약학회지제 47 권제 1 호 14~19 (2003) Yakhak Hoeji Vol. 47,No. 1 藥學舍확 모발생장기유도 C3H 생쥐에있어서미녹시딜과생약추출혼합조성물의모발재성장유도효능 이계호 한선일 박길홍 * 권영이 # STC 생명과학연구원신약개발연구소, * 고려대학

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용희 원
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1 약학회지제 47 권제 1 호 14~19 (2003) Yakhak Hoeji Vol. 47,No. 1 藥學舍확 모발생장기유도 C3H 생쥐에있어서미녹시딜과생약추출혼합조성물의모발재성장유도효능 이계호 한선일 박길홍 * 권영이 # STC 생명과학연구원신약개발연구소, * 고려대학교의과대학 (Received January 6,2003; Revised January 23,2003) Evaluation of the Herbal Extract Mixture for the Effects of Hair-Regrowth Compared to 3% Minoxidil; Elongation of Anagen Period on C3H Mice Kye-Ho Lee, Sun-11 Han, Gil-Hong Park* and Young-Ee Kw on# Drug Discovery Institute STC Life Science Center, 6-13 Nonhyun-Dong, Kangnam-Gu, Seoul Korea ^College of Medicine, Korea University, Anam-Dong, Sungbuk-Gu, Seoul , Korea Abstract The hair cycle consists of three phases, growth (anagen), involution (catagen) and quiescence (telogen) phases. In order to evaluate hair re-growth effect of herbal extracts mixture containing the 70% ethanol extracts of Polygoni Multiflori Radix, Mori Cortex Radicis, Gingko Biloba Folium and Pine bud, we have examined the induction of the anagen phase and/ or elongation of the anagen period using C3H mice. Morphological examination was done by Hattori' and Ogawa's method. Enzyme activities of y-glutamyl transpeptidase (y-gt) and alkaline phosphatase (ALP) was detected by Bessey-Lovry- Brock's method. Enzyme activity as a biochemical marker of hair cycle was investigated in the third hair cycle period of C3H mice after depilation. 3% Minoxidil treated group and herbal extract mixture treated group were shown 3 days earlier initiation of anagen than control group. In cycling mouse skin, y-gt activity is pronounced during anagen and greatly diminished during telogen. Herbal extract mixture has shown promising hair re-growth effect on hair follicular cycles of C3H mice. Keywords Hair re-growth, herbal extract, minoxidil, y-glutamyl transpeptidase 탈모란정상적으로머리카락이있어야할곳에유전적, 후천 적인요인으로머리카락미빠지는현상으로지금까지탈모를치 료하기위한많은약물과방법이연구되고있지만, 현재미국식 품의약품안전청 (FDA) 에의해발모제로인정된것은미녹시딜 (minoxidil)11 과피네스테라이드 (finasteride) 두가지이다. 이외 에는육모, 탈모방지의효능을표방하는의약외품및화장품이 시중에유통되고있는데이들의대부분은천연물추출혼합물인 것으로알려져있다. 미녹시딜은미국업존사에의해고혈압치 료제로개발되어승인을받았으나부작용으로발모작용이나타 나자 르는발모제로승인을받게되었고, 피네스테라이드는전 립선치료제로개발되었다가부작용으로발모작 ᅵ 나타나먹는 발모제로시용되고있다. 