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민희 이
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1 당뇨병제 3 권제 6 호, 26 원저 다시마분말이 Streptozotocin (STZ) 으로유발된당뇨쥐의혈당과체중에미치는영향 서울대학교의과대학해부학교실및종양면역연구센터, ( 주 ) 엔토팜 1 김형우 강재승 김수인 1 이왕재 Effect of Sea Tangle Powder on the Regulation of Blood Glucose Level and Body Weight in Streptozotocin (STZ)-induced Diabetic Rats Hyung Woo Kim, Jae Seung Kang, Su In Kim 1, Wang Jae Lee Department of Anatomy and Tumor Immunity Medical Research Center, Seoul National University, College of Medicine and EntoPharm Co., Ltd 1 - Abstract - Background: Sea tangle is one of the low calorie diet and the fibers in sea tangle suppress the increase of blood glucose level. Therefore, it has a better impact than any other diets for diabetic patients. In the present study, we have investigated the effect of sea tangle powder, hereafter referred as, as an antihyperglycemic agent and antioxidant in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats. Methods: Male Wistar rats were divided into three groups: group 1) vehicle-treated normal rats; group 2) vehicle-treated STZ-diabetic rats; group 3) sea tangle powder-treated STZ-diabetic rats. Fasting blood glucose levels and body weights were measured. Intracellular ROS levels were measured using Cytofluor 235 plate reader. Results: Oral administration of sea tangle powder for 1 days resulted in lowered levels of blood glucose in early stage (within a week) and preventing effect of weight loss in late stage. Treatment with sea tangle powder resulted in the decrease of intracellular ROS levels in Dendritic Cell line. Conclusion: Sea tangle powder exhibits antihyperglycemic activity and restorative activity on weight loss in STZ-induced diabetic rats. It's abilities depend not on protecting disruption of β-cell, but on antioxidant effect in other organs. (J Kor Diabetes Assoc 3:459~465, 26) Key Words: Antioxidant, Diabetes mellitus, Sea tangle powder 서론당뇨병은내분비질환중가장흔한질병중하나로췌장의베타세포에서분비되는호르몬인인슐린 (insulin) 의절대량이부족하거나혹은생체내인슐린의효율이떨어진결과로인해혈중포도당의농도가증가되어나타나는질병이며, 그이환율은전세계적으로증가하는추세에있다 1,2). 일차성당뇨병의유형중, 제1형당뇨병은다갈, 다뇨, 식욕증가및체중감소등의증상이발현된다 1). 이러한증상은랑게르한스섬의베타세포가인슐린분비기능을정상적으로수행하지못하는데기인한다. 인슐린조절기전의손상은일차적으로고혈당을일으키게되고, 눈과신장, 심혈관계의병변등과같은당뇨병의전형적인증상들을유발하게된다 1). 제2형당뇨병은다량의활성산소와산화스트레스 접수일자 : 25 년 1 월 26 일, 통과일자 : 26 년 9 월 1 일, 책임저자 : 이왕재, 서울대학교의과대학해부학교실및종양면역연구센터

