함유된예 4 에서 aldehyde dehydrogenase 활성이높게나타났음 - 관능 ( 맛, 향취미 ) 측면에서홍삼에비해우수하다는것을관능검사에의해서확인, 증명 하고자하며, 홍삼농축액과항산화활성, 혈액응고저해활성, 알콜분해및저해활성등 을비교조사하고자함 * 매출증대에대한추진예정사항견본시제품을제조하여국내, 국외거래처에송부및평가요청예정 < 국외거래처 > 1. 上海欧美药妆保健用品有限公司 ( 중국 ) 2. 錦御兰 ( 株 )( 중국 ) 3. J-E International( 중국 ) 4. 화창토산 5. 上海文君食品有限公司 ( 중국 ) 6. 富一金箔健品有限公司 ( 홍콩 ) 7. SUNRISE HEALTH PRODUCTS INC( 미국 ) 8. ROOT9 GINSENG INC( 미국 )

330 2) 시험제품의 In vitro 혈소판응집억제능조사 태극삼물추출농축분말을 0 20 mg의농도로첨가하여 collagen 및 ADP로유도된혈소판응집억제능을조사한결과는그림 14와같다. Collagen 및 ADP로유도된혈소판응집을모두농도의존적으로억제했으며, Collagen 보다 ADP가유도된혈소판응집억제작용을약간더강하게나타내었다. 그림 245. 태극삼농축액분말의농도가 ADP alc collagen으로유도된혈소판응집에미치는영향 - Blood was collected from male SD rats and washed platelets were prepared. - Platelet concentration was adjusted at cells/ml using Tyrode's buffer and platelet aggregation test was performed using light transmission aggregometry. - Briefly, platelets were pre-treated with different concentrations of taegeug ginseng water extract powder along with 1mM CaCl2 following stimulation with Collagen (2.5 µg/ml) or ADP (10 µm). - Taegeug ginseng water extract powder significantly inhibited platelet aggregation in a dose dependent manner(*** p < versus control).

331 7 절. 태극삼농축액의혈행개선개별인정형인정을 위한동물시험연구 태극삼농축액은현건강기능식품법상그기능성이면역력증진과피로개선으로한정되어 있어서혈행개선기능성을추가또는개별인정형원료ㆍ성분인정을받고자동물시험을추진 하고자한다 ( 표 68). 표 68. 동물시험추진방법

332 동물시험결과는다음과같이전반적으로는혈류개선기능성이인정되었다.( 별첨 ) 가 ) 시험동물의경동맥에 70% FeCl 3 를처리하여폐색 ( 혈전 ) 이일어나는시간측정에의한혈류개선효과가확인되었으며나 ) ADP 및 Collagen이유도된혈소판응집반응에서농도의존적으로그억제능이확인되었으나다 ) PT, APTT 측정에의한혈액응고저해능에는영향을미치지않았다. 시험명 : 태극삼추출물의혈행개선효능평가 상기시험의보고서를제출합니다 년 9 월 2 일 시험책임자 연구소장 서윤희 참여연구원 책임연구원 송혜진 참여연구원 연구원 장선형 참여연구원 연구원 강아름 시험감수인이학박사최수영 ( 주 ) 이비오대표오진근

333 요 약 태극삼추출물이혈행개선에도움이되는지확인하기위하여항혈전시험, 혈소판및혈액응고억제시험을수행하였다. 항혈전시험은시험동물의경동맥에 70% FeCl 3 를처리하여인위적으로혈전을유발하고혈전이형성되는시간은혈류를측정하여평가하였다. 용매대조군 ( 태극삼추출물 0mg / kg ) 에서혈전생성으로혈관폐색이일어나는시간은 9.2±5.7min이었고, 태극삼추출물 10mg / kg, 50 mg / kg, 500mg / kg투여군에서혈관폐색이일어나는시간은각각 37.5±6.2, 32.1±9.8, 35.4±7.1min으로투여농도와상관없이용매대조군에비하여통계적으로유의하게지연되었다. 혈소판응고억제시험에서 ADP에의한혈소판의응집률은용매대조군에서 55.5±3.7% 이고시험물질 10, 50, 500mg/kg 투여군투여군의응집률은53.9±3.6, 51.1±2.7, 51.6±2.4 % 로 50mg/kg 투여군에서통계적으로유의하게감소하였다. 또한 collagen에의한응집률은용매대조군에서 61.3±6.0% 이고시험물질 10, 50, 500mg / kg투여군의응집률은각각 52.8±6.9, 49.9±7.1, 50.5±4.5% 로모든시험물질투여군에서통계적으로유의하게감소하였다. 혈액응고억제시험에서 PT 및 aptt는시험물질투여군과용매대조군이차이가없었다. 위결과로보아 FeCl 3 로혈전을유도하였을때태극삼추출물을투여한군에서혈관폐색이일어나는시간이지연되는것은시험물질이항응고보다는항혈소판응집에더효과가있기때문으로생각되며, 농도의존성없이태극삼추출물을투여한모든시험군에서유사한혈관폐색지연과혈소판응집률을보이는것은특정임계값 (threshold) 를넘어서면혈행개선에효과가있기때문으로판단된다.

334 가. 시험방법 1) 항혈전활성시험시험물질마지막경구투여 45분후에 Isoflurane(Piramal, PA, USA) 로흡입마취하고목을절개하여경동맥을노출시킨다. 시험물질투여 60분후에 70% FeCl 3 를적신 2mm 2 의 Whatman No.1 filter paper를경동맥에올려놓고혈류측정기 (Omegawave, Tokyo, Japan) 를이용하여혈류를측정하였다. 10분후 Whatman filter paper를제거하고 30분동안 ( 총 40분 ) 혈류량을기록하였다. 처음혈류량의 10% 가되었을때를경동맥폐색이일어난것으로판단하였다. 2) 혈소판응집억제및혈액응고억제시험가 ) in vitro 혈액응고억제시험시험관에서시험물질의혈액응고억제효능을평가하기위하여 prothrombin time(pt) 과 plasma-activated partial thromboplastin time(aptt) 을자동혈액응고분석기 ACL100(Instrumentation Laboratory, Milano, Italy) 로측정하였다. 시험에사용된시료는액상형태의추출물로고형분의함량을알수없어시험에사용할수있는최대부피를최고농도로하여용량을설정하였다. 시험동물의복대정맥에서혈액 9ml 채취하고항응고제 3.8% Sodium citrate 1ml을처리하고 3,000rpm으로 10분간원심분리하여혈장을얻었다. 혈장과시료를섞어 37 에서 7분간 incubation하여혈장 50μl에 PT reagent(recombiplastin 2G, Instrumentation Laboratory) 100μl을섞어응고까지의시간을측정하였다. aptt 또한혈장과시료를섞어 37 에서 7분간 incubation하여혈장 50μl에 aptt reagent(synthasil, Instrumentation Laboratory) 53μl를첨가한후 CaCl 2 50μl를넣어응고까지의시간을측정하였다.

