제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 친환경자재를이용한꽃매미방제체계확립 의보고서로제출합니다 년 7 월일 주관연구기관명 : ( 주 ) 두애니 주관연구책임자 : 문선주 세부연구책임자 : 문선주 연 구 원 : 윤태호정장희김윤경 협동연구기관명 : 충북대학교 협동연

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1 발간등록번호 친환경자재를이용한꽃매미방제체계확립 (Establishmentoftheeco-friendlycontrolsystem of Lycormadelicatulausingagriculturalmaterials) ( 주 ) 두애니 농림수산식품부

2 제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 친환경자재를이용한꽃매미방제체계확립 의보고서로제출합니다 년 7 월일 주관연구기관명 : ( 주 ) 두애니 주관연구책임자 : 문선주 세부연구책임자 : 문선주 연 구 원 : 윤태호정장희김윤경 협동연구기관명 : 충북대학교 협동연구책임자 : 김길하 연 구 원 : 구현나김현경박영욱안정진 - 1 -

3 요약문 Ⅰ. 제목 친환경자재를이용한꽃매미의방제체계확립 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 1. 연구개발의목적 꽃매미의밀도증가에따른확산및피해를막기위한친환경적인방제대책으로첫째농약을대체할수있는친환경살충물질을탐색하여제품화하고, 둘째, 꽃매미의생태, 생리적인특성을이용한유인물질을탐색하여살충유인트랩을개발하고이를제품화하여, 셋째, 제품을활용한꽃매미의종합적인방제기술을수립하여농가에보급하는것이다. 2. 연구개발의필요성 가. 전국적으로꽃매미의발생밀도가증가 노린재목 (Hemiptera) 꽃매미과 (Fulgoridae) 에속하는꽃매미 (Lycorma delicatula) 는몇년전만해도사람들에게잘알려지지않은곤충이었는데, 2004년꽃매미가천안에서채집되어보고되었고, 2006년에대발생하면서그후해마다밀도가증가하면서전국적으로발생하여피해를주고있다. 나. 꽃매미의피해증가 꽃매미의기주식물로는가죽나무, 참죽나무, 소태나무, 미국담쟁이덩굴, 머루, 포도나무등목본 38종과초본 3종등 41종이알려져있는데, 임야, 과원등에서발견되며특히포도, 매실, 자두, 키위나무등의잎, 어린가지수액을흡즙하여나무수세저하로피해를주고배설물에의한그을음증상으로수확기상품가치를저하시킨다. 특히포도에대한피해가증가하고있는데 2009년도에는 21개시, 군으로확산되어전체포도재배면적의 15% 정도 (2,946ha) 에서발생하여피해를주고있고있으며매년급격히피해가증가하고있는실정이다. 다. 꽃매미에대한연구부족 최근꽃매미의대발생으로피해가잇달아보도되고특히농작물의경우주로포도농가 에서피해가속출함에따라이에대한방제가시급한상황이다. 이런꽃매미가대발생하게된 - 3 -

4 이유로기후변화와천적의부재로추측하고있지만, 꽃매미에대한연구가아직은미흡한실정 이다. 라. 꽃매미에대한방제법으로농약에의존 2009 년 6 월경농촌진흥청에서꽃매미종합방제대책으로월동전산란처알덩어리를 제거하거나약충이부화하는시기에등록된농약을살포하도록하고있다. 따라서, 꽃매미의방제대책수립이필요한시점이며화학농약이아닌친환경적인방제에 관한연구개발이요구되고있는상황에서본연구에서는꽃매미의친환경적인방제체계를확 립하고자한다. Ⅲ. 연구개발내용및범위 1. 연구개발내용 가. 친환경살충물질탐색및제품화 (1) 친환경살충물질및유기농자재선발 (2) 초기방제가가능한살란물질개발 (3) 친환경살충물질제품화 나. 꽃매미의유인물질탐색및트랩개발 (1) 유인물질탐색및물질분석 (2) 선발물질로살충유인트랩개발 다. 종합적인친환경방제기술개발 (1) 친환경살충물질을이용한방제기술연구 (2) 유인트랩을이용한방제기술연구 (3) 종합적인방제기술확립 (4) 현장적용기술확립 2. 연구범위 가. 주관연구기관 (( 주 ) 두애니 ) : 꽃매미의친환경방제기술의실용화 (1) 친환경살충물질탐색및제제연구 - 4 -

5 (2) 친환경살충물질의친환경유기농자재목록공시로제품화 (3) 꽃매미유인물질을이용한트랩제작 (4) 실제피해농가에서의약효검정을통한현장적용기술확립 나. 협동연구기관 ( 충북대 ) : 꽃매미의친환경방제기술의개발 (1) 친환경살충물질의꽃매미에대한살충활성검정및살충물질분석 (2) 친환경살충제품의현장약효평가를통한적용기술개발 (3) 꽃매미유인물질탐색및물질분석 (4) 꽃매미유인트랩의현장약효평가를통한적용기술개발 Ⅳ. 연구개발결과 1. 살란물질탐색을위한선행연구결과 살란물질탐색을위하여꽃매미 (Lycorma delicatula) 알을충북대학교주변과청주용암 동포도단지내에서채집하여실내로옮긴후, 온도 25±1, 상대습도 50 60%, 광주기 16L : 8D 조건에서유지하면서약제시험과부화율조사에사용하였다. 알의부화율에서 2010년 4월 20일에채집한알의부화율은 93.2% 로채집후부화까지기간이 14.8일이었으나, 2010년 5월까지약한달간격으로채집한알의부화율은 2010년 5 월에채집한알이 94.5%, 94.2% 로점점높아졌으며, 채집후부화까지기간도 2010년 5월채집알이 12.5, 4.6일로, 채집날짜가늦어질수록부화율은높아졌고, 부화까지기간도짧아졌다. 살란약제시험에서시판되고있는 26종의살충제를추천농도로희석하여채집한알에분무처리했을때알에대한약제감수성은유기인계의 chlorpyrifos가알에대해서 100% 로높은살란효과를나타냈지만 chlorpyrifos를제외한나머지 25종약제는알에효과가낮거나없었다. 2. 친환경살충물질탐색및제품화 가. 살충물질탐색및시제품제작 꽃매미에대한친환경살충물질은한약제 13 종추출물과식물추출물 10 종을살충효과 검정하여선발하였고, 선발된살충물질을제품화하기위하여제제연구, 살충물질분석, 약효, 약해및독성시험을수행하였다. 한약제 13 종에서는포공영추출물이살충률 53.3% 로가장살충효과가높았으며, 식물 추출물은데리스추출물이살충율이 61.6% 로가장살충효과가높았다. 또한이들식물추출물의 - 5 -

6 혼합조성물중에서데리스와멀구슬나무를혼합한조성물 (GTN 10-46) 이 91% 의살충율을보 여꽃매미에대한살충효과가높은것으로조사되었다. 꽃매미에대한살충효과가가장높은조성물 (GTN 10-46) 과목초액, 주정알콜을혼합 하여시제품을제조하였다. 나. 제품화 시제품의유효성분분석은멀구슬추출물의 toosendanin 과데리스추출물의 rotenone 을 HPLC 로정성, 정량분석하였다. 야외포장에서시제품의꽃매미에대한방제효과시험에서 76.1% 의방제가를보였으며 포도외 5 종에대한약해시험에서약해는없었다. 시제품의독성은급성경구독성 IV( 저독성 ), 급성경피독성 IV( 저독성 ), 피부자극성자극 지수 0.0, 안점막자극성급성안자극지수 7.3, 어독성 III 급, 꿀벌급성접촉독성 0.54ug/bee 로안전성을확보하였다. 시제품의 245 종농약에대한잔류성분을분석한결과잔류성분이검출되지않았다. 제품화하였다. 상기의연구결과를토대로시제품을유기농업자재로신청하여 깍지엔 이라는상표로 다. 살란물질개발 꽃매미의난괴에처리할수있는물질을개발하고자난괴에도포하여부화를하지못하도록하는점착액을제조하였다. 점착액은유인물질인 spearmint oil, 천연고무, 폴리부텐 (polybutene), 수소첨가공중합체 (Hydrogenated copolymer), 디시클로펜타디엔 (Dicyclopentadiene) 수첨수지및사이클로헥산 (Cyclohexane) 을혼합하여제조하였고, 이점착액을꽃매미난괴에도포하여부화율을조사한결과, 100% 로부화억제효과가있었다. 3. 제품생산공정구축및생산 제품생산을위한원료의안정적수급을위하여멀구슬나무추출물과데리스추출물을제조 하는중국에위치한제조회사에서공급받기로하였다. 제품의생산공정은수입한멀구슬나무추출물과데리스추출물을혼합기에넣고에탄올과 목초액을차례로투입하여혼합한후플라스틱병에주입하여 깍지엔 제품을생산하였다. 깍지엔제품의꽃매미에대한현장적용시험에서 67.7% 의방제가를보였으며, 포도에대한 - 6 -

7 약해는없었다. 4. 꽃매미유인물질탐색및물질분석 가. 식물정유에대한유인물질탐색및물질분석 꽃매미에대해서유인효과를나타내는물질을선발하기위해먼저 4령약충을대상으로 10종식물정유 (Black pepper, Caraway, Cadamone, Cinamon bark, Coriander, Eucalyptus, Neem, Pine needle, Sage, Spearmint) 를 5μl처리하여실험하였다. 그결과 spearmint oil이 94.1% 로가장높은유인율을나타내었으며그외식물정유들은 30.8% 53.3% 로유인율이낮거나유의성이없었다. 또한 spearmint oil은 4령약충과성충에서유인효과가높았으며, 2 3 령약충은비교적유인효과가낮았다. Spearmint oil 의유인활성물질을탐색하기위해서각성분의함량과조성에따라처리 량을달리하여유인효과를검정하였다. 그결과, carvone 만이유인효과를나타내었고 limonene 은유의성이없었다. Spearmint oil 에대한꽃매미의후각반응과안테나의전기생리반응을통해 spearmint oil 의유인활성물질은 carvone 임을알수있었다. Spearmint oil을가지고야외에서유인효과를검정한결과, 약충의경우 spearmint oil 을 20μl, 30μl처리했을때 A와 B장소에서 15일차까지모두유의성을나타내었으나, 10μl처리시에는두장소모두유의성이없었다. 성충의경우 30μl와 10μl처리시, 장소에따라유인효과가큰차이를보였다. 하지만 20μl처리시 A와 B장소모두 15일차까지높은유의성을나타내었다. 나. 가죽나무에대한유인탐색및물질분석 가죽나무조추출물및분획물, 그리고각 fraction에대해꽃매미의 olfactometer를이용한후각계반응을관찰한결과기죽나무 MeOH 조추출물에대하여 72.2% 의유인율을보였고, 4가지분획물에대해서는 hexane 83.3%, chloroform 80.0%, ethyl-acetate 55.5% 그리고 water 66.7% 로 haxane 층에서활성이가장높았다. LPPE 로 haxane 층에서분리된 F1~F5 에대하여유인반응을검정한결과 F2 에서 75.0% 로가장높은유인력을나타냈고, F2 를다시분리한 F21~25 에서는 F24 에서 77.8% 의 높은유인율을보였다. F24 의 GC 분석결과에서 retention time 645s 에나타난 peak 에대해안테나반응을 나타냈고, 물질을동정한결과 C 20 H 40 O 의 phytol 과동일물질임을확인할수있었다

8 5. 꽃매미기피물질탐색과물질분석 꽃매미에대한기피효과를나타내는식물정유를선발하기위하여 4 령약충을대상으로 10 종오일을 5ul 씩처리하여검정한결과 lavender oil 만이 80% 의기피효과를나타냈을뿐그 외식물정유들은기피효과가없었다. Lavender oil의기피활성물질을탐색하기위해서 GC로분석하고각구성성분의함량과조성에따라처리량을달리하여기피효과를검정한결과 linalool 만이기피효과를나타내었다. Lavender oil의꽃매미각령기별약충과암컷성충안테나의전기생리반응을살펴본결과약충과암컷성충의안테나는 10% 농도의 lavender oil에서반응하였으며, 그구성성분중 linalool에반응하는것을확인하였다. Lavender oil 의야외에서의기피효과검정을약충시기와성충시기를나누어시험한결과 약충의경우 lavender oil 을각각 20ul, 30ul 처리했을때기피효과를나타내었고, 성충의경우 30ul 처리량에서기피효과가우수하였다. 6. 유인트랩시제품제작 유인트랩색깔선발시험에서흰색, 노란색, 초록색, 파랑색중파랑색에가장유인이많이 되었지만트랩색깔에따른유인효과에는큰차이가없는것으로조사되었고, 야간빛에의한 유인효과를시험한결과형광색이노란색보다유의성있게꽃매미 2 령약충을유인하였다. 유인트랩의형태선발시험에서기존시중에판매하는 sticky trap, 델타트랩, 원형트랩, 윙트랩을구입하여꽃매미유인수를조사하였으나 sticky trap 을제외한트랩에서는꽃매미가 유인되지않았다. 따라서유인트랩시제품은꽃매미의약충, 성충모두나무를기어다니는행동습성을이용 하여 roll trap 의점착액에꽃매미유인물질 speamint oil 을넣은 roll trap 과나무에설치할 수있는일명 날개트랩 을고안하여제작하였다. 7. 유인트랩제품화 시제품들의제품화를위하여꽃매미에대한유인효과를시험한결과, 시제품 roll trap 은 기존 roll trap 과꽃매미 2 령약충의유인력을비교한결과차이가없는것으로조사되었다. 시제품날개트랩은꽃매미약충 2령과 3령에서가장효과적으로유인하는것으로확인하였고, 월별유인수를조사한결과 5월부터 7월까지유인효과가점차적으로증가하였고, 8월부터감하여 9월부터유인효과가크게감소하였다. 유인트랩에유인제로사용된 spearmint oil의유인지속효과는처리 5일후까지유인효과가높게나타났으나 10일후부터유인효과가크게감소하였다

9 8. 유인트랩설치방법에관한연구 유인트랩설치높이는 1m, 1.5m, 2m 중 1,5m 높이에서유인효과가높았고, 유인트랩설치수는설치수가증가할수록 4령약충의유인수는증가하였으나성충의경우설치수에따른유인효과는크게차이가없었다. 또한유인트랩의설치장소는포도나무주관에설치하는것이철골구조물보다유인효과가높은것으로나타났다. 9. 꽃매미종합적인친환경방제기술개발 월동하는알에대해서는꽃매미유인물질인 spearmint oil을첨가된점착액으로꽃매미난괴에도포처리하면부화를막을수있고, 부화한약충은날개트랩을설치하여발생밀도를억제하고꽃매미의발생을예찰하여약제방제시기를알수있고, 유기농업자재로공시된깍지엔으로꽃매미발생시기에처리함으로써효율적으로방제할수있는꽃매미의친환경적방제체계를확립하였다. Ⅴ. 연구성과및성과활용계획 1. 연구성과 가. 특허출원 : 1 건 (1) 발명의명칭 : 꽃매미방제용분무식점착액및이의제조방법 (2) 출원번호 : (3) 발명자 : 문선주, 정장희, 김윤경, 김길하 나. 학술발표및논문게재 : 4 건 (1) Kim, S.K., Lee, G.Y., Shin, Y.H., Kim, G.H Chemical control effect against spot clothing wax cicada, Lycorma delicatula(hemiptera: Fulgoridae) nymphs and adults. Korean J. Pesti. Sci. 14, (2) Yoon, C.M., Moon, S.R., Jeong, J.W., Shin, Y.H., Cho, S.R., Ahn, K.S., Yang, J.O., Kim, G.H Repellency of lavender oil and linalool against spot clothing wax cicada, Lycorma delicatula(hemiptera: Fulgoridae) and their electrophysiological responses. J. Asia Pac. Entomol. 14, (3) Moon, S.R., Cho, S.R., Jeong, J.W., Shin, Y.H., Yang, J.O., Ahn, K.S., Yoon, C.M., Kim, G.H Attraction response of spot clothing wax cicada, Lycorma delicatula(hemiptera: Fulgoridae) to spearmint oil. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 54, (4) Cho, S.R., Lee, J.E., Jeong, J.W., Yang, J.O., Yoon, C.M., Kim, G.H

10 Comparison of cuticular hydrocarbons of different developmental stages of the spot clothing wax cicada, Lycorma delicatula(hemiptera: Fulgoridae). Korean. J Appl. Entomol. 50, 다. 제품화 : 3건 (1) 유기농업자재 : 깍지엔 (공시번호 공시 ) (2) 꽃매미 방제용 분무식 점착제 : 끈끈이풀 (3) 꽃매미 유인트랩 : 날개트랩 라. 인력지원 성과 : 석사 5명, 학사 2명

