hwp

Transcription

1 발현저하가파골세포분화에미치는영향 SERCA2 발현저하가파골세포분화에미치는영향 연세대학교대학원 이 지 치의학과 이지현 현

2 SERCA2 발현저하가파골세포분화에미치는영향 연세대학교대학원 치의학과 이지현

3 SERCA2 발현저하가파골세포분화에미치는영향 지도김경호교수 이논문을박사학위논문으로제출함 2006 년 6 월일 연세대학교대학원 치의학과 이지현

4 이지현의박사학위논문을인준함 심사위원심사위원심사위원심사위원심사위원 인인인인인 연세대학교대학원 2006 년 6 월일

5 감사의글 논문이완성되기까지참많은분들께마음의빚을졌습니다. 먼저시종일관세심한조언과격려를베풀어주신김경호교수님과신동민교수님께진심으로감사드리며, 아낌없는지도편달해주신박영철학장님, 이승일교수님, 최광철교수님, 서정택교수님, 그리고처음교정학을공부하는데있어서도움을주신유영규교수님, 손병화교수님, 백형선교수님, 황충주교수님, 유형석교수님, 이기준교수님께깊은감사를드립니다. 아울러본논문과실험에많은도움을주신구강생리학교실의조해선생님께감사드리며, 늘웃는얼굴로반갑게맞아주고붙임성없는저를한식구처럼대해준구강생리학, 약리학교실원들께도고마운마음을전합니다. 마지막으로살아가는데있어서힘의원천이되는사랑하는남편과귀염둥이딸하영이그리고항상저를믿고후원해주시며지금이순간가장기뻐하실아버지, 어머니, 아버님, 어머님께무한한감사의말과함께이작은결실을바칩니다 년 6 월 저자씀

6 차례 그림차례 vii 국문요약 ix I. 서론 1 Ⅱ. 실험재료및방법 7 1. 실험재료 7 2. 실험방법 7 가. 세포배양 7 나. 세포내칼슘농도측정 9 다. 파골세포로의분화유도및 TRAP 염색 9 라. 면역반응염색 10 마. 면역형광염색 10 바. 파골세포의활성도측정 11 사. 골밀도의측정 11 아. 통계학적분석 12 Ⅲ. 결과 SERCA2 +/- 생쥐와대조생쥐의대퇴골에서골밀도측정 SERCA2 +/- 생쥐와대조생쥐로부터분리된파골세포전구세포에서의칼슘신호 파골세포분화제인 RANKL 처리후 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포에서의칼슘신호 대조생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의 SERCA 및 PMCA 단백의발현 RANKL 처리후 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포에서 NFATc1의발현및핵내로의이동 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포로부터분화된다핵세포의형성량과골흡수능력 24 Ⅳ. 고찰 27 - i -

7 Ⅴ. 결론 31 참고문헌 33 영문요약 39 - ii -

8 그림차례 Fig. 1. RANKL-induced signaling pathways and the role of Ca 2+ signaling in osteoclastogenesis. 5 Fig. 2. The role of SERCA in the Ca 2+ signaling complex. 6 Fig. 3. SERCA2 gene targeting strategy and Genotyping analysis. 8 Fig. 4. Bone morphology and bone density of SERCA2 +/- mice compared to wild-type. 14 Fig. 5. Bone density analysis of SERCA2 +/- mice compared to wild-type. 15 Fig. 6. Measurement of Ca 2+ release and Ca 2+ influx in BMMs from SERCA2 +/- and wild-type mice. 17 Fig. 7. Ca 2+ oscillations before and after 48hrs of RANKL stimulation in osteoclast precursor cells from SERCA2 +/- and wild-type mice. 19 Fig. 8. Expression of Ca 2+ signaling proteins by RANKL stimulation. 21 Fig. 9. NFATc1 expression and nuclear translocation stimulated by RANKL iii -

9 Fig. 10. Differentiation into multinucleated osteoclasts by RANKL stimulation. 25 Fig. 11. Bone resorbing activity of osteoclasts iv -

10 국문요약 SERCA2 발현저하가파골세포분화에미치는영향 분화된파골세포는뼈에서칼슘을재흡수하여혈장내의칼슘농도를변화시켜뼈를재구성하게된다. 조골세포에서분비된 receptor activator of NFκB ligand (RANKL) 는전구세포로부터파골세포분화를유도한다. RANKL 신호는전구세포내 TNF receptor associated factor 6 (TRAF6) 를시작으로 NFκB, c-fos, JNK, 그리고 ERK와같은다양한신호전달기전을활성화시키는것으로알려져있으며, 최근칼슘신호가최종적인분화단계과정에서발생함이밝혀졌다. 칼슘신호는세포내칼슘농도의증가와감소를통해나타난다. 그러나아직까지파골세포전구세포에서칼슘신호의변동이분화과정에어떠한영향을미치는지에대해정확히알려진바가없다. 칼슘신호관련단백중하나인 sarco/endoplasmic recticulum Ca 2+ ATPase 2 (SERCA2) 는세포내칼슘농도를낮게유지하는역할 을수행한다. 본연구자는 SERCA2를발현시키는유전자인 ATP2A2 중하나를결여시킨 SERCA2 이형접합자생쥐 (SERCA2 +/- ) 에서골밀도의증가를확인하였다. 이에본연구에서는 SERCA2 이형접합자생쥐에서분리된파골세포전구세포에서 SERCA2의발현저하가파골세포분화과정에어떠한영향을미치는지를세포생리학적, 생화학적방법을통해알아보고자하였다. SERCA2 +/- 와대조생쥐에서분리된파골세포전구세포에서칼슘 dye인 Fura2의형광정도를세포내칼슘농도로간주하여측정비교하였고, 파골세포분화과정에관여하는단백들의발현과활성도를면역반응법과면역형광염색법으로확인하였으며, RANKL에의한파골세포분화정도를 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색법과 pit assay를통해확인하였다. 미세컴퓨터단층촬영과골염색법을통해 SERCA2 +/- 에서는대조생쥐에비해약 50% 정도골밀도가증가하였다. SERCA2 +/- 파골세포전구세포에서 SERCA를 - v -

11 억제하여측정된소포체내칼슘의양은대조군에비해감소하였으며, 효현제자극시유리되는칼슘농도역시대조군에비해감소하였으나, 소포체내칼슘고갈에따른칼슘유입량은대조군과실험군간차이가없었다. 파골세포분화제인 RANKL 처치시대조전구세포에서는약 24시간에서 72시간까지세포내칼슘농도의주기적변화 ([Ca 2+ ] i oscillations) 가관측되었으나, SERCA2 +/- 에서는칼슘신호가관찰되지않았다. 대조군에비해 SERCA2 +/- 에서는 SERCA의발현이감소하 였으며, plasma membrane Ca 2+ ATPase 의발현은동일하였다. RANKL 처리후 48 시간에서칼슘신호에의해활성화되는 nuclear factor of activated T cell (NFATc1) 의발현양과 NFATc1 의핵내로의이동이 SERCA2 +/- 에서감소하였 다. RANKL 처리 6일후에 SERCA2 +/- 에서는다핵세포로의분화가현저히감소하였으며, 다핵세포형성인식표지인 actin ring의형성이거의발생하지않았다. 더불어 SERCA2 +/- 에서는골흡수능력이약 70% 정도감소하였다. 이상의결과는기존에알려진 RANKL 신호전달경로에서칼슘신호의활성화가파골세포분화과정에필수적인신호임을의미하며, 이와연관된향후연구는파골세포분화과정의생리적이해에필요하다고판단된다. 핵심되는말 : 파골세포, RANKL, SERCA2, SERCA2 이형접합자생쥐, 칼슘신호전달 - vi -