335 나 ) ex vivo (1) PRP 및 PPP 준비시험물질경구투여 1시간후에시험동물의복대정맥에서혈액 9ml을채취하고항응고제 3.8% Sodium citrate 1ml을처리하였다. 950rpm으로 10분간원심분리하여 platelet rich plasma(prp) 를분리하고, 3,000rpm으로 10분간원심분리하여 platelet poor plasma(ppp) 를얻었다. PRP는혈구계수기 (MELET SCHLOESING Laboratories, Osny, France) 를이용하여혈소판의수를계수하고 PPP로 /ml가되도록희석하였다. (2) 혈소판응집률측정혈소판응집은 Chrono-Log aggregometer(chrono-log, Havertown, USA) 를사용하여측정하였다. 정량된혈소판을 cuvette에넣고 37 에서 10분간 incubation한후 1200rpm으로교반하면서 baseline이안정화되면혈소판응집촉진물질인 adenosine diphosphate(ap) 와 Collagen을넣고반응하여 10분간응집률을측정하였다. (3) 혈액응고측정혈액응고에대한효과를평가하고자 prothrombin time(pt) 과 plasma-activated partial thromboplastin time(aptt) 을자동혈액응고분석기 ACL100(Instrumentation Laboratory, Milano, Italy) 로측정하였다. PPP를 37 에서 7분간 incubation 하여 50μl PPP와 PT reagent(recombiplastin 2G, Instrumentation Laboratory) 100μl을섞어응고까지의시간을측정하였다. aptt 또한혈장과시료를섞어 37 에서 7분간 incubation하여혈장 50μl에 aptt reagent(synthasil, Instrumentation Laboratory) 53 μl를첨가한후 CaCl 2 50μl를넣어응고까지의시간을측정하였다. 나. 자료의통계처리모든자료들은 SPSS program (SPSS INC,ver.21.0) 을이용하여통계해석을실시하였다. One-way analysis of variation(anova) 를실시하여유의성이관찰되면용매대조군 (vehicle) 과유의차가있는시험군을확인하기위해 Dunnett's t-test를실시하였다 ( 유의수준양측 5%).

336 2. 결과 가. 항혈전활성시험 1) 시험기간중체중 시험기간중용매대조군 (0) 과시험물질을투여한시험동물의체중은차이를보이지않았 다. Figure 246. Body weight of SD Rat on FeCl 3 -induced carotid artery thrombosis model. n=6 Table 69. Body weight of SD Rats on FeCl 3 -induced carotid artery thrombosis model. (g) Dose ( mg / kg ) Taegeuk ginseng concentrate Day ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 21.3 The values are mean±se, n=6

337 2) 항혈전활성시험 태극삼추출물을시험동물에 21일간경구투여후경동맥에 70% FeCl 3 를 10분간처리하여인위적으로혈전을유발하고시험물질이혈류의흐름에미치는영향을 40분동안평가하였다. 혈관폐색이일어나는기준은 FeCl 3 를처리하기전혈류량을기준으로 10% 이하가되는시간을기준으로하였다. 용매대조군 (0) 의혈관폐색이일어나는시간은 9.2±5.7 min이었고시험물질 10, 50, 500mg/kg 투여군에서는각각 37.5±6.2, 32.1±9.8, 35.4±7.1 min으로혈관폐색시간이지연되었으며통계적인유의성을보였다 (Figure 2, 3, Table 2). Figure 247. in vivo antithrombotic effect of Taegeuk ginseng concentrate The time to vessel occulusion are reported and the median times calculated. n=6, Significant difference from Vehicle(0) by Dunnet's t-test : ** p<0.01. Figure 248. Time-course of carotid arterial blood flow.

338 Table 70. (min) Dose ( mg / kg ) Occlusion time(min) in vivo antithrombotic effect of Taegeuk ginseng concentrate. Taegeuk ginseng concentrate ± ±6.2 ** 32.1±9.8 ** 35.4±7.1 ** The values are mean±se n=6, Significant difference from Vehicle(0) by Dunnet's t-test : ** 나. 혈소판응집억제및혈액응고억제시험 다. 1) 시험기간중체중 p<0.01. 시험기간중용매대조군 (0) 과시험물질을투여한시험동물의체중은차이를보이지않았 다. Figure 249. Body weight of SD Rats on platelet aggregation and blood coagulation. n=8

339 Table 71. Body weight of SD Rats on platelet aggregation and blood coagulation. (g) Dose ( mg / kg ) Taegeuk ginseng concentrate Day ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 22.1 The values are mean±se, n=8

340 2) 혈소판응집억제시험 태극삼추출물을시험동물에 28일간경구투여후채취한혈액에서혈소판을분리하여 agonist인 ADP와 Collagen으로반응하여혈소판응집률을 aggregometer로측정하였다. 용매대조군의 ADP에대한응집률은 55.5±3.7% 이고시험물질 10, 50, 500mg/kg 투여군투여군의응집률은53.9±3.6, 51.1±2.7, 51.6±2.4 % 로 50mg/kg 투여군에서통계적으로유의하게감소하였다. 용매대조군의 Collagen에대한응집률은 61.3±6.0% 이고시험물질 10, 50, 500mg / kg투여군의응집률은각각 52.8±6.9, 49.9±7.1, 50.5±4.5% 로모든시험물질투여군에서통계적으로유의하게감소하였다. Figure 250. ex vivo antiplatelet effect of Taegeuk ginseng concentrate. Platelet aggregation was induced by ADP(5μM) (A) and Collagen(5μg / ml ) (B). The aggregation rates of platelet are reported and the median calculated. Table 72. ex vivo antiplatelet effect of Taegeuk ginseng concentrate. (%) Dose ( mg / kg ) Taegeuk ginseng concentrate ADP 55.5 ± ± ± 2.7 * 51.6 ± 2.4 Collagen 61.3 ± ± 6.9 * 49.9 ± 7.1 ** 50.5 ± 4.5 **