11 2. 성과활용계획 가. 사업화방안 본연구과제를통해꽃매미친환경방제제의산업화를위한제품화 3건을성공하였다. 이중유기농업자재 깍지엔 은제품생산에필요한원료확보및생산공정이완성되어본연구과제의주관연구기관인 두애니에서 월기술이전실시계약을체결하고시중에판매할계획이고, 꽃매미방제용분무식점착제 끈끈이풀 은 월제품을판매할계획이다. 그러나꽃매미유인트랩으로개발한 날개트랩 은유인루어의지속성을연장할수있는추가연구와포도나무에설치시문제가되는부분을보완, 수정하여 1년이내에제품을출시할계획이다. (1) 국내판매계획 년도 2013년 2014년 2015년 매출액 ( 백만원 ) (2) 해외판매계획 년도 2015년 2016년 2017년 매출액 ($) 50, , ,000 나. 교육및홍보 본연구과제의주관연구기관인 두애니에서본연구과제수행을통해제품화된깍지 엔, 끈끈이풀, 유인트랩에대한홍보물을제작하여농업인영농교육을실시하고, 언론보도자 료및각종전시회를참가하여본연구과제의성과를홍보할계획이다

12 SUMMARY Ⅰ. Project title Establishment of the eco-friendly control system of Lycorma delicatula using agricultural materials Ⅱ. Object and necessity of the project 1. The purpose of the project The purpose of this study was performed to prevent the spread and damage by increasing the population density of Lycorma delicatula and to provide the control strategy with eco-friendliness achieve. To this, first of all, new eco-friendly insecticidal substance to alternate the agrochemicals was screened and commercialized. Second, new attractant considering ecological and physiological characteristics of Lycorma delicatula was searched for and commercialized. Lastly, establishment of integrated pest management using this product will be carried out and will be provided to the farmers. 2. The necessity of the project A. The surge of population density of Lycorma delicatula in countryside Spot clothing wax cicada, Lycorma delicatula, belongs to the Homoptera: Fulgoridae, was not known to the people until few years ago. It was collected in Cheonan following an outbreak was reported throughout the country in The size of damage increased as their population density increased. B. Increase of damage by Lycorma delicatula Identified host plants were known for 41 species including 3 species of herbs and 38 species of woody plants such as tree of heaven, a kind of chinaberry, quassia, ivy, wild grapes, and grapevines. It is commonly found in forest, fruit orchard and causes damage on host plants by feeding and excreting the honeydew, causing grey mold. The damage severely increased more especially on grapevine, and spread to 21 cities and provinces in 2009, with the occurrence estimated at 15 % (2,964 ha) in cultivation areas of grapevine. The damage is currently worsened by rapid increase in

13 the density of L. delicatula. C. Scarcity of research on Lycorma delicatula Recently, the damage by the outbreak of Lycorma delicatula has been continuously reported and it needs urgent control because grapevine orchard damage is getting bigger and bigger. The reason for the outbreak of Lycorma delicatula is suggested to be due to climate change and absence of natural enemy. However, there is insufficient research conducted on Lycorma delicatula. D. Dependence on pesticides to control Lycorma delicatula For integrated pest management of Lycorma delicatula, Rural development Administration provided the following strategies in June 2009: Egg masses before overwintering must be eliminated and/or pesticide spraying when the egg hatches to nymph. Therefore, there is need to establish integrated control methods for Lycorma delicatula. It also strongly needs to develop eco-friendly control, without use of pesticides. The purpose of this study is therefore to establish the eco-friendly control strategy for Lycorma delicatula. III. Contents and range of the projet 1. Contents of the project A. Screening of eco-friendly pesticidal substances and commercialization (1) Selection of eco-friendly pesticidal substance and organic agrochemical materials (2) Development of ovicidal materials possible for early control (3) Commercialization of eco-friendly pesticidal substances B. Searching of attractant and trap development for Lycorma delicatula (1) Searching of attractant and chemical analysis (2) Development of pesticidal lure trap using screened chemicals C. Development of integrated eco-friend control technique

14 (1) Development of control technique using eco-friendly pesticidal substance (2) Development of control technique using attraction trap (3) Establishment of integrated control technique (4) Establishment of field application technique 2. Research range A. Main Research Institute (DoANY Co., Ltd.) : Practical use of eco-friendly control technique for L. delicatula (1) Searching and formulation of eco-friendly pesticidal substance (2) Provide the product by registration of organic agrochemical materials including eco-friend pesticidal substance (3) Manufacture traps using attractant of Lycorma delicatula (4) Establishment of field application technique by field testing B. Cooperative Research Institute (CBNU) : Development of eco-friend control technique for L. delicatula (1) Insecticidal activity bioassay of eco-friend pesticidal materials for L. delicatula and analysis of materials having insecticidal activity (2) Development of field application technique through the efficacy evaluation of eco-friend pesticidal active materials to the field (3) Search for attractant for L. delicatula and compound analysis (4) Development of field application technique through the efficacy evaluation of attraction trap for L. delicatula IV. Expected outputs of the project 1. Result on the previous research on screening of ovicidal agent For screening of ovicidal agent, egg masses of Lycorma delicatula were collected from the grapevine in CBNU and grapevine orchard in Yongam-dong, Cheongju, and transferred into the laboratory for breeding. The insects were reared at 25±1 C, relative humidity of 50 60%, and a photoperiod of 16:8 hr (light:dark). Experiments were done after hatching of the eggs in a rearing cage and investigated the chemical tests and egg hatching rates. For egg masses collected on April 20th, 2010, egg hatching rate of 93.2 % was recorded and the period from collection to egg hatching was 14.8 days, but egg

15 hatching rate for egg masses collected one month later increased to 94.5% and the periods from collection to egg hatching takes 4.6 days. As the collection times delayed, egg hatching rates increased and the periods to egg hatching became shorter. For ovicidal activity, 26 kinds of commercialized pesticides were diluted to recommended concentration and sprayed on collected egg masses. The susceptibility on egg masses showed the perfect ovicidal activity when sprayed with chlorpyrifos, a class of organophosphates, but the other 25 kinds of pesticides did not show any effect. 2. Searching for eco-friendly pesticidal substance and commercialization product A. Searching for eco-friendly pesticidal substance and manufacturing of prototype From 13 kinds of oriental herb medicines, extracts of the dandelion showed the highest insecticidal activity of 53.3%, and plant extracts showed the highest insecticidal activity of 61.6%. In combination of plant extracts, mixture of Delis and a bastard cedar (GTN10-46) showed a higher insecticidal activity. This mixture that showed the highest insecticidal activity against Lycorma delicatula was made from the prototype products combined with an extract of certain tree or plant and alcohol. B. Making a product Efficient contents of prototype products from toosendanin of a bastard cedar and rotenone from delis extracts were analyzed using HPLC both quantitatively and qualitatively. In control efficacy test against Lycorma delicatula to the field, this prototype showed the control efficacy with 76.1% and there was no any harmful effect on grapevines. The toxicity of prototype was confirmed for safety as acute oral toxicity IV(low toxicity), acute skin toxicity(low toxicity), skin irritation index 0.0, Acute ocular irritation index 7.3, fish toxicity III class, and honeybee acute contact toxicity 0.54ug/bee. The prototype was also analyzed for residual chemicals against 245 agrochemicals, and no chemical residue was detected

16 From the above the result, the prototype was applied to organic agrochemical materials, and commercialized as the brand of Ggakjien. C. Development of ovicidal agent To develop killing agent for egg mass of Lycorma delicatula, sticky materials were manufactured to prevent the egg from hatching with brushing of ointment. Sticky materials were made by combination of spearmint oil, an attractant, natural rubber, polybutene, hydrogenated copolymer, dicyclopentadiene, and cyclohexane. These sticky materials were brushed on the surface of the egg masses and the rate of prevention of egg hatching was investigated to be 100%, a perfect prevention effect. 3. Construction of manufacturing process and product To confirm the resource supply for safe manufacturing of products, crude materials of extracts of bastard cedar and delis were signed on agreement with a company in China. Manufacturing process of products was as follows: Firstly, imported extracts of a bastard cedar and delis were poured in a mixer. Secondly, ethanol and extracts of certain trees or plant were put in the mixer and subsequently mixed well. Lastly, the product Ggakjien is injected into plastic bottle. This product for field application test against Lycorma delicatula showed the control efficacy with 67.7% and there was no harmful effect on grapevine. 4. Searching for attractant of Lycorma delicatula and its constituents analysis A. Searching for attractant of plant extract oils and its constituents analysis The contents of spearmint oil having an attraction effect were analyzed for its constituents using a GC and different dosages were tested. The results showed that only carvone had attraction efficacy while limonene did not show significant effect. The olfactory and electrophysiological responses of the antenna of Lycorma delicatula proved that carvone had an attraction activity. The attraction effect of spearmint oil seen in laboratory studies was tested in the field conditions with L. delicatula nymphs and adults. In nymphal stage, treatment with 20 μl and 30 μl spearmint oil produced similar effects in two test plots on day 15 after treatment. But use of 10 μl spearmint oil did not show any significant effect

17 In adult stage, treatment with 30 μl and 10 μl spearmint oil produced significant attraction effects, with big difference by local situation. However, the efficacy was stronger using 20 μl spearmint oil in two test plots with high significance on day 15 after treatment. B. Searching for attraction agent on tree of heaven and its constituent analysis Crude extracts of tree of heaven and its fraction were tested for olfactory response using olfactometer on Lycorma delicatula. MeOH crude extracts showed attraction response of 72.2% and other four fractions showed responses of 83.3% in hexane, 80.0% in chloroform, 55.5% ethyl-acetate and 66.7% in water layer. The hexane layer had the most active layer. LPPE, F1 to F5 fractionated from hexane layer were also tested for the attraction response, F2 showed the highest attraction with 75.0%. From F21 to F25 fractionated from F2 layer, F24 showed the highest attraction effect with 77.8%. From GC analysis of F24, the peak responded to antennal response on 645s retention time and its contents were identified to be the same compounds as phytol of C 20 H 40 O. 5. Searching for repellent agent against Lycorma delicatula and its contents analysis Through the repellent screening of ten plant oils with 5 ul against 4th nymph of Lycorma delicatula, only lavender oil displayed significant repellent activity, but other oils did not show any repellent activity. To investigate the repellent active compound of lavender oil, the GC analyzed and tested its contents with original contents, but only showed the repellency in linalool. To each nymph and female adults of Lycorma delicatula, electrophysiological response of antenna responded to the 10% concentration of lavender oil and confirmed response to linalool, one of its contents. To test the field repellent activity of lavender oil, the test was divided into nymphal stage and adult stage. 20 μl and 30 μl of lavender oil produced the repellent activity in nymphal stage and 30 μl of lavender oil also produced the repellent activity in adult stage

18 6. Manufacture the prototype of attraction trap In color selection test of attraction trap among white, yellow, green, and blue color, blue trap highly attracted the Lycorma delicatula, but there was no significant difference among trap color. In light effect in the dark, the fluorescent yellow showed much significance with 2nd nymph of Lycorma delicatula. The selection of trap formation was tested on commercialized sticky trap, delta trap, round trap, wing trap, but Lycorma delicatula was not attracted to the other traps except for sticky trap. Therefore, using the crawling habit of nymph and adult of Lycorma delicatula, prototype attraction trap is designed for wing trap, with transformation from existing sticky trap and roll trap and attractant spearmint oil in it and hang on the trees. 7. Product of attraction trap To produce the prototype, attraction effect was tested on Lycorma delicatula. Prototype roll trap had no significant difference from existing roll trap against 2nd nymph of Lycorma delicatula. Prototype wing trap confirmed the best effective attraction to the 2nd and 3rd nymph of Lycorma delicatula. In the investigation the number of insects by month, showed steady increase in the attraction effect from May to July but with sharp decreased from August to September. Spearmint used in attractant maintained the efficacy until 5 days after treatment but decreased the efficacy 10 days after treatment. 8. Research on the setting of attraction trap The attraction effect was the highest in a trap set at 1.5 m height from the ground, among those set at 1, 1.5, and 2 m height from the ground. An increase in the number of attraction traps increased the attraction number of 4th nymph, but it did not show the attraction effect on adults. Moreover, set location of attraction trap showed the highest attraction effect in main trunk of grapevine rather than iron frame structure. 9. Development of integrated eco-friend control technique for Lycorma delicatula For overwintering egg masses of Lycorma delicatula, sticky materials added on

19 spearmint oil as attractant will prevent the egg hatching by brushing these materials on the egg mass. And hatched nymphs will possibly be controlled in population by setting the attraction trap. Ggakjien as registered organic agricultural materials will be used to control the adults of Lycorma delicatula. This study will establish the integrated pest management for Lycorma delicatula using eco-friendly agricultural materials. V. Achievement and future plan to practical use 1. Achieved result A. A patent application : 1 case (1) Name of invention: Spraying sticky materials for the control of Lycorma delicatula and its manufacture (2) Access number of application : (3) Inventor : Sun-Ju Moon, Jang-Hee Jeong, Yun-Kyung Kim, and Gil-Ha Kim B. Presentation in congress and publication : 4 case (1) Kim, S.K., Lee, G.Y., Shin, Y.H., Kim, G.H Chemical control effect against spot clothing wax cicada, Lycorma delicatula(hemiptera: Fulgoridae) nymphs and adults. Korean J. Pesti. Sci. 14, (2) Yoon, C.M., Moon, S.R., Jeong, J.W., Shin, Y.H., Cho, S.R., Ahn, K.S., Yang, J.O., Kim, G.H Repellency of lavender oil and linalool against spot clothing wax cicada, Lycorma delicatula(hemiptera: Fulgoridae) and their electrophysiological responses. J. Asia Pac. Entomol. 14, (3) Moon, S.R., Cho, S.R., Jeong, J.W., Shin, Y.H., Yang, J.O., Ahn, K.S., Yoon, C.M., Kim, G.H Attraction response of spot clothing wax cicada, Lycorma delicatula(hemiptera: Fulgoridae) to spearmint oil. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 54, (4) Cho, S.R., Lee, J.E., Jeong, J.W., Yang, J.O., Yoon, C.M., Kim, G.H Comparison of cuticular hydrocarbons of different developmental stages of the spot clothing wax cicada, Lycorma delicatula(hemiptera: Fulgoridae). Korean. J Appl. Entomol. 50, C. Production : 3 case (1) Organic agricultural material : Ggakjien registered number Gongsi

20 (2) Spraying sticky materials for the control of Lycorma delicatula : GGeunGGeun-e pool (3) Attraction trap for Lycorma delicatula : Wing trap D. Achievement human power supporting : Masters 5, Bachelors 2 2. Future plan for achievement use A. Plan for business This investigation will lead to successful commercialization for the industry. Primarily, organic agricultural material Ggakjien have plans to sign the transfer agreement in September 2013 by completing the manufacturing process and securely confirmed the crude materials for the production, and spraying sticky materials for the

21 control of Lycorma delicatula are planned to start selling in December In case of attraction trap, we found the problem to set in grapevine and the time to selling will come out within one year after fixed it. (1) Plan to domestic sell Year The sales (Million Won) (2) Plan to sell oversea Year The sales ($) 50, , ,000 B. Education and advertisement Commercialized Ggakjien, GGeunGGeun-e pool and attraction trap from this investigation will be advertised by making brochure and provided to the public to educate the farmers, announced through the media, and attend display of the exhibition

22 CONTENTS Chapter1. Introduction Section1. Objectandnecessityoftheproject Section2. ScopeandContentsoftheProject Chapter2. Domesticandforeignstatusintechdevelopment Section1. ThePreviousStudiesoftheTechniqueAssociatedwiththe Project Section2. ProductandMarketAnalysis Chapter3. TheContentandResultoftheProject Section1. ScreeningandDevelopmentofEco-friendlyInsecticide Section2. DevelopmentofA tractantanda tractingtrap Section3. DevelopmentofEco-friendlyControlTechnique Chapter4. AchievementandContribution oftheproject Section1. AchievementoftheProject Section2. ContributionoftheProject Chapter5. Application oftheproject Section1. ApplicationPlanoftheProject Section2. ApplicationPerformanceoftheProject Chapter6. R&D Information from Overseain theprocessoftheproject Chapter7. References

23 목 차 제 1 장연구개발과제의개요제1절연구개발의목적및필요성제2절연구개발범위및연구내용 제 2 장국내외기술개발현황제1절국내외기술수준비교제2절제품및시장분석 제 3 장연구개발수행내용및결과제1절친환경살충물질탐색및개발 1. 살충물질탐색을위한선행연구 2. 친환경살충물질탐색 3. 유기농업자재제품화 4. 살란물질탐색및개발 5. 제품생산공정구축및생산제2절꽃매미의유인물질탐색및트랩개발 1. 식물성정유로부터유인물질탐색및물질분석 2. 식물성정유로부터기피물질탐색및물질분석 3. 가죽나무로부터유인물질탐색및물질분석 4. 유인트랩시제품제작제3절종합친환경방제기술개발 1. 유기농업자재의현장적용시험 2. 유인트랩의현장적용시험 3. 종합방제프로그램에따른실증시험 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도제1절연구개발의목표달성도제2절관련분야에의기여도 제 5 장연구개발성과및성과활용계획제1절연구개발의활용방안제2절연구개발결과의성과및활용목표 제 6 장 연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장 참고문헌

