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1 1 인삼의약리학적효과 ( 뇌질환과관련하여과학적인효능검증 ) 김선오 한국과학기술연구원의과학연구센터 To whom correspondence should be addressed. sunoh@kist.re.kr 목차 1. 초록 2. 서론 3. 본론 4. 결론 5. 참고문헌

2 2 1. 초록 천연물과같은대체약물이치료와예방목적으로써그이용이증가하고그중에서인삼은세계적으로가장널리사용되어지고있는전통약초이다. 인삼추출물이 forebrain 또는myocardial ischemia animal model에서신경세포사멸을막아준다는보고와함께최근에는 ginsenoside Rb1 과 ginsenoside Rg3가일차배양한흰쥐의대뇌피질신경세포에서 glutamate에대한신경독성을억제함이발표되었다. 그러나세포수준에서인삼성분의기전연구를통해그효능을입증할필요가있지만뇌신경세포수준에서의연구는거의초기단계이다. 최근연구에서발표되고있는인삼의과학적약리학적효능검증을위하여일차배양한흰쥐해마세포에서형광성 Ca2+ 표지물인 fura-2/am을이용하여인삼의 glutamate 특히 NMDA 수용체에의한 Ca2+ 유입의조절과, 전기생리학적기록기법으로 NMDA current의조절효과입증하고있다. 또한여러뇌질환과관련된질병모델을개발하여그에대한인삼추출물들의질병치료효과들을분자생물학적기법및기타생리학적기법들을이용하여체계적인효과를입증하고있다. 보고들에의하면 Ginseng total saponins(gts) 는 NMDA 수용체에의한 Ca2+ 유입을현저하게억제하였다. 또한인삼의각단일성분을분리하여각각의단일성분들이 NMDA수용체에미치는효과를보면그결과 ginsenoside Rg3에의한흰쥐해마신경세포에서의NMDA 수용체억제효과가가장효과적이었다. 다음으로인삼의성분을섭취하였을때그효능을나타내는인삼대사체의효과를알아보기위해사람장내미생물을이용하여인삼의각단일성분을대사시켜얻은 ginsenosides의효과를시험해보았다. 특히이대사체는 20(S)-form만을정제한것을사용하였고그결과 20(S)-ginsenoside Rg3와이것의대사체인 20(S)-ginsenoside Rh2가 NMDA수용체에특이적으로억제현상을가장크게나타내었다. 이러한결과는인삼은신경독성억제에관여하는중요한한기전으로써신경세포의흥분독성에의한뇌질환치료제로서의유용성을제시한다. 2. 서론 사회의노령화에의한뇌질환환자수의증가와국민들의대체의학에대한증가된관심하에서신경전달물질및이온통로에 target 가능성이높은많은단일성분들의보유자원의세포수준에서연구를통하여신경독성조절물질들의기전을밝히고, 그기전연구를통한주요 pathway(s) 를신경독성검색기술및 screening