341 3) 혈액응고억제시험 시험동물에서 PPP를분리하여태극삼추출물과반응시켜 prothrombin time(pt) 과 activated partial thromboplastin time(aptt) 를측정하였다. 모든농도군에서용매대조군 (0) 과차이를보이지않았다 (Table 5). 태극삼추출물을시험동물에 28일간경구투여후채취한혈액에서혈장을분리하여 prothrombin time(pt) 과 activated partial thromboplastin time(aptt) 를측정하여시험물질이혈액응고에미치는영향을평가하였다. 용매대조군의 PT는 9.7±0.7sec이고모든시험물질투여군에서유의성이없었다. aptt 또한용대조군과차이가없었다 (Figure, Table). Table 73. in vitro anticoagulation effect of Taegeuk ginseng concentrate. (sec) Dose (%) Taegeuk ginseng concentrate PT 9.5 ± ± ± ± 0.1 aptt 42.6 ± ± ± ± 5.9 n=2 Figure 251. ex vivo anticoagulation effect of Taegeuk ginseng concentrate. The coagulation times are reported and the median calculated. n=8. Table 74. ex vivo anticoagulation effect of Taegeuk ginseng concentrate. (sec) Dose ( mg / kg ) Taegeuk ginseng concentrate PT 9.7 ± ± ± ± 0.3 aptt 26.6 ± ± ± ± 1.6 The values are mean±se, n=8

342 3. 결론 태극삼추출물이혈행개선에도움이되는지확인하기위하여항혈전시험, 혈소판및혈액응고억제시험을수행하였다. 항혈전시험은시험동물의경동맥에 70% FeCl 3 를처리하여인위적으로혈전을유발하고혈전이형성되는시간은혈류를측정하여평가하였다. 용매대조군 ( 태극삼추출물 0mg / kg ) 에서혈전생성으로혈관폐색이일어나는시간은 9.2±5.7min이었고, 태극삼추출물 10mg / kg, 50mg / kg, 500mg / kg투여군에서혈관폐색이일어나는시간은각각 37.5±6.2, 32.1±9.8, 35.4±7.1min으로투여농도와상관없이용매대조군에비하여통계적으로유의하게지연되었다. 혈소판응고억제시험에서 ADP에의한혈소판의응집률은용매대조군에서 55.5±3.7% 이고시험물질 10, 50, 500mg/kg 투여군투여군의응집률은53.9±3.6, 51.1±2.7, 51.6±2.4 % 로 50mg/kg 투여군에서통계적으로유의하게감소하였다. 또한 collagen에의한응집률은용매대조군에서 61.3±6.0% 이고시험물질 10, 50, 500mg / kg투여군의응집률은각각 52.8±6.9, 49.9±7.1, 50.5±4.5% 로모든시험물질투여군에서통계적으로유의하게감소하였다. 혈액응고억제시험에서 PT 및 aptt는시험물질투여군과용매대조군이차이가없었다. 위결과로보아 FeCl 3 로혈전을유도하였을때태극삼추출물을투여한군에서혈관폐색이일어나는시간이지연되는것은시험물질이항응고보다는항혈소판응집에더효과가있기때문으로생각되며, 농도의존성없이태극삼추출물을투여한모든시험군에서유사한혈관폐색지연과혈소판응집률을보이는것은특정임계값 (threshold) 를넘어서면혈행개선에효과가있기때문으로판단된다.

343 8 절. 태극삼농축액의혈행개선개별인정형인정을 위한인체적용시험 혈행개선기능성을확보하기위한태극삼농축액의인체적용시험은동물시험결과가도 출되면 CRO 기관과협의하여추진하고자한다. 가 ) 태극삼농축액의혈행개선개별인정형인정 ( 기능성추가 ) 을위한인체적용시험 - 연구용역계약 : 경희대학교동서의학대학원의학영양학과임현정교수시험기관 : 경희대학교한방병원한의학임상시험센터 - 제목 : 건강한성인의태극삼추출물섭취가혈행개선에미치는유효성을평가하기위한인체적용시험 - 시험방법 : 혈소판응집억제효능, 혈액응고억제효능 - 분석 1차유효성평가 혈행관련검사 : 혈소판응집능, 프로트롬빈시간 (PT), 활성화부분트롬보플라스틴시간 (aptt), 트롬복산 B 2 (TxB 2 ), 트롬복산 A 2 (TxA 2 ), 세로토닌 (Serotonine), 혈액응고검사, 혈장피브리노겐, 혈소판수 (PLT) 2차유효성평가 지질관련검사 : 총콜레스테롤 (TC), 저밀도콜레스테롤 (LDL), 고밀도콜레스테롤 (HDL), 중성지방 (TG) - 고농도군, 저농도군, 위약군각 30명씩, 8주복용 나 ) 태극삼물추출농축액의분무건조및캅셀충진 인체적용시험에사용될시제품의제조와관련하여태극삼물추출농축액의 분무건조는다음과같이제조하였다. (1) 고농도군 - 태극삼농축액 100%(73Bx) 9 kg (2) 저농도군 - 태극삼농축액 100%(73Bx) 4.5 kg - 말토덱스트린 ( 씨제이제일제당, DEX150, DE16.7) 3.0 kg - Caramel 색소 {( 보락, Bolak) 덱스트린 73.3%, 카라멜색소 26.7%)} 28 g - 홍삼향 ( 식용, 한불화농, 허브향 LE1-0062) 20 ml - Bitter flavour( 식용, 81B015 Food grade, France) 54 ml (3) 위약군 - 말토덱스트린 ( 씨제이제일제당, DEX150, DE16.7) 6.0 kg

344 - Caramel 색소 {( 보락, Bolak) 덱스트린 73.3%, 카라멜색소 26.7%)} 56 g - 홍삼향 ( 식용, 한불화농, 허브향 LE1-0062) 40 ml - Bitter flavour( 식용, 81B015 Food grade, France) 108 ml 위의 3군을각각정제수를끓인후 80 정도로식혀서각성분을용해하고 50 정도를유지하면서분무건조한다. 이때분무건조기내의온도는약 120 정도이다. 각군의분무건조수율은고형분기준으로고농도군은 97.4%, 저농도군은 94.5%, 위약군은약 100% 이다. 이렇게제조된시제품분말을 400 mg 불투명적색캅셀에충진하였다 ( 표 24). 표 75. 인체적용시험관련시제품의성분함량 ( 성분함량 /1캅셀 400 mg 기준 ) * 붕해도시험 : 적합 (20분이내붕해되었음 ) - 포장방법 : 플라스틱병포장, 150 capsules/ 병, 204 병 (34 명 x 2 개월 x 3 시험구 ) - 복용방법 인체적용시험피험자는하루에 5 캅셀복용 (1일분무건조분말 2 g 복용기준, 400 mg x 5 캅셀 = 2 g): 아침에 2 캅셀, 저녁에 3 캅셀 * 시험제품제조완료 : IRB 심의 : IRB 승인 : 피험자가복용할시험제품전달 : ( 경희대학교한방병원한의학임상시험센터박소연 )