2 - 당뇨병제 3 권제 6 호, 26 - (oxidative stress) 에서기인하는다양한신진대사의감소와연관된질환이다 3). 자유산소라디칼 (free oxygen radical) 과산화스트레스 (oxidative stress) 는당뇨병의 2차합병증유발에중요한요소로작용한다. 고혈당은활성산소족 (reactive oxygen species) 를만들어내어, 지질의과산화와세포막의손상을초래하게된다 4). 당뇨병이유발된백서 (rat) 를사용한최근의연구에서혈장내의지질과산화도가상승되어있음이밝혀졌다 5). 이러한산화스트레스 (oxidative stress) 는당뇨병환자에게서신장질환을일으키는중요한요소이다 6). 다시마는당뇨병의증상완화및개선에있어서주목할만한효과가있는것으로인정 7,8) 되었으며민간에서는혈당조절목적으로다시마분말을복용하고있고추출액을사용한예도알려져있다. 그러나이에대한정확한기전은알려져있지않고, 다만다시마의항당뇨효과가항산화능에기인할것이라는가능성이제시되고있다 7-9). 본실험에서는주로췌장의베타세포를산화시켜파괴하는것으로알려져있는 streptozotocin (STZ) 을사용하여당뇨병을유발하였다 1). 그후 in vivo 실험을통하여다시마분말 <D> 가혈당과체중에미치는영향을알아보고, in vitro 실험을통하여서는정상세포에대한항산화능을알아보고자한다. 대상및방법다시마분말 <D> 의준비 : 경구투여를위하여증류수에다시마분말 <D> 를 6 mg/ml로녹여사용하였고, 활성산소족측정을위하여동일한농도로 PBS에녹인다음, 12 G 로원심분리한후, 상층액을얻어와트만지로거른다음,.45 um와.22 um 크기의 syringe filter로재차걸러사용하였다. 세포주및세포배양 : C57B6계생쥐 (mouse) 에서유래된수지상세포주 (Dendritic Cell line; DC-1) 를사용하였다. 배양액으로 1 units/ml 페니실린 (penicillin), 1 ug/ml 스트렙토마이신 (streptomycin) 그리고 1% fetal bovine serum이첨가된 RPMI 164을사용하였으며, 배양기속의 환경은 37, 5% 이산화탄소를유지하였다. 실험동물 : 15~18 g의웅성 (male) Wistar rat ( 샘타코, 경기도 ) 을구매하여, 물과고형사료 (SAM #31, 샘타코, 경기도 ) 를충분히공급하며 2주간실험실환경에적응시킨후실험에사용하였다. 당뇨병유발 : Streptozotocin (STZ, Sigma) 의복강주사로당뇨병을유발하였다..1 M의 citrate buffer를 ph 4.5로적정한다음, 133 mg/kg (2 mg/rat) 의분량으로 1회복강주사하였고, 정상군은동일한양의.1 M citrate buffer를복강주사하였다. 48시간후, 혈당을측정하여 2 mg/dl 가넘는쥐를당뇨병이유발되었다고생각하고실험에사용하였다. 실험군선정 : 정상군 (n = 3) 은.1 M의 citrate buffer를복강주사하고, 증류수 (D/W) 를하루 2회 (9:3, 18:) oral zonde를이용하여경구투여하였다. 당뇨병대조군 (n = 3) 은 STZ로당뇨병을유발시킨후, 증류수를하루 2회경구투여하였다. 실험군 (n = 3) 은 STZ로당뇨병을유발시킨후, 다시마분말 <D> (.6 mg/kg/day) 를하루 2회경구투여하였다. 다시마분말 <D> 의투여기간은 day 부터 day 1까지 11일간이었고, day 11부터실험종료시까지물과고형사료를충분히공급하면서관찰하였다 (Fig. 1). 혈당및체중측정 : 고형사료를치우고최소한 8시간이경과한후, 혈당측정기 (Surestep plus blood monitering system, USA) 를이용하여공복시혈당 (FBG, Fasting Blood Glucose) 을측정하였다. 공복시혈당은쥐꼬리동맥혈을이용하여매일오전 9시에측정하였다. 체중은고형사료와다시마분말 <D> 또는증류수를투여하기전간이저울 (Tanita, Japan) 을이용하여측정하였다. 활성산소측정 : 수지상세포주를 96 well plate에 cell/well로분주하고 37, 5% 이산화탄소를유지하며 4시간동안배양한다음, 5 um의 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA; Eastman kodak co., Rochester, NY) 를첨가하고 45분간배양하였다. 배양이끝난후, 배양액을씻어내고, PBS (2 ul/well) 또는희석된다시마분말 <D> 용액을첨가하였다. 다시마분말 <D> 용액은상기한방법으로만들어진것을 2배희석하여사용하였다. 활성산소족 Fig. 1. Schedule for Induction of Diabetes, oral Feeding of and measurement of Fasting blood glucose (FBG) and body weight (B.W)