12 SERCA2 발현저하가파골세포 분화에미치는영향 < 지도교수김경호 > 연세대학교대학원치의학과 이지현 I. 서론 파골세포 (osteoclast) 는골흡수능력을보이는특수한세포로서조골세포 (osteoblast) 와연계하여혈장내칼슘이온의항상성을유지하고성장기아동의골격성장그리고성인에서평생동안지속적으로일어나는골개조시중심적인역할을담당한다. 골개조에의해골은지속적으로새로운골조직으로대체되는데 (Manolagas, 2000) 이과정의균형에문제가발생하면, 관절염, 치주염등의질환을일으키고, 골다공증및골경화증과같이골구조에도영향을미치게된다 (Helfrich, 2003). 한편, 교정적치아이동은기계적자극에대한치주인대세포및치조골내여러세포들의반응으로치조골개조가일어나는현상인데예로부터압박부위에서의골흡수와인장부위에서의골침착으로설명되어왔다 (Reitan, 1960, 1964; Storey, 1973). 이때일어나는조직학적변화및세포내 kinetics에대한연구는있었으나 (Smith와 Roberts, 1980; Roberts 등, 1981), 세포및분자생물학적수준의연구는아직미흡한상황이다. 특히파골세포에의한골조직의흡수가치아이동속도를결정짓는중요인자임을감안할때 (Roberts, 2000) 파골세포의분화기전에대한이해는교정치료에있어서필수적이다

13 파골세포는단핵 / 대식세포계열의조혈세포전구세포로부터기원한다. 파골세포가골조직에부착하여산과여러종류의분해효소를분비하는다핵의거대세포가되기위해서는일련의분화과정을거쳐야한다. 이과정은 1) 조혈기관에서파골세포전구세포 (osteoclast progenitor) 의증식 2) 골흡수부위로의이동 3) commited osteoclast로의분화 4) 다핵거대세포로의융합으로이루어진다 (Ash 등, 1980; Tran Van 등, 1982). 이러한파골세포의분화는조골세포전구세포및골수간엽기원세포 (mesenchymal stromal cell) 에의해조절된다. 조골세포전구세포및골수간엽기원세포로부터 receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) 와 macrophage colony stimulating factor (M-CSF) 가발현되어파골세포의분화를조절한다. M-CSF는파골세포전구세포및파골세포의생존신호를제공하며, RANKL은 tumor necrosis factor (TNF) 계열의 cytokine으로서파골세포전구세포의 RANK 수용체와결합하여파골세포의분화, 다핵거대세포로의융합, 활성화그리고생존을위한신호를전달하게된다 (Khosla, 2001; Katagiri와 Takahashi, 2002; Boyle 등, 2003). RANKL-RANK 결합은세포내 TNF receptor associated factor 6 (TRAF6) 와 c-fos 신호전달체계를활성화시켜궁극적으로 nuclear factor of activated T cell 1 (NFATc1) 전사인자를활성화시킨다. NFATc1은파골세포분화의최종전사인자로서자가증폭과정을통해 NFATc1 자체의전사를증가시키는특징이있으며, AP-1과함께 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), 칼시토닌수용체그리고 cathepsin K 등의파골세포특이유전자의발현을유도한다 (Takayanaki 등, 2002, 2005) ( 그림 1). 현재전세계적으로파골세포의분화와관련되어연구되고있는경향은 RANKL 이파골세포와결합하여 TRAF6, JNK, 그리고 NF-κB 까지이어지는신호전달기전에대한연구에집중되고있다. 이는 RANKL이전구세포와결합된후주로 24시간안에이루어지는기전이다. 그러나여러전사인자가핵내로들어가다양한유전자발현을조절한이후즉, 분화중기 (24시간) 이후에대해서는잘알려져있지않다. 다만, 최근분화중기이후세포내칼슘농도의주기적변화 (Ca 2+ oscillation), 즉칼슘신호가관찰되었으며, 칼슘신호가 calcineurin (Ca 2+ /calmodulin 의존성탈인산화효소 ) 과이하신호전달계인 NFATc1의활성을조절함으로써최 - 2 -

14 종적인분화단계에관여함이밝혀졌다 (Takayanaki 등, 2002, 2005; Koga 등 2004). 현재칼슘신호는파골세포분화과정의필수적인신호전달체계로인식되고있는데, 특히세포내칼슘치환제로파골세포전구세포를처리하면분화과정이억제되었다는결과는칼슘신호가파골세포분화과정에서매우중요한역할을하고있음을시사한다 (Takayanaki 등, 2002). 세포내자유칼슘이온은주로호르몬이나신경전달물질에의해증가되는데, 증가된세포내칼슘이온은유전자발현, 성장과분화, 외분비액의분비, 근육수축, 신경물질의전달, 기억과학습등의다양한생체내반응을조절한다 (Berridge 등, 2003). 세포내칼슘이온농도는기저상태에서세포외부에비해 1/10,000정도의낮은수준으로유지되다가외부신호가전달되면세포내농도가증가한후 calmodulin 등칼슘결합단백들과결합하여단백질인산화효소와단백질탈인산화효소의활성도를조절한다. 특히파골세포분화과정에서칼슘신호는탈인산화효소인 calcineurin의활성화를매개로 NFATc1의활성화에중요한역할을한다 (Takayanaki 등, 2002, 2005; Koga 등 2004). 이때칼슘신호는칼슘 oscillation이라는독특한형태로나타나는데, 이는세포내칼슘농도의증가와감소가반복되는현상이다. 일반적으로비흥분성세포에서세포내칼슘농도의증가는세포내칼슘의저장소인소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 에서의칼슘유리와세포외부로부터의칼슘유입에의하며, 세포내칼슘의감소는칼슘완충단백들과소포체막 칼슘펌프 (sarco/endoplasmic Ca 2+ ATPase, SERCA), 세포막칼슘펌프 (plasma membrane Ca 2+ ATPase, PMCA) 와같은칼슘펌프에의한다 (Kiselyov 등, 2003; Shin 등, 2003) ( 그림 2). 파골세포분화과정에서칼슘신호발생은다양한면역수용체및 RANKL-RANK 상호작용에의한 immunoreceptor tyrosine-based activation motif-harbouring adaptor (ITAM) 의인산화로부터시작되는것으로알려져있다 (Koga 등, 2004; Takayanaki 등, 2005). ITAM은 phospholipase Cγ (PLCγ) 를활성화시키며 PLCγ는세포막에존재하는 phophatidyl-inositol-diphosphate (PIP2) 를가수분해하여 inositol 1, 4, 5-triphosphate (IP 3 ) 가증가하며, 증가된 IP 3 는세포내 칼슘저장고로알려진소포체의 IP 3 수용체 (IP 3R) 의칼슘투과도를변화시켜세포 - 3 -

15 질로의칼슘유리를촉진시킨다. 더불어소포체로부터의칼슘유리에따른고갈은세포막에존재하는칼슘저장고의존성칼슘이온통로 (store-operated Ca 2+ channel, SOCC) 의전도도를변화시켜세포외부의고농도의칼슘을세포내로유입시키도록한다 (Kiselyov 등, 2003). 이와같이세포내증가된칼슘이온은칼슘펌프에의해제거되는데, SERCA는칼슘이온을소포체로유입시킴으로써세포내칼슘농도를낮게유지하는역할을수행한다. SERCA는 1, 2 그리고제 3아형으로분류되는데 (Wuytack과 Raeymaekers, 1992; Verboomen 등 1992, 1994) 그중에서 SERCA 제 2아형 (SERCA2) 은거의모든세포에서발현되며가장중요한역할을수행한다고알려져있다 (Gunteski-Hamblin 등, 1988). SERCA2는칼슘신호와연관된주요단백으로 ATP2A2 유전자에의해발현된다. ATP2A2 유전자중하나를결여시킨실험동물모델인 SERCA2 이형접합자생쥐 (SERCA2 +/- ) 에서본연구자는골밀도의증가를확인하였다. 이에 SERCA2 가칼슘신호와골개조에관여할가능성이있어, 본연구에서는 SERCA2 이형접합자생쥐에서분리된파골세포전구세포에서 SERCA2의발현저하가파골세포분화과정에어떠한영향을미치는지를세포생리학적, 생화학적방법을통해알아보고자하였다