발모제의발모작용은명확히밝혀지지 않았고, 일반적으로혈액순환의증가로두피에영양분공급증 # 본논문에관한문의는저자에게로 ( 전화 ) ( 팩스 ) ( ) yekwon@stc365.com 가가그주요원인으로알려져있다.31 상백피, 하수오, 솔싹, 은행잎둥은동의보감에한방적으로발모와탈모방지에효능이있는것으로되어있다. 상백피 (Mori Cortex Radicis) 는약리실험에서혈압강하, 거담, 이뇨, 혈당강하작용등이알려져있으며,4) 하수오 (Polygoni Multiflori Radix) 는기운과피를도와주고, 근육과뼈를튼튼히하며골수를메우고, 모발을검게하며수명을연장하는것으로5 솔싹 (Pine bud) 은프리라디칼소거와자외선흡수보조역할을수행하는것으로알려졌으며,6) 은행잎 (Gingko Biloba Folium) 주줄물은사람각질세포 (keratinocyte) 에서 glutathione 대사를유도하는것으로알려져있다.7' 발모효능시험방법으로는 C57BL이나 C3H 생쥐를이용한실험법이널리사용되고있다.840) 휴지기 (telogen) 단계의생쥐등부위를제모勝 S ) 한후, 시료를처리하고발모정도를육안으로관찰히는것이일반적이며, 생쥐등부위피부조직을적출하여발모와관련된생화학적또는유전적인효소의활성여부를측정하는법도사용되고있다. 발모와관련된생화학적효소인 Y-GT(Y-glutamyl transpeptidase) 는 membrane-bounded enzyme.0-?- glutathione 14

2 15 생약추출물의 모발 재성장 유 효능 대사와 세포막을 통한 아미노산과 펩티드의 흡수 배출에 관여 Male C3H mice at 8 weeks after birth 하며11 13 특히 생장기 (anagen)의 가장 좋은 지표로 보고된 바 있 Depilation 다.13) y-gt는 중식과 분열이 활발한 세포내에서 많이 발현되고, Materials application 휴지기(telogen)에 접어들면 감소했다가 생장기(anagen)에 들어 가면 증가하는 양상을 나타내는 것으로 보고되어 있다.14) Hair 5, days after depilation follicle 세포내 y-gt의 역할은 glutathione tripeptide로부터 r Sacrificed cysteine moiety가 분리되는 과정에 작용하여 cysteine을 얻어 Dorsal skin 적출 keratin을 합성하는 것으로 알려져 있다.15) Alkaline phosphatase (ALP)가 발모 기전에 관여하는 바는 규명되어 있지 않지만 모발 Added 4 vol. 0.1 M K P buffer (ph 7.4) 생성 과정 중 hair matrix 내 혈관 신생에 관여한다는 보고16>와 Homogenization 발모가 일어나면서 효소 활성이 증가한다는 보고8 9 13)가 있어 발 모의 또 다른 지표로 고려될 수 있다. 본 연구는 미녹시딜과 생 Homogenate 약추출물 혼합 조성물을 처리하였을 때 나타나는 발모작용을 비 Centrifuged at 12,000 rpm for 20 min 교 관찰하기 위하며, C3H 생쥐의 등부위를 제모(depilation)하며 생장기 (anagen)를 유도한 푸 날짜 경과에 따른 hair re-growth에 대한 형태 관찰과 이때 증가되는 Y-GT 및 ALP 활성을 측정하 여 발모 정도를 알아보고자 하였다. Pellet (discarded) Supernatant g a m m a - G T ALP activity Fig. 1 - Process of hair growth activity assay. 실험방법 경추 탈구법에 의해 처치한 후 피부 조직을 적출하여 지방과 근 시약 및 기기 육조직을 제거하고 효소 활성도 측정에 사용하였다. Folin & ciocalteu's phenol reagent, reduced glutathione, oxidized glutathione, bovine serum albumin, (3-NADPH, tris- 효소 시료의 조제 (hydroxymethyl)aminomethane는 Sigma 사의 제품을 사용하였 피부 조직은 빙냉하에서 미세 절편으로 만들었고, 그 중 일정 으며 그 외 일반 시약들은 특급을 사 용하였다. 기기는 UV 량을 칭량한 후 4배량의 0.1 M 인산완충용액(pH 7.4)을 가하여 spectrophotometer(bio-rad, SmartSpecTm30G0), biohomogenizer biohomogenizer를 이용하여 20%(w/v) 마쇄 균질액을 만들었다- (Biospec Products, Inc., M133/1281-0)와 그 외의 기기는 실험 이 균질액을 12,000 rpm 에서 20분간 원심 분리하여 그 상등액 실에서 사용하는 일반적인 기자재를 이용하였다. 시험 물질은 시 (PMF: post-mitochondrial fraction)을 분리하였다(Fig. 1). 