3 - 이왕재외 3 인 : 다시마분말이 Streptozotocin (STZ) 으로유발된당뇨쥐의혈당과체중에미치는영향 - Table 1. 분말 <D> 의단백질, 지방, 탄수화물함유량과열량 수분 (%) 단백질 (%) 지방 (%) 탄수화물 (%) 열량 (Kcal) Table 2. 분말 <D> 의비타민함유량 (mg/1 g) C B1 B2 PP B-Karotin Table 3. 분말 <D> 의미량원소함유량 (mg/kg) Fe Zn Mg Ni J Se Table 4. 분말 <D> 의독성원소 (mg/kg) 및방사능 (bk/kg) 함유량 Cu Cd As Hg Pb Cesium 137 Strontium 의양은형광분석기 (Millipore, Bedford, MA) 를사용하여측정하였다 (excitation at 485 nm, emission at 53 nm) 11). 결과 1. 다시마분말 <D> 의성분분석본연구에서혈당조절효과를알아보기위하여사용된다시마분말형태의물질 <D> 를러시아에소재하고있는국가보건위생센터에의뢰하여독극성및방사능안정성여부와화학성분에대한분석을시행하였으며분석결과는 Table 1~4에제시한바와같다. 이상의사실들을근거로하여볼때, 다시마분말 <D> 는독성물질과방사능물질이안전지수를초과하지않으며또한성인의일일미량원소복용권장량에도부합되는식품으로서의가치가있다고할수있다. 2. 다시마분말 <D> 가당뇨병유발쥐의혈당에미치는영향다시마분말 <D> 가 STZ에의하여유발된당뇨병쥐의혈당에미치는영향을알아보기위하여공복시혈당을측정하였다. 다시마분말 <D> 의경구투여개시일을 일로하고, 24시간후, 첫공복시혈당측정일을 1일로하였다. STZ의복강주사 (-6일) 48시간후 (-4일), 공복시혈당이 2 mg/dl가넘는쥐를제1형당뇨병이유발되었다고판단하였다. 다시마분말 <D> 를경구투여한후, 2일에서 4일사이에공복시혈당이거의정상수준으로떨어지는것을알수있다. 각군에서 6일간의평균공복시혈당은정상군 89.5 mg/dl, 당뇨병대조군 36 mg/dl, 다시마분말 <D> 군은 mg/dl이었다 (Fig. 2). 그러나, 경구투여 7일이후에는경구투여를계속한경우에도 (7~1일) 유의한감소를보이지않았다. 또한경구투여를중지하여도 (11~3일) 공복시혈당이유의하게상승하거나, 감소하는경향은보이지않았다. 다시마분말 <D> 투여후 7일부터 3일까지의평균혈당은정상군 92.8 mg/dl, 당뇨병대조군 391 mg/dl, 다시마분말 <D> 군 mg/dl이었다 (Fig. 3). 3. 다시마분말 <D> 가당뇨병유발쥐의체중에미치는영향다시마분말 <D> 가당뇨병유발쥐의체중에미치는영향을알아보기위해공복시체중을측정하였다. 체중의변화량은다시마분말 <D> 의경구투여개시일 (1일) 을기준으로계산하였다. 다시마분말 <D> 투여후 1일까지는유의한체중변화를보이지않았지만, 다시마분말 <D> 의경구투여를중지한후, 계속되는관찰에서유의한수준의체중감소에대한억제효과가관찰되었다. 다시마분말 <D> 의경구투여후 1일째되는날, 정상군은 4 g이증가하였으나, 당뇨병대조군은변화가없었고, 다시마분말 <D> 군은평균 3 g 증가하여유의한차이를보이지않았다. 같은조건으로다루어진다른개체에서도동일한추세를확인하였다 (data not shown). 그러나, 계속되는관찰에서유의한수준의체중감소에대한억제가관찰되었는데, 18일째다시마분말 <D> 군의체중감소율은당뇨병대조군에비하여각각 13.% 와 36.4%, 3일째에는 14.9% 와 5.% 억제효과를보였다 (Fig. 4)