345 * 피험자가복용할시험제품의병라벨과피험자모집홍보물은다음과같다. 다 ) 국제임상시험 ( 진안홍삼연구소 ) 을위한시료의종류와배합비율은표 25와같다. 1) 진안홍삼연구소 : 수삼구입및홍삼, 태극삼, 흑삼제조후분쇄 2) 고려인삼제조 ( 주 ) : 홍삼, 태극삼, 흑삼분말및위약군각 20 kg 과립제조후스틱포장 (2.5 g/ 스틱 ), 60스틱포장용지함포장후진안홍삼연구소송부홍삼과립 : 2.5 g 스틱제품 8,640개, 60개스틱지함 144 box 태극삼과립 : 2.5 g 스틱제품 7,080개, 60개스틱지함 118 box 흑삼과립 : 2.5 g 스틱제품 8,520개, 60개스틱지함 142 box 위약과립 : 2.5 g 스틱제품 6,000개, 60개스틱지함 100 box 표 25. 위약제조원료배합비율 ž 혼합및용해 과립화 건조 사별 (20 30 mesh), 수분함량 10% 이하 * 흑삼및흑삼제품관련참고사항 [ 국내제품 ] - 식약처에서고려인삼연구 ( 주 ) 에서제조한흑삼제품인흑삼농축액과고려흑삼분말골드에대해서홍삼제품과같은기준규격및기능성 (1면역력증진에도움을줄수있음 2피로개선에도움을줄수있음 3혈소판응집억제를통한혈액흐름에도움을줄수있음 4기억력개선에도움을줄수있음 5항산화에도움을줄수있음 ) 을동일하게적용한다고하였고 ( ), 이와관련한공문이건강기능식품업체에발송하였고당업체에서도관련공문을접수하였다 ( 표 76).

346 표 76. 흑삼제품의품목제조신고관련기준규격 경인지방식품의약품안전청식품안전관리과 ( , 식품안전관리과 -3319) 수신 : 관내건강기능식품업체대표귀하제목 : 품목제조신고관련참고사항알림 1. 귀사의무궁한발전을기원합니다. 2. 건강기능식품의기준및규격적용 ( 흑삼사용 ) 과관련하여 인삼산업법 에서 흑삼 도넓은범위에서 홍삼 으로포함시킬수있다는관련부처의의견을반영하여 흑삼 을주원료로하여제조하는제품에대하여건강기능식품 ( 홍삼제품 ) 으로품목제조신고가가능함을알려드리니관련업무에참고하여주시기바랍니다. 끝 인삼산업법에서는가공방법에따라인삼류의종류는밭에서수확한후가공하지않은수삼, 수삼을햇볕열풍또는기타방법으로익히지아니하고건조한백삼, 수삼을물로익히거나그밖의방법으로익혀서건조한태극삼, 수삼을증기나그밖의방법으로쪄서익혀건조한홍삼, 수삼을증기나그밖의방법으로쪄서익혀건조한것으로서이과정을 3회이상반복하여제조한것을흑삼이라고분류하고있다.

347 건강기능식품법에서는백삼이나태극삼의기능성은면역력증진과피로개선만인정하는 반면홍삼은면역력증진, 피로개선, 항산화효과, 기억력개선, 혈소판응집억제효과에의 한혈액의흐름에도움을준다는기능성과여성갱년기장애개선을인정하고있다. 한편, 흑삼은건강기능식품법테두리에없었으나최근흑삼을주원료로하여제조하는 제품에대하여건강기능식품 ( 홍삼제품 ) 으로품목제조신고가가능하다고하였다 ( 식약처공 지사항 ). 따라서국내매출은물론국외에태극삼의홍보나판매를위해서는보다많은기능성을 확보하는것이최선이라고판단되어혈액의흐름에도움을줄수있다는기능성을확보하 기위해서동물시험을거쳐인체적용시험을실시하여기능성을추가하고자하였다. 피험자의인구학적정보는다음표 77 과같다. 표 77. 인구학적정보 1) Values are expressed as means ± SD. 2) No significant difference between among groups at P<0.05 by obtained from χ 2 tests for categorical variables or One-wayANOVAforcontinuousvariables.

348 사 ) 피험자의건강관련음주, 흡연및운동여부에관한정보는표 78 과같다. 표 78. 피험자의건강관련음주, 흡연및운동여부 1) Values are n (%) 2) Significantly different among the groups by χ2 tests for categorical variables *p<0.05. 아 ) 태극삼섭취가피험자의혈행개선유효성지표들의변화 시제품 ( 저농도, 고농도 ) 과위약을 8주간복용한지원자들의혈액을채취하여혈액의흐름에도움을줄수있다는지표로서 ADP 및 collagen으로유도한혈소판응집억제능과 PT, aptt와같은혈액응고에미치는영향을비교한결과는위의표 29와같다. ADP 및 collagen으로유도한혈소판응집억제능에있어서는위약군과시험군 ( 저, 고농도투약군 ) 간에차이가없는것으로나타났다. 혈소판응집을촉진하는 serotonin 함량은크게차이는없었으나고농도투약군에서는오히려약간증가하는경향이었고, thromboxane A2 함량은고농도군에서약간감소하는경향이었다. 혈소판응집을억제하는 PGI2 함량은위약군과시험군 ( 저, 고농도투약군 ) 모두증가하는경향이었으며저농도군에서가장많이증가하였다. 또혈액응고와관련된 fibrinogen 과 plasminogen 함량은군간에큰변화는보이지않았 으며, PT 나 aptt 에서도차이를보이지않았다. 이러한결과를종합하면태극삼물추출 물은혈소판응집과혈액응고기작에는별영향을미치지않는다고판단된다. 실제로태극삼에도여러가지 ginsenosides, ethylacetate 추출물, 석유에테르추출물, 산성다당체등이상당량존재하기때문에태극삼도혈소판응집억제력이홍삼보다는조금약하지만그활성을나타낼것으로기대하고시험을실시하였다. 이시험이전반적으로잘못기획되었는지, 액상제품이아닌태극삼물추출농축분말제품에문제가있었는지, 복

