임상병리검사과학회지 : 제 30 권제 2 호 CELL-DYN 에서표적적혈구로언한 위백혈구증가중을보안 2 예 - 광학현미경및주사전자현미경척관찰 - 영남대학교의료원임상병리과 계명대학교의과대학중앙전자현미경설 * 이정우 김영호 * The Light Mic

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일우 목
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1 임상병리검사과학회지 : 제 30 권제 2 호 CELL-DYN 3000@ 에서표적적혈구로언한 위백혈구증가중을보안 2 예 - 광학현미경및주사전자현미경척관찰 - 영남대학교의료원임상병리과 계명대학교의과대학중앙전자현미경설 * 이정우 김영호 * The Light Microscope and Scanning Electron Microscope observation for two cases of Pseudoleukocytosis due to Target Cells in CELL-DYN 3000@ Lee, Jung Woo., Kim, Young Ho* Dept. 0/ Clinical Pathology, Yeoung Nam University Hospital. Dep. 0/ Central Electron Microscope, Keimyung University Schoolo/ Medicine* In recent, CBC count is measured by the autoanalyzer of the blood cell count in many routine laboratory, but some cases that is out of reference value showing incorrectly result. This study was carried out to elucidate differences between morphological findings and blood cells autoanalyzer in the specimens that appeared out of reference value, using light microscopy with blood smear treated Wright s stain and scanning electron We observed that the results of the Cell-Dyn 3000\!Y, direct blood smear, and SYSME- XSE are not same as those of each in the processing samples. The present study shows that RBC is composed of target RBC on the capillaη blood smear test. The main reason that pseudoleu1 ocytosis appeared to be result of the equipment

2 of Cell-Dyn is caused by falsely increased Í1umbers of lymphocytes. RBC was not identified at both light microscopy and scanning electron micrescopy, after sample which is easily lysed by the solution of the sheath was immediately admixed with the solution of the sheath. However, after "resistant RBC" in the specimen that showed pseudoleukocytosis is admixed with the solution of the sheath for 30 seconds, RBC was still observed at to light microscopy and scanning electron microscopy. Key Words Pseudoleukocytosis, Target cells, Cell-Dyn 3000뱅, Optical microscope, Scanning Electron micros pe 1. 서론 일반혈액검사에서가장많이하는검사는전혈구계산 (CBC, complete blood cell count) 검사와백혈구감별검사인데최근에는 자동혈구계산기로백혈구검사와백혈구감 별검사까지자동화된방법으로측정하고었 다. 자동혈구계산기에서의백혈구검사와백혈 구감별검사는전기저항법, 세포화학적분 석법, 레이져광선산란법등을이용한방법 으로발전되었고전자기술의발전으로혈구 계산과다양한혈구감별을할수있는체계 를가지게되었다. CELL-DYN 3 아 )()@ (Abbott Diagnostics, USA) 은성숙된 5 가지백혈구종류 ( 호중구, 림프구, 단구, 호산구, 호염기구 ) 를구분하기 위하여다각도편광산란분리법 (MAPSS, multi -angle polarised scatter separation ) 을이용 한 laser light scatter 방법으로검사하는자 동혈구계산기이다. 그러나이러한자동혈구계산기들은 많은 검체들을신속하고정확한결과를나타내지 만여러가지원인으로인하여잘못된결과를 나타내기도하는데그것을보완하기위하여 각병원의혈액검사실에서는참고기준치를 설정하여기준에벗어나는검체는수동으로 도말표본을만든후 Wright 염색을하여현 미경으로확인하면서자동혈구계산기로잘못 된검사결과를보완해주고있다. 저자들은이러한확인과정에서 CELL DYN 3000@ 에서계산된백혈구수와백혈구 감별검사가도말표본에서의결과와불일치로관찰되어 CELL-DYN 1600@ (ABBOTT Diagnostics, USA) 과 SYSMEX SE-9000 (TOA Medical Electronics Co, JAP AN) 으로 재확인결과도역시불일치하게관찰되었다. 특이한점은도말표본에서많은수의적혈구 CELL-DYN 가표적적혈구로나타났으며 에서의백혈구감별은림프구의가성 증가가인상적이었다. 본실험에서는 sheath solution 에 의해표 적적혈구가용해되어야함에도불구하고용 해가불완전하여백혈구로오인되어계산되 는것으로생각되었고이러한백혈구들은거 의대부분이림프구로측정이되는것으로 나타났으며실험을통하여광학현미경으로 확인하는과정에서용해되는과정을볼수가 있었다. 의 이에저자들은시간의경과에따른적혈구 용해과정을광학현미경과주사전자현미경 으로비교관찰을하여문헌고찰과함께보 고하는바이다. 11. 실험채료및방법