중에서 구입한 3% minoxidil(현대약품)과 모발영양제로 시중에 유통되고 있는 생약추출물 혼합조성물(은행잎 : 솜싹 : 하수오 : 상 백피 = 1 :1 :1 :1 추출 혼합조성물 - 이하 Hem 으로 표기>을: 사용 하였다. 효소 활성도 측정 Y-glutamyl transpeptidase (y-gt) 활성 - Y-glutamyl-3carboxy-4-hydroxyanilidel 기질로 하여 생성된 5-aminosalicylic acid를 다시 p-xylenol과 sodium metaperiodate로 반응시켜 생 실험동물 성된 kenoid 색소블 635 nm 에서 즉정하는 kit 시액(영동제약)에 동물은 체중 30 g 내외의 건강한 5 주령 C3H/He종, 수컷 생 의하였다. 활성도 단위는 단백질 1 mg 당 unit로 표시하였다. 쥐를 중앙실험동물로부터 구입하여 사육실(온도 25 土10C, 습도 A lkaline phosphatase (ALP) 활성 -p-nitrophenolphosphate 50±5%)에서 3주일 적응시켜 실험에 사용하였다. 실험군은 제모 를 기질로 하여 37 ( 에서 30분간 반응시킨 후 유리된 p- 기 및 면도기를 이용하여 제 2 발모 주기의 휴지기 (telogen)에 nitrophen이에 alkali를 가하여 비 색 정량하는 Bessey-Lovry- 제모한 후 45% 에탄올 도포군 (대조군), 3% minoxidil 도포군, Brock 방법17>에 의하였다. 활성도 단위는 단백질 1 mg 당 Hem 도포군으로 나누었고 각 군은 날짜 경과(5 8, 11, 15, 20, Bessey-Lowry unit로 하였고. 단백질의 정량은 Lowry 등의 방 30일)에 따라 다시 6군으로 나누어 1군당 각각 5마리씩 분리 수 법 i8)에 준하여 b0vine albumin을 표준품으로 하여 측정하였다. 용하였다. 각 실험군에 대한 시료의 도포는 제모한 등부위에 1 일 2회, 1회 도포시 약 300 [ii 씩 도포하였다(total n = 90). 동물 통계 처리 은 제모 후 5, 8, 11, 일에 발모 형태를 사진 촬영하고 통계 처리는 student s t-test로 하였으며 유의 수준은 0.05 이 Vol. 47, No. 1, 2003

3 16 이계호 한선일 박길홍 권영이 하로하였다.19) 형태관찰 Hair re-growth 형태관찰은 Hattori와 Ogawa 방법9} 에준하였다. 휴지기 (telogen) 인 C3H/He 생쥐 (8주령, 수컷 ) 등부위털을제거후 1일 2회, 1회약 300 i/ 씩도포하였다. 제모후 15, 20일째에디지털카메라 (Sony Corp., Cyber-shot) 를이용하여제모부위당 hair re-growth 정도를비교하였다. 결과및고찰형태변화발모주기는생장기 (anagen), 퇴행기 (catagen), 휴지기 (telogen) 를거치면서탈모와발모가반복되어지는것으로알려져있는데20> C3H 생쥐의경우휴지기일때핑크색을나타내는피부색이발모가일어나면서청색으로바뀌어생장기시작점을육안으로관칠하기쉬워 in vivo 발모약효검색실험동물로많이이용되고있다.8 9) 발모주기를이용한발모실험을위하여 8주령 C3H 생쥐의제 2 발모주기휴지기상태인등부위를제모함으 로써동일한세번째발모주기를유도한후 3% minoxidil, Hem 를도포하였을때나타나는형태변화를제모후 15,20 일째에사진촬영을통해확인하였다 (Fig. 2). 실험결과, 대부분제모후약 8~13일경에생장기가유도되었다. 3% minoxidil 도포군은다른군에비해약 2~3일생장기 (anagen) 가빨리유도되었고, 제모후 20일경거의완전한 hair re-growth를나타내었다. 반면, Hem 도포군의경우제모후 15일경대조군과비슷한양상으로 hair re-growth가일어났지만, 날짜경과에따라급격한 hair regrowth가일어나면서도포 20일경에는대조군에비해더많은 hair re-growth를보여주었으며, 모발의윤기와건강상태가미녹시딜도포군이나대조군보다더우수하였다. 이는은행잎의 glutathione 대사및상백피의혈행촉진작용, 하수오의모발증강작용과솔싹의항산화효능이서로상승작용으로나타난것으로사료되며모발의윤기와건강상태가미녹시딜도포군보다좋았던점은생약추출물들이모발에영양분을공급하여나타난작용이라고생각된다. y-glutamyl transpeptidase (y-gt) 활성 y-gt(y-glutamyl transpeptidase) 는생체내산화적스트레스와 소 15 days after depilation Control Minoxidil Hem 20 days after depilation 纖맥 ^ 져^ 뼈 / V\v j T i / scontrol Minoxidil Hem Fig. 2 - Morphology of C3H mice hair re-growth after depilation. Photographs were taken after topical application of test agents for 15,20 days. These agents were applied to 8-week old C3H mice ( $ ), 600 i//day/mouse. J. Pharm. Soc. Korea

