92 Minkyu Kong and Youngchul Kim 서론사람의모발은생명에관계되는중요한기능을수행하지는않으나충격으로부터머리를보호하고완충장치로서의역할을하여자외선으로부터두피를보호하는기능을갖는다. 최근식생활의서구화, 스트레스그리고환경오염등은탈모증을계속증가시키는원인이되고있

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1 Journal of Biomedical Research 11(2) : (2010) C57BL/6 마우스모델에서검은깨오일의모발성장촉진효과 공민규, 김영철 * 계명대학교대학원공중보건학과대구광역시달서구신당동 1000 Promotion Effect of Black Sesame Oil on Hair Growth in an Alopecia Model of C57BL/6 Mice Minkyu Kong, Youngchul Kim* Department of Public Health, Graduate School, Keimyung University 1000, Shindang-dong, Dalseo-gu, Daegu, , Korea ABSTRACT: This study was carried out to investigate the effect of black sesame oil on hair growth in a shaving animal model of C57BL/6 mice. Five weeks old male mice were acclimated for one week under 22 ± 1µl room temperature, 50 ± 5% relative humidity and 12 hours of a light/dark cycle before beginning experiment. The animals were divided into 3 groups including normal group (saline, N), positive control group (3% MXD, PC), and experimental group (black sesame oil, E) and they were topically applied with an amount of 100µl once a day, 6 days a week for 3 weeks. Hair regrowth was evaluated by the gross and histological examination. Also immunohistochemical observation for SCF, the activities of enzymes including ALP and γ-gt, and the expression quantity of growth factor including IGF-1 in the skin of mice were carried out or evaluated. Topical treatment of black sesame oil and 3% minoxidil for 3 weeks to dorsal skin accelerated hair regrowth faster than N group. E and PC groups promoted development and elongation of hair follicles compared with N group. Serum ALP activity was significantly higher in E group compared with N group in 3 weeks (p<0.05). Skin ALP activity were significantly higher in PC group compared with N group in 2 weeks (p<0.05), and E and PC groups were higher than N group in 3 weeks with no significant differences. Serum γ-gt activity was significantly higher in PC group compared with N group in 2 weeks (p<0.01), and E group was significantly higher compared with N group in 3 weeks (p<0.05). Skin γ-gt activity was significantly higher in PC group compared with N group in 2 weeks (p<0.05), and PC (p<0.01) and E (p<0.001) groups were significantly higher compared with N group in 3 weeks. IGF-1 expression in the skin was significantly higher in PC and E groups compared with N group (p<0.01). SCF antigens were heavily stained in bulge, stem cell and dermal papilla and middle stained in inner root sheath, outer root sheat and epidermis in E and PC groups. These results indicate that black sesame oil effectively stimulated hair growth in an animal model via several mechanisms and that it can be used practically for hair growth or prevention of hair loss in human beings. Key words: ALP activity, Black sesame oil, C57BL/6 mice, IGF-1, γ-gt activity *Corresponding author: Youngchul Kim, Tel.: , Fax: yckim@kmu.ac.kr