349 용량문제아니면인체적용시험시행기관에서의시험과정에서어떤문제가있었는지알 수가없지만안타까운결과가아닐수없다. 인삼에함유되어있는많은 ginsenosides들이혈액의흐름에도움을줄수있는기능이있다고보고하였다 (55). 혈소판응집억제작용은 ginsenoside-ro, Rb1, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1 등이, 항트롬빈작용은 ginsenoside-ro, Rg1, Rg2 등, 선용활성화작용은 ginsenoside-ro, Rg1, Rg2, Rh1, 혈관확장 ( 이완 ) 은 ginsenoside-ro, Rb1, Re, Rg1, Rg3, 항혈전작용은 ginsenoside-rg3은 thromboxane A 2 (TXA 2 ) 합성효소억제작용은 ginsenoside-rb2, prostacyclin(prostaglandin I2, PGI 2 ) 생성촉진작용은 ginsenoside -Rc가그기능을나타낸다고하였다. 그리고인삼성분은혈관확장작용에의한혈류순환개선, 동맥경화증발생억제, 혈관내피세포손상억제, 심근세포보호작용, 심기능강화작용, 적혈구변형능의개선에의한말초순환개선, 혈관평활근세포의증식억제등의효능을나타낸다고하였다. 그리고건강한성인남녀에게홍삼분말을급성경구투여 (3 g) 한후 6시간동안혈소판응집억제능을조사한바에의하면 ADP, epinephrine, collagen에의해유도된혈소판응집을억제하였다. 그리고 Ginsenoside-Ro, b1, b2, c, d, e, g1, g2를건강인혈소판풍부혈장을사용하여혈소판응집억제능을조사한결과 Ginsenoside-Ro는 collagen, Rg1 은 ADP 및 collagen, Rg2는 ADP에의해유도된혈소판응집을억제하였다. 또 Rg1은 arachidonic acid에의한혈소판응집을저해하였으며 Ca ionophore 응집을억제해서 ATP 방출을강하게억제하였다고하였다. 홍삼분획물이혈전에미치는영향을조사한결과항혈액응고작용과혈전용해촉진작용을동시에나타낸다고하였다 (56). 또 ginsenoside-rg1은 arachidonic acid, collagen, ADP, epinephrine 등에의해유도된혈소판응집을강하게억제하였으며이는 thromboxane A2 합성저해에의한결과라고보고하였다 (57). 한편, 동맥경화와혈전증에미치는인삼의영향에있어서 arachidonic acid를전구체로해서 TXA2 synthase에의해서강력한혈소판응집작용과혈관수축작용을나타내는 TXA2와 PGI2 synthase에의해서혈소판응집억제작용과혈관확장작용을나타내는 PGI2 의서로상반된두가지물질이만들어진다. 인삼중에함유되어있는 protppanaxatriol 계사포닌인 ginsenoside-rg1은갈력한혈소판응집억제능을나타내며, 또 protppanaxadiol계사포닌인 ginsenoside-rb1, Rb2, Rc, Rd는혈소판응집억제작용이없지만위액내에서 ginsenoside-rg3로전환되면 Rg1과거의같은혈소판응집억제작용이있다고알려져있다. 그중에서 ginsenoside-rc는혈관벽에존재하는 PGI2의생산을촉진하고, 배양혈관평활근세포의 PGI2 생산과배양혈관평활근세포의 cyclooxygenase 활성및 cyclooxygenase의 mrna 수준을높힌다고알려져있다 (58,59). Shin 등은 ginsenoside-ro 는 thrombin 으로유도된혈소판응집을농도의존적으로저 해하고그리고또 c-amp 의존적으로 vasodilator-stimulated phosphoprotein 을인산화

350 해서 Ⅱb/ 3 에 fibrinogen 의결합을약화시킨다고보고하였다 (60). 또홍삼으로부터 얻은 total saponin 은 vasodilator-stimulated phosphoprotein 을인산화해서 thrombin 으 로유도된혈소판응집을저해한다고하였다 (61). Rhee 등은인삼으로부터얻은 lipophilic fraction은 thrombin으로유도된혈소판응집을강하게저해하였으며, 또농도의존적으로 serotonin의방출을억제시켰다고하였고, 홍삼에서얻은비사포닌분획 ( 지용성분획 ) 이 thrombin으로유도된혈소판응집을강하게저해하였으며, protopanaxadiol 및 triol 분획은 adrenaline으로유도된혈소판응집에서 Thromboxa A2의생성을억제하고혈소판응집을억제하였다고하였다 (62 64). 또 Chang 등은돼지관상동맥에서 protopanaxatriol과 protopanaxadiol의혈관이완효과를조사한결과 acethylcholine에의한수축은농도의존적으로억제하였다고하였다 (65). 그리고이등은홍삼의소수성단백질분획이 cgmp 생성에석유에테르추출물과상승작용을하고석유에테르추출물과단백질분획이항혈소판응집작용을나타낸다고하였다 (66). 이등은 linoleic acid가다량함유된 corn oil과포화지방산이다량함유된 beeftallow 를 3주간쥐에게식이한후홍삼 petroleum ether 분획을 3주간식이시켜 thrombin 및 collagen으로유도된혈소판응집작용을조사한결과혈소판응집을강하게억제하였으며, 혈액응고의지표인 thrombin time도유의성있게연장되었다고하였다 (67). 김등은인삼성분이혈관내피세포에영향을미쳐혈관이완효과, 혈관수축억제및고콜레스테롤개선등의효과를나타낸다 (68). 이등은 ginsenoside Rg 3 의혈소판응집억제효과및그작용기전에대해서조사한결과 ginsenoside Rg 3 는 collagen과 thrombin으로유도된혈소판응집을강하게억제하였으며 Rg1이나 ginsenosides nonpolar fraction, ginsenosides polar fraction보다훨씬강하다고하였다. 그리고 ginsenoside Rg 3 의혈소판응집억제기전은세포내저장소로부터의 Ca2+ 의유리및외부 Ca2+ 유입을억제함으로서 TXA2 생성을억제하고과립분비를억제함에기인한다고하였다 (69). Serotonin 방출과관련해서는홍삼 6년근에서얻은 petroleum ether extract (X-compound) 는 platelet activating factor에의한 serotonin 방출을강하게억제하였으며 collagen과 thrombin에의해혈소판으로부터의 serotonin 방출도억제하였다. 이기능은 4년근의물추출물이나 petroleum ether extract보다강하다고보고하였다 (70). 홍삼제품류를 4 5년정도복용했을때에는혈전과동맥경화증을예방할수있다는증거로서 collagen에의한혈소판응집을억제하고그리고 aptt 도연장시키고 triglyceride에대한 HDH cholesterol ratio도유의성있게낮았다고보고하였다 (71). 또홍삼을염기성수용액으로추출하여 40.2% 의우론산을함유하는분자량약 177 kda 의산성다당체를분리하였으며, 이다당체는 thrombin 에의한 fibrinogen 의응고를