16 Fig. 1. RANKL-induced signaling pathways and the role of Ca 2+ signaling in osteoclastogenesis. RANKL-RANK interaction results in NFATc1 activation via the c-fos and TRAF6 signaling pathways. Recent studies have revealed that Ca 2+ signaling mediated by calcineurin is critical for NFATc1 activation. NFATc1 leads to the induction of osteoclast specific genes during the terminal differentiation of osteoclasts. (RANKL, receptor activator of NF-κB ligand; NFATc1, nuclear factor of activated T cell; TRAF6, TNFR-associated cytoplasmic factor) - 5 -

17 Fig. 2. The role of SERCA in the Ca 2+ signaling complex. Binding of an external signaling molecule to a receptor leads to a cascade of intracellular signaling which induces IP 3 formation. IP 3 induces [Ca 2+ ] i increase via release of Ca 2+ from ER and Ca 2+ entry through a Ca 2+ channel. SERCA and PMCA pumps remove Ca 2+ from the cytosol to reduce [Ca 2+ ] i back toward resting levels. (SERCA, sarco/endoplasmic reticulum Ca 2+ ATPase; IP 3, inositol 1,4,5-triphosphate; PMCA, plasma membrane Ca 2+ ATPase) - 6 -

18 II. 실험재료및방법 1. 실험재료 미국 Cincinnati 의과대학의 Garry E. Shull 박사의실험실로부터제공받은 SERCA2 +/- 생쥐를교배시켜태어난후 2 주가되었을때유전자검사후실험군 인 SERCA2 +/- 생쥐와대조생쥐로분류하여생쥐가태어난지 4주가되었을때파골세포전구세포 (bone marrow derived monocyte/macrophage precursor cells) 를각각의생쥐대퇴골에서분리하여사용하였다 ( 그림 3). RANKL은 KOMA Biotech. Inc. (Seoul, Korea) 에서구입하였다. 세포배양에필요한 α-mem 배지및 FBS는 GIBCO/BRL (Grand Island, NY) 에서구입하였다. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining kit, toluidine-blue 그리고 phalloidin 항체는 Sigma Chemical Co., Ltd (St. Louis, MO) 에서구입하였다. ERK 다중항체, phospho-erk 다중항체, JNK 다중항체, phospho-jnk 다중항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) 에서구입하였으며, PMCA 단일항체는 Transduction Laboratory (San Jose, CA, USA) 에서, NFATc1 다중항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (CA, USA) 에서구입하였다. 그리고 IP 3R3 다중항체는 Tanimura 박사 ( 일본, 호카이도치과대학 ) 로부터제공받았다. Fura-2/AM과 pluonic F-127은 Molecular probe (Eugene, OR, USA) 에서구입하였다. 2. 실험방법 가. 세포배양 정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포는 5% CO2와 95% air가지속 - 7 -

19 Fig. 3. SERCA2 gene targeting strategy and Genotyping analysis. (A) Top, restriction map of wild-type allele including 3 kinds of exons. Middle, targeting construct in which 1.5 kb of SERCA2 genomic sequence, containing exons 1 and 2 and part of exon 3, was replaced by the neo gene. The herpes simplex virus thymidine kinase gene was placed 5' to the SERCA genomic sequence. Bottom, targeted SERCA2 allele, with BamHI restriction fragments identified by 5' and 3' probes indicated below. Restriction enzyme sites: B, BamHI; Bg, BglII, Sp, Spel; S, SacI. (Adapted from Periasamy M et al J Biol Chem 274: , 1999). (B) Genotyping analysis of tail DNA from offspring of SERCA2 +/- matings. Left band indicates wild-type gene. Right bands, which include two bands, indicate SERCA2 +/ gene

20 적으로제공되는 37 C 세포배양기에서 10% FBS와 1% antibiotics를포함하고있는 α MEM 배지로배양하였다. 최초분리시 100mm 배양접시에 M-CSF(10ng/ml) 와함께하루동안초기배양후, 다시실험목적에맞는배양접시로분주한후, 48시간이후에 RANKL (50ng/ml) 과 M-CSF (50ng/ml) 를처리한후사용하였다 ( 단, 각각의대조군은 M-CSF 만처리하였으며, RANKL은처리하지않았다 ). 배지교체시에는항상 RANKL과 M-CSF의양은 50ng/ml로일정하게유지하였으며, 각각의세포는동일한조건과환경하에서배양하였다. 나. 세포내칼슘농도의측정 정상생쥐와 SERCA2 +/- 파골세포전구세포에 RANKL과 M-CSF 처리시 35 mm 배양접시에유리로된 cover-slip (22 x 22) 을올려놓은뒤, 배양접시당 2 X 10 5 개의세포를분주하였다. 그로부터 48시간이후에배지제거후 PSS (physiological salt solution, 140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl 2, 1mM CaCl 2, 10mM HEPES, 10mM glucose, ph7.4, 310mOsm) 에 Fura-2/AM을 5μM의농도로실온에서 40분간세포내에축적하였다. 340nm와 380nm의두파장으로세포내 Fura-2/AM을활성화시켰으며, 510nm의파장으로칼슘을측정하였다. 두파장으로부터활성화된값은각각의파장값에서다음과같은계산을거친이후적용되었다. (Ratio = F 340 /F 380 ) 세포로부터나오는형광은현미경에부착되어져있는 CCD (Photon Technology International Inc, Lawrencevile, NJ) 카메라로측정하였으며 2초당한장씩 30분간측정되었다 (Hong 등, 2004). 다. 파골세포로의분화유도및 TRAP 염색 정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포를 48 well plate 에 well 당 5 x 10 4 의수로분주한뒤 48 시간이지난이후 RANKL 과 M-CSF 를처리하였다

21 6 일이지난뒤, 파골세포로의분화를확인하기위하여 TRAP 염색을실시하였다. TRAP ( 파골세포의표지단백질 ) 염색은 leukocyte acid phosphate assay kit (Sigma Chemical Co., Ltd St. Louis, MO) 을이용하여수행하였다. 라. 면역반응검색 정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포를 60mm 배양접시에분주 한뒤이틀후 RANKL과 M-CSF을처리하고원하는시간동안배양하였다. Lysis buffer (20 mm Tris, ph7.4, 250 mm NaCl, 2 mm EDTA, ph 8.0, 0.1% Triton-X100, 0.01 mg/ml aprotinin, mg/ml leupeptin, 0.4 mm PMSF, and 4 mm NaVO4) 를이용하여정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포로부터전체단백질을원심분리를통해추출하였다. Well 당 ug의동량단백질을전기영동법을사용하여 8% SDS-page gel에서크기별로분리하였다. 분리된단백질들을 nitrocellulose membrane에전기적으로이동시킨다음 6% skim milk를사용하여 blocking과정을거친후, NFATc1 (1:1000), total-erk (1:1000), phospho-erk (1:1000), total-jnk (1:1000), phospho-jnk (1:1000), 그리고 NF-κ B p65 (1:1000) 의항체를이용하여 blotting하였으며, 이후 HRP-conjugated 이차항체를실온에서한시간동안반응시킨뒤, chemiluminescence (ECL, Amersham Pharmacia Biotech) 를사용하여단백질의발현정도를확인하였으며, 발현정도는 Meta Morph Program를이용하여측정하였다. 마. 면역형광염색 정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포를 poly-l-lysine 코팅되어있 는얇은유리판 (22 x 22) 위에분주한뒤다음날 RANKL과 M-CSF를처리하고원하는시간동안배양하였다. 4% paraformaldehyde (PFA) 를 20분간처리하여세포를고정시킨이후 0.2% Triton X-100을 5분간처리하였다. 이후 5% goat serum이들어있는 blocking solution (0.1% gelatin, 1% BSA, 0.01% Na azide) 을