3 3 기술로이용하고자하는것이최근들어시도되고있고이러한연구들의최종목표이다. 그중에서도동양전통의약품으로써널리사용되어온인삼은연구의가치가충분히있다고본다. 퇴행성뇌질환의동물모델에서글루타메이트의과도한활성이신경손상및사멸을일으킨다는축적된증거들이지난수십년간의연구로부터제시되었다. 또한이러한글루타메이트신경독성 (neurotoxicity) 이 epilepsy, stroke, hypoglycemia와같은급성뇌질환에도관계한다고알려져있다 (Coyle & Puttfarcken, 1993, Science 262: 689). 그러나이러한퇴행성뇌질환과글루타메이트신경독성과의상관관계의가장큰문제점은수 millisecond에일어나는글루타메이트매개이온통로 (glutamate-gated ion-channels) 활성과정과수년에걸쳐서서히일어나는퇴행성뇌질환에서의신경세포손실과정과의불일치이다. 그러나이러한불일치는세포사멸의또다른기전으로알려진 oxidative stress 과정에글루타메이트매개이온통로의활성이중요원인으로작용한다는사실로부터해결될수있다. 즉매우빠르게일어나는글루타메이드신경독성이 oxidative stress 매개세포사멸의원인이되어두기전이서로상호적으로세포사멸을강화시켜선택적신경세포의퇴화가일어난다는이론들이제시되었다. 이러한이론을뒷받침하는최근의연구결과로는글루타메이트수용체의 subtype인 NMDA 수용체의활성이 PSD-95 (NMDA수용체 scaffolding 단백질 ) 를통해서 oxidative stress의핵심요소인 nitric oxide 생성에관여함이밝혀졌다 (Sattler et al., 1999, Science 284:1845). 그러면이러한급성및퇴행성뇌질환의효율적예방책및치료제의개발은무엇일까? 글루타메이트신경전달물질과 oxidative stress 간의연결성을잘이해하여중추신경계의주신경전달물질인글루타메이트의작용은유지한채질환의병리학적인상태의고리를끊을수있는약물의개발이필요하다. 특히 NMDA-, AMPA/KA-, metabotropic-type으로나누어지는글루타메이트수용체 subtype중 NMDA-매개신경독성의효과가가장크므로 NMDA-매개신경독성을차단할수있는치료제를개발하여신경독성의초기과정을차단하고그로인한 oxidative stress를차단할수있는약물개발이필요하다. 현재까지선진국의제약회사및연구소에서는이들여러가지가운데특히 NMDA 수용체길항제개발에집중적으로노력한결과, dextromethrorphan이나 GV 약물은 phase III에서시험중이나대부분개발된약물들은합성물자체의독성으로인하여임상실험중종료되거나보류중인것으로나타나 (Lee et al., 1999, Nature. 399:A7) 위에서언급한것처럼신경전달물질의조절작용은유지하면서질환의병리학적인상태의고리를끊을수있는약물개발의새로운전략이필요하다. 최근미국등선진국에서는 Alternative Medicine

4 4 ( 대체의약 )" 분야에서천연물의유용성분분리및기전연구를통한차세대신약개발분야가각광받고있다. 한약재등풍부한천연물질을약물로사용하고있는국내에서도분리된단일성분들의세포수준에서의기전연구를통해그효능을입증할필요가있지만그연구영역은뇌질환영역에서는아직초기단계이다. 또한국내학교및연구소에서다양한신경전달물질의합성이가능하고천연물연구소, 한의학연구소등에서유용식물자원으로부터단일성분분리및일차적효능의스크리닝에관한연구로인하여신경전달물질및이온통로에 target 가능성이높은많은단일성분들의 chemical pool은형성되고있으나세포수준에서의스크리닝법및기전연구는체계적으로이루어지지않고있는점이국내기술의현황이다. 그러므로출연연구소에소속된본연구책임자는정부기관의연구영역의중요성으로국내에형성되어있는신경전달물질관련 chemical pool 중에서합성및 natural compound에서분리된단일성분들을 in situ system에서신호전달물질 imaging 및전기생리학적 methods로 screening법을확립하고그기전을밝히는데본연구의필요성이있다. 특히일차적으로글루타메이트수용체중신경독성의효과가가장큰 NMDA 수용체를중심으로 NMDA 활성에의해매개되는 transient 및 delayed 칼슘유입, mitochondria potential 변화, 칼슘이온통로등에관련된측정기법을사용하여현재신경독성억제효과가있는것으로알려진여성호르몬에스트로젠 (Singer et al., 1999, J. Neurosci. 19:2455; Singh et al., 1999, J. Neurosci. 19:1179), 진세노사이드 (Kim et al., 1998, J. Neurosci. Res. 53:426) 및그대사물질들과합성된신경전달물질조절물질들의효과를탐색하여선택적인신경독성억제물질을도출하여뇌질환치료제개발의정확한구조및기전연구이다. 3. 본론 3-1. GTS 및진세노사이드들의해마신경세포에서의효과단기적으로 NMDA를투여할때마다 NMDA 수용체활성은세포내칼슘유입을가져오므로세포내칼슘유입을관찰한결과매 4-5분씩 12번이상세포에투여한결과탈감각없이일정한값을유지하고기존에알려진 NMDA 수용체길항제인 D-APV와 ginseng total saponin (GTS) 을처리한결과현저하게억제되므로 ( 그림 1) 인삼성분의 NMDA 수용체억제제에스크리닝시스템으로사용하였다. 또한이러한 GTS의효과는배양세포뿐만아니라 acutely 분리한해마세포에서도관찰되는세포준비조건과