24 제 1 장 연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적및필요성 꽃매미 (Lycorma delicatula) 는노린재목 (Homiptera) 꽃매미과 (Fulgoridae) 에속하는곤충으로 1845 년에처음기록되었으며 (White,AnnalsandMagazineofnaturalHist.15:34-37,1845), 우리나라에서는 1932 년 Doi 에의해보고되었고 (J.chosen NaturalHist.Soc.13:30-49), 인도, 베트남등지에서도발생하지만주로중국의북부나남부지역에분포한다고알려져있다. 국내에서는 2004 년에천안에서처음으로채집되었고,2006 년에대발생하면서그후해마다밀도가증가하여전국적으로급속도로확산되었다. 꽃매미의기주식물로는가죽나무, 참죽나무, 소태나무, 미국담쟁이덩굴, 머루, 포도나무등목본 38 종과초본 3종등 41 종이알려져있는데 (Parketal.,2009), 임야, 과원등에서발견되며특히포도, 매실, 자두, 키위나무등의잎, 어린가지수액을흡즙하여나무수세저하로피해를주고배설물에의한그을음증상으로수확기상품가치를저하시킨다. 특히포도에대한피해가증가하고있는데 2009 년도에는 21 개시, 군으로확산되어전체포도재배면적의 15% 정도 (2,946ha) 에서발생하여피해를주고있고있으며매년급격히피해가증가하고있는실정이다. 꽃매미는 1년에 1회발생하며, 알덩어리로포도나무의줄기등에서월동하고,5 월상순부터부화를시작하며 6월상순이면대부분부화하여 7월중순부터 11 월상순까지성충으로활동한다. 또한 10 월경찬바람이불면산란을시작하며, 꽃매미한마리가덩어리형태의알을 30~40 개씩산란하는데, 알의수가 400~500 여개에이른다. 꽃매미는입의긴침을이용하여나무줄기에서즙액을빨아먹어나무가자라는것을 방해하며, 나무즙액을빨아먹은후에는당분이많은분비물을배출하여그을음피해를일으켜 과실의품질을떨어뜨린다. 이와같은꽃매미를방제하기위해서는이미다클로프리드 (Imidacloprid), 페니트로티온 (Fenitrothion), 티아클로프리드 (Thiacloprid) 등의농약을살포하는약제방제법이널리사용되고있다. 또한꽃매미약충 (nymph) 이나무를기어오르는습성을이용하여끈끈이트랩등을나무밑둥에설치하여꽃매미가나무줄기를기어오르지못하도록하는방법, 월동기에나무껍질을벗겨알덩어리를제거한후불태우는방법, 방충망을설치하여외부유입을방지하는방법, 트랩식물을설치하여꽃매미를유인하여방제하는방법이사용되고있으며, 최근에는천적을이용한방제법등이개발되고있다 (Parketal.,KoreanJ.Appl.Entomol.48:53-57,2009). 그러나, 꽃매미방제를위해사용되는농약은꽃매미의생장주기에따라주기적으로 살포해야하고, 농약살포에의해환경과인체에유해한영향을줄수있다. 끈끈이트랩을사

25 용할경우유충및일부성충에대하여는방제가가능하나날아다니는성충의경우에는방제에한계가있으며, 넓은면적에적용하기어렵다. 월동기에알덩어리를제거하는방법은노동력의소모가크며, 방충망을설치하는방법은꽃매미의접근을막는방법이므로근본적인해결방법으로사용하는데는한계가있다. 또한, 트랩식물을설치하는방법은드릴을이용하여나무에구멍을내고수간주사를해야하므로노동력및시간이많이소요되며, 천적을이용하는방법은꽃매미를방제하는데필요한천적의대량사육방법의연구가필요하고천적생물이대량번식하면 2차적인피해를유발할수있다는문제점이있다. 따라서, 꽃매미방제효과가높고, 적용이편리하며, 노동력이적게소요되고친환경적인꽃매미방제방법의개발이필요한실정이다. 본연구과제에서는꽃매미의밀도증가에따른확산및피해를막기위한친환경적인방제대책으로첫째, 농약을대체할수있는친환경살충물질을탐색하여제품화하고둘째, 꽃매미의생태, 생리적인특성을이용한유인물질을탐색하여살충유인트랩을개발하고이를제품화하여셋째,2 개의제품을활용하여꽃매미의종합적인방제기술을수립하여농가에보급하는것이목적이다

26 제 2 절연구개발의범위및연구내용 구분연도연구개발의범위연구개발의내용 주관연구기관 ( 주 ) 두애니 ) - 친환경살충물질탐색및제품화 친환경살충물질탐색 - 기존에알려진천연살충물질확보 :20 여종 ( 식물추출물및에센스오일등 ) - 협동연구기관에서살충활성검정 - 살충활성이우수한천연추출물선발 : 살충활성이 80% 이상의물질 2 종이상선발 - 선발된물질을이용한제제연구 : 보조제선발시험 : 온도, 저장기간에따른제제안정성시험 1 차년도 2010 친환경살충물질의제품화 - 꽃매미에대한약효시험 - 포도에대한약해시험 - 독성시험 - 친환경유기농자재목록공시신청 협동연구기관 ( 충북대 ) 친환경살충물질의제품화 - 선발물질의살충활성검정 - 분석기를이용한제품의지표물질분석 - 꽃매미유인물질탐색및물질분석 꽃매미유인물질탐색및물질분석 - 선행연구결과를활용한물질선발 -HPLC,GC/MS 등분석기를이용한유인물질의성분분석

27 트랩의형태선발시험 - 평판, 원형, 델타, 콘, 펀넬등 주관연구기관 ( 주 ) 두애니 ) - 유인트랩시제품제작 트랩의색깔선발시험 - 흰색, 녹색, 노란색, 파란색등 트랩시제품제작 - 트랩디자인, 금형제작 - 부자재구입 : 트랩고정줄, 끈끈이판등 2 차년도 2011 협동연구기관 ( 충북대 ) - 친환경살충제품의현장적용기술개발 꽃매미유인물질탐색및물질분석 - 유인물질의성분, 함량, 조성비에따른유인효과검정 - 유인물질의약량결정시험 - 유인물질의루어선발 : 바이엘, 고무, 이중부직포등 친환경살충제품의현장적용시험 - 대상작물 : 포도 - 처리농도 : 기준량, 배량처리대상 : 알, 약충, 성충 - 조사항목 : 살란효과, 살충효과 주관연구기관 ( 주 ) 두애니 ) - 종합방제프로그램수립 유인트랩의제품화 - 유인물질생산 - 유인물질루어생산 - 유인트랩시험생산 종합방제프로그램에따른실증시험 - 대상작물 : 포도 - 시험지역 : 피해가심한 3 개지역 - 조사항목 : 꽃매미의발생밀도포도피해수량 3 차년도 2012 협동연구기관 ( 충북대 ) - 유인트랩의현장약효평가를통한적용기술개발 유인트랩설치시기에관한연구 - 영기별유인효과시험 : 약충, 성충 - 월별유인수에따른설치시기결정 - 유인루어의지속시간시험을통한 루어교체시기결정 설치방법에관한연구 - 설치높이에따른효과시험 - 설치수에따른효과시험 - 설치장소에따른효과시험

28 제 2 장 국내외기술개발현황 제 1 절국내외기술개발현황 1. 본연구관련국내외기술수준비교 개발기술명 꽃매미의유인트랩개발 꽃매미의친환경살충물질개발 관련기술최고보유국 우리나라 현재기술수준 연구신청팀 기술개발목표수준 비고 꽃매미의대발생피해사례가 없음 2. 특허분석에따른본연구과제와의관련성 개발기술명 꽃매미의유인트랩개발 꽃매미의친환경살충물질개발 Keyword 꽃매미, 유인물질 친환경, 천연물, 해충방제 검색건수 5 21 유효특허건수 0 8 특허명 - 식물성천연병해충조성물및그의제조방법 핵심특허및관련성 보유국 - 한국 등록년도 관련성 (%) - 50% 유사점 - 살충물질로천연물을이용 차이점 - 살충활성물질및대상해충이다름

29 3. 논문분석에따른본연구과제와의관련성 개발기술명 꽃매미의유인트랩개발 꽃매미의친환경살충활성물질개발 Keyword 꽃매미, 유인물질 친환경, 천연물, 해충방제 검색건수 2 2 유효논문건수 1 1 논문명 꽃매미에대한식물정유의유인과백선을가정에서이용한친환경적기피효과방충, 살충효과에대한탐구지도 학술지명 한국농약과학회 대구과학 저자협동연구기관충북대조광연핵심논문게재년도 및관련성관련성 (%) 유사점 80 0 차이점 유인물질성분이다름 대상해충및살충물질이완전히다름 제 2 절생산및시장현황 1. 국내제품생산및시장현황 가. 전국피해면적 ( 농촌진흥청보도자료 09 년 6월 ) (1)2008 년도전국피해면적 :91ha (2)2009 년도전국피해면적 : 포도재배면적 2,765ha( 전체포도재배면적의 15%) (3)2010 년도에는 2009 년보다피해면적이증가할것으로예상 나. 꽃매미에대한농약시험결과 ( 산림청 09 년도 ) -5 개약제가공시 다. 지자체에서방제약제지원사업추진 ( 아산시 09 년 ) -1ha 당 70,000 원정도소요되는것으로조사 라.2009 년기준예상농약방제비용 - 전국피해면적 2,765ha*70,000 원 = 193 백만원 마. 향후피해면적이증가할것으로예상되며방제비용도늘어날것으로추정됨. 2. 국외제품생산및시장현황 국외에서는꽃매미피해에대한보고된자료가없어제품생산및시장현황에대한분석이 곤란함

30 제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 1 절친환경살충물질탐색및개발 1. 살충물질탐색을위한선행연구 가. 연구방법 (1) 시험곤충 꽃매미 (Lycormadelicatula) 알은충북대학교주변과청주용암동포도단지내에서채집하여실내로옮긴후, 온도 25±1, 상대습도 50 60%, 광주기 16L :8D 조건에서유지하면서약제시험과부화율조사에사용하였다. 채집한알에서부화한 1령약충을아크릴사육용상자 ( cm) 에서가죽나무를먹이로제공하였다. 가죽나무는자른부위를물에담그고유리병의입구에닿는부분은솜으로말아서유리병에고정시켜아크릴사육상자안에세워두었다. 사육조건은온도 25±1, 상대습도 50 60%, 광주기 16L :8D 조건으로유지하였다. 약제시험에는 1령과 2령약충을사용하였다. (2) 시험약제 시험에사용된작물보호제는유기인계 5 종, 카바메이트계 2 종, 피레스로이드계 4 종, 네 오니코티노이드계 6 종,IGR 계 4 종, 혼합제 3 종, 기타 2 종으로총 26 종의시중에판매되고있는 제품을사용하였다. 실험약제들의일반명, 제형, 유효성분량및추천농도는 Table2 와같다. (3) 부화율조사 날짜별로채집한꽃매미알 ( 난괴 ) 을용기 (Ø 11.5cm, 높이 8cm) 에넣은후실내로가 져와, 온도 25±1, 상대습도 50 60%, 광주기 16L :8D 조건을유지하면서부화율과채집후 부화까지기간을조사하였다. (4) 알과약충에대한약제시험 알에대한약효시험을위해채집된난괴를추천농도로희석된약제가충분히적셔지도록일반분무용스프레이 ( 입자크기 :400 μm ; 분사력 ml/ 회팁노즐 0.30mm dia.) 를이용하여 15 회살포하였다. 예비실험을통하여 chlorpyrifos 가나방류에대한추천농도인 ppm 으로꽃매미알에처리시효과가있음을확인하여그농도를본실험에적용하였다. 약제가처리된난괴는페트리디쉬 (9 cm dia. 5 cm ht.) 에넣어서온도 25±1, 상대습도 50 60%, 광주기 16L:8D 조건에두고부화율을조사하여보정살충율을구하였다. 실험은 1개난

31 괴를 3반복으로수행하였다. 약충에대한약효시험은용기 (Ø 11.5cm, 높이 8cm) 에약충을넣고깔대기 ( 높이 10.5cm, 아랫지름 9cm, 윗지름 2cm) 를씌운후추천농도로희석된약액을충체에 10 회살포한후용기 (Ø 11.5cm, 높이 8cm) 로옮긴후가죽나무를먹이로제공하였다.48 시간후사충수를조사하였고, 실험은 10 마리 3반복으로수행하였다. 나. 연구결과 (1) 야외에서채집한알의부화율 야외에서채집한꽃매미알을채집일자별로조사하였을때, 알의부화율에서 2010 년 4 월 20 일에채집한알의부화율은 93.2% 로채집후부화까지기간이 14.8 일이었으나,2010 년 5 월까지약한달간격으로채집한알의부화율은 2010 년 5월에채집한알이 94.5%,94.2% 로점점높아졌으며, 채집후부화까지기간도 2010 년 5월채집알이 12.5,4.6 일로, 채집날짜가늦어질수록부화율은높아졌고, 부화까지기간도짧아졌다 (Table1). 채집한날짜에맞추어알의부화율이증가함은충분한월동시간이주어질수록높은부화율을보이므로완전하게깨어날수있음을보여주고있고, 알기간또한충분한월동시간이주어지면점차짧아지는것을알수있다. Table1.Eggs'period andhatchingrateoflycormadelicatulaunderlaboratorycondition Colectingdateofeggs Hatchingrate Eggs'period(Days± n inthefield (Mean± SD) SD) a (Range) ± ± 1.23(6 12) ± ± 2.31(7 13) ± ± 1.58(3~9) a Theperiodfrom fieldcolectingdateofeggstohatchinginthelaboratory. (2) 알, 약충및성충에대한약제감수성 시판되고있는 26 종의살충제를추천농도로희석하여채집한알에분무처리했을때알에대한약제감수성은 Table2 와같다. 유기인계의 chlorpyrifos 가알에대해서 100% 로높은살란효과를나타내었다. 하지만 chlorpyrifos 를제외한나머지 25 종약제는알에효과가낮거나없었다. 대부분의약제가꽃매미난괴에영향이없는것은꽃매미알을덮고있는진회색의분비물이약제가알속으로침투하는것을막아주는보호역할을하는것으로보인다.Table2 에서알에 100% 살충효과를보인 chlorpyrifos 에대해서는현재로서는그기작에대해서알수없으나효과가우수하여채집시기별로나누어알과약충에대하여살충율을조사하였다 (Table 3).Chloropyrifos 로 2010 년 4월 20 일에채집된알은배수농도 (625ppm), 추천농도 (312.5ppm),

32 반수농도 (156.3ppm) 모두에서 94.5% 이상부화가억제되었다. 하지만 5월 10 일과 5월 15 일에채집한알은처리농도가낮아질수록부화억제율이크게낮아졌다. 부화약충에대해서는대부분 24 시간이내에 100% 살충되었지만, 알이부화하기시작하는시기인 5월 15 일에채집된알은추천농도로처리한부화약충에대해서는 61.0%, 반수농도로처리한부화약충에는 22.0% 로처리농도가낮아질수록살충효과가낮아졌다. 이처럼알이부화하는시기에약제를처리하면꽃매미의알은환경에대한적응력이생겨어느정도방어할수있는기작이생성되는것으로보인다. 그러므로포도과원에서꽃매미알의방제시기는 95% 이상의부화억제효과를나타내는 4월말이전까지가효과적일것이다.1 령과 2령약충에대해서는채집후실내에서부화한 1~2 령을사용하였으며유기인계 5종, 카바메이트계 2종, 피레스로이드계 4종, 네오니코티노이드제 6종, 혼합제 3종, 기타2종약제의시험결과, 모든약제에 100% 살충되었다 (Table4). 현재등록된 7약제중 lambda-cyhalothrin + thiamethoxam 은본실험에서사용하지않았지만그외약제들은모두 1~2 령약충에대해서 100% 살충율을나타냈다. 꽃매미는 개의알로이루어진난괴를산란하기때문에, 이알이부화를한다면이동성이큰약충이분산됨으로효율적인방제가어려워진다. 알단계에서 chloropyrifos 를이용한방제가이루어진다면, 꽃매미의밀도를줄이는데매우효과적일것으로판단된다. 하지만부화시기부터약제의효과가떨어짐으로, 부화시기이전인 4월말까지미리약제를처리하는것이권장된다. 그리고 5 6 월사이에보이는 1 2 령약충은대부분의약제에높은감수성을나타내므로, 이시기에약제를살포함으로서꽃매미의초기방제가가능하리라판단된다

33 Table2.EfectofsomeinsecticidesonhatchingrateofLycormadelicatulaeggs Commonname Tradename AI a & formulation b Recommended Conc.(ppm) n Corected mortality (%) Organophosphates Chlorpyrifos Deoseuban 25 WP Diazinon Dieaton 34 EC Fenitrothion Seumichion 50 EC Methidathion Suprasaid 40 EC Phenthoate Elsan 47.5 EC Carbamates Bensultap Trophy 50 WP Furathiocarb Deltanet 10 EC Pyrethroids Bifenthrin Taseuta 2 WP Deltamethrin Desis 1 EC Esfenvalerate Jeoksita 1.5 EC Etofenprox Sebero 20 EC Neonicotinoids Acetamiprid Mospilan 8 WP Clothianidin Bigcard 8 SC Dinotefuran Osin 10 WP Imidacloprid Cornido 8 SC Spinosad Sympony 10 SC Thiamethoxam Actara 10 WG InsectGrowthRegulators Bistrifluron Hanaro 10 EC Pyriproxyfen Shingiru 10 EC Tebufenozide Mimic 8 WP Teflubenzuron Nomolt 5 SC Others Chlorfenapyr Rempeigi 10 SC Machineoil - 95 EC Mixtures Acetamiprid+Etofenprox Manjangilchi WP Chlorpyrifos+a-cypermethrin Gangtaga 10+1 EC Etofenprox+Diazinon Ttuksim 8+25 WP a Activeingredient. b WP = wetablepowder,ec = emulsifiableconcentrate,sc = suspension concentrate,wg = waterdispensiblegranule