4 17 생약추출물의 모발 재성장 유도S 능 Table I - Change in y-glutamyl transpeptidase activity after depilation m C3H mice skin Group 5 days 8 days 11 days Control ± ± % Minoxidil ±26.41*a c) ± a) Hem ±12.21*a) ± days 20 days ± ± 土13.85***al ± ± 17.50*a) ±30.81 베 30 days ± ± ± ± ± 27.02**a*5" b) ±17.96 The assay procedure was described in experimental methods. Each value represents the mean 土S.E. of 5 experiments. a) Significantly different from the control (45% ethanol) group, b) Significantly different from the minoxidil group, c) Significantly different from the Hem group (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). Unit; mu/m/. 700 올을 도포한 대조군에 비해 3일 정도 생장기가 먼저 유도되었음 6 을 나타낸 것이다. 또한 Hem 도포군의 경우 Fig. 2에서 관찰된 가 일어남과 동시에 Y-GT 또한 유의하게 증가(p < 0.05, p<0.01) 3 바와 같이 제모 후 15일에서 20일 사이에 급격한 hair re-growth 4 ᄀ E/SIIU 5 OJ 우 8일째부터 효소 활성의 증가를 보여주었다. 이는 45% 에탄 l ojd u CD 800 하고 있음을 관찰할 수 있었다. Richards 등은 표피에서 진피로 hair follicle의 함몰시에 丫 -GT의 발현이 보이지 않으나, 초기 생 - o Days after depilation Fig. 3 Change in gamma-glutamyl transpeptidase activities after depilation in C3H mice skin. Skin samples were incubated with gamma-gt substrate for 20 min at 37 C. Each value represents the mean 土S.E. of 5 experiments. Unit; mu/m/. *p<0.05, **p<0.01, ***p< compared with control. 장기 단계에서 케라틴화와 관련하여 y - g t 활성이 나타나고 있 음을 보고하였다.23'24) 즉 제모 후 생장기가 유도되는 8일에서 11 일경에 丫-GT 활성이 증가하는 양상은 초기 생장기의 케라틴화 에 필요한 cysteine으로 분해하는데 yᅳ GT 가 관여하며 나타난 결 과로 생각된다. 특히 은행잎이 glutathione 대사에 관여하는 것 으로 보고되어 있어7 y-gt 활성 증가에 영향을 준 것으로 사료 된다. glutathione 대사 그리고 세포막을 통한 아미노산과 펩티드의 듭 Alkaline phosphatase (ALP) 활성 수 및 분비에 관여히는 효소로,12 21) glutamate, cysteine, glycine ALP 는 주로 혈관 신생에 관여하며, 진피 유두에 밀집되어 있 으로 구성된 glutathione의 체내 대사에 관여하여 세포내 hair의 는 모세 혈관으로 영양을 공급함으로써 발모 삭용을 원활하게 해 케라틴화에 주성분인 cysteine을 공급한다.15) 발모 주기에서 생 주는 것으로 알려져 있다.8 91 따라서 ALP 측정은 발모 작용을 간 장기 (anagen)가 유도될 때 y-gt의 더 많은 발현으로 발모의 표 접적으로 추측 가능한 것으로 보고되어 있고 16) non-growth 부 지 성분중 하나로 Y-GT가 제시되었다.15) Table I 과 Fig. 3은 8 위에 비해 re-growth 부위에서 alkaline phosphatase 활성이 현 주령 C3H 생쥐 등부위를 제모하여 anagen 유도후 날짜 경과에 따라 적출된 피부 조직의 Y-GT 측정 결과이다. 