5 5 관계없는인삼의고유한효과임을알수있었다. 인삼의주요사포닌성분중 10종의진세노사이드 ( 진세노사이드-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re, -Rf, -Rg2, -Rg3, -Rh1, -Rh2) 를 1차검색으로 C-20위치의이성체를분리하지않은상태로검색한결과진세노사이드-Rg3의 NMDA 수용체억제효능이다른진세노사이드성분들에비해월등히뛰어남을밝혔다. 진세노사이드-Rg3의 NMDA 수용체억제효능은칼슘의유입뿐만아니라 NMDA 수용체매개전류유입을직접측정할수있는전기생리학의패치크램프 (whole-cell patch-clamp) 방법으로도확인되었고 IC 50 농도 3.8μM로농도의존적으로나타남을알수있었다. 이러한 NMDA 수용체활성의초기검색이세포죽음의초기기전임을증명하기위하여기존의세포독성검사에사용되는 MTT assay로분석한결과 NMDA 수용체길항제인 D-APV, 인삼의총사포닌성분 (GTS), 진세노사이드 Rg 3 가 NMDA 유발신경독성으로인한 cell viability를유효하게증가시킴을밝혔다. 이상의 GTS 및진세노사이드의 cultured hippocampal neuron 에대한연구결과는아래의논문으로 최종발표되었음. Inhibitory effect of ginsenosides on NMDA receptor-mediated signals in rat hippocampal neurons. (2002) BBRC 296:247.

(B) Co-application of ginseng total saponins (GTS, 100 μ g/ml) with NMDA caused 70.2% inhibition of NMDA-induced [Ca 2+ ] i increase in this cell.

6 6 그림 1). Effects of ginseng total saponins on NMDA receptor-mediated signals in cultured rat hippocampal neurons. (a) Multiple applications of NMDA (100 μ M) on the increases in [Ca 2+ ] i using fura-2-based digital imaging techniques. (B) Co-application of ginseng total saponins (GTS, 100 μ g/ml) with NMDA caused 70.2% inhibition of NMDA-induced [Ca 2+ ] i increase in this cell. Ginseng total saponins were pretreated for 1 min in the cell before the application of NMDA. (C) Dose-response relationship for inhibition of NMDA-induced [Ca 2+ ] i increase by ginseng total saponins. Inset, Time-dependent relationship for inhibition of NMDA-induced [Ca 2+ ] i increase by 30 μ g/ml ginseng total saponins. (D) The effect of ginseng total saponins on current responses induced by application of NMDA (5 s) using perforated whole-cell voltage-clamp recordings 진세노사이드 Rg 3 의해마 NMDA 수용체에대한세부기전연구해마신경세포에서진세노사이드 Rg 3 의 NMDA 수용체억제효과에대한세부기전으로본연구에서는여러가지 NMDA channel complex에대하여, NMDA 결합부위, 글라이신결합부위, 이온통로결합부위, polyamine 결합부위등에대하여한단계씩조사해나갔다. 가. 이온통로결합부위에대한진세노사이드 Rg 3 의효과 NMDA 수용체채널복합체구조중중요한조절부위로는수용체가활성화될때 Na + 및 Ca 2+ 이유입되는이온채널부위그자체이다. 수용체가활성화될때또는