34 Table3.EfectofchlorpyrifosonLycormadelicatulaeggs,accordingtocolectiontime Insecticide Colectingdate Concentration (ppm) n Egg Mortality(%) Nymph b ± ± ± ± Chlorpyrifos ± ± ± ± ± ± ± ±5.9 - a Inhibitionrateofegghatching. b Nymphwithin24hafterhatchfrom eggstreatedwithinsecticide

35 Table4.Insecticidesusceptibilityon1stand 2nd instarnymphsoflycormadelicatula Commonname 1stInstar Corected mortality(%) 2ndinstar Organophosphates Chlorpyrifos Diazinon Fenitrothion Methidathion Phenthoate Carbamates Bensultap Furathiocarb Pyrethroids Bifenthrin Deltamethrin Esfenvalerate Etofenprox Neonicotinoids Acetamiprid Clothianidin Dinotefuran Imidacloprid Spinosad Thiamethoxam Others Chlorfenapyr Machineoil Mixtures Acetamiprid+Etofenprox Chlorpyrifos+α-cypermethrin Etofenprox+Diazinon Sample size, number of 1st, 2nd instar = 친환경살충물질탐색 가. 연구방법 (1) 시험곤충 충북대학교인근에서채집한꽃매미 3 4 령약충을사용하였고, 충북대학교주변과청 주용암동포도단지내에서채집한알을실내조건 25±2, 상대습도 50 60%, 광주기 16L : 8D 조건에서부화시킨후, 부화약충을사육용상자 ( cm) 에서가죽나무를먹이로

36 하여사육하면서실험에사용하였다. 실험에는 1 4 령약충과암컷성충을사용하였다. (2) 식물추출물탐색 본연구에사용된천연살충물질은석창포, 할미꽃, 금은화, 인진쑥, 길경, 흑축, 연교, 오배자, 천궁, 포공영, 익모초, 어성초, 박하등 13 종은건조된한약재를분쇄하여메탄올 (methanol,meoh) 을부어잘흔들어준뒤에실온암실에서 3일간방치하고 filterpaper 로여과하여회전진공농축기를이용하여 45 에서감압농축시켜 MeOH 추출물을사용하였고, 님추출물, 고삼뿌리추출물, 고삼씨앗추출물, 멀구슬나무추출물, 데리스추출물, 죽자초추출물 6종은농촌진흥청에유기농업자재로공시되어충해관리용자재의주성분으로사용되는조추출물과현호색추출물, 은행추출물은중국에서조추출물을구입하여사용하였다. (3) 살충효과검정 용기 ( 지름 11.5cm 높이 8cm) 에성충을넣고깔대기 ( 높이 10.5cm 아랫지름 9 cm 윗지름 2cm) 를씌운후추천농도로희석된약액을충체에 10 회살포한다음, 다른용기 ( 지름 9cm 높이 18cm) 로옮긴후포도나무줄기를먹이로제공하였다.24,48 시간후사충수를조사하였고, 실험은 3마리씩,5 반복으로수행하였다. 나. 연구결과 꽃매미에대한살충활성물질을탐색하기위해옛문헌과민간요법, 그리고타연구보고서를토대로석창포, 할미꽃, 금은화, 인진쑥, 길경, 흑축, 연교, 오배자, 천궁, 포공영, 익모초, 어성초, 박하등한약재 13 종의 MeOH 추출물을 5,000ppm 농도로처리하여 24 시간,48 시간후에살충율을조사한결과,48 시간후포공영추출물처리구에서 53.3% 로가장높은살충율을보였으나, 나머지추출물에서는 30% 이내의저조한살충율을나타내었다 (Table5). 또한 GTN 등 8종의식물추출조성물을 500 1,000 배희석하여처리한후 48 시간후에살충율을조사하였다. 그결과 GTN 데리스추출조성물에서 61.6% 로가장높은살충율을보였으나, 나머지식물추출조성물에서는데리스추출조성물보다살충율이낮았다. 그러나식물추출혼합조성물중에서데리스와멀구슬나무추출물의혼합물 GTN 은 500 배희석액에서 91% 의살충율을보여꽃매미에대한살충효과가높은것으로조사되었다 (Table6). 따라서, 본연구에서는꽃매미에대한친환경살충물질로데리스와멀구슬나무추출물이 혼합된조성물 GTN 을선발하였고, 선발된 GTN 을유기농업자재로제품화하기위 한제제, 유효성분분석, 약효, 약해, 독성시험, 농약잔류성시험등의연구를수행하였다

37 Table5. 꽃매미성충에대한한약재 13 종의살충율조사 시험약제 처리농도공시충살충률,% (Mean±SD) (ppm) ( 마리 ) 24h(corected) 48h(corected) 석창포 5, ± ± 0.0 할미꽃 5, ± ± 0.0 금은화 5, ± ± 0.0 인진쑥 5, ± ± 11.5 길경 5, ± ± 0.0 흑축 5, ± ± 0.0 연교 5, ± ± 0.0 오배자 5, ± ± 0.0 천궁 5, ± ± 11.5 포공영 5, ± ± 11.5 익모초 5, ± ± 11.5 어성초 5, ± ± 13.2 박하 5, ± ± 11.5 Table6. 꽃매미성충에대한식물조성물 10 종의살충율조사 시험약제주성분유효성분 희석농도 (ppm) 공시충 ( 마리 ) 살충률 (Mean± SD) 48h(corected) GTN 데리스 rotenone5% 2, ± 0.0 GTN 현호색 2, ± 36.5 GTN 고삼뿌리 oxymatrine0.2% 2, ± 36.5 GTN 고삼씨앗 matrine0.6% 2, ± 29.8 GTN 죽자초 sanguinarine0.5% 2, ± 23.6 GTN 멀구슬 toosendanin0.2% 2, ± 27.9 GTN 님 azadirachtine0.2% 1, ± 14.9 GTN 은행 2, ± 38.0 GTN 멀구슬 toosendanin0.1% + 고삼뿌리 +oxymatrine0.1% 2, ±29.8 GTN 데리스 toosendanin0.1% + 멀구슬 + rotenone2.5% 2, ±

38 3. 유기농업자재제품화 가. 연구방법 (1) 시제품제조 선발된데리스와멀구슬나무추출물이혼합된조성물 (GTN 10-46) 과유기농업자재병 해충관리자재로공시가가능하고공시기준에맞는물질을혼합하여시제품을제조하였다. (2) 시제품유효성분분석 시제품의품질관리및안정성을확보하기위하여멀구슬나무추출물의유효성분 toosendanin 과데리스추출물의유효성분 rotenone 을정성, 정량분석하였다. ( 가 ) 멀구슬나무추출물유효성분분석 멀구슬나무추출물의유효성분인 toosendanin 은시제품 0.1g 을취하여 50ml methanol 에혼합하여추출한다음여과하여 HPLC 분석기 (AgilentTechnology,1260Infinity) 를이용하여 Table7 의조건으로정성, 정량분석을하였다. Table7.Toosendanin 분석조건 column Detector HypersilGold5 μm,250mm x4.6mm, ELSD oventemperature MeOH/DIwater= 60/40 flow InjectionVolumn 0.7ml/min 10ul ( 나 ) 데리스추출물유효성분분석 데리스추출물의유효성분인 rotenone 은시제품 0.1g 을취하여 50mlAcetonitrile 에 혼합하여추출한다음여과하여 HPLC 분석기 (AgilentTechnology,1260Infinity) 를이용하여 Table8 의조건으로정성, 정량분석을하였다

39 Table8.Rotenone 분석조건 column Detector HypersilGold 5 μm,250mm x4.6mm, UV 294nm oventemperature ACN/DIwater= 50/50 flow InjectionVolumn 0.7ml/min 20ul (3) 시제품의꽃매미에대한약효및약해시험 2010 년 8 9 월에성충을대상으로약효시험을실시하였다. 포도원은캠벨얼리 11 년생으로구성되어있었으며선발약제처리구와무처리구로나누어완전임의배치법으로 3반복실시하였다. 총구수는 6구, 구당주수는 5주로소요주수는 30 주로수행하였다. 약제처리전및처리후 3일과 7일차에생충수를조사하였다. 포도원은캠벨얼리 11 년생으로구성되어있었으며무처리, 기준량처리, 배량처리로총 구수는 9 구, 구당주수는 2 주로소요주수는 18 주로수행하였다. 약제처리 3 일,5 일,7 일후에 기준량과배량에서외관상약해유무를달관조사하였다. 또한, 유기농업자재로공시하기위해포도외감, 고추, 상추, 오이등 4 작물에대하여 ( 주 ) 한국생물안전성연구소의뢰하여약해시험을수행하였다. (4) 시제품독성시험 인축독성은급성경구, 급성경피, 피부자극성, 안점막자극성등 4 항목, 환경독성은급성 어류독성, 꿀벌에대한급성접촉독성등 2 항목을 ( 주 ) 한국생물안전성연구소의뢰하여시제품의 안전성평가를수행하였다. (5) 시제품농약잔류성시험 원료제조시유해물질함유여부를확인하고안전한제품생산에필요한잔류농약성분 분석을순천대학교친환경농업센터에의뢰하여농약 245 성분에대한잔류여부를확인하였다. 나. 연구결과 (1) 시제품제조

40 선발된데리스와멀구슬나무추출물이혼합된조성물 (GTN 10-46) 은액제로서제제안 정성에는문제가없으나, 침전물이있어이를용해하기위해발효주정알콜을첨가하였다. 또한,GTN 은급성어류독성이높아유기농업자재로공시가어려운것으로검토 되어 GTN 의급성어류독성을낮추기위하여유효성분의함유량을높일수있는원료로 유기농업자재의병해충관리용자재로허용된물질인목초액을첨가하였다. 시제품은 GTN 과국립산림과학원에서품질인증을받았고유기농업자재로공시 ( 공시 ) 된홍천숯가마에서제조한목초액및발효주정알콜을 Table9 의투입비율로제조 하였다. Table9. 시제품의제조조성비원료명 유효성분 투입비율 (%) 함유량 (%) 멀구슬나무추출물 Toosendanin1% 데리스추출물 Rotenone20% 목초액 에탄올 ethylalcohol 29 - 합 계 (2) 시제품유효성분분석 ( 가 ) 멀구슬나무유효성분분석 멀구슬나무추출물의유효성분인 toosendanin 의 HPLC 크로마토그램은 Fig.1 과같 으며 min 에 peak 를보였고, 시제품에서 toosendanin 의함량을분석하여계산한결과 0.12% 함유되어있는것을확인하였다

41 Fig.1.Toosendanin 의 HPLC chromatogram ( 나 ) 데리스추출물유효성분분석 데리스추출물의유효성분인 rotenon 을분석한 HPLC 크로마토그램은 Fig.2 와같 으며 min 에 peak 를보였고, 시제품에서 rotenon 의함량을분석한 HPLC 크로마토그램 은 Fig.3 과같으며그함량을계산한결과 1.203% 함유되어있는것을확인하였다. Fig.2.Rotenone 의 HPLC chromatogram

42 Fig.3. 시제품의 rotenonehplc chromatogram 이상의결과와같이 toosendanin 과 rotenone 의정량분석결과 Table9. 의시제품제조조성비에따른 toosendanin 과 rotenone 의함유량 0.1%,1.2% 이상으로분석되어목초액과발효주정알콜을혼합한시제품의안정성이확인되었고향후제품생산시품질관리에활용하고자한다. (3) 꽃매미에대한약효및약해시험 다음은야외포장에서시제품의꽃매미에대한방제효과시험을실시하였다.2010 년 8 9월,11 년생캠벨얼리포도원에서꽃매미성충을대상으로완전임의배치법 3반복으로약효시험을수행하였다. 그결과무처리 3일과 7일후의방제가가각각 75.7%,76.1% 로나타났다 (Table 10). 또한약해시험을약제처리 3,5,7 일후조사에서약해가없는것으로나타났다 (Table11). 따라서예비포장실험결과시험약제는친환경방제제로개발가능성은인정되나좀더효과적인약제탐색이필요한것으로사료된다. Table10. 시험약제처리후 3,7 일차에방제효과 시험약제 처리전밀도 ( 마리 / 구 ) 약제처리후생충률 (%) 방제가 Ⅰ반복 Ⅱ반복 Ⅲ반복평균 (%) GTN 일차무처리 GTN 일차무처리

43 Table11. 시험약제처리 3,5,7 일후의약해조사 약해정도 (0 5) * 시험작물 기준량 배량 비고 포도 ( 캠벨얼리 ) 0 0 약해없음 * 농약등록기준법 또한, 유기농업자재공시를위한자료를활용하기위하여 ( 주 ) 한국생물안전성연구소에의뢰한감, 고추, 상추, 오이등 4작물에대한약해시험을수행한결과, 시제품의기준량 1,000 배및배량 500 배에서외관상나타난약해증상이없어유기농업자재로실용성이있다는시험성적서를교부받았다. (4) 독성시험 ( 가 ) 급성경구독성 시제품에대한급성경구독성을마우스를공시하여 1회경구투여한후 14 일동안치사수, 일반중독증상, 체중변화및부검소견을관찰조사한결과, 각장기에미치는영향은없는것으로조사되었으며수컷과암컷모두에대한 LD 50 값은 5,000mg/kg 이상으로서농약관리법에의거독성을구분하면 IV 급 ( 저독성 ) 으로분류되었다. ( 나 ) 급성경피독성 시제품에대한급성경피독성을랫트 (S.D. 계통 ) 를공시하여 1회약제처리후 14 일동안치사수, 일반중독증상, 체중변화및부검소견을관찰조사한결과, 각장기에미치는영향은없는것으로조사되었으며수컷과암컷모두에대한 LD 50 값은 4,000mg/kg 이상으로서농약관리법에의거독성을구분하면 IV 급 ( 저독성 ) 으로분류되었다. ( 다 ) 피부자극성시험 시제품에대한피부자극성시험을토끼 (New Zealand White 계 ) 를사용하여피부에 1 회노출시킨후 1,24,48,72 시간째에피부반응정도를관찰하고치사수, 체중변화및일반중 독증상을관찰, 조사하였다. 시제품 0.5ml 을토끼 (New ZealandWhite 계 ) 에투여한결과, 시험기간중치사동물은관찰되지않았고, 일반중독증상및특이한체중변화도없었다. 시험물질을제거후적용부의국소자극성을관찰한결과, 피부자극이관찰되지않아 1차자극지수 (P.I.I) 는 0.0 으로산출되었다

44 ( 라 ) 안점막자극성시험 시제품에대한안점막자극성시험을토끼 (New Zealand White 계 ) 를사용하여결막낭 내에 1 회처리후 1,24,48 및 72 시간째에일반중독증상, 치사수, 체중변화및안점막자극증상 을관찰, 조사하였다. 시험물질 0.1ml 을토끼 (New Zealand White 계 ) 에투여한결과, 시험기간중치사동물은관찰되지않았고, 개체별체중을측정한결과, 시간이경과함에따라증가추세를보였다. 시험물질적용후적용부의국소자극성을관찰한결과, 비세척군에서결막의부종에대한자극증상과배출물이관찰되어급성안자극지수 (A.O.I) 는 7.3 으로산출되었고, 관찰된안점막자극성의반응은 72 시간째관찰시소실되어모든시험동물이정상으로회복되었다. ( 마 ) 급성어류독성 시제품의잉어 (Cyprinuscarpio) 에대한급성어류독성시험을 96 시간동안실시하여생사수와일반중독증상을관찰하고체중및전장을조사한결과, 잉어에대한 48 시간반수치사농도 (LC 50 ) 는 2.967mg/L(2.714~3.266),96 시간반수치사농도 (LC 50 ) 는 2.772mg/L(2.488~3.086) 으로농약관리법에의거독성을구분하면 I급으로분류되었다. ( 바 ) 꿀벌에대한급성접촉독성 시제품의꿀벌에대한급성접촉독성을수행한결과, 보행장애및무기력등의이상증상이관찰되었고,48 시간반수치사약량 (LD 50 ) 은제품기준으로 0.973ug/bee 이고제품의유효성분 (56.3%) 기준으로환산하면 ug/bee 로산출되어꿀벌에대한급성독성이있는것으로조사되었다. 이상의독성시험으로시제품을유기농업자재로공시하는데필요한자료를확보하였으며시제품의꿀벌에대한급성독성으로유기농업자재로공시될경우 이유기농업자재는꿀벌에대한독성이강하니꽃이피어있는동안에는사용하지말아야하며, 일시에광범위한지역에살포하지마십시오 라는문구및꿀벌독성에대한그림문자를제품에표기하여야한다. (5) 시제품농약잔류성시험 원료제조시유해물질함유여부를확인하고안전한제품생산에필요한잔류농약성분 분석을순천대학교친환경농업센터에의뢰하여농약 245 성분에대한잔류여부를분석한결과, 농약 245 종의성분이불검출되었다는농약잔류성적서를교부받았다. 시제품에사용한멀구슬나무추출물, 데리스추출물, 목초액에는농약성분이함유되지 않은것을확인하였고, 안전한제품생산이가능할것으로판단된다