351 농도의존적으로저해하였고혈장을사용한실험에서내인성경로의혈액응고를저해하였다고하였다 (72). 그리고건강한성인 31명 ( 홍삼투여군 19명, 위약군 12명 ) 을대상으로홍삼 3 g을 1회투여한후지질대사와혈소판응집능에미치는영향을조사한결과, 홍삼투여군은 ADP, epinephrine, collagen으로유도된혈소판응집을유의하게억제하였다고하였다 (73). 한편, 건강한지원자에게홍삼농축액 ( 위약군, 저농도, 고농도군 ) 을 8주간복용시킨뒤 ADP, collagen에의한혈소판응집억제능을조사한결과홍삼복용군모두통계적으로유의하게개선되었다고하였다 (74). 홍삼산성다당체와관련된연구로서홍삼산성다당체는 thrombin과 collagen으로유도된혈소판응집을억제하였으며비사포닌성분인산성다당체가 thrombosis나 atherosclerosis와같은심혈관질환의예방효과에있어서중요한역할을할수있다고하였다 (75). NO 유리와관련해서는홍삼의총사포닌과 ginsenoside-rg3 혈관내피세포유래 nitric oxide(no) 를혈관내피세포로부터유리하여혈액의흐름을원활하게하고또혈소판응집을억제하여혈액순환개선에기여한다고하였다 (76). Panaxtriol은 Ca의수준과 phosphoinositide breakdown을감소시켜 thrombin에의한혈소판응집을저해함으로서혈소판응집이매개한혈전증질환에유익한효과를나타낼수있다고하였다 (77). 또홍삼으로부터얻은 panaxadiol은 thrombin에의해서유도된혈소판응집반응을강하게촉진하는 thromboxane A2의생성을저해하여항혈소판작용을나타낸다고하였다 (78). 한편 Wee 등은홍삼으로부터얻은 ethylacetate 분획은 thrombin time을연장시켜서 anticoagulant로서의역할을하며이는심장질환에효과적일수있다고하였다 (79). 또조직배양한산삼근에서얻은 ethlacetate 추출물이시험관실험에서전혈에서혈소판응집을억제하고쥐의말초혈액의흐름을증가가혈관에서혈소판응집과혈전혈성을저해할수도있다고하였다 (80). 그리고홍삼으로부터얻은 total saponin은 cyclooxygenase(cox-1) 와 thromboxane A2 synthase를억제하여 thromboxane A2의생성을저해함으로서혈소판이매개된혈전증질환에유용한전통생약재라고하였다 (81). 또홍삼물추출물이 arginase를저해하여 NO signaling을증가시킴으로서죽상동맥경화증과같은내피기능장애로생기는혈관질환에유용할것이라고하였다 (82). 그리고홍삼에서얻은 crude saponin 분획은 collagen으로유도된혈소판에서 Ca의동원을현저하게억제하여혈소판응집과 ATP 유리를강하게저해하기때문에비정상적인혈소판의기능을포함한심혈관기능장애의치료에유용할수있다고하였다 (83). 한편, 홍삼의비사포닌분획이 thrombin으로유도된혈소판응집을강하게저해하였으며혈소판내 camp 생성증가에도크게영향을미치지않았고 thromboxne A2의생성과 serotonin의방출도억제시켰다. 또비사포닌분획은혈소판막인지질로부터 arachidonic acid의방출을억제하지않았으며 arachidonic acid를 thromboxane A2로전환시키는경로를저해하여혈전증의치료및예방에중요한역할을할것이라고하였다 (84).

352 한편, Matsuda 등은홍삼과백삼의 70% 메탄올추출물이순환기계에미치는영향을조사한결과정상쥐와 serotonin이나 endotoxin 처리쥐에서저하된장기조직의혈류를증가시키며혈액응고를억제하고선용계의활성화작용을나타내었으며홍삼이백삼보다강하다고하였다 (86 88). 그리고또홍삼에존재하는 ginsenoside-rg3는혈관의평활근확장작용 ( 혈압저하 ), 혈관이완작용을하는 cgmp의분해억제작용, 혈액순환촉진작용 ( 혈류장애개선및혈액유동성향상 ), 혈소판응집억제작용등이있다고보고하였다. 표 79. 혈행개선유효성지표 ( 보정전 ) ADP, Adenosine diphosphate; PGI-2, Prostaglandin I2; TXA2, Thromboxane A2; PTT, Partial thromboplastin time; PT, Prothrombin time. 1) Values are adjusted mean ± SD for age, sex, dietary vitamin K intake (Baseline). 2) No significantly different among the groups by obtained using Bonferroni multiple comparison of ANCOVA. Significantly different from the baseline by paired t-test at p < 0.05.

353 자 ) 혈중지질지표들의변화 시험제품섭취전과후에혈중지질및콜레스테롤농도변화를비교한결과는위표 80과같다. 시험제품섭취전과후, 혈중 triglyceride, total cholesterol, LDL-cholesterol, HDL cholesterol의군간또는군내에차이는보이지않았다 (P>0.05). 또한, 나이와성별을보정한결과에서도식품섭취군간또는군내유의적인차이를보이지않았다 (P>0.05). 표 80. 혈중지질지표들의변화 ( 보정전 ) HDL, High density lipoprotein; LDL, Low density lipoprotein. 1) Values are adjusted mean ± SD for age, sex. 2) No significantly different among the groups by Duncan multiple comparison of ANOVA. 3) No significantly different from the baseline by paired t-test at p < 0.05.

354 사 ) 혈액학적및혈액화학적검사혈액학적및혈액화학적검사결과는표 90과같다. 식품섭취전과후, 세군간의유의한변화를보인지표는없었다 (P>0.05). 각지표의군내비교에서, 대조군의 RBC가유의적인증가를보였으나, 모두정상범위내에서의변화였다. 표 90. 혈액학적및혈액화학적검사 Variables Placebo L-TG H-TGF Baseline Week 8 Baseline Week 8 Baseline Week 8 p 2) AST, Aspartate aminotransferase; ALT, Alanine aminotransferase; BUN, Blood urea nitrogen; CRP, C - reactive protein. 1) Values are adjusted mean ± SD for age, sex. 2) White blood cell(10 3 /ul) 5.7± ±1.7 1) 5.3± ± ± ± Red blood cell (10 6 /ul) 4.7± ± ± ± ± ± Hemoglobin (g/dl) 14.2± ± ± ± ± ± Hematocrit (%) 42.9± ± ± ± ± ± AST (U/L) 20.9± ± ± ± ± ± ALT (U/L) 17.0± ± ± ± ± ± BUN (mg/dl) 12.7± ± ± ± ± ± Total protein (g/dl) 7.4± ± ± ± ± ± Albumin (g/dl) 4.6± ± ± ± ± ± Glucose (mg/dl) 85.1± ± ± ± ± ± CRP (mg/l) 0.9± ± ± ± ± ± No significantly different among the groups by Duncan multiple comparison of ANOVA. Significantly different from the baseline by paired t-test at p < 인체적용시험에서지원자들이복용한시제품은식품학적안전성측면에서아무런이상증 후를발견하지못했다.