광학현미경관찰 : CELL-DYN 3000@ 에서 의자동혈구계산기로측정할때와같은희석 방법 ( 약 10 초간혼합후측정 ) 으로혈액 32ul 와 sheath solution 1. 6ml 를사용하여혼합 즉시, 10 초, 30 초경과시광학현미경으로관 찰하였다. 주사전자현미경관찰 : 위와같은방법으 로도말한표본을 2.5% glutaraldehyde 고정 액 <O.

3 광학현미경관찰 : CELL-DYN 3000@ 에서 의자동혈구계산기로측정할때와같은희석 방법 ( 약 10 초간혼합후측정 ) 으로혈액 32ul 와 sheath solution 1. 6ml 를사용하여혼합 즉시, 10 초, 30 초경과시광학현미경으로관 찰하였다. 주사전자현미경관찰 : 위와같은방법으 로도말한표본을 2.5% glutaraldehyde 고정 액 <O.lM 인산완충액, ph. 7.4) 으로 C 에 서 2 시간전고정하고인산완충액으로세척 한후 1% osmium 산용액에 2 시간후고정 한후같은완충액으로세척하여 2% tannic 산에 12 시간전도염색한후 1% osmium 산 용액에 2 시간재고정후계열 alcohol 로탈수 하고 t-buthyl alcohol 에넣은후 Hitachi ES-2030 형동결건조기로동결건조하였다. 건조된시료를시료대에부착후 Hitachi E-1030 형이온증착기를사용하여 pt-pd 합 금으로증착한다음 Hitachi S-4200 형주사 전자현미경으로관찰하였다. 1. 환자 A III. 증례 75 세의남자로간경변으로진단받고입원 치료중에있는환자이다. 검사소견은 CELL-DYN 3α)()@ 에서백혈 구수 ul, 적혈구수 2,110,OOOul 혈색소 8.8 g/dl, 백혈구자동감별은호중구 17.5%, 림프구 77.5%, 단구 1.8%, 호산구 0.4%, 호 염기구 2.8% 이었고 SYSMEX SE-9000 은백 혈구수 ul, 적혈구수 2,140,000 ul, 혈색 소 8.6 g/dl 이고자동감별은불가능으로나 왔다. CELL-DYN 1600@ 은백혈구수가 11,80 o ul 으로나왔다. Wright 염색을하여현미 경으로본백혈구감별검사결과는호중구 55%, 림프구 40%, 단구 3%, 호산구 2% 가 나왔다 ( 표 1). 광학현미경으로검경하는과정 에서표적적혈구가많이보여인위적으로 sheath solution 과혼합하여 ( 혈액 32ul 와 1.6 ml 의 sheath solution) 혼합후 10 초, 20 초, 30 초를경과하여관찰을실시하였다. 정 상적혈구는혼합즉시 (Fig l) 과같이 용해 되었으나 A 환자는혼합 10 초후는많은적혈 구들이광학현미경상태에서관찰되었으며 (Fig2) 혼합 30 초후까지도비용해된적혈구 를볼수있었고 (Fig3) 주사전자현미경상태 에서도 30 초후비용해된표적적혈구를볼수 있었다 (Fig4). 2. 환자 B 55 세의여자로간염으로진단받고외래로 치료받고있는환자이다. 검사소견은 CELL-DYN 31α)()R 에서백혈구수 는 24,500 ul 이고 SYSMEX SE-9000 은 10, 밍 o ul 이었다. 백혈구자동감별에서도 CE LL - DYN 3000 R 은호중구 15.5%, 림프구 79.0%, 단구 3.5%, 호산구 0.4%, 호염기구 1.6% 가나왔으며역시 SYSMEX SE- 9Q00 은 불가능으로나왔다. Wright 염색을하여현 미경으로본백혈구감별검사결과는호중구 60%, 림프구 34%, 단구 3%, 호산구 2%, 호염 기구 1% 이었다 (Table2). B 환자 에있어서도 sheath solution 에혼합후광학현미경으로 관찰하였으나용해되는과정이빨리진행되 어 10 초후는많은적혈구가관찰되었으나 30 초후는거의모든적혈구가용해되어사진 촬영을할수없었다. 이에저자들은주사전 자현미경고정액 2.5% glutaraldehyde 고정 액 <O.1M 인산완충액, ph. 7.4) 올가하여혼 합 10 초후광학현미경으로관찰하였으며 (Fig 5) 혼합 20 초후비용해된표적적혈구를 관찰할수있었다 (Fig 6). 주사전자현미경 상태에서도 (Fig 7) 과같이혼합 10 초후비 용해된표적적혈구를관찰할수있었으며 혼합 20 초후에도비용해된표적적혈구를관 찰할수있었다 (Fig 8)