45 이상과 같이 시제품의 제조조성비 선발,유효성분 분석,약효 약해시험,인축독성 및 환경 독성시험,잔류농약시험 등 유기농업자재 공시에 필요한 자료를 준비하였고,유기농업자재 인 증기관인 농업기술실용화재단에 신청하여 깍지엔 이라는 상표로 공시( 공시1228 ) 하여 제품화 하였다. 4.살란물질 탐색 및 개발 가.연구방법 ( 1)살란물질 선발 및 제조 한약제 추출물이나 기존에 유기농업자재로 공시된 충해관리용자재를 가지고 꽃매미 알에 대한 살란효과를 시험한 결과,살란효과를 나타내는 물질을 선발하지 못하였다. 살란물질을 살충물질이 아닌 물리적으로 부화를 억제할 수 있는 방법을 s t i c kt r a p의 점착성분을 응용하게 되었고,이를 난괴에 쉽게 처리할 수 있는 처방을 선발하여 끈끈이풀 을 제조하였다( Fi g.4). Fi g.4. 끈끈이풀 시제품 ( 2)살란제( 끈끈이풀) 를 이용한 꽃매미 알의 방제력 시험 끈끈이풀을 이용한 꽃매미 알의 방제력 시험은 충북 청주시 흥덕구 개신동,청주시 상 당구 용암동,그리고 충북 옥천군 청성면 등 3 곳 지역에 있는 포도원 포장에서 실험을 수행하 였다( Fi g.5). 포장에서 발생한 꽃매미 알 표면에 붓을 이용하여 끈끈이풀을 도포처리 하고( Fi g.6 ), 약 23주 후 꽃매미 약충의 발생 시기에 맞춰 부화율을 조사하였으며 난괴의 알의 구멍의 수에 따라 부화율을 검정하였다.모든 실험은 3반복으로 수행하였다

46 (A) (B) (C) Fig.5. 포도원포장 (A) 청주시개신동 (B) 청주시용암동 (C) 옥천군청성면, 빨간색원으로 표시한곳이포도원포장. Fig.6. 꽃매미알 ( 난괴 ) 에끈끈이풀을도포처리하는모습 나. 연구결과 (1) 살란물질선발및제조 꽃매미살란물질로선발한 끈끈이풀 은점착제로천연고무와폴리부텐 (Polybutene) 을사용하였고, 접착제로디시클로펜타디엔 (DCPD) 수첨수지 ( 분자량이 570~700) 와수소첨가공중합체 (Hydrogenated copolymer)styrene-ethylene/butylene-styrene(s-eb-s) 를사용하였으며, 용제로사이클로헥산 (Cyclohexane), 꽃매미유인물질은스피어민트오일을사용하여제조하였다. 꽃매미방제용 끈끈이풀 의제조에사용된원료의중량비는천연고무 6%, 폴리부텐 40%, 디시클로펜타디엔 (DCPD) 수첨수지 6.5%, 수소첨가공중합체 6.5%, 사이클로헥산 40% 및스피어민트오일 1% 로하여제조하였고, 각단계별제조방법은아래와같다

47 ( 가 ) 점착제용해및혼합단계 : 고체상태인천연고무를잘게자른상태에서검상태인폴리부텐과함께용기에넣고 180 로가열하여천연고무가폴리부텐에완전히녹을때까지혼합한다. ( 나 ) 급속냉각단계 : 천연고무와폴리부텐을완전히혼합한후 40 로급속냉각시킨다. 이때급속냉각시키지않을경우천연고무와폴리부텐이분리될수있다. ( 다 ) 접착제혼합단계 : 천연고무와폴리부텐을혼합된혼합액에디시클로펜타디엔수첨수지및수소첨가공중합체를순차적으로넣고 4시간동안교반한다. 이때, 디시클로펜타디엔수첨수지및수소첨가공중합체가완전히녹을때까지교반하는데,2 시간이지나면대부분이녹는것을확인할수있다. ( 라 ) 용제및유인제혼합단계 : 디시클로펜타디엔수첨수지및수소첨가공중합체가완전히녹은후사이클로헥산과스피어민트오일을순차적으로넣고교반하여완전히혼합한다. ( 마 ) 숙성단계 : 용제와유인제가상기 ( 라 ) 단계의혼합액과완전히혼합되면 8시간정도숙성시킨다. 상기의제조단계를거쳐제조된 끈끈이풀 은동력분무기또는붓으로도포할수있는액상이며, 포도나무에분무또는도포할수있으며, 분무또는도포이후에용제가휘발되면도포된점착액이흘러내리지않는상태가된다. 이를이용하여꽃매미의약충및성충을유인 포획하여방제하고, 알의부화를방지하는데사용된다. 이상과같이제조한 끈끈이풀 에대한제조방법에대하여특허출원하였다. (2) 살란제 ( 끈끈이풀 ) 를이용한꽃매미알의방제력시험 3개지역각각 3개의꽃매미난괴 ( 총 9그룹 ) 에 끈끈이풀 을도포하고 2-3 주후꽃매미알의부화율을조사한결과, 끈끈이풀 을도포하지않은무처리군에서는 90% 이상의부화율을보였으나, 끈끈이풀 처리구에서는 100% 부화가억제되었다 (Fig.7). 따라서자체개발한 끈끈이풀 의살란효과는우수한것으로확인되었다

48 Fig.7. 끈끈이풀에의한부화율 (%) 5. 제품생산공정구축및생산 가. 제품원료확보 제품대량생산을위한생산공정을구축하기위해서는원료를안정적으로수급할수있어야한다. 본연구에서친환경살충물질로선발된멀구슬나무추출물과데리스추출물은국내에서는생산하는회사가없었으며, 유기농업자재를생산하는회사들도해외에서수입하고있었다. 따라서본연구를통해개발된제품의대량생산을위해원료를안정적으로공급할수있는해외제조업체를조사하였다. (1) 멀구슬나무추출물 멀구슬나무는멀구슬과멀구슬나무속에속하는식물로근피또는수피를고련피라고하며과실은천련자로고대중국에서부터주로구충제로사용해왔고, 이외에항균, 이뇨및해열작용이있으며동의보감에는생식기와고환이붓고아프며대소변이막히는산증치료에도사용한다는기록이있다. 현재전세계의여러나라에서는멀구슬나무추출물인투센다닌 (toosendanin) 에대한 의약품및생물농약으로연구, 개발, 이용을진행하고있으며중국에서는생물농약신제제로 국가연구개발프로젝트를수행하여국가농업과학기술성과상을받았다. 멀구슬나무추출물은중국에서대부분생산되고있으며제조회사는 2~3 곳이있는것으로조사되었다. 그중중국시안에위치한 Xi'anYingsateBiotechCo.,Ltd. 와접촉하여멀구슬나무의수피와과실에서에탄올을사용하여추출, 증발, 농축한추출물 ( 지표성분으로투센다닌 (toosendanin) 함량이 1% 인원료 ) 을공급받기로하였다

49 (2) 데리스추출물 데리스는뉴기니섬을포함하여동남아시아와남서태평양군도등에분포되어자라는쌍떡잎식물장미목콩과의덩굴성관목식물이다. 데리스의뿌리에살충효과를나타내는성분중 로테논 (rotenone) 이라는성분은해충구제약으로이용되었고동남아시아에서는예로부터물고기를잡을목적으로어독성이강한뿌리, 줄기, 잎을찧어서하천, 연못에넣거나화살독성분으로이용하였다. 로테논은화학식 C 23 H 22 O 6, 녹는점이 163 이고무색결정형물질로서곤충의소화기관, 기문, 체표면을통하여접촉ㆍ식독작용에의해살충효과를나타내며효과가있는것으로알려져있다. 사람ㆍ가축등포유동물에대한독성이낮아안전하나, 어패류에대한독성은매우높은편이며, 작물에대한약해 ( 藥害 ) 는없다. 국내외의여러회사에서데리스분제, 데리스유제형태의생물농약또는친환경유기농자재로널리사용하고있는원료이다. 데리스추출물도멀구슬나무추출물과같이중국에서대부분생산되고있었으며그중중국북경에위치한 KingboBiotechCo.,Ltd. 와접촉하여데리스를아세톤으로추출하고농축과정에서아세톤을제거하고정제한추출물 ( 지표성분으로로테논 (rotenone) 의함량이 20% 인원료 ) 을공급받기로하였다. 나. 생산공정구축 멀구슬나무추출물은점성이있어발효주정알콜로희석한후에다른물질을첨가하여 침전물이최소가되도록하는공정으로주관연구기관이보유하고있는생산설비를이용하여 원료의투입순서를 Fig.8 과같은생산공정을구축하여 깍지엔 (Fig.9) 제품을생산하였다. 멀구슬나무추출물, 데리스추출물 â 수입멀구슬추출물을에탄올에투입 â 용해데리스추출물투입 â 혼합목초액투입 â 혼합입병 â 포장 Fig.8. 제품생산공정

50 Fig.9." 깍지엔 제품 제 2 절꽃매미유인물질탐색및트랩개발 1. 유인물질탐색및물질분석 가. 연구방법 (1) 식물정유및 Terpene 화합물 실험에사용된식물정유는 Table 12 와같다.Cinamon bark 오일은 FKA(France), black pepper 외 8종오일은 JinArome(USA) 의제품을구입하여사용하였다.Terpene 물질인 carvone(96%) 과 limonene(97%) 은 Aldrich(Milwaukee,WI,USA) 의제품을구입하여사용하였다. Table12.Nameand sourcesof10essentialoilsused inthisstudy Essentialoil Plant Family Source Blackpepper Pipernigrum Piperaceae JinArome(USA) Caraway Carum carvi Umbeliferae JinArome(USA) Cadamone Eletatiacardamomum Zingiberaceae JinArome(USA) Cinamonbark Cinnamomum cassia Lauraceae FKA (France) Coriander Coriandrum sativum Umbelifera JinArome(USA) Eucalyptus Eucalyptusglobulus Myrtaceae JinArome(USA) Neem Alium cepa Liliaceae JinArome(USA) Pineneedle Pinussylvestris Pinaceae JinArome(USA) Sage Salviaoficinalis Labiatae JinArome(USA) Spearmint Menthaspicata Labitae JinArome(USA)

51 (2) 후각계를이용한유인검정 꽃매미에대한식물정유의유인효과를검정하기위해서 T-tube olfactometer(id:10 cm;length:40 cm;angle between arms:180 ) 를사용하였다 (Fig.10). 유인효과검정용 olfactometer 는진공펌프 (Thomasmedipump R ) 를이용하여양쪽 arm 에서곤충이접종된지점으로일정한유속 (100ml/min) 의공기가흐르게하였고, 한쪽 arm 에물질을처리하면곤충이물질을감지하고습성에의해서기어올라가양쪽 arm 중한곳을선택하도록고안하였다. 각 arm 을통해들어오는공기는 activated charcoal,molecularsieve, 그리고 silicagelblue 로여과되어신선한공기를흐르도록하였다. 한쪽 arm 의말단부에는 microapplicator 를이용하여일정량의식물정유와시약을처리한 filterpaper(whatman paperno.2,9cm dia.,1/4) 를놓았고, 다른한쪽은무처리한 filterpaper 를놓았다.5 분이지난후, 양쪽 arm 중어느쪽을선택하였는지기록하였고각 arm 의말단에서 10 cm까지를 choice, 그이외는 nochoice 로기록하였다. 방향에따른영향을고려하여 20 반복을수행한후,180 회전하여 20 반복을실험하였다. 식물정유를선별하기위한검정에서는각 10 반복씩수행하였다. 한번사용된 olfactometer 는에탄올과증류수로세척한후,100 오븐에서충분히건조시켜다음실험에사용하였다. 실험조건은온도 25±2, 상대습도 50 60%, 광주기 16L :8D 을유지하였다. 실험에는 1 4 령약충과암컷성충이사용되었다. 통계분석은 binomialsigntest(zar,1996) 를이용하였다. Fig.10.Olfactometer apparatus.the air flowing on treatment and blank space influenceatinsecttreatmentsiteintheinitialstage. not (3) 유인물질분석 식물정유는 gas chromatographer(gc, Agilent Technologies 6890N) 와 gas chromatograph-mass spectrometer(gc/ms,agilenttechnologies 7890A,5975C) 를이용하여분석하였다.Column 은 DB-WAX(ID 0.25 mm 30 m,thickness 0.25 μm,j&w Scientific, Folsom,CA)fused silicacapilary 를사용하였다.Injector 의온도는 180,detector 의온도는 200 를유지하였으며, oven 온도는 35 에서 200 까지분당 5 의속도로승온하였다

52 Carier gas 로는질소를사용하였고분당 1 ml의흐름을유지하였다. 각성분의확인은 GC/MS 를이용하여 70eV ionization voltage 조건에서각성분의 massspectrum 을얻은후, WILEY 138 library(agilenttechnologies) 의표준품 mass spectrum 과비교하여확인하였고, GC 를이용하여표준품과머무름시간을비교하여재확인하였다. (4)GC-EAD 를이용한전기생리반응 식물정유에대한꽃매미안테나의전기생리반응은 GC 와 electroantennograph(eag, Syntech,probe/manipulator,MP-15,stimulus controler,cs-55,data acquisition interface box,serialidac-232,hilversum,netherlands) 로구성된 GC-EAD system 을이용하여확인하였다 (Fig.11).GC 의 column 은 DB-WAX fused silicacapilary 를사용하였고, 그끝이두갈래로나누어져있어, 분리된각성분이한쪽은 flameionization detector(fid) 로나머지한쪽은 electroantennograph detector(ead) 로이동하도록고안되었다.Injector 와 detector 의온도는 20 0 이며 1μl의시료가주입되었고,oven 온도는 100 에서 150 까지는분당 20,200 까지는분당 25 속도로승온하였다. 꽃매미안테나의전기생리반응을확인하기위해서머리를절단한다음,ringersolution(154mM NaCl,5.5mM KCl,1.4mM CaCl 2 ) 으로채워진 capilary 를이용하여절단면과안테나끝을 EAG probe 에연결시켰다.EAG 신호는 GC/EAD Ver3.74.4program system(hilversum,netherlands) 을이용하여기록하였다. 실험에는 1 4 령약충과암컷성충이사용되었다. Fig.11.GC-EAD system

53 (5) 야외포장에서의유인효과검정 선발된물질의유인효과를야외포장에서검정하기위해서 lure 와 stickytrap 을사용하였다.Lure 는일정량의물질을처리한후,4 에서 24 시간동안보관하면서처리물질이완전히흡수되게한다음, 실험에사용하였다. 야외실험조건은 Fig.12 와같다. 먼저기주식물 ( 가죽나무 ) 을기준으로양쪽 10m 내외거리에있는비기주식물 2개를선정한다음, 한쪽에는 lure 와 stickytrap 을설치하였고, 반대편에는 stickytrap 만을설치하여꽃매미가비기주식물로유인되는지를조사하였다. 실험은 2개장소에서각 5반복으로하였고 5,10,15 일후에 stickytrap 에붙은꽃매미의수를기록하였다. 약충시기와성충시기에야외검정을수행하였다. Fig.12.Field conditionfortestingofatractant. 나. 연구결과 (1) 식물정유로부터유인물질탐색 꽃매미에대해서유인효과를나타내는물질을선발하기위해먼저 4령약충을대상으로 10 종식물정유 (Black pepper,caraway,cadamone,cinamon bark,coriander,eucalyptus, Neem,Pine needle, Sage, Spearmint) 를 5 μl처리하여실험하였다 (Table 13). 그결과 spearmintoil 이 94.1% 로가장높은유인율을나타내었으며그외식물정유들은 30.8% 53.3% 로유인율이낮거나유의성이없었다.5 μl처리량에서우수한유인효과를나타낸 spearmint oil 을가지고각영기별약충과성충에대해서처리량을달리하여검정하였다 (Table14).5 μl처리량에서 1령을제외한나머지령기와성충이유인반응을나타내었고, 특히 4령약충이 84.4% 로유인율이가장높았다.2 3 령약충은유의성은있었으나, 유인율이각각 66.7%, 68.8% 로비교적낮았다.10 μl처리량에서는 4령약충과성충만이유의성을나타내었으며 ( 각각 71.0%,76.7%), 나머지 (2.5 μl와 1μl ) 처리에서는 4령약충만이 2.5 μl처리량에서유의성이있었을뿐, 나머지는모두유의성이없었다. 식물정유는곤충과식물간의상호작용에영향을