7 7 이온채널이열릴때만작용을하기때문에이부위를억제하는화합물을일명 open channel blocker로불리고그예로는 phencyclidine (PCP) 계이고대표적화합물로 MK-801이있다. 해마배양세포에서칼슘영상화기술을이용한 NMDA 수용체이온통로결합부위검색법으로는 NMDA 수용체가활성되어야한다는전제조건이있어야한다. NMDA와 open channel blocker로잘알려진 MK-801의동시처리는 NMDA 수용체를거의억제하지않지만 NMDA 수용체의활성후, MK-801의처리는 NMDA 수용체를통한칼슘유입을거의다억제시켰다. 그러나진세노사이드 Rg 3 와 MK-801과의동시처리에의한억제효과는진세노사이드 Rg 3 에의한효과이고그약물에대한회복도 MK-801과는다르게작용한다는사실로부터진세노사이드 Rg 3 가이온통로결합부위에는작용하지않음을간접적으로제시한다. 나. NMDA 결합부위에대한진세노사이드 Rg 3 의효과진세노사이드 Rg 3 가 NMDA 수용체중가장중요한 agonist 인 NMDA 결합부위에작용하는지알기위하여 NMDA 농도를증가시킴에따라두화합물이경쟁적으로작용하는가에대하여알아보았다. Non-NMDA에비해 NMDA 수용체만을선택적으로최대활성화시키기위해 Mg 2+ -free 및글라이신 (1 μm) 을포함하는세포밖용액을사용하였고진세노사이드 Rg3도 NMDA에최대효과를나타내는 30 μm을사용하였다. 이러한조건하에서농도의존적곡선을알아본결과, 30 μm 농도의진세노사이드 Rg3의투여는 NMDA의그수용체에대한 EC 50 값에변화를주지않는 non-competitive antagonist로작용한다는사실로부터 NMDA 결합부위와는관계없이작용함을밝혔다. 다. NMDA 수용체글라이신결합에대한진세노사이드 Rg 3 의효과 NMDA 수용체채널복합체구조중 co-agonist로작용하는글라이신결합부위가 NMDA 수용체의활성에중요하므로글라이신결합부위에경쟁적길항제로작용하는것으로잘알려진 7-chloro-kynurenic acid (CK) 를표준물질로해마신경세포에서칼슘-영상화기술을이용하여단기활성시 NMDA 수용체의글라이신결합부위에작용하는화합물의검색조건을구축하였다. 구체적으로해마신경세포에서 NMDA 수용체에 co-agonist로글라이신이작용한다는점과 CK가이글라이신결합부위에경쟁적으로작용한다는성질을이용하여글라이신의농도가최저인상태 (-Gly) 와 NMDA 수용체활성을위한최대상태 (+Gly, 100 μm) 에서 NMDA 수용체활성을보았다. 그결과진세노사이드 Rg 3 는 CK와마찬가지로글라이신농도의존적으로글라이신이낮은농도에서만그효과를나타내고, 높은농도에서는그효과가거의사라짐을알

(A) Effects of different ginsenosides Rg 3, Rf and Rh 2 on NMDA-induced [Ca 2+ ] i increase in a one cell.

8 8 수있었다. 그러므로본실험을글라이신의전농도에확대하여시행한결과진세노사이드 Rg3는글라이신과경쟁적으로결합하여 NMDA 수용체를억제하는글라이신수용체부위에대한 antagonist로작용함을알수있었다. 그림 2). Identification of active components responsible for ginseng-mediated inhibition on NMDA receptors. (A) Effects of different ginsenosides Rg 3, Rf and Rh 2 on NMDA-induced [Ca 2+ ] i increase in a one cell. (B) The pooled results illustrating the mean percentage inhibition of NMDA-induced [Ca2+]i increase by individual ginsenosides. Among 10 ginsenosides tested, ginsenosides Rb1, Rc, Rh1, and Rh2 produced more than 20% inhibition and ginsenoside Rg3 produced the biggest effect (70.0±4.5%) on NMDA-induced [Ca2+]i increase at 10 mm. (C) Dose-response relationship for inhibition of NMDA-induced [Ca 2+ ] i increase by ginsenoside Rg3. The IC 50 value of ginsenoside Rg3 on NMDA-induced [Ca 2+ ] i increase is 3.8 μ M. (D) Ginsenoside Rg3, the major active component of ginseng on the inhibition of NMDA-induced [Ca 2+ ] i increase, also inhibited NMDA receptor-gated currents. In this cell, ginsenoside Rg3 (1 μ M) inhibited NMDA-mediated currents at both peak and the mean values of sustained currents by 63.2 and 49.5%, respectively.