22 30분간처리하고, NFATc1 단일항체를세포에처리하여세포내부의 NFATc1을표지하였다. 이어서 Alexa 488-labeled IgG antibody (Molecular Probe) 이차항체와함께 4 에서 24시간배양후, PBS로 1회세척후 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 를처리하여 1회세척했다. 이후에 PBS만으로 1회세척후, mounting media로슬라이드글라스에고정시킨후 24시간이지난후 confocal microscope (Leica TCSNT) 으로형광을관찰하였다. 단, 파골세포의 actin ring 형성을알아보기위해처리한 phalloidin 항체의경우, phalloidin 항체만을세포에처리하여세포내부의 actin을표지하였으며, 이차항체의처리없이세척후즉시, mounting media로슬라이드글라스에고정시킨후 24시간이후에 confocal microscope으로형광을관찰하였다. 바. 파골세포의활성도측정 정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포를최초분리시 100mm 배양 접시에 M-CSF (10ng/ml) 와함께하루동안초기배양후, 각각의세포를 osteoclast activity assay substrate (OAAS, Oscotec, Korea) 에 5 x 10 4 수로분 주한후 48시간이후배지교체시 RANKL과 M-CSF를처리한후 6일동안배양하였다. 배양하는동안배지는 4일에한번씩교체하였으며, 교체시 RANKL과 M-CSF 또한정해진농도를유지시켰다. 실험방법 ( 가 ) 의세포배양시와같은조건에서배양하였다. 형성된 pit의사진은현미경 (Eclipse TE2000-U, Nikon, Japan) 에부착된디지털카메라를이용하여 20배의배율에서촬영되었다. pit의면적은 MMP를이용하여측정하였다. 사. 골밀도의측정 사 -1. Toluidine-blue 염색법 정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의대퇴골을분리한후, 4% paraformaldehyde 에

23 일동안 4 에서고정시킨후, paraffin wax에 embed 하였다. 미세절편기 (CM3050S, Leica, Germany) 를이용하여 6µm의두께로가늘게썰은후 Xylen (x2), 100%, 95%, 90%, 80%, 70% (EtOH) 의순서로 rehydrogenation 시킨후, Toluidine-blue 시약을약 30초간처리후 rehydrogenation의역순으로 dehydrogenation 시켰다. Mounting media로슬라이드글라스에고정시킨후 24 시간이후에현미경에부착된디지털카메라에서 10배율로촬영하였다. 사 -2. 미세단층촬영에의한골밀도분석법 정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의뒷다리를절개한후대퇴골을제외한부분을제 거하였다. 생쥐의대퇴골을고정하기위하여 polystyrene holder 를제작하였으며, 기계조작중양생쥐에서분리된대퇴골이각각따로촬영될시에생길수있는 threshold 와 resolution 의설정의차이를배재하기위하여동일 polystyrene holder 에정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의대퇴골을각각 2 개씩삽입한후 3 차원 미세단층촬영기 (SkyScan-1076 high-resolution in-vivo micro-ct system, Aartselaar, Belgium) 를이용하여투과이미지를얻었으며, 제조사소프트웨어인 Cone beam reconstruction과 CTAn을이용하여단층이미지와골밀도를분석하였다. 3 차원이미지는단층이미지를재조합하여응용프로그램을통하여얻어졌다. 아. 통계학적분석 Student t-test 를실시하여통계학적으로분석하였으며, P<0.05 일때유의성있 는차이로간주하였다

24 III. 결과 1. SERCA2 +/- 생쥐와대조생쥐의대퇴골에서골밀도측정 파골세포전구세포의분화과정에서 RANKL 처리후 24시간에서 72시간동안칼슘신호전달이발생한다. 그러나아직까지파골세포전구세포에서칼슘신호의변동이분화과정에어떠한영향을미치는지에대해정확히알려진바없으며, 실험동물에서칼슘신호변동이골밀도의변화에어떠한영향을미치는지역시알려진바없다. SERCA 펌프는칼슘신호전달계와밀접한연관성을갖는단백으로, SERCA2 +/- 생쥐에서는 ATP2A2 유전자의감소로인한 SERCA2의발현저하가골형성에영향을줄가능성이있다. 이에정상생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의대퇴골의외형적인변화와내부에서의골밀도의변화를확인하였다. 각각의생쥐에서대퇴골을분리하여확인해본결과, 크기나외형에커다란이상을보이지않았다 ( 그림 4A, n=4). 그러나 3차원미세단층촬영기를통하여뼈내부의골밀도를이 차원그리고삼차원적으로측정해본결과, SERCA2 +/- 생쥐의대퇴골에서는대조 생쥐에비해약 1.5배가량골밀도가증가한것을확인하였으며 ( 그림 4B와 5A와 B, ± 11.39%, n=4, P<0.05), toluidine 시약을이용해뼈를염색해본결과 또한 SERCA2 +/- 생쥐의 대퇴골에서 골밀도가 증가함을 확인하였다 ( 그림 4C, n=6)

25 Fig. 4. Bone morphology and bone density of SERCA2 +/- mice compared to wild-type. (A) No difference considering tibial bone length and morphology was found between SERCA2 +/- and wild-type mice. However, three dimensional micro-computed tomography (micro-ct) reconstruction (B) and toluidine blue staining (C) showed increased tibial bone density in SERCA2 +/- mice compared to wild-type. Images are representative of 4-6 independent experiments

26 Fig. 5. Bone density analysis of SERCA2 +/- mice compared to wild-type. Two-dimensional micro-ct images were used to compare bone density (A) According to bone density analysis using a software program provided by the manufacturer, SERCA2 +/- mice showed a mean 1.5 fold increase in bone density compared to wild-type (B) Results are representative of 4 independent experiments (P<0.05)

27 2. SERCA2 +/- 생쥐와대조생쥐로부터분리된파골세포전구세포에서의칼슘 신호 그림 4 와 5 에서의실험쥐와대조생쥐간의골밀도차이는실험쥐의파골세포 형성또는활성의감소에의해나타날가능성이있다. 또한 SERCA2 +/- 생쥐에서 칼슘신호전달단백중하나인 SERCA2 유전자의결여는파골세포전구세포의 칼슘신호전달계에영향을줄가능성이있다. 이에대조생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐 로부터분리한파골세포전구세포에 M-CSF를선처리하여양세포를생존시키면서, 다양한방법을통해양세포간의칼슘신호를비교하였다. 즉, 효현제의자극에의한칼슘농도의증가, 소포체내칼슘의양과외부로부터의칼슘유입량을측정하여양세포간의칼슘신호를확인하였다. SERCA2 +/- 와대조생쥐에서분리된파골세포전구세포에서칼슘 dye인 Fura2의형광정도를세포내칼슘농도로간주하였다 (ratio=340/380). SERCA 억제제인 1 μm thapsigargin (Tg) 로 SERCA를저해함과동시에 G-단백연계수용체의효현제인 ATP 1mM로동시자극한결과대조생쥐로부터분리한파골세포전구세포에서의세포내칼슘농도의최대치는 1.64 ± 0.15이었으며, SERCA2 +/- 생쥐로부터분리한파골세포전구세포에서의세포내칼슘농도는 0.54 ± 0.05이었다 ( 그림 6A, n=4, P<0.001). Tg을이용하여소포체내의칼슘을완전히고갈시킨후, 세포외부로부터의칼슘유입에따른세포내칼슘농도의증가는대조생쥐로부터분리한파골세포는 0.53 ± 0.06이었으며, SERCA2 +/- 생쥐로부터분리한전구세포에서는 0.55 ± 0.10 이었다 ( 그림 6B, n=4). 또한 ATP 1mM 만으로자극한경우세포내칼슘농도의최대치는대조생쥐에서 1.44 ± 0.06, SERCA2 +/- 생쥐에서 0.97 ± 0.04 이었으며, ATP 존재하에외부칼슘 유입에의한칼슘농도의최대치는대조생쥐에서 1.10 ± 0.18, SERCA2 +/- 생쥐에 서는 0.91 ± 0.05 이였고, Tg 존재하에외부로부터의칼슘유입에따른농도의최 대치는대조생쥐 0.49 ± 0.08, SERCA2 +/- 생쥐는 0.52 ± 0.07 이었다 ( 그림 6C, n=4). 이상의실험결과는 SERCA2 +/- 생쥐에서소포체내의칼슘의양과효현제자 극에따른칼슘농도는감소한반면, 외부유입되는세포내칼슘농도의증가에는 대조생쥐와비교하여유의성있는차이가없음을의미한다