4 - 당뇨병제 3 권제 6 호, FBG (mg/dl) DATE Normal DM Control Fig. 2. Effect of on blood glucose levels in early stage. Normal, vehicle-treated rat; DM Control, vehicle-treated STZ-diabetic rat;, -treated STZ-diabetic rats. FBG (mg/dl) DATE Normal DM Control Fig. 3. Effect of on blood glucose levels in late stage. Normal, vehicle-treated rat; DM Control, vehicle-treated STZ-diabetic rat;, -treated STZ-diabetic rats. 4. 다시마분말 <D> 의항산화효과다시마분말 <D> 가정상세포내에서항산화능이있는지알아보기위하여, ROS-sensitive probe인 DCFH-DA를사용하여 ROS level를측정하였다. 다시마분말 <D> 는정상세포내의 ROS level을시간에따라유의하게감소시켰다. ROS level은다시마분말 <D> 투여 6분이후부터유의한수준으로감소시켰는데, Control과비교하여 6분에는 23.4%, 9분에는 28.9%, 12분에는 3.% 가감소하였다 (Fig. 5). 고찰본연구를통하여다시마분말 <D> 는정상세포내에서항산화능을가지며, 당뇨병초기의고혈당은효과적으로조절할수있으나, 췌장의베타세포가완전히파괴되어제1형당뇨병으로발전한이후에는혈당을조절할수없음을알 수있었다. 그러나, 제1형당뇨병이확립된이후에도체중감소를억제시키는기능이있음을알수있었다. 각종천연물에서추출한성분중, 항고혈당능또는항고지혈능을갖는물질이항산화능을동시에갖는경우가알려져있고, 약용식물추출물인 Hyponidd의항고혈당능은프리라디칼을제거하고, 내재적항산화제들이파괴되는것을막아주는기전에의한다는사실이알려져있다 4,12,13). 또한, 비타민 C와코발트를이용한최근의연구에서항산화제가효과적으로고혈당을조절하였으나, 신장의변형된방어체계는완벽하게회복시키지못한다는것이밝혀졌다 14). 다시마분말 <D> 는당뇨병유발초기의고혈당은효과적으로조절하였지만, 계속되는관찰에서항고혈당능을발휘하지는못하였다. 이는다시마분말 <D> 투여와관계없이, STZ에의하여베타세포가파괴되어제1형당뇨병이형성되었음을의미한다. 이러한사실들을바탕으로, 다시마분말 <D> 의항고혈당능은췌장의베타세포파괴를방지하는기능에기인

5 - 이왕재외 3 인 : 다시마분말이 Streptozotocin (STZ) 으로유발된당뇨쥐의혈당과체중에미치는영향 Change of body weight (g) Normal DM control DATE Fig. 4. Effect of on body weight loss in diabetic rats. Normal, vehicle-treated rat; DM Control, vehicle-treated STZ-diabetic rat;, -treated STZ-diabetic rats. 1.4 Relative fluorescence Time (min) Negative control Control Fig. 5. Effect of on intracellular ROS levels in normal cells. Negative control, Cell only; Control, Cell + 5 μm DCTH-DA; treated Cell + 5 μm DCTH-DA+ (1 : 2 dilution). Results are representative of three experiments. 하는것이아니라, Hyponidd나비타민 C처럼항산화효과에기인한다는것을알수있다. 또한항산화능이있는 R-(+)-α-lipoic acid (R-ALA) 를사용한최근의연구에서적절한운동과항산화제가인슐린의기능을향상시켜혈당에대한저항성을높이는것이보고되었다 15). 이러한내용으로볼때, 다시마분말 <D> 의혈당조절에는다른항산화제들과유사한혈당에대한전신적저항성과관련된다른기전이있을가능성은매우높다. STZ를복강주사하여당뇨병을유발시키면고혈당, 다뇨, 단백뇨와체중감소를보인다. 시간이지나면여러가지복합적요인에의하여신장이제기능을하지못하게되므로크레아티닌과요소의제거기능이떨어지게되고, 산화적스트레스가현저하게증가하게된다 16). 다시마분말 <D> 의경구투여후, 계속된관찰에서점진적으로체중감소가억제되는것이관찰되었는데, 이때의혈당은당뇨병대조군과 유의할만한차이가없었다. 최근연구에서비타민 C와 desferrioxamine이신장사구체내에서 superoxide anion의생성을억제하고, 이어 PGE2의생성을억제하는것이알려졌다 17). 따라서다시마분말 <D> 의체중감소억제효과도이와유사한항산화능에의한신장손상방지에기인한것이라생각된다. 또한, 혈장내의지질과산화도를낮추거나내피세포보호하는등의항산화효과를통해혈관손상을방지하고, 그결과이차적으로신장의손상을방지한다는가정도배제할수없다 18). 본연구에서당뇨병유발초기에체중감소억제효과가없는것으로나타난것은체중변화의속도가느리고그폭이작기때문으로생각된다. 다시마분말 <D> 투여 7일째, 정상군은 25 g의체중증가를보였고, 당뇨병대조군은첫째날과동일하였으므로비록 3 g의증가이지만, 다시마추출분말 <D> 군이대조군에비해 12% 의체중감소억제효