The light rnicroscopic morphology of the lysed RBC(X400) Fig 2.

4 Fig 1. In ten seconds, the patient s RBC is rnixed with Sheath solution. The light rnicroscopic morphology of the lysed RBC(X400) Fig 2. In ten seconds, the blood specimen of the patient A is mixed with Sheath solution. The light rnicroscopic morphology of the unlysed "Target RBC"(X400) Fig 3. In thirty seconds, the blα 성 S 야 cimen of the patient A is mixed with Sheath solution. The light rnicroscopic morphology of the unlysed "Target RBC"(X400) Fig 4. In thirty seconds, the blood specimen of the patient A is mixed with Sheath 5 solution. The scanning electron microscopic morphology of the unlysed "Target RBC"(Xll00) Fig 5. In ten seconds, the blood specimen of the patient B is mixed with Sheath s solutions. The light microscopic morphology of the unlysed "Target RBC"(X400) Fig 6. In twenty seconds, the blood specimen of the patient B is mixed with Sheath s solution. The light microscopic morphology of the unlysed "Target RBC"(X400)

In twenty seconds, the blood specimen of the patient B is mixed with Sheath s solution.

5 Fig 7. In ten seconds, the blood specimen of the patient B is mixed with Sheath s solution. The scanning electron microscopic morphology of the unlysed "Target RBC"(X200ü) Fig 8. In twenty seconds, the blood specimen of the patient B is mixed with Sheath s solution. The light microscopic morphology of the unlysed "Target RBC"(XllOü) Table 1. 증례 A 환자의자동혈구계산기에따른혈액검사비교 Cell-Dyn 3000 Sysmex SE Cell-Dyn 1600 WBC 27.4 X 10/ul 11.5 X 10/ul 11.8 X 10/ul RBC 2.11 X 10/ul 2.14 X 10/ul Hgb 8.8 g/dl 8.6 g/dl Auto Diff Manual Diff Neu 17.5 % 불가능 55 % Lym 77.5 % 40 % Mo 1.8 % 2% Eo 1.4 % 2% Ba 1.8 % 1 %