28 Fig. 6. Measurement of Ca 2+ release and Ca 2+ influx in BMMs from SERCA2 +/- and wild-type mice. (A) In order to measure the amount of Ca 2+ release from ER, BMMs were stimulated by ATP 1mM in the presence of Tg 1μM, a specific SERCA inhibitor. (B) Ca 2+ influx was measured by initially emptying the ER Ca 2+ store, treating the cells with ATP 1mM and Tg 1μM in a Ca 2+ -free medium and then changing it to a regular medium. (C) Intracellular Ca 2+ level increase followed by ATP stimulation was measured. Then Ca 2+ influx after ER Ca 2+ store emptying was measured. Finally, Ca 2+ influx in the presence of Tg was measured. Results are representative of 4 independent experiments. (BMMs, bone marrow derived monocyte/macrophage precursor cells; ATP, adenosine triphosphate; Tg, thapsigargin; ER, endoplasmic reticulum)

29 3. 파골세포분화제인 RANKL 처리후 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포 에서의칼슘신호 그림 6에서확인된칼슘신호의변동은 RANKL 처리후유발되는분화중기이후의칼슘신호에영향을미칠가능성이있다. 이에 RANKL 처리후유발되는양세포에서의칼슘신호를비교하였다. 대조생쥐세포에서는파골세포의분화유도인자인 RANKL (50ng/ml) 처리시 24-72시간대에걸쳐세포내칼슘농도의주기적변화 (Ca 2+ oscillations) 가유발된다. 본실험에서는 Ca 2+ oscillations의최대치가나타나는 RANKL 처리후 48시간에서대조생쥐에서는 Ca 2+ oscillations이관찰된반면 ( 그림 7C), SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포에서는 RANKL 처리후 48시간에서도칼슘신호가발생하지않았으며 ( 그림 7D), 24와 72시간대에서도칼슘신호가발생하지않았다 (n=4)

30 Fig. 7. Ca 2+ oscillations before (A,B) and after 48hrs (C,D) of RANKL stimulation in osteoclast precursor cells from SERCA2 +/- and wild-type mice. Note that Ca 2+ oscillations are not evoked in SERCA2 +/- mice. Results are representative of 4 independent experiments

31 4. 대조생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의 SERCA 및 PMCA 단백의발현 그림 7에서의대조생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포에서의칼슘신호, 즉 Ca 2+ oscillations의유도차이는그림 4에서의소포체내의칼슘의양의차이와더불어, 칼슘관련단백들의발현변동에의해나타날가능성이있다. 이에양세포에서 RANKL 처리후시간대에따른칼슘신호관련단백의발현의변동을알아보았다. SERCA2 단백은 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포에서 RANKL을처리하지않았을때에대조생쥐에비하여발현양이 ± 3.89 % 감소하였으며, RANKL 처리 15분후에는 ± 4.33 %, 1시간후에는 ± 6.95 %, 2시간후에는 ± 2.33%, 48시간후에는 ± 3.14 % 로감소하였 다. 그러나 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포에서각시간대에따른발현양 의차이는없었다 ( 그림 8, n=4). 세포막칼슘펌프인 PMCA는 RANKL을처리하지않았을때에대조생쥐에비하여 ± 2.86 % 발현되었으며, RANKL 처리 15분후 ± 3.12 %, 1시간후 ± 6.26 %, 2시간후 ± 1.66 %, 48시간후 ± 1.79% 로발현되었다 ( 그림 8, n=4). PMCA의단백발현양또한시간대에따라차이가거의없었으며, 대조군과거의유사한양으로발현됨을확인하였다

32 Fig. 8. Expression of Ca 2+ signaling proteins by RANKL stimulation. No difference in PMCA expression level was found between SERCA2 +/- and wild-type mice. However, down regulation of SERCA2b was observed in SERCA2 +/- mice compared to wild-type. These results were independent of RANKL stimulation time. The immuno-blotting was the representative of 4 independent experiments

33 5. RANKL 처리후 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포에서 NFATc1 의발 현및핵내로의이동 파골세포의분화중기이후, 즉 48시간대에핵내전사인자인 NFATc1의발현및활성을위한핵내로의이동은칼슘신호, 그리고 TRAF6의활성에따른 JNK 와 ERK의인산화에의하여조절된다 (Takayanaki 등, 2002, 2005; Koga 등 2004). 따라서 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포에서의칼슘신호의감소는 NFATc1의발현및활성을위한핵내로의이동에영향을줄가능성이있다. 이에 RANKL 처리후대조생쥐와실험생쥐파골세포전구세포에서 NFATc1의발현 과활성을위한핵내로의이동을알아보고자하였다. 대조생쥐와 SERCA2 +/- 생 쥐에서모두 NFATc1 은 RANKL 처리후 15 분, 1 시간, 2 시간경과후발현이이루 어지지않다가 48 시간대에발현이증가하였는데, SERCA2 +/- 생쥐는대조생쥐에 비해 ± 3.29 % 로적게발현하였다 ( 그림9A, n=4). 또한면역형광염색결과 48시간대에서 NFATc1의핵내로의이동이 SERCA2 +/- 생쥐는대조생쥐세포에비해현저히감소하였음을확인하였다 ( 그림 9B, n=4). 이는 SERCA2의발현감소에의해분화중기이후에나타나는칼슘신호의소멸과더불어 NFATc1의활성과발현이감소함을의미한다

34 Fig. 9. NFATc1 expression and nuclear translocation stimulated by RANKL. (A) NFATc1 was expressed 48 hrs after RANKL stimulation in both SERCA2 +/- and wild-type mice. The expression level decreased in SERCA2 +/- mice compared to wild-type. (B) Immunostaining of NFATc1 in BMMs from wild-type mice shows translocation of NFATc1 into the nucleus 48hrs after RANKL stimulation. However, SERCA2 +/- mice show a marked decrease in nuclear translocation. The immuno-blotting and immuno-labeling were the representative of 4 independent experiments

35 6. SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포로부터분화된다핵세포의형성량과 골흡수능력 SERCA2 발현저하가파골세포형성과정에직접적으로관여했는지를확인하기 위하여대조생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포로부터분화된파골세포 를 TRAP 염색을이용하여형성된파골세포의개수와모양을확인하였다. RANKL 처치 6 일후 TRAP 염색결과, 양세포에서분화된파골세포의개수는거의차이 가없었다. 그러나대조생쥐의파골세포전구세포는대체적으로거대다핵세포로 의분화가정상적으로이루어진반면, SERCA2 +/- 생쥐로부터분화된파골세포는 크기가작은단핵세포를형성하였다 ( 그림 10A, n=4). 그림 10의결과를토대로다핵세포에서나타나는 ruffled border의표지인자인 actin ring을형광염색하여확인해보았다. 이결과, 6일이지난후완전히성숙된정상세포의파골세포전구세포로부터분화된파골세포의경우정상적으로형성된 ruffled border 를확인할수있었으나, SERCA2 +/- 파골세포전구세포로부터분화된 파골세포에서는 ruffled border 가거의발견되지않았다 ( 그림 10B, n=4). 대조생쥐와 SERCA2 +/- 생쥐의파골세포전구세포를 RANKL 처리한후파골세 포로서정상적인기능을하는지를확인하기위하여, 양세포에서발현된파골세포의골흡수능력을 pit assay를통하여확인하였다. 양세포의파골세포전구세포를 OAAS에 RANKL을처리하지않은경우모두 pit가형성되지않았으며, RANKL처리 15일후 SERCA2 +/- 생쥐의 pit 면적이대조생쥐의 pit 면적에비하여 ± 0.78% 감소하였다 ( 그림 11A와 B, n=4, P<0.05)