6 - 당뇨병제 3 권제 6 호, 26 - 과를보인다고말할수있다. 이러한체중감소억제효과는 18일에 24.7%, 3일에 32.5% 로시간이지남에따라점점증가하였다. 체중감소억제효과의또다른요인인식이량에있어서는각군간의유의할만한차이는없었고, 일일음수량은당뇨병대조군에서정상군이나실험군에비해많았다 (data not shown). 본연구에서다시마분말 <D> 는정상세포에대한항산화능을가지고있으며, 당뇨병이유발된쥐에서항고혈당능과체중감소를억제하는능력을갖지만, 그것은췌장의 β-세포파괴를방지하는데에기인하는것이아니라다시마분말 <D> 가가진항산화능에기인한다는사실을밝혔다. 아울러다시마분말 <D> 는항산화능을가진새로운대체물질로서의가능성을가지고있으며당뇨병성신증뿐만아니라, 심혈관계질환, 망막질환에이르기까지광범위하게그효과를검증해보아야할것으로사료된다. 따라서, 다시마분말 <D> 는식품보조제로서권장할만하며기존의다시마가가지고있는혈당조절기능을바탕으로하여볼때혈당조절과관련된다시마분말 <D> 의효능에관한연구도가치가있을것으로사료된다. 요약연구배경 : 다시마는저칼로리식품으로다시마의섬유질성분은혈당조절효과가있는것으로알려져있다. 따라서본연구에서는본연구진이직접분리한다시마분말 <D> 를이용하여 streptozotocin에의해서당뇨병이유발된백서에서의혈당조절효과에대해서알아봄으로써당뇨병환자의효과적혈당조절보조인자로서의사용가능성에대해서알아보고자하였다. 연구방법 : 백서를각군당 3마리씩 1) 용매만을투여하는대조군, 2) 용매만을투여하는당뇨병유발군, 3) 다시말분말 <D> 를투여하는당뇨병유발군의세군으로나눈다음일정기간동안의공복시혈당을측정하였다. 이와함께혈당조절과관련한다시마분말 <D> 의항산화제로서의효능을알아보기위하여세포내유해산소활성기의생성정도및수준을형광분석기를이용하여분석하였다. 연구결과 : Streptozotocin을이용하여당뇨병을유발시킨후다시마분말 <D> 를경구투여한백서군에서초기 (7일이내 ) 혈당상승의억제효과를관찰하였다. 또한동일백서를장기간관찰한결과, 당뇨병에동반되는체중감소현상의억제가확인되었다. 다시마분말 <D> 를처리한세포에서세포내유해산소반응기의생성이현저하게억제됨을확인하였다. 결론 : 본연구진이순수분리한다시마분말 <D> 는 streptozotocin에의해서유발된당뇨병모델에서혈당의상승을억제하고체중감소를방지하는효능이있는데, 그러한 기능은다시마분말 <D> 가가진항산화능에기인한다. 감사의글본연구는서울특별시지원전략산업혁신클러스터육성사업의연구비지원으로수행되었습니다. 참고문헌 1. Kurt J. lsselbacher, Eugene Braunwald, Jean D. Wilson, Joseph B. Martin, Anthony S. Fauci, Dennis L. Kasper: Harrison TR. Principles of Internal Medicine, Diabetes Mellitus , 215, , Beckman JA, Creager MA, Libby P: Diabetes and atherosclerosis: epidemiology, pathophysiology, and management. JAMA 287;257-81, Hayden MR, Tyagi SC, Kerklo MM, Nicolls MR: Related Articles: Type 2 diabetes mellitus as a conformational disease. JOP. 6;287-32, Babu PS, Stanely Mainzen Prince P: Antihyperglycaemic and antioxidant effect of hyponidd, an ayurvedic herbomineral formulation in streptozotocin-induced diabetic rats. J Pharm Pharmacol. 56; , Kamalakkannan N, Stanely Mainzen Prince P: Effect of Aegle marmelos Correa. (Bael) fruit extract on tissue antioxidants in streptozotocin diabetic rats. Indian J Exp Biol. 41;1285-8, Kopyt NP: Slowing progression along the renal disease continuum. J Am Osteopath Assoc. 