6 Table 2. 증례 B 환자의자동혈구계산기에따른혈액검사비교 Cell-Dyn 3000 Sysmex SE-9000 Cell-Dyn 1600 WBC 24.5 X 10/ul 10.5 X 10/ul 10.1 X 10/ul RBC 1.90 X 10/ul 1.97 X 10/ul Hgb 7.8 g/dl 7.7 g/dl Auto Diff Manual Diff Neu 15.5 % 불가능 60% Lym 79.û % 34% Mo 3.5 % 3% Eo 0.4 % 2% Ba 1.6 % 1 % 위의 2 예에서특이한것은 CELL-DYN 적인방법인현미경검경보다는아직은완전 3000@ 에서의 Suspected flag 는 Variant Ly- 하지못한실정이다. 이러한자동혈구계산기 mphocytes, Nucleated RBC, RBC Morpho- 들을사용할때에는각검사실에서선정한 logy 의다양한 flag 가거의전예에서출현참고기준치를벗어나는환자군에서는수동으 하였고, SYSMEX SE-9000 에서는자동백혈로도말표본을제작하고 Wright 염색하여 구감별이불가능하였으며 RBC Lyse 현미경으로백혈구감별검사를확인하여보 Resistance, NRBC? 의 WBC flag가거의완해주고있다. 모든예에서출현하였으며백혈구감별에서미국 ABBOTT사의 CELL-DYN 3000@ 에 의특이한점은 CELL-DYN 3α'IJ@ 에서림서는백혈구수와백혈구감별을측정하기위 프구의가성증가가인상적이었고도말표본해서흡입된혈액 32ul 와 1. 6ml 의 sheath 에서표적적혈구가많이보였다 solution 을사용함으로서 ( 약 10 초간 ) 순수 한백혈구들을보호하고직선유체흐름의생 N. 고찰성둥을유지하며백혈구를자연상태그대로 유지한다. 이때 RBC 들은용해해서투명하게 자동혈구계산기는많은겸체의혈구수를하고유세포분석기원리를이용한희석된전신속하고정확하게측정하여경비와시간을혈을 flow cell로통과시키면서 helium-neon 줄이게되었고자동기기의발전으로백혈구레이저광을투시하여 WBC optical count 감별계산도자동으로측정되어지고있다. 이 (WOC) 방법인다각도편광산란분리법 (MA 러한자동혈구계산기들은비정상검체에대 PSS, m 띠디 - 뻐 gle polarised scatter separation ) 해서는검체소견에대한표시및 histogram 을사용하여 4 가지각도의산란광검출기로, scattergram 등을통하여많은정보를제백혈구감별계산 : 을한다 4,5) 공하고있으나미성숙세포에대해서는수동 O. forward angle light scatter에서는 cell

size 를측정하고 10 0 narrow angle light scatter 에서는세포의구조와복잡성을측정하 고 90 0 orthogonal light scatter에서는과립도와분엽도를측정하고 90 0 D ninety degree depolarized scatter로호산구를측정 한다.

7 size 를측정하고 10 0 narrow angle light scatter 에서는세포의구조와복잡성을측정하 고 90 0 orthogonal light scatter에서는과립도와분엽도를측정하고 90 0 D ninety degree depolarized scatter로호산구를측정 한다. 이는레이저 flow cytometry 법의일종으로서 cellol 조사되는레이저광선속을통과할때세포의크기, 핵의복잡도, 분엽도, 두께, 과립도, 투과도, 편광성등을분석하는방법이다 4, 5) 이때측정된백혈구의수가 4,000 ul 이하가되면자동적으로재측정을실시하며검체의결과가설정된참고치를벗어나거나비정상세포가보일경우는다양한 flag 가표시 되며비정형임파구는 low angle forward s catter상림프구의위치, 분포, 밀도등의정보및림프구와단구의경계구분이설정된기준치에맞지않는경우등에따라표시된 다 4,5) 백혈구가가성증가되는경우는한냉글로부린, 한명섬유소원유핵적혈구, 혈소판응집, 비용해된적혈구에의한경우가있을수있으며 EDTA 에의한위백혈구증가증과위혈소판감소증등은보고된예들이많이보고되고있다 2,,3끼백혈구측정에서적혈구를용해시키는과정에서적혈구용해제가약하여적혈구가남아있어서잘못계산된경우나적아구가섞인경우에는높게측정되기도한다. 본예에서도 Sheath solution 에의한표적적혈구가용해되어야함에도불구하고용해가불완전 하여 CELL-DYN 3000@ 의 MAPSS 방식인다각도편광산란분리법에의해 mononuc1ear cells은 O 와 10 에서분류가되는데여기에는림프구, 단구, 호염기구가포함된다. 이러한원리로인해백혈구중에서도림프구로측정이된것으로사료되었다 4,5) 저자들의관찰에의하면표적적혈구가나오는모든검체에서위백혈구증가증을보이 지는않았으며, 이는아마도 sheath 용액에의해용해 (WBC mixing chamber 에서약 10 초간 ) 가되어투명하게되는표적적혈구는 검사결과에아무문제가없었다. ABBOTT 사에서도 CELL-DYN 3500@ 을 개발하면서 resistant RBC 를해결하기위해 Two separate channels 인 WIC!WOC(WBC impedance count, WBC optical count) 방법으로빠른 L yse 용액을이용하여 resistant RBC 가 WBC 로인지되는점을개선하였다고하였다 10) 혈액검사실에서는의화가들어온모든환 자의검체에대해이러한 suspect flag 가 나타나는것뿐아니라백혈구수, 혈소판수, 적혈구수, 혈색소, 호중구나림프구의절대수 가비정상인환자에대해서는전혈구검사와 백혈구감별검사는자동혈구계산기와도말표 본을병행하여자세히관찰하는것이좋고 신규환자들도도말표본을병행하여 업무의 효율성을증대하고검사결과의신뢰성을최 대한높여야할것이다. V. 결론 일반혈액검사실에서많이이용되고있는 전혈구계산과백혈구감별검사는자동혈구계 산기로측정한결과에서참고기준치를벗어나는검체는도말표본을제작하여 Wright 염색하여현미경으로확인한후결과를보완 하고있다. 이러한과정에서 CELL-DYN 3α)()@ 에서의결과와도말표본에서확인한결 과가불일치로관찰되어 SYSMEX SE-9000 으로확인한결과백혈구수가 SYSMEX SE 과다른결과를보여주었다. 말초혈액도말검사에서적혈구는표적적혈 구로구성되어 서 있었고 CELL-DYN 3 아 )()R 에 림프구의가성증가로인하여위백혈구증 가증을보였으며표적적혈구에서도 sheath 용액에용해되는검체는문제가없었으나 Resistant RBC 라고 부르는 sheath 용액에