36 Fig. 10. Differentiation into multinucleated osteoclasts by RANKL stimulation. (A) TRAP staining was performed 6 days after RANKL stimulation. BMMs from wild-type mice differentiated into large multinucleated TRAP-positive cells, whereas BMMs from SERCA2 +/- mice remained small and mononuclear. (B) Actin ring formation, which is a marker of mature osteoclasts was only observed in wild-type mice. Images were the representative of 4 independent experiments

37 Fig. 11. Bone resorbing activity of osteoclasts. (A) Pit Assay was performed 15 days after RANKL stimulation. Pit formation decreased in BMMs from SERCA2 +/- mice. (B) Comparison of relative pit area. Pit assay was a representative of 4 independent experiments (P<0.005)

38 IV. 고찰 본연구에서는칼슘신호관련인자인 SERCA2 발현이감소된생쥐모델을이용하여칼슘신호의변동과골형성의차이를추적함으로써, in-vivo 그리고 in-vitro 상에서의파골세포분화에서칼슘신호의중요성을증명하고자하였다. 세포내의칼슘항상성유지를위한칼슘제거기전단백중의하나인 SERCA 펌프에관한연구는 SERCA 유전자아형들이각각제거된생쥐모델을이용하여이루어져왔다. 특히, SERCA2 유전자는다른아형들과다르게거의모든조직의세포에서발견되는 house keeping gene" 의역할을수행하며, 그중요성또한다른아형들에비하여강조되어왔다 (Verboomen 등, 1992). 특히, SERCA2 유전자가완벽히제거된생쥐 (SERCA2 -/- ) 의경우배아상태에서죽어버리기때문에생산이불가능하였으며 (Sakuntabhai 등, 1999), 이러한이유로 SERCA2 이형접합자생쥐모델 (SERCA2 +/- ) 에서도외형적이상이나병적인증상이예상되었는데, Dr. Shull에의해제작된 SERCA2 이형접합자생쥐모델 (SERCA2 +/- ) 의심근세포에서는칼슘신호전달계의변동과심근비후가보고된바있다 (Ji 등, 2000). 한 편, Darier Disease 에대한연구모델로서 SERCA2 +/- 생쥐췌장선세포에서의칼 슘신호전달의변동과더불어적응성이관찰되어, SERCA2 유전자인 ATP2A2 유전자변이가원인인 Darier Disease 환자에서심각한장애나질환을보이지않는이유를설명할수있었다 (Zhao 등, 2001). 또한 SERCA2 결여에의한몇몇조직에서칼슘신호전달계의변동으로인하여생후약 50주가량이지난 SERCA2 +/- 생쥐의생식기를포함한몇몇조직에서암종의발견이보고된바 있다 (Liu 등, 2001). 그러나, 현재까지 SERCA2의유전자감소에의해서생쥐개체의형성이상, 또는특이적인질병유발의원인이된다고증명된바없으며, 골과연계된검사는현재까지이루어지지않은상태이다. 최근골형성및골개조를위한조골세포와파골세포의분화시칼슘신호전달이유발된다고보고되었다 (Takayanaki 등, 2002). 따라서 SERCA2 발현감소생쥐에서칼슘신호전달계의변동이조골세포와파골세포에서도나타나 SERCA2 발현

39 감소생쥐의골형성및골개조에영향을줄가능성이있다. 먼저 SERCA2 +/- 생쥐 의대퇴골형태를관찰해보았는데대조군과비교하여커다란이상이없었다 ( 그림 4A). 그러나, SERCA2 +/- 와대조군의대퇴골내부를미세단층촬영하여비교한결과, 대조군에비하여골밀도가약 50 % 증가되었음을확인하였다 ( 그림 4B 와그림 5). 또한 Toluidine blue 시약을이용하여뼈내부를염색해본결과도미 세단층촬영과동일하게 SERCA2 +/- 생쥐에서뼈내부의밀도가증가됨을확인 하였다 ( 그림 4C). 이는골형성은정상적으로이루어졌으나골개조과정에이상이생김으로써 SERCA2 +/- 생쥐의대퇴골에서의골흡수가감소된것으로추측할수있다. 세부적으로살펴보면 SERCA2 +/- 생쥐의 1) 조골세포의분화및활성의변동과, 2) 파골세포의분화및활성의변동이골밀도증가의원인이되었으리라가정할수있다. 그런데 rheumatoid arthritis와같은질병연구에서보고된바와같이 in vivo 내골밀도의변화는주로파골세포의이상에주요원인이있다고알려 져있다 (Rodan 과 Martin, 2000; Takayanagi 등, 2000). 따라서 SERCA2 +/- 생쥐 의대퇴골골밀도의증가는주로파골세포의분화및활성의변동에의한것으로가정할수있다. 특히, 파골세포에서도 SERCA2는칼슘신호전달과밀접한관련을갖는단백이며, 최근파골세포분화중기이후에칼슘신호가 NFATc1의활성에중요한역할을한다고보고된바있다 (Takayanaki 등, 2002). 따라서본연구에서는 SERCA2 결여에의한칼슘신호전달계의변동을파골세포에서추적해보았다. SERCA2 +/- 파골세포전구세포에서소포체내의칼슘의양이대조군에비해감소 하였으며, 이로인해효현제자극시전구세포내칼슘증가량이감소하였으나소포체내의칼슘고갈로인한외부로부터의칼슘유입량에는변동이없었다 ( 그림 6). RANKL 유도성칼슘 oscillations는파골세포전구세포의분화단계중 24시간에서 72 시간대에나타나는데, RANKL 유도성칼슘 oscillations은 RANKL에의해직접적으로유도되는것이아니라, RANKL/RANK 결합후특정한인자의발 현에의한것으로여겨지고있다. 본실험에서 SERCA2 +/- 파골세포전구세포에서 는 RANKL 유도성칼슘신호가대조군과는달리나타나지않았다 ( 그림 7). 또한 SERCA 와더불어세포질내칼슘제거기전중에하나인 PMCA 의양적인변동

40 을측정해보았으나, PMCA 의발현양에는변동이없었다 ( 그림 8). 따라서 SERCA 의인위적인감소의영향에의해소포체내의칼슘의양, 외부자극시칼 슘증가량이감소되었으며, 이러한변동이원인이되어 RANKL 유도성칼슘 oscillations 가사라졌다고판단된다. 그런데 SERCA2 +/- 생쥐의심근과췌장선세 포에서 SERCA2의감소로인해일종의적응효과로생긴 PMCA의발현의증가 (Liu 등, 2001) 는 SERCA2 +/- 파골세포에서는보이지않았다 ( 그림 8). 이는 PMCA의발현증가로 SERCA의기능저하가어느정도상쇄되었던심근이나췌장선세포에서기능및형태상의이상이보이지않은반면 (Liu 등, 2001; Zhao 등, 2001), 대퇴골에서는 SERCA의발현저하에따른기능을상쇄시켜줄수있는 PMCA의발현에변동이없었기때문에결과적으로골밀도가증가되는형태상의변화가생겼으리라추측된다. NFATc1 은 TRAF6, c-fos 그리고칼슘 oscillations에의해서활성화될수있다. 칼슘 oscillations는 calcineurin을활성화시켜 NFATc1의자가증식 (autoamplification) 을유도하며, 이를탈인산화시켜세포막에서핵내로의이동을촉진시킨다. 핵내로이동한 NFATc1은파골세포분화에필요한여러인자들의전사인자로서중요한역할을하며, RANKL/RANK 결합이후약 24시간이후에발현및핵내로이동되는특징을갖고있다 (Takayanaki 등, 2002, 2005). 양세포에서 RANKL 처리 15분, 1시간그리고 2시간이후 NFATc1이거의발현되지 않았으며, SERCA2 +/- 파골세포전구세포에서 RANKL 처리 48 시간이후에발현 및핵내로이동되는 NFATc1이대조군에비하여감소됨을확인하였다 ( 그림 9). 이상의결과는, SERCA2의발현저하가칼슘신호전달계에영향을주었으며이로인해 NFATc1의활성이감소됨을의미하며, 칼슘 oscillations가 NFATc1의활성유도에커다란역할을하고있음을의미한다. NFATc1 은파골세포분화를위하여가장중요한인자중의하나이기때문에칼슘신호변동에의한 NFATc1의감소가파골세포분화에영향을주었을가능성이있다. 이를알아보기위하여 TRAP 염색과 actin rings의형성을확인하였다. TRAP은 cathepsin K, calcitonin receptor 그리고 β 3 -integrin과함께성숙한파골세포의표지인자로서파골세포가단핵세포에서성숙한다핵세포로분화하면발