54 미치기때문에, 트랩의유인제로이용한다면해충을예찰하거나밀도를줄이는데활용할수있 을것으로생각된다. 본실험의결과에서 spearmintoil 은 4 령약충과성충에서유인효과가높 았으며,2 3 령약충은비교적낮았다. Table13.OlfactoryresponseofL.delicatula4thnymphtoessentialoils Numberofnymphs Essentialoil No % a P-value b Blank Treatment choice Blackpepper n.s Caraway n.s Cadamone n.s Cinamonbark n.s Coriander n.s Eucalyptus n.s Neem n.s Pineneedle n.s Sage n.s Spearmint < a Olfactoryresponse(%)=Treatment/(Blank+Treatment)*100. b Thedatawasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferencesfrom 50:50 responses.n =20,P < 0.05,n.s(notsignificant)P >

55 Table14.A tractionefectofvariousdosesofspearmintoilagainstl.delicatulanymphand adult Dose NumberofL.delicatula Instar ( μl ) Blank Treatment Nochoice % a P-value b 10 1st n.s 2nd n.s 3rd n.s 4th adult st n.s 2nd rd th adult st n.s 2nd n.s 3rd n.s 4th adult n.s 1 1st n.s 2nd n.s 3rd n.s 4th n.s adult n.s a Olfactoryresponse(%)=Treatment/(Blank+Treatment)*100 b Thedatawasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferencesfrom 50:50 responses.n =40,P < 0.05,n.s(notsignificant)P > (2)Spearmintoil 의구성성분분석과유인효과 Spearmintoil 의구성성분을분석한결과는 Fig.13 과같다.Spearmintoil 의구성성분을분석한결과 carvone (89.7%) > limonene (10.3%) 순으로 terpene 류가존재하였다. Spearmintoil 의유인활성물질을탐색하기위해서각성분의함량과조성에따라처리량을달리하여유인효과를검정하였다 (Table 15). 그결과, carvone 만이유인효과를나타내었고 limonene 은유의성이없었다.Carvone 을 4.5 μl처리했을때,1 령을제외한모든령기의약충과성충에서유인율이 69.7% 79.3% 로나타났다.9 μl처리량에서도 2령을제외한약충과성충에서유의성을나타내었으며,4.5 μl처리량과비교했을때큰차이는없었다. 따라서 spearmintoil 처리량에따라꽃매미의반응이차이가났지만, 처리량과유인효과가비례하지는않았다. 또한발육단계에따라유인반응의차이를나타냈는데, 물질의양과발육단계에따른반응의차이는좀더심도있는연구가진행되어야할필요가있다. 식물정유에는각성분들이다양한함량과조성으로존재하기때문에, 각성분들이혼합되었을때, 유인효과를검정할필요가있다. 각성분을식물정유에존재하는조성비로혼합하여유인효과를검정한결과, 조성물을 5μl처리했을때, 약충과성충에서모두유의성을나타내었으며 (66.7% 80.7%), 특히

56 4령약충과성충의유인율이상대적으로높았다.Carvone 의유인효과와비교했을때, 약간의상승효과를나타내었으나, 큰차이를보이지는않았다.10 μl를처리했을때는 3령 성충만이유의성을나타내었다. 그리고 spearmintoil 과구성성분이동일하다고알려진 carawayoil 은유의성을나타내지않았다.Caraway oil 은 carvone 이 56.1%,limonene 이 43.9% 로본연구에서분석한 spearmintoil 과비교했을때각성분의조성비에서큰차이를나타내었다.Table15 에서보듯이본실험에서는 carvone 과 limonene 을 spearmint 오일의조성비 ( 약 9:1) 와동일하게처리하여유인효과를확인하였다.Caraway oil 이동일성분임에도불구하고유인효과를나타내지않은것은 carawayoil 의조성이꽃매미가선호하는데적합하지않았기때문이라판단된다. Fig.13.GC profile ofspearmintoil.db-wax capilary column (I.D.0.25mm,30m long, 0.25mm film thickness)(temp.,35 to200 at5 /min)

57 Table15.A tractionefectofmajorcomponentsofspearmintoilagainstl.delicatula Components Dose ( μl ) Carvone Limonene Mixture c Instar % a P-value b 1st nd 65.5 n.s 3rd th adult st 61.1 n.s 2nd rd th adult st 54.5 n.s 2nd 55.6 n.s 3rd 54.6 n.s 4th 44.1 n.s adult 48.5 n.s 1st 48.6 n.s 2nd 46.7 n.s 3rd 50.0 n.s 4th 42.4 n.s adult 44.1 n.s 1st 58.1 n.s 2nd 62.5 n.s 3rd th adult st nd rd th adult a Olfactoryresponse(%)=Treatment/(Blank+Treatment)*100 b Thedatawasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferencesfrom 50:50 responses.n =40,P < 0.05,n.s(notsignificant)P > c Mixture=carvone(89.7%)+limonene(10.3%). (3)Spearmintoil 의구성성분에대한꽃매미안테나의전기생리반응 식식성곤충이기주및산란장소를탐색하거나, 포식자가먹이를찾아가기위한단서로서식물이방출하는휘발성물질을감지한다고알려져있다. 후각반응은곤충의감각기와휘발성물질의상호작용한결과로서나타난다. 이러한물질들을수용하는 olfactory receptor 들은곤충의여러부위에존재한다고알려져있는데대부분은곤충의안테나에존재하고있다. 휘발성물질에대한곤충의안테나반응을살펴보는연구들이많이진행되고있으며, 안테나반응

58 은행동적인반응과매우밀접한관계가있는것으로알려져있다. 본실험에서는 spearmint oil 에대한꽃매미의후각반응과더불어안테나의전기생리반응을살펴보았다.GC-EAD 를이용하여각령기별약충과암컷성충안테나의전기생리반응을살펴본결과,4 령약충과암컷성충의안테나는 10% 농도의 spearmintoil 에서반응하였으며, 구성성분중에서 monoterpene 인 carvone 에반응하는것을확인하였다 (Fig.14). 하지만유인율이비교적낮거나유의성이없었던 1 3 령약충의안테나는반응하지않았다. 꽃매미가 spearmintoil 에유인되는이유는안테나가 carvone 과반응하여신호를수용했기때문이라생각되며, 특히 4령약충과성충이이러한반응에좀더민감한것으로보인다. 결과를종합적으로볼때,carvone 은앞서후각기검정에서도유인효과를나타냈으며, 본실험에서도 carvone 에 4령약충과성충의안테나가반응하는것으로보아 spearmintoil 의유인활성물질은 carvone 임을알수있었다. Fig.14.Comparison of electrophysiologicalresponses on each developmentalstages of femaleantennaagainstspearmintoil.(1)limonene(2)carvone

59 (4) 야외포장에서의유인효과 앞서유인효과를확인한 spearmintoil 을가지고야외에서검정하였다. 야외검정은약충과성충시기에진행하였으며, 그결과는 Fig.15 와같다. 약충의경우 spearmintoil 을 20 μl, 30 μl처리했을때 A와 B장소에서 15 일차까지모두유의성을나타내었으나,10 μl처리시에는두장소모두유의성이없었다. 성충의경우 30 μl와 10 μl처리시, 장소에따라유인효과가큰차이를보였다. 하지만 20 μl처리시 A와 B장소모두 15 일차까지높은유의성을나타내었다. 아직까지해충관리를위해서식물정유의유인효과를이용한사례는그리많지않은실정이다. 주로유인효과에대해서는식물정유나휘발성물질보다는페로몬같은곤충들의신호물질을이용한연구가대부분이고, 이미이러한페로몬은트랩의형태로해충의예찰이나방제에적용되고있다. 하지만페로몬을상업적으로이용하기위해서는시간과비용이소모되는데, 식물정유를이용한트랩은이러한문제점들을보완할수있을것으로보인다. 야외에서 spearmintoil 의유인효과는꽃매미의발육단계와장소에따라차이를나타내었으며, 본실험결과로보아,spearmintoil 은야외에서도유인효과를나타내는것으로보인다. 그리고앞서실험에서꽃매미 4령약충과성충이 spearmintoil 에더잘반응하는것을확인하였는데, 실제로야외에서사용될경우말령약충또는성충시기에사용하는것이훨씬효과적일것으로판단된다. 결과적으로 spearmintoil 은꽃매미밀도를줄이기위한수단으로서사용이가능하리라판단된다

60 Fig.15.Atractionefectofspearmintoiltonymphandadultintwofields. a Thedatawas analyzed using binomialsign teststo evaluatethediferencesfrom 50:50responses.*P < 0.05, *P<0.01 *P< b Thisnumbermeansthenumberofcapturedinsects. 2. 꽃매미유인및기피물질탐색과물질분석 가. 연구방법 (1) 시험곤충 충북대학교인근에서채집한꽃매미 3 4 령약충과충북대학교주변과청주용암동포도단지내에서채집한알을실내조건 25±2, 상대습도 50 60%, 광주기 16L:8D 조건에서부화시킨후, 부화한약충을사육용상자 ( cm) 에서가죽나무를먹이로하여사육하면서실험에사용하였다. 실험에는 1 4 령약충과암컷성충을사용하였다

61 (2) 식물정유및 Terpene 화합물 실험에사용된식물정유는 Table 16 과같다. Lemongrass, majoram 오일은 Charabot(France), pennyroyal 오일은 Hasegawa(Japan), bergamot 외 7종오일은 JinArome(USA) 의제품을구입하여사용하였다.Terpene 화합물인 caryophylene oxide(99%), linanool(97%), linalyl acetate(97%) 는 Aldrich(Milwaukee, WI, USA), terpinen-4-ol(93%) 은 Wako(Osaka,Japan) 의제품을구입하여사용하였다. Table16.Namesand sourcesof10essentialoilsusedinthisstudy Essentialoil Plant Family Source Blackpepper Pipernigrum Piperaceae JinArome(USA) Caraway Carum carvi Umbeliferae JinArome(USA) Cadamone Eletatiacardamomum Zingiberaceae JinArome(USA) Cinamonbark Cinnamomum casia Lauraceae FKA (France) Coriander Coriandrum sativum Umbelifera JinArome(USA) Eucalyptus Eucalyptusglobulus Myrtaceae JinArome(USA) Neem Alium cepa Liliaceae JinArome(USA) Pineneedle Pinussylvestris Pinaceae JinArome(USA) Sage Salviaoficinalis Labiatae JinArome(USA) Spearmint Menthaspicata Labitae JinArome(USA) (3) 활성성분의분리 음건후, 분쇄하여얻은가죽나무잎과가지의시료를 50g 을취하여 1l 의메탄올을부어잘흔들어준뒤에실온암실에서 3일간방치한후,filterpaper 로여과하여회전진공농축기를이용하여 45 에서감압농축시켜 methanol 추출물을얻었다. 가죽나무조추출물 20g 을취하여증류수 800 ml에녹인후,2l 의분액여두에부은다음, 동량의 hexane 을넣어시료와두용매가잘섞이도록흔들었다. 약 1시간방치후, 분리된두층에서 hexane 층만을내려감압 농축하였으며,water 층에는새로운 hexane800 ml를부어위와동일한과정을반복하여약 3.2g 의 hexane 층을얻었다. 남아있는 water 층에 chloroform 을 800 ml을부어위와동일한과정을반복하여약 0.42g 의 chloroform 을얻었으며, 마지막으로 ethyl-acetate800 ml을부어동일한방법을거친뒤약 1.9g 의 ethyl-acetate 층을얻었다. 그리고마지막에남아있는 water 층을감압 농축하여 14.5g 을얻었다. 각각분획물의생물검정결과에의해활성을가지고있는분획층에대하여분리및정제를실시하였다. Low- and medium-pressured pumped elution(lppe)(merch mesh,ø6 60 cm ) 를이용하여 silicagel1,125g 을 hexane 으로습식, 충진시킨뒤, 활성을나타냈던 hexane 분획물을스포이드로 loading 하였다. 이동상용매는 hexane 과 ethyl-acetate 를사용하여각각의비율로분당 10 ml씩흘려주었다. 플라스크에일정하

62 게받아낸후각각박층크로마토그래피 (thin layer chromatography, TLC) 에의해 TLC plate(silc/uv 254,0.25mm,Merck KGaA,Germany) 상에전개된 spotpatern 을 UV hand lamp(uvgl-58,uv-254/356nm,uvp Inc.,USA) 로확인후요오드 (I) 반응을확인했으며, 스프레이기를이용하여 50% 황산용액을 TLC 에플레이트에뿌리고 hotplate 를이용하여반응을확인하였다. (4)Olfactometer 를이용한유인및기피효과검정 꽃매미에대한식물정유의유인및기피효과를검정하기위해서 T-tubeolfactometer (ID:10 cm,length:40cm,anglebetween arms:180 ) 를사용하였다 (Fig.10). 유인및기피효과검정용 olfactometer 는진공펌프 (Thomasmedipump R ) 를이용하여양쪽 arm 에서 olfactometer 내부로일정한유속 (100ml/min) 의공기가흐르게하여, 한쪽 arm 에물질을처리하면곤충이습성에의해기어올라가서물질을감지한후, 양쪽 arm 중한곳을선택하도록고안하였다. 각 arm 을통해들어오는공기는 activated charcoal,molecularsieve,silicagelblue 로여과하여신선한공기를흐르도록하였다. 한쪽 arm 의말단부에는 microapplicator 를이용하여일정량의식물정유와 terpene 을처리한 filterpaper(whatmanpaperno.2,9 cm diameter,1/4) 를놓았고, 다른한쪽은처리하지않은 filterpaper 를놓았다.5 분이지난후, 양쪽 arm 중어느쪽을선택하였는지기록하였고각 arm 의말단에서 10 cm까지를 choice, 그이외는 nochoice 로기록하였다. 방향에따른영향을고려하여 olfactometer 를 180 회전시킨후재검정하였다. 한번사용된 olfactometer 는에탄올과증류수로세척한후,100 오븐에서충분히건조시켜다음실험에사용하였다. 실험조건은온도 25±2, 상대습도 50 60%, 광주기 16L:8D 을유지하였다. Screening 단계에서는 20 반복, 나머지검정은 40 반복을수행하였다. 실험에는 1 4 령약충과암컷성충을사용하였다. 통계분석은 binomialsigntest(zar,1996) 를이용하였다. (5) 식물정유분석 식물정유는 gas chromatographer(gc, Agilent Technologies 6890N) 와 Gas chromatograph-mass spectrometer(gc/ms,agilenttechnologies 7890A,5975C) 를이용하여분석하였다.Column 은 DB-WAX(ID 0.25mm 30m,thickness0.25 μm,j&w Scientific,Folsom, CA)fused silicacapilary 를사용하였다.Injector 의온도는 180,detector 의온도는 200 를유지하였으며,oven 온도는 35 에서 200 까지분당 5 의속도로승온하였다.Cariergas 로는질소를사용하였고분당 1mL 의흐름을유지하였다. 각성분의확인은 GC/MS 를이용하여 70eV ionization voltage 조건에서각성분의 mass spectrum 을얻은후, WILEY 138 library(agilenttechnologies) 의표준품 massspectrum 과비교하여확인하였고,GC 를이용하여표준품과머무름시간을비교하여재확인하였다. (6)GC-EAD 를이용한전기생리반응 식물정유에대한꽃매미안테나의전기생리반응은 gaschromatographer(gc,agilent Technologies, 6890N) 와 electroantennograph(eag, Syntech, probe/manipulator, MP-15,

63 stimulus controler, CS-55, data acquisition interface box, serial IDAC-232, Hilversum, Netherlands) 로구성된 GC-EAD system 을이용하여확인하였다.GC 의 column 은 DB-WAX(ID 0.25mm 30m,thickness0.25 μm,j&w Scientific,Folsom,CA)fused silicacapilary 를사용하였고, 그끝이두갈래로나누어져있어, 분리된각성분이한쪽은 flame ionization detector(fid) 로나머지한쪽은 electroantennograph detector(ead) 로이동하도록고안되었다. Injector 와 detector 의온도는 200 이며 1μl의시료가주입되었고,oven 온도는 100 에서 15 0 까지는분당 20,200 까지는분당 25 속도로승온하였다. 꽃매미안테나의전기생리반응을확인하기위해서머리를절단한다음,ringersolution(154mM NaCl,5.5mM KCl,1.4mM CaCl 2 ) 으로채워진 capilary 를이용하여절단면과안테나끝을 EAG probe 에연결시켰다. EAG 신호는 GC/EAD322005Ver3.74.4program system(hilversum,thenetherlands) 을이용하여기록하였다. 실험에는 1 4 령약충과암컷성충이사용되었다. (7) 야외에서의기피효과검정 선발된식물정유의기피효과를야외에서검정하기위해서 lure 와 stickytrap 을사용하였다.Lure 는일정량의식물정유를처리한후,4 에서 24 시간동안보관하면서식물정유가완전히흡수되게한다음, 실험에사용하였다. 야외실험조건은 Fig.16 과같다. 먼저서로 10m 내외에있는 2개의기주식물 ( 가죽나무 ) 을선정하여한쪽에는 lure 와 sticky trap 을설치하였고, 반대편가죽나무에는 sticky trap 만을설치하여꽃매미가기주식물로부터기피하는지를조사하였다. 실험은 2개장소에서각 5반복으로하였고 5,10,15 일후에끈끈이트랩에붙은꽃매미의수를기록하였다. 약충의령기별시기와성충시기에수행하였다. Fig.16.Field condition for testing ofrepelent.above,diagram ofexperimentfor the setingoflureand trap,below,apicturesetlureand trapinatree