8 용해되지않은검체는백혈구로계산되어위 백혈구증가증을보였다. Sheath 용액에용해되는검체는 sheath 용 액과혼합즉시 광학현미경으로검경하거나 주사전자현미경으로관찰하여도적혈구는용 해되어있었으나, 위백혈구증가증을보이는 용해되지않은 Resistant 적혈구는광학현미 경으로관찰한결과 30 초가지나도많은수 의적혈구가관찰되었으며주사전자현미경 상태에서도 30 초에서표적적혈구를볼수있 었다. REFERENCE 1. 차영주, 홍석일, 조한익 : 혼합성한앵글로 부린으로인하여위백혈구증가증및위혈 소판증가증을보인 1 예. 대한임상병리학 회지 3 : 119, 이정우, 이경순, 강영숙, 김정숙 : EDTA 에 의한위백혈구증가증과위혈소판감소 증을보인 2 예, 대한임상병리사회지 17( 1) : 윤영호, 한규섭, 김춘원, 김기홍 : EDTA 에의한위혈소판감소증 3 예. 임상병리와 정도관리 8( 1) : 91, CELL-DYN 3000 operation reference m anual. Sequoia-Tumer corporation, August CELL-DYN 3000 version 4.17 software update manual. Abbott diagnostics, November Combleet PJ, Myrick D, Judkins S, Levy R Evaluation of the CELL-DYN 3000 differentiol. 98 : 김정애, 박은경, 변대훈 : EDTA 항응고제 에의한위혈소판감소증 2 예. 임상병리사 회지 24(1): 203, 정화령 : 자동혈구계산기 CELL-DYN 3000 을이용한백혈구감별계산의평가. 임상병리와정도관리 15 : 207, Aubert-Letrillart-B, Binet-JL, Baudet-S, Azgui-Z, Merls-Beral-H Performance evaluation of the haemat이 ogical analyser CELL-DYN 3α)(). 35(6) : 535, CELL-DYN 3500 operation reference manual. Abbott diagnostics, January 이정우, 은영숙, 박해철 CELL-DYN 3000 에서표적적혈구로인한위백혈구증 가증 2 예. 대한혈액수혈검사학회지 4( 1)

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<5B30325DC8ABBDC2BAB92E687770> 대한임상검사학회지 : 37 권제 3 호, 143-148, 25 Coulter LH 75 TM 에의한백혈구감별계산및 Suspect Flags 의평가 분당제생병원진단검사의학과 홍승복 최종태 이성규 김현수 Evaluation of Coulter LH 75 TM on Leukocyte Differential Count and Suspect Flags Seung-Bok