제모시 면도에 의한 피부 자극으로 올 수 있는 초기 효소 활성의 영향을 배제 minoxidil 도포군이 다른 군에 비해 효소 활성이 높게 나타났으 나 피부색이 핑크색에서 청색으로 변하는 8일에서 11일경에는 Hem 도포군과 유사한 값을 나타내었다. Hair re-growth가 급격 6E/^cn u lb OJd 하고자 제모 5일 후부터 효소 활성을 측정하였고, 초기에 3% 히 일어나는 제모 후 15일에서 20일경에는 Hem 도포군이 3% minoxidil 도포군에 비하여 유의한 효소 활성 증가를 나타내었으 며(p<0.05 p < 0.001), 이는 형태 관찰과 같은 결과를 보여주 었다. 3% Minoxidil 도포군은 생장기가 일어나는 시기에는 다른 군에 비하여 효소 활성이 높았고 후기 생장기 시기인 15일에서 20일 사이에는 다른 군에 비해 활성이 떨어져 전반적으로 완만 한 곡선의 변화를 보였다. 대조군의 경우 제모 후 11일에서 15 일 사이에 효소 활성이 급격히 증가하는 반면 Hem 도포군의 경 Vol. 47 No Days after depilation Fig. 4 - Alkaline phosphatse activities of hair cycle-dependent changes in C3H mice. Skin samples were incubated with ALP substrate for 30 min at 37 C. Each value represents the mean ± S.E. of 5 experiments. Unit; Bessey-Lowry unit/m/. *p<0.05, **p< 0.01, ***p < compared with control.

5 18 이계호 한선일. 박길홍 권영이 Table II - Change in alkaline phosphatase activity after depilation in C3H mice skin Group Control 3% Minoxidil Hem 5 days 8 days 11 days ± ± ± ±0.141"*a) ±0.070**a c) ±0.599" ± ± ± days 20 days 30 days ± ±0.141% 土0.249**a) ± ± 0.420*c) ± 0.271* *a) ± ±0.225 *a c) ±0.071 The assay procedure was described in experimental methods. Each value represents the mean ± S.E. of 5 experiments. a) Significantly different from the control(45% alcohol) group, b) Significantly different from the minoxidil group, c) Significantly different from the Hem group (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). Unit; Bessey-Lowry unit/m/. 저히 증가함이 보고되었다.9) Fig. 4와 Table II는 날짜 경과에 따 3) Bessey, 0. A., Lowry, 0. H. and Brock, M. J. : A method for the 른 ALP 활성을 측정한 것으로 3% minoxidil 도포군의 경우 제 rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic 모 후 5일에서 8일 사이의 ALP 는 y-gt와 유사한 양상으로 다 른 군에 비해 유의한 치이를 보였다(p < 0.01, p < 0.001). 효소 활 성은 생장기가 일어나는 시기인 8일에서 11일경에 세 군 모두 비슷한 양상으로 중가하는데, 3% minoxida 도포군이 가장 높은 증가를, Hem 도포군은 丫 -GT 활성도와 유사하게 11일에서 15일 millimeters of serum. /. Biol. Chem., (1946). 4) Choi, H. J., Kim, N. J. and Kim, D. H. : Inhibitory effects of crude drugs on alpha-glucosidase. Arch. Pharm. Res. 23(3) 261 (2000). 5) Buxman, M. M., Kocarnik, M. J. and Holbrook, K. A. : Differentiation markers in Fetal Epidermis: Transglutaminase 사이에 대조군에 비해 높은 활성 중가를 보여주었다. 3% and transpeptidase. J. Invest. Dermatol. 72, 171 (1979). Minoxidil 도포군이 시간에 따라 ALP 활성도가 다른 군에 비해 6) Domisch, T, Finer, L. and Lehto, T. : Effects of soil 증가하는 것은 혈관 확장에 의한 혈액순환의 증가로 모발 생장 temperature on biomass and carbohydrate allocation in Scots 에 필요한 영양분을 공 급 함 로 써 발모 작용이 나타나는 것과 관 련된 결과로 추측되며, 상백피, 은행잎 둥 천연물 추출 혼합 조 성물로 이루어진 Hem 도포군도 대조군보다 높은 ALP 활성을 나 타내어 천연물 추출 혼합물이 혈관 확장에 영향을 주었을 것으 로 생각된다. pine (Pinus sylvestris) seedlings at the beginning of the growing season. Tree Physiol. 