The cultures were then exposed to 100 mm NMDA for 15 min and washed with culture medium. b After a 24-h incubation, the cultures were assessed for the extent of neuronal death using the MTT assay.

9 9 그림 3). Neuroprotective effect of ginsenoside Rg3 against NMDA-induced excitotoxicity in primary cultures a of rat hippocampal neurons. Hippocampal neurons were treated with ginsenoside Rg3, D(-)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid (D-APV) and 7-chlorokynurenic acid (7-CK) for 1 min before the NMDA insult. The cultures were then exposed to 100 mm NMDA for 15 min and washed with culture medium. b After a 24-h incubation, the cultures were assessed for the extent of neuronal death using the MTT assay. NMDA-treated value differs significantly from the control at a level of P< c Results differ significantly from the NMDA-treated at the P values indicated by asterisks. *** P < with the NMDA-treated cultures. 그림 4). Effects of ginsenoside Rg3 in rat hippocampal neurons: possible involvement of the glycine binding site on NMDA receptor

10 진세노사이드 Rh 2 의해마 NMDA 수용체에대한세부기전연구인삼에는 30여종의진세노사이드가자체로존재하지만그중의여러성분은그전구체에의하여생체내에서대사과정으로변하여추가생성되므로이러한 1차결과를바탕으로토대로사람의위에존재하는미생물에의한대사생성물을특히홍삼에서특이적으로존재하는성분들을중심으로 C-20위치의 (S)-형태의순수화합물만을추가로해마신경세포에서 NMDA 수용체에대한효능을검색하였다. 진세노사이드성분의 C-20위치의 (S)-형태의순수화합물검색에는 20(S)-진세노사이드-Rb1,-Rd, -Rg1, -Rg3, -Rh1, -Rh2, 20(S)-protopanaxadiol, 20(S)-protopanaxatriol, compound K의총 9가지의화합물을이용하였고그중 NMDA 수용체활성에가장우수한효과를나타내는화합물은 20(S)-진세노사이드 Rg3와 20(S)-진세노사이드 Rh2임을밝혔다. 진세노사이드 Rg3는본연구에서수행된이전연구에서도 C-20위치의이성체가 S- 또는 R-form 이든또는그혼합물이든생체효능은전혀다르게나타나지않는반면진세노사이드 Rh2는혼합물보다 20(S)-form이월등한효과를나타내었다. 가. NMDA 수용체글라이신결합에대한진세노사이드 Rh 2 의효과진세노사이드 Rg 3 가 NMDA 수용체의 glycine-binding site에작용함을미리밝힌것같이진세노사이드 Rh 2 의 glycine binding site에대한효과를알아보았다. Glycine free와 100μM glycine 용액에서진세노사이드 Rg 3 와 Rh 2 (10μM) 를 1분간전처리후 NMDA와같이 10초간처리한결과, glycine free 용액에서 NMDA에의한 [Ca 2+ ] i 이진세노사이드 Rg 3 에의해서는평균 78.2 ±2.7% (n=26), 진세노사이드 Rh 2 에의해서는평균 69.9 ± 5.0% (n=12) 감소되었으나 100μM glycine 용액에서는 NMDA에의한 [Ca 2+ ] i 이진세노사이드 Rg 3 에의해서는평균 30.1 ±1.7 (n=51), 진세노사이드 Rh2에의해서는평균 64.3 ± 4.5% (n=16) 감소하여진세노사이드 Rg 3 는 NMDA 수용체 glycine binding site에작용하나진세노사이드 Rh 2 는 NMDA수용체의 glycine binding site와는무관하게작용함을알수있다. 나. NMDA 수용체 polyamine-binding site에미치는진세노사이드 Rh 2 의효과 NMDA 수용체의여러개의조절부위중 polyamine-binding site에작용하는 spermine (200μM) 을진세노사이드 Rg 3 와 Rh 2 와함께 1분간전처리한후 NMDA와함께 10 초간처리하였을때진세노사이드 Rg 3 는단독으로처리한것 (78.2 ± 2.7%) 과 spermine을같이처리한것 (89.0±1.7%) 이큰차이를보이지않았으나진세노사이드 Rh 2 는단독으로처리한것 (63.2±2.2%) 이 spermine과함께처리했을때 (26.7 ± 3.3%) 에비해 NMDA 수용체억제효과가현저히줄어드는것을확인할수있었다. 이는