15;27-15, Lee KS, Choi YS, Seo JS: Sea tangle supplementation lowers blood glucose and supports antioxidant systems in streptozotocin-induced diabetic rats. J Med Food. 7: 조영자, 방미애 : Streptozotocin-유발당뇨쥐에서다시마추출물첨가식이의항당뇨및항산화효과. 한국영양학회지. 37: 김대경, 이호, 김진숙, 용철순, 김정애, 허근 : 스트렙토조토신으로유도된흰쥐의당뇨성간에서산화적스트레스및크산친옥시다제의활성에대한다시마 (Laminaria japonica) 의예방효과. 영남대학교연구업적집. 14: Rakieten N, Rakieten ML, Nadkarni MV: Studies on the diabetogenic actions of streptozotocin. Cancer

7 - 이왕재외 3 인 : 다시마분말이 Streptozotocin (STZ) 으로유발된당뇨쥐의혈당과체중에미치는영향 - Chemother Rep 29:91-8, Cho D, Hahm E, Kang JS, Kim YI, Yang Y, Park JH, Kim D, Kim S, Kim YS, Hur D, Park H, Pang S, Hwang YI, Lee WJ: Vitamin C downregulates interleukin-18 production by increasing reactive oxygen intermediate and mitogen-activated protein kinase signalling in B16F1 murine melanoma cells. Melanoma Res. 13;549-54, Luo Q, Cai Y, Yan J, Sun M, Corke H: Hypoglycemic and hypolipidemic effects and antioxidant activity of fruit extracts from Lycium barbarum. Life Sci. 76;137-49, de Sousa E, Zanatta L, Seifriz I, Creczynski-Pasa TB, Pizzolatti MG, Szpoganicz B, Silva FR: Hypoglycemic effect and antioxidant potential of kaempferol -3,7 -O-(alpha)-dirhamnoside from Bauhinia forficata leaves. J Nat Prod. 67;829-32, Yildirim O, Buyukbingol Z: In vivo effect of vitamin C with cobalt on oxidative stress in experimental diabetic rat kidney. Diabetes Nutr Metab. 16;28-13, Saengsirisuwan V, Perez FR, Kinnick TR, Henriksen EJ: Effects of exercise training and antioxidant R-ALA on glucose transport in insulin-sensitive rat skeletal muscle. J Appl Physiol. 92;5-8, Sharma S, Anjaneyulu M, Kulkarni SK, Chopra K: Resveratrol, a Polyphenolic Phytoalexin, Attenuates Diabetic Nephropathy in Rats. Pharmacology. 76;69-75, Iino K, Iwase M, Sonoki K, Yoshinari M, Iida M: Combination treatment of vitamin C and desferrioxamine suppresses glomerular superoxide and prostaglandin E production in diabetic rats. Diabetes Obes Metab. 7;16-9, Serbecic N, Beutelspacher SC: Anti-oxidative vitamins prevent lipid-peroxidation and apoptosis in corneal endothelial cells. Cell Tissue Res. 32:465-75,

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee University College of Medicine & Hospital E mail : ycell2@yahoo.co.kr Abstract