21(7) 465 (2001). 7) Rimbach, G., Gohil, K., Matsugo, S., Moini, H. Saliou, C. Virgili, E, Weber, S. U. and Packer, L. : Induction of glutathione synthesis in human keratinocytes by Ginkgo biloba extract (EGb761). Biofactors 15(1), 39 (2001). 8) Carlberg, I. and Mannervik, B.: Purification and characterization 결 론 of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver. Bio. Chem. 250(14) 5475 (1975). 천연물 추출물 혼합조성물인 Hem 의 발모효능을 시험하기 위 하여 발모제인 미녹시딜과 hair re-growth 효능을 비교 관찰하였 다. 발모 주기중 퇴행기(telogen) 시기의 C3H 생쥐 등부위를 제 모하여 생장기 (anagen)를 유도한 다음 hair re-grwoth에 따른 형 태 관찰과 발모시 증가되는 丫-GT 및 ALP 활성도를 측정한 과 3% minoxidil 도포군에서 결 약 2일 정도 초기 생장기 유도가 빠르게 나타났고, Hem 도포군의 경우 mid-anagen 단계에서 급 9) Chase, H. B., Rauch, H. and Smith, V W. : Critical stages of hair development and pigmentation in mouse. Physiol. Zool (1951). 10) Deyoung, L. M. Richards, W. L., Bonzelet, W., Tsai, L. L. and Boutwell, R. K. : Localization and significance of yglutamyltranspeptidase in normal and neoplastic mouse skin. Cancer Res. 38, 3697 (1978). 11) Hamada, K. : Evaluation of the effects of hair re-growth 격한 hair re-growth 촉진이 나타났으며, 모발의 상태가 대조군 substances on elongation of anagen period and blockagen of 이나 미녹시딜 도포군보다 건강한 상태를 보여주어 천연물 추출 anagen-catagen 물도 발모제 개발의 후보 소재로서 활용 가능함을 시사하였다. transformation by hair cycle markers. Fragrance J (1997). 12) Handjiski, B. K. Eichmuller, S., Hofmann, U., Czarnetzki, B. M. and Paus, R.: Alkaline phosphatase activity and localization 문 헌 during the murine hair cycle. B y. J. Dermatol (1994). 13) Hattori, M. and Ogawa, H. : Biochemical analysis of hair growth 1) Rumsfield, J. A., West, D. R and Fiedler-Weiss, V C. : Topical minoxidil therapy for hair re-growth. Clin. Pharm. 6(5) 386 (1987). 2) Trueb, R. M.: The value of hair cosmetics and pharmaceuticals. Dermatology 202(4) 275 (2001). from the aspects of aging and enzyme activities. J. Dermatol. 10(1) 45 (1983). 14) Kawabe, T. T., Kubicek, M. E, Johnson, G. A. and Buhl, A. E. : Use of gamma-glutamyl transpeptidase activity as a marker of hair cycle and anagen induction in mouse hair follicles. J. J. Pharm. Soc. Korea

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Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,