11 진세노사이드 Rg 3 및 Rh 2 는구조적으로유사할뿐아니라 NMDA

수용체조절부위에서도진세노사이드 Rg 3 는 glycine, 진세노사이드 Rh 2 는 polyamine

진세노사이드성분의 C-20 위치의 (S)- 형태의순수화합물대사과정및 NMDA 에대한활성. 그림 6).

이결과는진세노사이드 Rh 2 도 NMDA 결합부위에 non-competitive antagonist 작용함.

11 11 진세노사이드 Rg 3 및 Rh 2 는구조적으로유사할뿐아니라 NMDA 수용체억제효과에서도비슷하게특이성을나타내지만 NMDA 수용체에작용하는부위에대하여는선택성을나타내어 NMDA 수용체조절부위에서도진세노사이드 Rg 3 는 glycine, 진세노사이드 Rh 2 는 polyamine binding site에작용함을확인하였다. 그림 5). 진세노사이드성분의 C-20 위치의 (S)- 형태의순수화합물대사과정및 NMDA 에대한활성. 그림 6). 진세노사이드 Rh 2 와 NMDA 의동시처리는진세노사이드 Rg 3 와비슷하게비경쟁적으로작용함. 이결과는진세노사이드 Rh 2 도 NMDA 결합부위에 non-competitive antagonist 작용함. 그러나진세노사이드 Rh 2 는진세노사이드 Rh 2 와는다르게 NMDA 수용체의 glycine bind site 에의해서영향받지않지만, spermine free 용액에서진세노사이드 Rh 2 는 NMDA 수용체활성을크게억제하지만 spermine 이있는용액에서는그효과가현저하게줄

12 12 어듦. 이결과로진세노사이드 Rh 2 는 NMDA 수용체의 polyamine binding site 에작용함을확인 In vitro 간질모델에서 NMDA 수용체 antagonist와진세노사이드의효과 NMDA 수용체의장기활성에대한또다른시스템으로 Mg 2+ -free 용액을시간별처리시 (20분 - 3시간 ) 발생되는세포내칼슘농도의증가와 oscillation 현상이간질 (epilepsy) 발생의중요한한기작이고이러한현상이 NMDA 수용체에의해발생됨을문헌 (Delorenzo, R.J. et al., 1998, PNAS, 95: 14482) 및본연구결과로확인하여 NMDA 수용체장기활성에따른 in vitro 상에서간질발생모델로확립하여 screening에이용가능함을확인했다. 이렇게확립된해마배양신경세포 in vitro epilepsy 모델에서기존에알려진 NMDA 수용체억제제와비교하여진세노사이드를검색한결과 in vitro epilepsy 모델에서도진세노사이드 Rg 3 가 status epilepticus (SE) 와 spontaneous recurrent epileptiform discharges (SREDs) 유발칼슘증가를억제시키고 SREDs 관련 cell death를현저히감소시킴을밝혔다. NMDA 수용체인이러한연구결과를 NMDA-induced convulsion animal model에도적용하였으나기존 NMDA 수용체억제제인 AP-5나 5,7-DCKA에비해 convulsion을억제시키지못했음. 이상의 in vitro 간질모델에서 NMDA 수용체 antagonist 및진세노사이드의연구결과는아래의 논문으로최종발표되었음. Ginsenosides inhibit NMDA receptor-mediated epileptic discharges in cultured hippocampal neuron (2004) Arch. Pharm. Res 27:524.