64 나. 연구결과 (1)Lavenderoil 에대한꽃매미의발육단계별기피효과 꽃매미에대해서기피효과를나타내는식물정유를선발하기위해서먼저 4령약충을대상으로 10 종오일을 5μl씩처리하여검정하였다 (Table17). 그중에서 lavenderoil 만이기피효과 (80%) 를나타내었을뿐, 그외식물정유들은기피효과가없었다.5 μl처리량에서유일하게기피효과를나타낸 lavenderoil 을가지고각령기별약충과성충에대해서처리량을달리하여검정하였다 (Table18).5 μl처리량에서모든령기의약충과성충이기피반응을나타내었다.10 μl를처리했을경우 1령을제외한약충과성충의기피율이 % 로유의성을나타내었으나,5 μl를처리했을때보다는기피효과가감소하였다.2.5 μl를처리했을때는기피효과가감소하였으며,3 4 령약충과성충만이유의성을나타내었고 1μl처리량에서는유의성이없었다. 이처럼식물정유는곤충과식물간의상호작용에큰영향을미치기때문에이러한점을이용하여해충의접근을막는다면효과적인작물보호가가능할것으로여겨진다. Table17.OlfactoryresponsesofL.delicatula4thnymphto10essentialoils Numberofnymphs Essentialoil No % a P-value b Blank Treatment choice Bergamot n.s Chamomile n.s Clarysage n.s Fenel n.s Lavender Lemongrass n.s Majoram n.s Peanut n.s Pennyroyal n.s Peppermint n.s a Olfactoryresponse(%)=Blank/(Blank+Treatment)*100. b Thedatawasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferencesfrom 50:50 responses.n= 20,P <0.05,n.s(notsignificant)P >0.05(Zar,1996)

65 Table18.RepelencyofvariousdosesoflavenderoilagainstL.delicatulanymphand adult Essential oil Lavender NnumberofL.delicatula Dose ( μl /cm 2 ) Instar Blank Treatment No choice % a P-value b 1st n.s 10 2nd rd th Adult st nd rd th Adult st n.s 2nd n.s 3rd th Adult st n.s 2nd n.s 3rd n.s 4th n.s Adult n.s a Olfactoryresponse(%)=Blank/(Blank+Treatment)*100. b Thedatawasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferencesfrom 50:50 responses.n= 40,P <0.05,n.s(notsignificant)P >0.05.(Zar,1996). (2)Lavenderoil 의분석과구성성분의기피효과 기피효과를나타낸 lavender oil 의구성성분을분석한결과는 Fig. 17 과같다. Lavender oil 은 linalyl acetate(49.4%), linalool(42.2%), terpinen-4-ol(5.0%), caryophylene oxide(3.4%) 순으로 terpene 류가존재하였다.Lavenderoil 의기피활성물질을탐색하기위해서 GC 로분석하고각구성성분의함량과조성에따라처리량을달리하여기피효과를검정하였다 (Table19). 그결과,linalool 만이기피효과를나타내었고,linalylacetate,terpinen-4-ol 그리고 caryophyleneoxide 는유의성이없었다.Linalool 을 2.11 μl처리했을때, 모든령기의약충과성충에서기피율이 % 로유의성이나타났다.4.22 μl처리량에서는 1령을제외한약충과성충에서유의성은있었으나,2.11 μl처리량보다는효과가약간감소하였다.linalool 은 lavenderoil 의주요성분중하나이며, 독특한향기로화장품및음식재료등으로다양하게활용되고있는물질이다. 각성분을식물정유에존재하는조성비로혼합하여기피효과를검정한

66 결과, 조성물을 5 μl,10 μl처리했을때, 대부분기피효과를나타내었으나 ( %),linalool 의 기피율과비교하였을때, 큰차이를나타내지는않았다. 본실험의결과로보아,lavenderoil 의 기피활성물질은 linalool 이었다. Fig.17.GC profile oflavenderoil.db-wax capilary column (ID:0.25mm,length:30m, film thickness:0.25mm )(Temp.35 to200 at5 /min)

67 Table 19.Repelency ofmajorcomponentsoflavenderoilagainstl.delicatula in T-tube olfactometer Components Dose( μl ) Instar % a P-value b Linalylacetate Linalool Terpinen-4-ol 0.50 Caryophylene oxide st 55.6 n.s 2nd 54.6 n.s 3rd 51.5 n.s 4th 61.8 n.s Adult 59.4 n.s 1st 52.8 n.s 2nd 48.4 n.s 3rd 54.6 n.s 4th 61.1 n.s Adult 60.0 n.s 1st 55.9 n.s 2nd rd th adult st nd rd th adult st 57.1 n.s 2nd 62.5 n.s 3rd 58.1 n.s 4th 60.0 n.s Adult 62.1 n.s 1st 58.8 n.s 2nd 64.5 n.s 3rd 61.3 n.s 4th 59.4 n.s Adult 60.0 n.s 1st 48.3 n.s 2nd 51.6 n.s 3rd 54.8 n.s 4th 60.0 n.s Adult 61.3 n.s 1st 51.4 n.s 2nd 48.5 ns 3rd 46.4 n.s 4th 58.8 n.s Adult 58.1 n.s

68 Mixture c st 64.7 n.s 2nd rd th Adult st nd rd th Adult a Olfactoryresponse(%)=Blank/(Blank+Treatment)*100. (continue) b Thedatawasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferencesfrom 50:50 responses.n= 40,P <0.05,n.s(notsignificant)P > 0.05(Zar,1996). c Mixture = linalylacetate(49.4%)+ linalool(42.2%)+ terpinen-4-ol(5.0%)+ caryophylene oxide(3.4%) (3)Lavenderoil 의구성성분에대한꽃매미안테나의전기생리반응 곤충의후각반응은감지하는물질과감각기의상호작용으로이루어지기때문에 lavenderoil 에대한꽃매미의후각반응은감각기의전기생리반응연구와병행하여수행되어야할필요가있다. 본실험에서는 lavenderoil 에대한후각반응과더불어안테나의전기생리반응에대해살펴보았다.Olfactometer 검정에서기피효과를나타내었던 lavenderoil 에대한안테나반응을확인하기위해서 GC-EAD 를이용하여각령기별약충과암컷성충안테나의전기생리반응을살펴본결과,1 4 령약충과암컷성충의안테나는 10% 농도의 lavenderoil 에서반응하였으며, 그구성성분중 linalool 에반응하는것을확인하였다 (Fig.18). 하지만 linalyl acetate,terpinen-4-ol, 그리고 caryophyleneoxide 에는반응을하지않았다. 곤충은기주및산란장소등을탐색하기위한단서로서휘발성물질을감지한다고알려져있는데이러한점은곤충이특정물질에대해서기피또는유인되는반응과매우밀접한관계가있는것으로생각된다.Linalool 은앞서실험에서도기피효과를나타냈으며, 전기생리반응에서도 linalool 에안테나가반응하는것을확인하였다. 따라서꽃매미의후각반응은안테나의물질감지에의한결과임을알수있었다

69 Fig.18.Comparisonofelectrophysiologicalresponsesoflavenderoilonnymphsand female adultantenna.(1)linalylacetate,(2)linalool,(3)terpinen-4-ol,and(4)caryophyleneoxide. (4) 야외에서의기피효과 Lavenderoil 에대한야외기피검정결과는 Fig.19 와같다. 야외검정은약충시기와성충시기를나누어진행하였다. 약충의경우,lavenderoil 을각각 20 μl,30 μl처리했을때두장소에서모두 15 일차까지기피효과를나타내었다. 하지만 10 μl처리시에는효과가감소하였다. 성충의경우,30 μl처리량에서기피효과가우수하였으며,20 μl처리량에서도유의성을나타내었으나, 기피효과가다소감소하였으며,10 μl처리량에서는유의성을나타내지않았다. 본실험에서 lavenderoil 은꽃매미의모든령기의약충과성충에서기피효과를나타내었으며, 야외검정에서도기피효과를확인하였다.Lavenderoil 은꽃매미의기피물질로활용이가능하리라생각되며, 화학적방제및기타방제의보완수단으로서적용이가능할것으로기대된다

70 Fig.19.Repelentefectoflavenderoiltonymphandadultintwofields. a The data wasanalyzed using binomialsign teststo evaluate the diferencesfrom 50:50 responses.*p< 0.05, *P< 0.01 *P < 0.001(Zar,1996). b Thisnumbermeansthenumberofcapturedinsects. (5) 가죽나무추출물로부터유인효과탐색 가죽나무에서꽃매미유인물질을찾기위하여조추출물및분획물, 그리고각 fraction 에대해꽃매미의 olfactometer 를이용한후각계반응을관찰하였다. 그결과, 꽃매미는 MeOH 조추출물에대하여 72.2% 의유인율을보였고, 4가지분획물에대해서는 hexane 83.3%, chloroform 80.0%,ethyl-acetate55.5%, 그리고 water66.7% 로 hexane 층에서활성이가장높았다 (Fig.20). 따라서 LPPE 로 hexane 층에서분리된 F1 F5 에대하여유인반응을검정한결과 F2 에대해 75.0% 로가장높은유인력을나타냈다 (Fig.21). 그리하여다시,F2 에서분리한 F21 F25 에대해각각유인반응을실험한결과,F24 에대해 77.8% 의높은유인율을보였다 (Fig.22)

71 Treatment Blank No choice % a P b MeOH * Hexane ** CHCl * EtOAc n.s. H 2O n.s No. of attracted insect Fig.20.Olfactory responsetotheadultsofl.delicatulaon crudeextract from A.altisima. a Olfactoryresponse(%)=Treatment/(Blank+Treatment)*100. b Thedata wasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferences from 50:50 responses(treated and untreated arms,n = 20, *,P>0.05n.s.;notsignificant). P<0.05*,P<0.01 Treatment Blank No choice % a P b F n.s. F * F n.s. F * F n.s No. of attracted insect Fig.21.Olfactory response to the adultsofl.delicatulaon fractionated layer(f1-f5)from A.altisima. a Olfactoryresponse(%)=Treatment/(Blank+Treatment)*100. b Thedata wasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferences from 50:50 responses(treated and untreated arms,n = 20, P<0.05 *,P>0.05 n.s.;notsignificant)

72 Treatment Blank No choice % a P b F n.s. F n.s. F n.s. F * F n.s No. of attracted insect Fig.22.Olfactory responsetotheadultsofl.delicatulaonfractionated layer(f21-f25)from A.altissima. a Olfactoryresponse(%)=Treatment/(Blank+Treatment)*100. b Thedata wasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferences from 50:50responses(treated and untreated arms,n = 20,P<0.05*,P>0.05n.s.; notsignificant). 다음은가죽나무로부터분리된 F24 에서활성물질을확인하고탐색하기위하여 GC-EAD 를이용하여꽃매미성충의안테나반응을확인하였다. 그결과, 꽃매미의반응을 Fig. 23 과같이전하흐름의파장을통해확인할수있었다.F24 의 GC 분석결과에서 retentiontime 645s 에나타난 peak 에대해안테나반응을나타냈다. GC-EAD 에서꽃매미안테나반응이나타났던 retention time645s 의 peak 의물질을동정하기위해 GC/MS 를이용하여활성물질의스펙트럼과분자량및패턴을확인하였다. 그결과, 가죽나무로부터추출한활성물질의분자량은 296 으로나타났으며데이터베이스와연동하여분자량과스펙트럼을비교한결과,C 20 H 40 O의 phytol 과동일물질임을확인할수있었다 (Fig.24)

73 Fig. 23. GC-EAD responses to the adults of L.delicatula on F24 fractionfrom A.altissima. Fig.24.Massspectrum and chemicalstructureofactivecomponentfrom fraction (F24)of A.altisima. GC/EAD 와 GC/MS 로확인된활성물질인 phytol 은 Aldrich(97%,USA) 에서구입하여, 꽃매미의성충에대해후각계검정을수행하였다.3 가지농도 (7.5,0.75,0.075%) 의 phytol 에대해꽃매미성충의후각계반응검정결과,7.5% 의농도에서 76.5% 의유인율이나타났으며 0.75% 에서도비슷한경향을나타내었다. 그러나 0.075% 의농도에서는유의성이없었다 (Fig. 25). 실제가죽나무와 Aldrich 에서구입한순도 97% 의 phytol 간유의성을확인하기위해앞과동일한방법으로 Olfactometer 를이용하여꽃매미의후각계검정을수행하였다 (Fig.26). 꽃매미는 phytol 의 7.5,0.75,0.075%, 세농도와가죽나무유묘사이에서모두유의차가관찰되지않았다. 이로써, 가죽나무와 phytol 에모두유인됨을알수있었다. 또한, 가죽나무에서추출된

74 활성물질인 F24 와순도 97% 의 phytol 간꽃매미의유인검정에서도 phytol 의세농도모두유 의성이관찰되지않았다 (Fig.27). 이역시도꽃매미는 F24 와 phytol 에대해비슷한유인율을 나타냈다. Pythol Blank No choice % a P b 7.5 % * 0.75 % * % n.s No. of attracted insect Fig.25.Olfactory responseto theadultsofl.delicatulaon each doseof phytol. a Olfactoryresponse(%)=Treatment/(Blank+Treatment)*100. b Thedata wasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferences from 50:50responses(treated and untreated arms,n = 20,P<0.05*,P>0.05n.s.; notsignificant)

75 Phytol Pot No choice % a P b 7.5 % n.s % n.s % n.s No. of attracted insect Fig.26.AtractionefectofL.delicatulaadultsonvariousdosesofphytol vs.wholeextractofa.altisimainanolfactometer. a Olfactoryresponse(%)=Treatment/(Blank+Treatment)*100 b Thedata wasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferences from 50:50 responses (treated and untreated arms,n = 20,P>0.05 n.s.;not significant). Phytol F24 No choice % a P b 7.5 % n.s % n.s % n.s No. of attracted insect Fig.27.AtractionefectofL.delicatulaadultsonvariousdosesofphytol vs.f24fractionofa.altisimainanolfactometer. a Olfactoryresponse(%)=Treatment/(Blank+Treatment)*100 b Thedata wasanalyzed using binomialsign teststo evaluatethediferences from 50:50 responses (treated and untreated arms,n = 20,P>0.05 n.s;not significant.)

76 3. 유인트랩시제품제작 가. 연구방법 (1) 트랩의색깔선발시험 유인트랩제작시사용할색깔을선발하기위해서꽃매미가어떤색깔에더많이유인되는지실험하였다.4 개의원형기둥 ( 높이 36cm) 의상단에각각색깔별 ( 파랑, 노란, 초록, 흰색 ) 트랩 (5cm) 을붙인후사각아크릴 cage(70cm 70cm) 에서로의간격이 30cm 가되도록각모서리에배열하였다 (Fig.28). 공시충으로는탈피한지하루지난꽃매미 2령약충 300 마리를방사하였으며, 처리후 1,2,4,8,12,24,48h 에유인정도를조사하였다. 모두 3반복으로실험하였으며온도 25±2, 상대습도 50%, 광주기 16:8(L:D) 조건하에서실험하였다. 또한야간에빛에의한유인효과를시험하기위해제작한형광색을지닌트랩을이용하여꽃매미유인효과시험을진행하였다.2 개의원형기둥 ( 높이 36cm) 의상단에형광색과대조군으로노란색트랩 (5cm) 을붙여실험하였다. 붙인원형기둥은사각아크릴cage(70cm 70cm) 에서로의간격이 30cm 가되도록하여중앙에배치하였다. 실험은 22:00 시에시작하였으며 48h 동안관찰하였다 (Fig.29). 공시충으로는탈피한지하루지난꽃매미 2령약충 200 마리를방사하였으며, 처리후 1,2,4,8,12,24,48h 에조사하였다. 모두 3반복으로실험하였으며온도 25±2, 상대습도 50% 조건하에서실험하였다. 초록 2 령약충 흰색 노랑 파랑 Fig.28.Anarangementplanoffourcolortraps

77 형광노랑형광노랑 낮 밤 Fig.29.Anarangementplanofluminousand yelow colortraps (2) 트랩의형태선발시험 트랩의형태에따른유인효과를검정하기위해서트랩은 sticky trap, 델타트랩, 원형트랩, 윙트랩을사용하였고,Lure 는 spearmintoil 을 20ul 처리한후 4 에서 24 시간동안보관하면서처리물질이완전히흡수되게한다음실험에사용하였다. 야외실험조건은포도과원가장자리에 20m 간격으로트랩을설치한다음 lure 를처리하고유인되는꽃매미수를조사하였다. 실험은각트랩별 3개를설치하였고 5,10,15 일후에각트랩에유인된꽃매미의수를기록하였다. 약충시기와성충시기에야외검정을수행하였다. (3) 유인루어제조 실험에사용된유인물질은 1차년도연구수행결과유인효과가뛰어났던 spearmintoil 로 HelgaStolzGmbH (Austria) 에서구입하여사용하였다 (Fig.32A).Spearmintoil 의휘발성을조절하기위하여시중에서판매되고있는 silicone sleeve septa 를사용하였다 (Fig.32B). Spearmintoil30 μl를 pipete 을이용하여 siliconesleevesepta 에떨어뜨린후, 용기에담아밀봉하고흡수될수있도록 4 저온실에 24 시간놓아둔후실험에사용하였다. 나. 연구결과 (1) 트랩의색깔선발시험 유인트랩색깔에따른꽃매미유인효과를조사한결과, 파랑색에 33 마리가유인되어 가장많이유인되었지만흰색, 노랑색, 초록색각각 32,30,27 마리가유인되어트랩색깔에 따른유인효과에는큰차이가없는것으로조사되었다 (Fig.30)