355 6) 식의약처 건강기능식품 개별인정형 신청 시제품의 원료ㆍ성분 분석 결과 (붙임자료 참조, 분석기관 : 한국건강기능식품협회) 식의약처 건강기능식품 개별인정형 신청 시제품의 원료ㆍ성분 분석 결과는 그림 15와 표 32와 같다. 대장균은 음성이며, 열량은 Kcal/100g, 중금속과 ginsenosides 함량은 3lot 3반복 실험에 의한 평균값으로 표시하였다. 중금속 4종은 미량 수준으로 기준 규격에 적합하였으며 ginsenosides 함량은 10 mg/g 이상으로 나타났다. 그리고 30종의 잔류농약 함량을 조사한 결과 불검출 또는 0.02 ppm 이하 수준으로 모두 기준치 이하로 나타났다. 가. 성상 : 이미, 이취가 없고 고유의 향미가 있는 영한 황갈색의 내용물을 함유한 진한 빨간색의 경질 캡슐 그림 252. Lot별 시제품의 성상, 성분 분석 검사 성적서 표 91. 성분 함량 조사 결과 시험ㆍ검사항목 성상 대장균군 열량(Kcal/100g) T1 이미, 이취가 없고 고 유의 향미가 있는 연 한 황갈색의 내용물을 함유한 진한 빨간색 의 경질 캡슐 음성 시험ㆍ검사 결과(Lot 별) T2 T3 이미, 이취가 없고 고 이미, 이취가 없고 고 유의 향미가 있는 연 유의 향미가 있는 연 한 황갈색의 내용물을 한 황갈색의 내용물을 함유한 진한 빨간색 함유한 진한 빨간색 의 경질 캡슐 의 경질 캡슐

356

357 ㆍ γ ㆍ 7) 농가-기업체의상생방안농가-기업체의상생방안의일환으로태극삼, 흑삼제품제조에사용되는원료수삼의확보를지속적으로유지하기위하여강화인삼조합의황우덕씨의포지 ( 인천광역시강화군강화읍갑곶리 844-1, 277,900 m 2 ) 를사용할수있도록약정서를작성하였다 ( 그림 16). 그림 253. 황우덕씨의포지사용약정서

358 최종연구결과보고서 건강한성인의태극삼추출물섭취가혈행개선에미치는유효성을 과제명 평가하기위한인체적용시험 A clinical trial for the evaluation of the efficacy of blood circulation with Taegeuk ginseng extraction among healthy adults ~ 연구비 220,000 천원 연구기간 성명임현정전화번호 이메일주소 핸드폰 기관주소 (02447) 서울특별시동대문구경희대로 26 주관연구기관 책임연구원 ( 총괄책임자 ) 소속 / 부서 경희대학교동서의학대학원의학영양학과교수 경희대학교임상영양연구소소장 직위부교수전공임상영양학 이의주 ( 경희대학교한의과대학한의학과교수, 경희대학교한방병원사상체질과교수 ) 김미아 ( 경희대학교한방병원동서협진실임상전문교원 ) 정연형 ( 경희대학교동서의학대학원석사과정 ) 연구참여자 임효정 ( 경희대학교임상영양연구소연구원 ) 김기윤 ( 경희대학교임상영양연구소연구원 ) 유혜진 ( 경희대학교임상영양연구소연구원 ) 원윤선 ( 경희대학교한방병원사상체질과연구코디네이터 ) 김원숙 ( 경희대학교한방병원한의약임상시험센터과제연구원 ) 권형준 ( 경희대학교한방병원한의약임상시험센터임상관리약사 ) 본연구기관은붙임과같이최종보고서를제출합니다 년 6 월 28 일 경희대학교산학협력단장 ( 직인 ) 붙임 1. 최종결과보고서

359 목 차 인체적용시험계획서요약 3 1. 인체적용시험의명칭 5 2. 연구자및연구지원조직 5 3. 인체적용시험의뢰자및지원기관 6 4. 인체적용시험의배경및목적 6 5. 인체적용시험용식품 7 6. 시험기간 9 7. 대상자의선정기준, 제외기준및목표대상자수 9 8. 시험방법 검사항목및방법 시험중지및탈락기준, 분석제외기준 통계분석방법 통계분석결과 요약및결론 Reference 40 인체적용시험결과보고서요약 제목 건강한성인의태극삼추출물섭취가혈행개선에미치는유효성을평가하기위한인체적용시험 A clinical trial for the evaluation of the efficacy of blood circulation with Taegeuk ginseng extraction among healthy adults 인체적용 시험책임자 이의주 ( 경희대학교한의과대학한의학과교수, 경희대학교한방병원사상체질과교수 )