41 현된다 (Lacey 등, 1998). 따라서 TRAP 양성세포의경우성숙한파골세포로분화되었음을의미한다. 또한파골세포는골흡수를위하여골표면과강력한봉인 (tight seal) 을형성한다. 이때형성된봉인은 actin filaments로구성되어있으며, actin rings를확인함으로써골흡수를위해골조직에흡착되어있는파골세포의확 인이가능하다 (Wang 등, 2003). SERCA2 +/- 파골세포전구세포로부터분화한파 골세포는 TRAP 염색결과수적인측면에서대조군과비슷한수준의파골세포로분화되었다. 하지만파골세포의크기가대조군에비해매우작은특징을보였다 ( 그림 10A). 또한 actin rings를확인한결과, SERCA2 +/- 파골세포는대조군에비해크기가작은봉인을형성하는파골세포로분화되었다 ( 그림 10B). 양세포모두에서다핵세포인파골세포로의분화가확인되었으며, 골조직과세포사이의봉인 도대체적으로정상적으로이루어졌음이확인되었다. 다만, SERCA2 +/- 파골세포는 크기가대체적으로작고봉인또한대조군에비하여뚜렷하지않은특징이있었다. 이러한파골세포의형성의차이는파골세포의활성에영향을주었을가능성이있다. 마지막으로양세포에서의파골세포활성도의차이를확인하기위하여양세포를 dentin slice 상에서배양하여 6일후 dentin slice에형성되는구멍 (pits) 을확인한결과 SERCA2 +/- 파골세포전구세포로배양된 dentin slice 에서구멍의 형성이현저히감소됨을확인하였다 ( 그림 11). 소포체내의칼슘의재충전 (refilling) 은파골세포분화에필수적임이보고된바있으며 (Mentaverri 등, 2003), 소포체내칼슘을재충전하는 SERCA의감소가파골세포의분화와활성에영향을준다는측면에서본연구는이전의보고와일치된결과를보였다. 본연구는 RANKL 유도성파골세포분화의중요인자로알려진 TRAF6와 c-fos 이외에칼슘 oscillations가중요한인자로작용할수있음을 in-vivo와 in-vitro상에서증명하였으며, 칼슘신호의발생에 SERCA의역할이중요함을확인하였다. 또한, 본연구에서배제하였던조골세포분화에 SERCA2의감소가영향을주었을가능성이있으나, 뼈의크기및형태가대조군과유사한것으로보아조골세포에서의칼슘신호전달계에는일종의적응현상이생겼으리라 추측되며, 이후의연구에서는 SERCA2 +/- 조골세포에서의칼슘신호전달계의변동 과발현및활성의관계에대한연구가필요할것이다

42 V. 결론 SERCA2 +/- 와대조생쥐의파골세포전구세포에서칼슘신호단백의발현과 RANKL 처리후측정된칼슘신호와신호전달단백의발현양을비교분석하여 다음과같은결론을얻었다. 1. 미세컴퓨터단층촬영과골염색법을통해 SERCA2 +/- 에서는대조생쥐에비해 약 50% 정도골밀도가증가하였음을확인하였다. 2. SERCA2 +/- 파골세포전구세포에서 SERCA 를억제하여측정된소포체내칼슘 의양은대조군에비해적었다. 3. 파골세포분화제인 RANKL 처치시대조전구세포에서는약 24 시간에서 72 시 간까지세포내칼슘농도의주기적변화 ([Ca 2+ ] i oscillations) 가관측되었으나, SERCA2 +/- 에서는칼슘신호가관찰되지않았다. 4. 대조군에비해 SERCA2 +/- 에서는 SERCA 의발현이감소하였으며, plasma membrane Ca 2+ ATPase 의발현은동일하였다. 5. RANKL 처리후 48 시간에서칼슘신호에의해활성화되는 NFATc1 의발현양 과 NFATc1 의핵내로의이동이 SERCA2 +/- 에서감소하였다. 6. RANKL 처리후 6 일후에 SERCA2 +/- 에서는다핵세포로의분화가현저히감소 하였으며, 다핵세포형성인식표지인 actin ring 의형성이거의발생하지않았다. 7. SERCA2 +/- 에서는골흡수능력이약 70% 정도감소하였다

43 이상의결과는기존에알려진 RANKL 신호전달경로에서칼슘신호의활성화가파골세포분화과정에필수적인신호임을의미하며, 파골세포전구세포에서의칼슘신호, 칼슘 oscillations의발생은 SERCA의활성에의해서조절되어질수있다. 따라서 SERCA의활성은파골세포의분화, 형성그리고활성을위하여필수적인요소임을발견하였다

44 참고문헌 Ash P, Loutit JF, and Townsend KM: Osteoclasts derived from hematopoietic stem cells. Nature 283: , Berridge MJ, Martin D, Bootman H, and Roderick L: Calcium Signaling: Dynamics, homeostasis and remodeling. Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: , Boyle WJ, Simonet WS, and Lacey DL: Osteoclast differentiation and activation. Nature 423: , Gunteski-Hamblin AM, Greeb J, and Shull GE: A novel Ca 2+ pump expressed in brain, kidney, and stomach is encoded by an alternative transcript of the slow-twitch muscle sarcoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase gene. Identification of cdnas encoding Ca 2+ and other cation-transporting ATPases using an oligonucleotide probe derived from the ATP-binding site. J Biol Chem 263: , Helfrich MH: Osteoclast diseases. Microsc Res Tech 61: , Hong JH, Lee SI, Kim KE, Yong TS, Seo JT, Sohn MH, and Shin DM: German cockroach extract activates protease-activated receptor 2 in human airway epithelial cells. J Allergy Clin Immunol 113: , Ji Y, Lalli MJ, Babu GJ, Xu YF, Kirkpatrick DL, Liu LH, Chiamvimonva N,

45 Walsh RA, Shull GE, and Periasamy M: Disruption of a single copy of the SERCA2 gene results in altered Ca 2+ homeostasis and cardiomyocyte function. J Biol Chem 275: , Katagiri T, and Takahashi N: Regulatory mechanism of osteoblast and osteoclast differentiation. Oral Diseases 8: , Khosla S: Minireview: The OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology 142: , Kiselyov K, Shin DM, and Muallem S: Signalling specificity in GPCR-dependent Ca 2+ signaling. Cellular Signaling 15: , Koga T, Inui M, Inoue K, Kim S, Suematsu A, Kobayashi E, Iwata T, Ohnishi H, Matozaki T, Kodama T, Taniguchi T, and Takayanagi H: Costimulatory signals mediated by the ITAM motif cooperate with RANKL for bone homeostasis. Nature 428: , Lacey DL, Timms E, Tan HL, Kelley MJ, Dunstan CR, Burgess T, Elliott R, Colombero A, Elliott G, Scully S, Hsu H, Sullivan J, Hawkins N, Davy E, Capparelli C, Eli A, Qian YX, Kaufman S, Sarosi I, Shalhoub V, Senaldi G, Guo J, Delaney J, and Boyle WJ: Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 93: , Liu LH, Boivin GP, Prasad V, Periasamy M, and Shull GE: Squamous cell tumors in mice heterozygous for a null allele of ATP2A2, encoding the