78 A. 색깔별트랩에잡힌꽃매미 2 령약충의모습 B. 색깔별트랩에잡힌꽃매미 2 령약충의마리수 Fig.30.AtractionefectofL.delicatulaadultsonvariouscolortraps(A and B). 야간에빛에의한유인효과를시험하기위해제작한형광색을지닌트랩을이용하여 꽃매미유인효과를시험한결과는대조군으로사용한노랑색트랩에비해형광색트랩에서유 의성있게꽃매미 2 령약충들이유인됨을알수있었다 (Fig.31)

79 A. 형광색트랩에잡힌꽃매미 2 령약충의모습 형광 노랑 B. 형광색트랩에잡힌꽃매미 2 령약충의마리수 Fig.31.AtractionefectofL.delicatulaadultsonluminouscolortrap(A and B). (2) 트랩의형태선발시험 트랩의형태에따른유인효과를검정하기위해서 sticky trap, 델타트랩, 원형트랩, 윙 트랩을설치하고 5,10,15 일후에각트랩에유인된꽃매미의수를조사하였다. 그러나 sticky trap 을제외한델타트랩, 원형트랩, 윙트랩에서는유인된꽃매미가없었다. (3) 유인트랩시제품제작 꽃매미유인트랩을제조하기위한트랩색깔에따른유인효과시험, 트랩형태에따른유인효과시험결과, 꽃매미는약충시기, 성충시기모두나무를기어다니는행동습성때문에델타트랩, 원형트랩, 윙트랩과같이별도의트랩을설치하여유인하는방법은실용성이없을것으로판단되고 sticky trap 과같이꽃매미의이동을차단하는트랩형태가꽃매미의피해를감소시키는데효과가있을것으로생각된다. 따라서유인트랩시제품은꽃매미의이동을차단하는데효과가있었던 stick trap 과

80 이를응용한 roltrap 의점착액에꽃매미유인물질 spearmintoil 을첨가한 stick trap 과 rol trap 2개를제조하였고, 꽃매미유살용유인트랩은유인제인 spearmintoil 을첨가한 silicone sleevesepta 를설치할수있는플라스틱망이있으며, 약충시기와성충시기모두나무를기어다니는행동습성을고려하여 Fig.32C 와같은구모양으로제작하여포도나무주관에설치할수있도록일명 날개트랩 을제작하였다. 유인트랩의상부와하부에는갈색의 sticky trap 을설치할수있게하였다. 실제포도나무에설치한모습은 Fig.32D 와같다. (A) (B) (C) Fig.32. 유인제인 spearmintoil(a), 루어 (B), 꽃매미유살용날개트랩 (C), 포도나무에 날개트랩을설치한모습 (D). 제 3 절꽃매미종합방제프로그램수립 1. 유기농업자재의현장적용시험 가. 시험방법 (1) 시험작물 ( 품종 )/ 수령 : 포도 ( 캠벨얼리 )/ 7 년생 (2) 꽃매미발생상황 : 자연발생하였으며, 약제처리전무처리구의평균밀도가 마리 로약효검토에충분하였다

81 (3) 처리내용 시험약제 깍지엔 주성분함량 (%) 56.3 (toosendanin +rotenone+ 목초액 ) 약효시험희석배수처리시기 및사용량 1,000 배 및방법 다발생기경엽처리 (9.5) 기준량 1,000 배 (9.5) 약해시험 배량 500 배 (9.5) 무처리 (4) 경종개요 : 시험기간전후시험포장에서는타살충제를전혀살포하지않았으며, 일 반관행 (1m 30cm 2m 10cm) 에따라설계된비가림이없는포도원에서실시하였다. (5) 시험구배치및면적 : 난괴법 3반복구분처리수반복수총구수구당면적소요면적총소요면적약효 m2 60 m2 90 m2약해 m2 30 m2 (6) 약제살포전후기상상황 : 강우 12 시간후모두건조된상태에서약제살포실시하였 고약제살포 24 시간후까지강우는없었다. * 약제살포일 월 / 일강우량 (mm) 최고 / 최저기온 ( ) 평균기온 ( ) 9/ / /5* / / / (7) 조사방법 구 분 조사항목 조사횟수 조사일자 조사방법 약효시험 생충률 3 9/5,9/8, 약제처리전및처리 3,7 일후전구에 9/12 대하여생충수조사 약해시험 약해유무 3 9/8,9/10, 약제처리 3,5,7 일후기준량, 배량에서 9/12 외관상나타나는약해유무달관조사 나. 시험결과 야외포장에서깍지엔의꽃매미에대한방제효과시험을실시한결과, 무처리에비해 3 일 과 7 일후의방제가가각각 69.4%,67.7% 로나타났다 (Table20). 또한시험약제는기준량과배

82 량모두에서외관상약해가관찰되지않았다 (Table21). 따라서포장실험결과시험약제는포 도꽃매미방제에실용성이있을것으로보인다. Table20. 시험약제처리후 3,7 일차방제효과 처리전밀도약제처리생충률 (%) 유의차시험약제 ( 마리 / 구 ) 후 Ⅰ반복 Ⅱ반복 Ⅲ반복평균 (DMRT) 깍지엔 a 3일차무처리 b 깍지엔 일차 a 무처리 b 방제가 (%) Table21. 시험약제처리 3,5,7 일후의약해조사 시험작물 약해정도 (0 5) * 기준량배량 비고 포도 ( 캠벨얼리 ) 0 0 약해없음 * 농약등록기준법 따라서주관연구기관은본연구를통해개발된 깍지엔 제품에대해기술실시계약을체 결하고사업화를할계획이다. 2. 유인트랩의현장적용시험 가.roltrap 시제품의약효시험 (1) 연구방법 충북청주시상당구용암동에있는포도원포장에서제작한 roltrap 을이용하여유인효과를시험하였다.roltrap 은황토색이며트랩내유인제로선발한 spearmintoil 을처리하였고, 대조구는 spearmintoil 을처리하지않은황토색의 roltrap 을사용하였다. 유인트랩은포도주관의 1m 높이에설치하였으며 (Fig.33) 설치후 10 일후에 roltrap 에붙은꽃매미의수를조사하였고,2 령약충을대상으로실험하였다

83 Fig.33. 포도주관에황토색 roltrap 을설치한모습 (2) 연구결과 실내검정에서유인효과가좋았던 spearmintoil 을처리한 roltrap 과처리하지않은 roltrap 간의꽃매미유인력을비교한결과큰차이는나타나지않았다 (Fig.34).1 차년도연구결과에의하면야외에서의 spearmintoil 의유인효과는꽃매미의발육단계와장소에따라차이를나타냈었고말령약충또는성충시기에사용하는것이훨씬효과적이라고하였다. 그러나본실험에서는트랩개발의지체로인해 2013 년봄에본실험을진행하여 2령약충을대상으로하였다. 따라서 spearmintoil 을처리한 roltrap 과처리하지않은 roltrap 간의차이가나타나지않은것으로생각된다. Fig.34.Spearmintoil 끈끈이트랩을이용한유인효과시험

84 나. 날개트랩의설치시기에관한연구 (1) 연구방법 ( 가 ) 날개트랩의꽃매미영기별유인효과시험 유인트랩의제품화를위하여자체제작한날개트랩의꽃매미에대한유인효과를검정하였다. 시험은충북청주시개신동 ( 충북대학교농업생명환경대학부속농장과수원 ) 에서포도 ( 캠벨얼리 )8년생을대상으로자체제작한날개트랩을주관에설치하였다 (Fig.35). 날개트랩에는갈색의 roltrap 과 spearmintoil 을처리한 silicon sleevesepta 를같이처리하였으며, 설치 10 일후에 roltrap 에붙은같은영기의수를기록하였다.1 령 (5 월 ),2 령 (6 월 ),3 령 (7 월 ) 과 4 령약충 (8 월 ) 과성충 (9 월 ) 으로나누어 3반복시험하였으며,spearmintoil 의처리량을약충과성충시기에각각 30,20 μl로다르게처리하여실험하였다. Fig.35. 자체제작한날개트랩을야외포장에대한유인효과를시험하기위한계획 (A) 과 실제포도나무에설치한모습 (B). ( 나 ) 날개트랩의월별유인효과시험 Spearmintoil 이처리된자체제작한날개트랩을 5월부터 11 월까지포도 ( 캠벨얼리 ) 8년생의야외포장 ( 충북청주시상당구용암동 ) 에설치하여꽃매미에대한월별유인효과를시험하였다. 유인효과조사는매월 10 일에유인트랩을 5반복으로설치하였으며, 설치 10 일후 stickytrap 에붙은꽃매미의수를기록하였다. 매월유인트랩설치시새로운유인루어로교체하여사용하였으며, 대조구로는현재시중에서판매되고있는갈색 stickytrap 을사용하였다

85 ( 다 ) 유인루어의지속력시험 자체제작한날개트랩의유인제로사용되는 spearmintoil 의유인루어의지속효과를 알아보기위하여 8 월과 9 월에종령약충과성충에대하여청주시개신동충북대학교야외포장 에서 8 년생포도 ( 캠벨얼리 ) 를대상으로영기별유인효과시험과동일한방법으로시험하였다. 유인루어는 30 μl를처리하여, 처음설치후각각 5,10,15,20 일에 roltrap 에붙은 꽃매미수를기록하고 roltrap 을교체하였다. 모든시험은 3 반복시험하였으며, 통계분석은 Tukey sstudentizedrangetest 로수행하였다 (SASInstitute,2010). (2) 연구결과 ( 가 ) 날개트랩의꽃매미영기별유인효과시험 날개트랩설치후꽃매미영기별유인효과를조사한결과,2 령과 3 령에서각각 69 마 리와 76 마리로다른영기보다많은수가포획되었다 (Fig.36). 따라서제작된트랩은꽃매미약 충 2 령과 3 령에서가장효과적인것으로확인되었다. Fig.36. 자체제작한날개트랩의꽃매미영기별유인효과 ( 나 ) 월별유인수에따른설치시기결정 월별유인수에따른설치시기결정을위해 5 월부터 11 월까지조사한결과,5 월에서 부터 7 월까지는유인효과가점차적으로증가하였고 8 월부터다소감소하여 9 월부터유인효과 가크게감소하였다 (Fig.37). 또한자제개발한트랩과기존시제품과의유인효과차이에는유

86 의성은없었지만많이포획되는 6,7 월에는기존시제품보다효과가더좋은것으로확인되었 다. Fig.37. 제작된트랩의월별유인효과 ( 다 ) 유인루어의지속력시험 유인트랩에유인제로사용된 spearmintoil 의유인지속효과는처리 5일후까지유인효과가높게나타났으나처리 10 일후부터유인효과가크게감소하였다 (Fig.38). 지속력이길지않은이유는휘발성이강한 spearmintoil 의특성으로인해초기에냄새가많이휘발되었기때문인것으로예상되어진다. 따라서완제품으로개발시장시간냄새를보존할수있는방법을보강할필요가있다

87 Fig.38. 유인루어의지속력시험 다. 날개트랩의설치방법에관한연구 (1) 연구방법 ( 가 ) 설치높이에따른유인효과시험 충북대학교포도 ( 캠벨얼리 )8년생야외포장에서 4령약충과성충에대하여자체제작한날개트랩을높이 1,1.5, 그리고 2m 높이의포도나무에설치하였다 (Fig.39).1m 높이는포도의주관에직접설치하였고,1.5m 와 2m 는 Fig.39B 와 C 같이철사와나무각목을이용하여각각설치하였다. 설치 10 일후 roltrap 에붙은꽃매미수를조사하였다. 조사시기는 8월 (4 령약충 ) 과 10 월 ( 성충 ) 두차례시험하였다

88 Fig.39. 높이에따라날개트랩을설치한모습.1m (A),1.5m (B),2m (C). ( 나 ) 설치수에따른유인효과시험 충북청주시상당구용암동에있는포도원포장에자체제작한날개트랩수를달리설치하여유인효과를시험하였다. 유인트랩모두포도주관 (1m) 에설치하였으며트랩의수는전체포도원에걸쳐 Fig.40 과같이 4,6, 그리고 8개를설치하였다. 트랩을설치한후 10 일후에 roltarp 에붙은꽃매미의수를조사하였다. 시험은 4령약충 (8 월 ) 과성충 (10 월 ) 을대상으로수행하였다. Fig.40. 유인트랩수에따른꽃매미의유인효과검정.(A)4 개,(B)6 개,(C)8 개. ( 다 ) 설치장소에따른유인효과시험 충북대학교포도 ( 캠벨얼리 )8년생야외포장에 2령약충을대상으로자체제작한유인트랩을높이 1.5m 지점에설치하였으며설치장소는 Fig.41 과같이기주인포도나무의주관과포도포장의철골구조물에설치하였다. 설치 10 일후 roltrap 에붙은꽃매미수를조사하였다

89 Fig.41. 날개트랩의설치장소에따른꽃매미의유인효과검정. 계획 (A) 및포도나무 (B) 와 포장내철골구조물 (C) 에설치한모습 (2) 연구결과 ( 가 ) 설치높이에따른효과시험 트랩의설치높이에따라유인효과를조사한결과,1.5m 의높이에서유인효과가크게증가하였으며다음으로는 1m 높이에서많이포획되었다.2m 높이에설치한결과아주낮은유인효과를보였다 (Fig.42). 그이유는꽃매미약충과성충은기주 ( 포도나무 ) 를기어다니는행동습성이있으므로굳이 2m 높이의비기주인나무각목에까지는기어가지않은것으로보인다

90 Fig.42. 트랩의설치높이에따른유인효과비교 ( 나 ) 설치수에따른효과시험 야외포장에서의트랩설치수에따른유인효과를조사한결과,4 령약충의경우설 치수가증가할수록유인효과가증가하였으나성충의경우설치수에따른유인효과는크게차 이나지않았다 (Fig.43). Fig.43. 트랩의설치수에따른유인효과비교

91 ( 다 ) 설치장소에따른효과시험 날개트랩의설치장소에따른꽃매미의유인효과를조사한결과, 포도나무주관에설치한경우가철골구조물보다유인효과가더크게나타났다 (Fig.44). 이와같은이유는기주나무를기어다니는꽃매미의습성으로인해기주나무에서더많이포획된것으로보인다. 따라서유인트랩은기주에설치하는것이가장효과적일것으로예상된다. Fig.44. 트랩의설치장소에따른유인력비교 이상의결과를종합하여볼때, 꽃매미방제를위한날개트랩의설치시기는 6 월 8 월, 설치높이는 1 1.5m 의포도주관에설치하고, 설치수는되도록많이설치해주는것이꽃매미 방제에효과적일것으로확인되었다. 3. 꽃매미종합방제프로그램수립 꽃매미종합방제프로그램수립을위하여본연구과제에서개발된시제품에대한현장적용 시험을통해약효를검증하였고이를활용하여방제프로그램 (Fig.45.) 을수립하였다. 가. 꽃매미월동기 꽃매미는난괴로월동하여 4월말 ~5 월에부화하기때문에이시기에방제하는것이중요하므로난괴에서부화하지못하도록하는방제방법이중요하다. 그러나화학농약및친환경방제제를분무처리하여방제하는방법은약제가난괴를둘러쌓고있는물질을침투하여살란효과를나타내기는어려우므로현재는난괴를제거하는방법을사용하고있다

92 본연구과제를통해개발된 끈끈이풀 은난괴에도포할경우 100% 부화가억제효과가 있어꽃매미부화시기에처리할경우효과가있을것으로판단되어 끈끈이풀 을처리하였다. 나. 약충발생초기 꽃매미약충발생초기에는포도나무줄기를기어오르는습성을가지고있고, 본연구겨 과유인물질인 spearmintoil 에유인되는효과가있다. 본연구과제에서개발된날개트랩은많이설치하면할수록약충을유인하는수가많아방제효과를높일수있지만방제비용및노동력등경제적인면에서 1,000m 2 에 5개를설치하고, 그외포도나무줄기에는꽃매미의약충을기어오르는습성을이용하여끈끈이풀일 10cm 너비로도포하여꽃매미약충이포도나무줄기를기어오르는것을차단하였다. 다. 약충및성충발생기 꽃매미월동기와약충발생초기에끈끈이풀과날개트랩으로발생을억제하고, 약충및성충발생기에외부에서유입되는꽃매미를방제하기위하여날개트랩과끈끈이풀에유인, 포획된수를조사하여예찰한후발생최성기에 10 일간격으로본연구과제에서개발된친환경방제제 깍지엔 을 2~3 회분무처리하여꽃매미의발생밀도를감소시키고자하였다. 상기의꽃매미의발생시기에따라본연구과제에서개발된시제품을적용하여포도나무의 피해를줄이고자방제프로그램을수립하고종합적현장적용시험을수행하였다. Fig.45. 꽃매미종합방제프로그램