hippocampal neuronal culture (HNC) model.

changeof [Ca 2+ ] i measured using fura-2-based intracellular Ca 2+ imaging technique.

Hippocampal neurons were exposed to Mg 2+ free solution for 30 min and [Ca 2+ ] i level

Ginseng (GTS, ginsenoside Rg 3, ginsenoside Re), the competitive NMDA antagonists (D-APV

13 13 그림 7). [Left] Changes of [Ca 2+ ] i dynamics and levels during status epilepticus (SE) in the hippocampal neuronal culture (HNC) model. After exposure to Mg 2+ free HEPES-buffered solution, (A) illustrates the long-term changeof [Ca 2+ ] i measured using fura-2-based intracellular Ca 2+ imaging technique. (B) Examples of time course of [Ca 2+ ] i dynamics and levels at labeled time points from (A). [Right] Effects of ginseng and NMDA receptor antagonists on [Ca 2+ ] i level during SE. Hippocampal neurons were exposed to Mg 2+ free solution for 30 min and [Ca 2+ ] i level was measured before, during, and after 2 min treatment of drugs. Ginseng (GTS, ginsenoside Rg 3, ginsenoside Re), the competitive NMDA antagonists (D-APV for NMDA biding site, 7-CK for glycine binding site), NMDA open channel blocker, MK-801, the L-type channel inhibitor, nifedipine, and the non-nmda receptor blocker, CNQX, were tested. 그림 8). Effects of ginseng and NMDA receptor antagonists on SREDs-induced [Ca 2+ ] i, neuronal death, and NMDA-induced convulsion animal model.

14 14 4. 결론 뇌졸중은암이외에단일질환으로서는우리나라에서가장중요한사망원인으로밝혀져있고뇌졸중에걸려사망하지않는다하더라도반신마비, 언어장애등의후유증으로고생하게되는무서운질병이다. 그러나발병후 6시간이내에사용해야하는혈전용해제이용, 외과적치료법이외에는예방및치료법이부족한현실이다. 한약재등풍부한천연물질을약물로사용하고있는국내에서는분리된단일성분들의세포수준에서의기전연구를통해그효능을입증할필요가있지만그연구영역은뇌질환영역에서는아직초기단계이다. 또한국내학교및연구소에서다양한신경전달물질의합성이가능하고천연물연구소, 한의학연구소등에서유용식물자원으로부터단일성분분리및일차적효능의스크리닝에관한연구로인하여신경전달물질및이온통로에 target 가능성이높은많은단일성분들의 chemical pool은형성되고있으나세포수준에서의스크리닝법및기전연구는체계적으로이루어지지않고있는점이국내기술의현황이다. 이러한현황에서뇌졸중과동반되어일어나는글루타메이트신경독성을억제하는물질들의빠른스크리닝법을구축하고진세노사이드 Rg 3 의분자수준에서 NMDA 수용체에대한세부기전을밝힌점은국내천연물연구에기여한바가큰것으로사료된다. 5. 참고문헌 Behl C, Widmann M, Trapp T, Holsboer F Beta estradiol protects neurons from oxidative stress-induced cell death in vitro. Biochem Biophys Res Commun 216(2): Chen QX, Perkins KL, Choi DW, Wong RKS Secondary activation of a cation conductance is responsible for NMDA toxicity in acutely isolated hippocampal neurons. J. Neurosci. 17: Coyle JT, Puttfarcken P Oxidative strees, glutamate, and reurodegenerative disorders. Science 262: DeLorenzo, RJ, Pal, S, Sombati, S Prolonged activation of the