46 sarco(endo)plasmic reticulum Ca 2+ -ATPase isoform 2 Ca 2+ pump. J Biol Chem 276: , Manolagas SC: Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocr Rev 21: , Mentaverri R, Kamel S, and Brazier M: Involvement of capacitive calcium entry and calcium store refilling in osteoclastic survival and bone resorption process. Cell Calcium 34: , Periasamy M, Reed TD, Liu LH, Ji Y, Loukianov E, Paul RJ, Nieman ML, Riddle T, Duffy JJ, Doetschman T, Lorenz JN, and Shull, GE: Impaired cardiac performance in heterozygous mice with a null mutation in the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase isoform 2 (SERCA2) Gene. J Biol Chem 274: , Reitan K: Tissue behavior during orthodontic tooth movement. Am J Orthod 46: , Reitan K: Effect of force magnitude and direction of tooth movement on different alveolar bone type. Angle Orthod 34: , Roberts WE, Goodwin WC, and Heiner SR: Cellular response to orthodontic force. Dent Clin North Am 25:3,

47 Roberts WE: Bone physiology, metabolism, and biomechanics in orthodontic practice. In Orthodontics: current principles and techniques. Graber TM, Varnasdall RL, editors, 2000, Mosby, St Louis. Rodan GA and Martin TJ: Therapeutic approaches to bone diseases: Science 289(5484): , Sakuntabhai A, Ruiz-Perez V, and Carter S: Mutations in ATP2A2, encoding a Ca 2+ pump, cause Darier disease. Nat Genet 21: , Shin DM, Dehoff M, Luo X, Kang SH, Tu J, Nayak SK, Ross EM, Worley P F, and Muallem S: Homer 2 tunes G protein-coupled receptors stimulus intensity by regulating RGS proteins and PLCβ GAP activities. J Cell Biol 162: , Smith RK and Roberts WE: Cell kinetics of the initial response to orthodontically induced osteogenesis in rat molar periodontal ligament. Calcif Tissue Int 30: 51, Storey E: The nature of tooth movement. Am J Orthod 63: , Takayanagi H, Ogasawara K, Hida S, Chiba T, Murata S, Sato K, Takaoka A, Yokochi T, Oda H, Tanaka K, Nakamura K, and Taniguchi T: T-cell-mediated regulation of osteoclastogenesis by signalling cross-talk between RANKL and IFN-gamma. Nature 408: 600-5, Takayanagi H, Kim S, Koga T, Nishina H, Isshiki M, Yoshida H, Saiura A,

48 Isobe M, Yokochi T, Inoue J, Wagner EF, Mak TW, Kodama T, and Tanigichi T: Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts. Developmental Cell 3: , Takayanagi H: Mechanistic insight into osteoclast differentiation in osteoimmunology. J Mol Med 83: , Tran Van PT, Vignery A, and Baron R: Cellular kinetics of the bone remodeling sequence in the rat. Anat Rec 202: , Verboomen H, Wuytack F, De Smedt HB, Himpens R, and Casteels R: Functional difference between SERCA2a and SERCA2b Ca 2+ pumps and their modulation by phospholamban. Biochem J 286: , Verboomen H, Wuytack F, Van den Bosch L, Mertens L, and Casteels R: The functional importance of the extreme C-terminal tail in the gene 2 organellar Ca 2+ -transport ATPase (SERCA2 a/b). Biochem J 303: , Wang Q, Y Xie, QS Du, XJ Wu, X Feng, L Mei, JM McDonald, and WC Xion: Regulation of the formation of osteoclastic actin rings by proline-rich tyrosine kinase 2 interacting with gelsolin. J Cell Biol 160: , Wuytack F and Raeymaekers L: The Ca 2+ -transport ATPases from the plasma membrane. J Bioenerg Biomembr 24: ,

49 Zhao XS, Shin DM, Liu LH, Shull GE, and Muallem S: Plasticity and adaptation of Ca 2+ signaling and Ca 2+ -dependent exocytosis in SERCA2 +/- mice. EMBO J 20: ,

50 Abstract Effect of a partial loss of SERCA2 on osteoclast differentiation Ji Hyun Lee, D.D.S., M.S.D. Department of Dental Science The Graduate School, Yonsei University ( Directed by Professor Kyung-Ho Kim, D.D.S., Ph.D. ) Differentiated osteoclats resorb bone, which results in increase of blood Ca 2+ level and bone remodeling. Receptor activator of NF-kB ligand (RANKL) is expressed on osteoblasts and induces the signaling essential for precursor cells to differentiate into osteoclasts. Binding of RANKL to RANK results in the recruitment of TNF receptor associated factor 6 (TRAF6) which activates the NFκB, c-fos, JNK and ERK pathways. Recent studies have shown that, Ca 2+ signaling is evoked in osteoclast precursor cells in the terminal stage of osteoclastogenesis. Ca 2+ signals usually occur in the form of Ca 2+ oscillations, which is a repeated and periodic transient change of intracellular Ca 2+ level. However, the precise role of Ca 2+ signaling in the process of osteoclatogenesis, is as yet unknown. Sarco/endoplasmic recticulum Ca 2+ ATPase 2 (SERCA2) is a Ca 2+ signaling-related protein which serves to maintain low intracellular Ca 2+ level. In a preliminary study, SERCA2 heterozygotic mice (SERCA2 +/- ) which were produced by deletion of one copy of the ATP2A2 gene, showed increased bone density compared to wild-type mice. Therefore we started a research to

51 elucidate the effect of decreased SERCA expression in the differentiation of osteoclasts, in a cell physiological and biochemical manner. Fluorescence level of Fura2 in bone marrow derived monocyte/macrophage precursor cells was measured in order to compare intracellular Ca 2+ level of cells from SERCA2 +/- and wild-type mice. Immuno-blotting and immuno-labeling were used in order to compare expression levels and activation rate of proteins related to osteoclastogenesis. Osteoclast activity was checked by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining and pit assay. SERCA2 +/- mice showed a 50% increase in bone density according to two dimensional micro CT images and tolouidine blue staining. Endoplasmic Ca 2+ store and amount of Ca 2+ release triggered by ATP stimulation was decreased in SERCA2 +/- mice compared to wild-type mice. However, the amount of Ca 2+ influx, after emptying of the endoplasmic Ca 2+ store showed no difference. In wild-type osteoclast precursor cells, Ca 2+ oscillations were observed 24 to 72hrs after RANKL stimulation. However, Ca 2+ oscillations were not observed in SERCA2 +/- osteoclast precursor cells. The expression level of SERCA2 was decreased in SERCA2 +/- osteoclast precursor cells compared to wild-type osteoclast precursor cells. However, no difference was found in the expression level of plasma membrane Ca 2+ ATPase. The expression level of nuclear factor of activated T cell (NFATc1) and nuclear translocation after 48hrs of RANKL stimulation was decreased in SERCA2 +/- osteoclast precursor cells compared to wild-type osteoclast precursor cells. Differentiation of mononuclear cells into multinucleated cells, 6 days after RANKL treatment, was markedly suppressed in SERCA2 +/- mice compared to wild-type. Furthermore, actin rings, which are known as markers of multinucleated osteoclast, were not detectable in SERCA2 +/- osteoclasts. Hence, the activity of SERCA2 +/- osteoclasts in absorbing bone was decreased in SERCA2 +/- osteoclasts. According to these results we may suggest that Ca 2+ signaling is essential

52 for RANKL-induced osteoclastogenesis. Further studies are necessary for the understanding of the precise molecular mechanism during osteoclast differentiation. Key Words : Osteoclast, RANKL, SERCA2, SERCA2 heterozygote mice, Ca 2+ signaling