360 공동연구자 임현정 ( 경희대학교동서의학대학원의학영양학과교수, 경희대학교임상영양연구소소장 ) 김미아 ( 경희대학교한방병원교수, 동서협진실임상전문교원 ) 실시기관경희대학교한방병원한의약임상시험센터 ( 서울특별시동대문구경희대ㅁ로 23) 지원기관 최초지원기관 : 농림수산식품기술기획평가원 ( 경기도안양시동안구부림로 166) 의뢰기관 : 고려인삼제조 ( 경기도평택시청북면청오로 358) 기간 ( 첫연구대상자동의일 ) ~ ( 마지막연구대상자방문일 ) 대상자디자인목적방법대상자수분석항목통계분석방법 1) 만 20세이상 60세이하건강한성인 2) 본인체적용시험에참여할것을동의하고서면동의서에자의로서명한자 8주간, 무작위배정, 이중맹검, 위약대조인체적용시험건강한성인을대상으로 8주간태극삼추출물섭취가혈행개선에미치는영향에대해유효성을평가하고자함. 방문 1 에자의에의해연구대상자동의서에서명한지원자는대상자선정기준에적합여부를판정받음. 선정된대상자는방문 2 (0 주 ) 에순서에따라랜덤번호와함께대조군, 태극삼저함량섭취군, 태극삼고함량섭취군중한군으로무작위배정되어, 8 주간시험식품을섭취함. 방문 2 (0 주 ), 방문 3 (4 주 ) 및방문 4 (8 주 ) 에혈행관련유효성지표및안전성을평가하기위한지표를측정을실시하였음. 각군당 27명씩총81명이목표이고, 탈락률 (20%) 를고려하여선정기준에적합한연구대상자는군당 34명씩총 102명을등록함. 혈행관련유효성지표 : ADP 또는 collegen을이용한혈소판응집능검사, Serotonin, 프로트롬빈시간 (PT), 부분트롬보플라스틴시간 (PTT), Plasminogen, Fibrinogen, Thromboxane B 2, TormboxaneA 2, Plateletcount 지질관련유효성지표 : 중성지방 (TG), 총콜레스테롤 (TC), 저밀도콜레스테롤 (LDL), 고밀도콜레스테롤 (HDL) 생화학지표 : WBC, RBC, Hb, Hematocrit, BUN, Albumin, Glucose, CRP protein (hs) 안전성지표 : ALT, AST 인체적용시험계획서에따라일정수준이상으로순응하고, 시험을완료한대상자를대상으로분석을시행하였음. 범주형변수는 Chi-square test 분석함. 연속형변수에대해서는군간비교를위해서 one-way ANOVA로유효성검증을실시하였고, P-value가 0.05 미만일경우, Duncan multilple test로사후검정을실시함. 모든지표는전후비교를위해 Paired t-test를실시하였음.

361 공변량에의한보정이필요할경우, 공분산분석 (ANCOVA) 을실시하여유의 성을검정한후, Bonferroni 로사후검정을실시함. 만 20 세이상 60 세이하건강한성인모집 ( 각그룹당 34 명이상의대상자 확보, 최종평가예수이상의대상자 (27 명이상 ) 로분석함.) 세군간의인구학적특징 ( 성별비, 연령 ) 과신체계측지표 ( 키, 체중, BMI), 혈압에는차이가없었음 (Baseline). 건강관련습관에서음주, 운동여부에서유의적인차이가있으나성별을 구분하여분석시차이가없었음. 결론 혈행개선유효성지표분석결과, 시험전군간의차이가없으나연령, 성별, vit K섭취량보정후, 태극삼섭취군의 PGI-2 (pg/ml) 가유의적으로증가함. ( 저함량섭취군 :176.7±61.82 (pg/ml) 243.2±16.22 (pg/ml); 고함량섭취군181.1±77.22 (pg/ml) 234.3±16.52 (pg/ml)) 또한태극삼저함량섭취군에서 PT가 13.0초에서 13.2초로유의적으로증가함. 하지만 8주후군간의차이가없어의미가있다고할수없음. 혈행개선유효성지표의군간의변화량, 변화율에유의적인차이는없었음. 성별로층화분석한결과, 남성에서 8주후 ADP(U) 에서대조군이가장높았고, 태극삼군에서의차이는없었음. 여성의경우, 태극삼두군에서 PGI-2 (pg/ml) 가유의적으로증가함. 혈중지질농도, 혈액화학적검사, 식이섭취에는연구전후, 군간의유의적인차이가없었음. 1. 인체적용시험의명칭건강한성인의태극삼추출물섭취가혈행개선에미치는유효성을평가하기위한인체적용시험 A clinical trial for the evaluation of the efficacy of blood circulation with Taegeuk ginseng extraction among healthy adults. 2. 연구자및연구지원조직 2.1. 인체적용시험실시기관경희대학교한방병원한의약임상시험센터 ( 서울특별시동대문구경희대로 23)

362 2.2. 인체적용시험책임자 이의주 ( 경희대학교한의과대학한의학과교수, 경희대학교한방병원사상체질과교수 ) 2.3 인체적용시험공동연구자 임현정 ( 경희대학교동서의학대학원의학영양학과교수, 경희대학교임상영양연구소소장 ) 김미아 ( 경희대학교한방병원동서협진실임상전문교원 ) 2.4 인체적용시험연구담당자정연형 ( 경희대학교동서의학대학원석사 ) 임효정 ( 경희대학교임상영양연구소연구원 ) 김기윤 ( 경희대학교임상영양연구소연구원 ) 유혜진 ( 경희대학교임상영양연구소연구원 ) 원윤선 ( 경희대학교한방병원사상체질과연구코디네이터 ) 2.5 모니터링담당자 김원숙 ( 경희대학교한방병원한의약임상시험센터과제연구원 ) 2.6. 시험제품관리담당자 권형준 ( 경희대학교한방병원한의약임상시험센터임상관리약사 ) 3. 인체적용시험의뢰자및지원기관 3.1 최초지원기관 농림수산식품기술기획평가원 ( 경기도안양시동안구부림로 166) 3.2 의뢰기관및의뢰자 최태복 고려인삼제조 ( 경기도평택시청북면청오로 358)

363 4. 인체적용시험의목적및배경 4.1 목적본연구에서는건강한성인을대상으로태극삼추출물의섭취가혈행개선의기능성여부를평가하기위함이었다 4.2 배경 년사망원인 10 위안에혈액및혈관건강으로인한질병 ( 심장질환, 뇌혈관질환, 당뇨병, 고혈압성질환 ) 이절반을차지하고있다 ( 통계청 2013). - 현재고혈압, 이상지질혈증, 당뇨등은완치법이확립되어있지않은질환으로혈압, 혈중 지질, 혈당을조절하는것을가장중요한치료목표로하고있다. -해당질환의치료를위해약물복용법을사용하고있지만, 증상개선에어려움이있어식품소재에대한요구가증가하고있다. -인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 은오갈피나무과 (Araliaceae) 인삼속 (Panax) 에속하는다년생초본류로서, 건강기능식품공전에따라말리지아니한수삼, 수삼을햇볕 열풍또는기타방법으로익히지아니하고말린백삼, 수삼을물로익혀말린태극삼을포함하고있다. -태극삼은홍삼전매법시행으로인하여민간제조가허용되지않을때인삼을가공하던기술로 85 물에 30분간 ( 수삼내부조직의부분호화 ) 침지하고건조과정을통해제조하였다. -태극삼추출물의혈행개선의기능성에대한 in vivo 연구를통하여본소재의혈당조절기능성을확인한바있다. 따라서본연구에서는태극삼추출물의혈행개선기능성을인체적용연구를통해확인하고자하였다.