15 15 N-methyl-D-aspartate receptor-ca2+ transduction pathway causes spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal neurons in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, Dubal DB, Shughrue PJ, Wilson ME, Merchenthaler I, Wise PM Estradiol modulates bcl-2 in cerebral ischemia: a potential role for estrogen receptors. J Neurosci 19: Kim DSHL Discovery and development of neuroprotective agents from Curcuma longa (Zingiberaceae) and Zingiber officinale (Zingiberaceae) against Alzheimer's disease. International symposium on the development of neuroprotective agents from plant resources Kim S, Rhim H. Ginsenosides inhibit NMDA receptor-mediated epileptic discharges in cultured hippocampal neurons. Arch. Pharm. Res May 27(5): Kim S, Ahn K, Oh T, Nah S, Rhim H. Inhibitory effect of ginsenosides on NMDA receptor-mediated signals in rat hippocampal neurons. Biochem Biophys Res Commun Aug 16;296(2): Kim YC, SR Kim, GJ Markelonis and TH Oh Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate-induced neurodegeneration. J. Neurosci. Res. 53: Lee, DY, EB Lee, YG Chai, KW Kim, S-Y Nah, TH Oh & Rhim, H. 17Beta-estradiol inhibits high-voltage-activated calcium currents in rat sensory neurons via a non-genomic mechanism. Life Sci Mar 15;70(17): Lee JM, Zipfel GJ, Choi DW The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms. Nature. 399:A7-14. Mosmann T Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J Immunol Methods 65:55-63.

16 16 Ni YC, BL Zhao, JW Hou and WJ Xin Preventive effect of Ginkgo-biloba extract on apoptosis in rat cerebellar neuronal cells induced by hydroxyl radicals. Neurosci Lett. 214: Sattler R, Xiong Z, Lu WY, Hafner M, MacDonald JF, Tymianski M Specific coupling of NMDA receptor activation to nitric oxide neurotoxicity by PSD-95 protein. Science 284: Sattler R, Tymianski M. Molecular mechanisms of calcium-dependent excitotoxicity J Mol Med 78:3-13 Singer CA, Figueroa-Masot XA, Batchelor RH, Dorsa DM The mitogen-activated protein kinase pathway mediates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primary cortical neurons. J. Neurosci. 19: Singh M, Setalo G. JR, Guan X, Warren M, Toran-Allerand CD Estrogen-induced activation of mitogen-activated protein kinase in cerebral cortical explants: convergence of estrogen and neurotrophin signaling pathways. J. Neurosci. 19: Randall RD, Thayer SA Glutamate-induced calcium transient triggers delayed calcium overload and neurotoxicity in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. 12: Rhim H, Kim H, Lee DY, Oh TH, Nah SY. Ginseng and ginsenoside Rg3, a newly identified active ingredient of ginseng, modulate Ca2+ channel currents in rat sensory neurons. Eur J Pharmacol Feb 2436(3):151-8 Vergun O, Sobolevsky AI, Yelshansky MV, Keelan J, Khodorov BI, Duchen MR Exploration of the role of reactive oxygen species in glutamate neurotoxicity in rat hippocampal neurones in culture. J Physiol 531(Pt 1):147-63

17 17 본글의저작권은 " 생물학연구정보센터 BioWave" 에있습니다. 일부내용인용시 " 생물학연구정보센터 BioWave ( Vol. 7 No. 10" 으로정보출처를밝혀야합니다. 전체내용에대한인용시생물학연구정보센터의사전허락 (mail: biowave@bric.postech.ac.kr Tel: ~8) 을받으신후전재가가능합니다. ( 단. 원저작자의경우는정보출처만밝히시면됩니다.)

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee University College of Medicine & Hospital E mail : ycell2@yahoo.co.kr Abstract