2 92 Minkyu Kong and Youngchul Kim 서론사람의모발은생명에관계되는중요한기능을수행하지는않으나충격으로부터머리를보호하고완충장치로서의역할을하여자외선으로부터두피를보호하는기능을갖는다. 최근식생활의서구화, 스트레스그리고환경오염등은탈모증을계속증가시키는원인이되고있으며, 발병연령도남녀모두서서히낮아지고있는추세이다 [1]. 탈모증은정상적인피부에서비정상적으로일시적또는영구적으로털이빠지는병으로혈액순환장애와신경계통의이상으로두피와모발을손상시켜탈모가발생한다 [2]. 이러한탈모증을겪는사람들은모발상실로인한우울증및스트레스자각도가높아지며대인관계나이성관계에서도적응의어려움을겪는것으로보고되고있다 [3]. 모발은모발이성장하는성장기 (anagen), 성장을멈추고모구부가축소되면서대사과정이늦어지는퇴행기 (catagen), 모낭이수축되면서위쪽으로올라가는휴지기 (telogen) 로구분된다 [4]. 이러한모발은같은장소에서새로운모발이생성됨으로인해오래된모발이빠지고성장기로전환하게되는모발주기 (hair cycle) 를가지고일생동안성장과탈락을반복한다 [3] 모발은모발의각성장주기에대하여다양한인자들이작용함으로써양모또는탈모를유발하게된다. 지금까지밝혀진탈모기전에대한연구내용들을살펴보면, 피부에존재하는 cytokines 중 interleukin(il)-1과 tumor necrosis factor(tnf)-α는모발세포의세포사를유발함으로써탈모를일으키며 transforming growth factor(tgf)-β2 및남성호르몬 androgen은모발의 anagen기를짧게함으로써정상보다빨리 catagen기로접어들게한다. 반면, insulin-like growth factor(igf)-1, epidermal growth factor(egf), fibroblast growth factor(fgf) 등과같은성장인자는모발의성장을촉진하고모발세포의세포사를방지하는것으로알려져있다 [5]. 현재미국식품의약품안전청 (FDA) 에의해발모제로인정된제품은피나스테라이드 (finasteride) 와 2,4-diamino-6-piperidino-3-oxide의다른이름인미녹시딜 (minoxidil) 이있다. 이들외에육모, 탈모방지의효능을표방하는의약외품및화장품이시중에유통되고있는데이들의대부분은천연물추출혼합물인것으로알려져있다 [6]. 미녹시딜은미국업존사 (Pharmacia & Upjohn) 에의해고혈압치료제로개발되었다가부작용으로다모증이보고되면서발모제로개발되었고그발모효과에대한작용기전은현재까지명확하게밝혀지지않았지만혈관확장을통한영양공급증가및 potassium channel open ing 효과등이모발성장을유도하는것으로생각되고있다 [7]. 하지만 finasteride는모발성장효과를유지하기위해서평생동안지속적으로사용하여야하며남성의경우성기능장애, 임신한여성의경우기형아출산과같은부작용등의안전성에문제점이있다 [8]. Minoxidil의경우가려움증 (pruritus), 홍반 (erythema), 표피벗겨짐 (scaling), 건성화 (dryness) 를동반한피부염을일으키고몇몇사례에서는심낭압전과심근세포의괴사를가져올수도있고피부조직의말단비대증유발등이보고되고있으며또한미녹시딜자체가고혈압치료를목적으로개발되었기때문에과량사용하면혈압이떨어질수도있다 [9-10]. 흑임자라불리우는검은깨는참깨과에속하는식물로서흰깨에비해유지함유량은적으나방향성이풍부하고맛이좋아우리나라에서는예로부터한과류와죽, 조미료등의식용및약용으로이용되어온식품재료이며 cholesterol의농축을감소시켜주고혈행개선효과가뛰어난사포닌성분을함유하고있다 [11]. 또한검은깨는모발강화와호르몬관련질병을예방하는식물성에스트로겐을풍부하게제공할수있을뿐만아니라이소플라본가운데세포분열과밀접한관련이있는 tyrosine kinase를저해하는화합물로잘알려진 genistein을함유하고있으며 [12], 항산화효과가뛰어나다 [13]. 이와같은효능으로인해중금속및방사능흡착기능과과다한염분, 콜레스테롤의체외배출작용이뛰어난알긴산섬유질이풍부하며단백질, 지질, 비타민, 무기성분인 Ca, I 등의영양소를비롯해 DHT 생성을억

3 Effect of Black Sesame Oil on Hair Growth in C57BL/6 Mice 93 제하는식물성에스트로겐, flavonoid 등을고루함유하고있는해조류, 미역, 다시마 [14] 와에스트로겐과유사한작용을하는이소플라본 (isoflavone) 과콜레스테롤저하효과를가져다주는사포닌을함유하고있는검은콩 [15] 과함께검은깨는오래전부터탈모예방및모발성장에뛰어난효과가있다고전해지고있으나검은콩, 해조류등에비해육모효과에대한연구는현재까지미흡한실정이다. 이에본연구는검은깨오일을제모한 C57BL/6 마우스의배부에경피도포하여기존의 FDA 공인제품인 3% 미녹시딜과육안적및조직학적관찰을통한육모효과, 모발성장관련인자인효소활성과유전자발현등을비교 분석해봄으로써, 탈모예방및모발성장촉진제로서의실용가능성을알아보고, 아울러발모효과의기전연구및탈모치료제개발의기초자료를마련하고자한다. 재료및방법 1. 시약및기기시약은 ALP 및 γ-gt는 Thermo사 (Finland) 의제품을, Trizol은 Invitrogen 사 (USA) 의제품을 cdna synthesis 및 PCR kit와 GAPDH 및 IGF-1 의 primer는 BioNEER사 (Korea) 의제품을사용하였으며 SCF antibody는 SANTACRUZ사 (USA) 의제품을그외일반시약들은특급품을사용하였다. 실험기기는 refrigerated centrifuge (Beckman Coulter Inc., USA), auto biochemistry analyzer (Thermo, Konelab 20XT, Finland), homogenizer (IKA, T25 basic, Malaysia), PCR machine (Bio- RAD, MycyclerTM thermal cycler, USA), spectrophotometer (SHIMADZU, UV-1601, Japan), mini centrifuge (Hettich, MIKRO 200R, Germany), white/uv transilluminator (KODAK, EDAS 290, USA), Inverted microscope (Carl Zeiss, Axiovert 200, Germany) 및실험실에서사용하는일반기기를사용하였다. 2. 실험동물및처치 5주령웅성 C57BL/6 마우스를 ( 주 ) 대한바이오링크로부터분양받아사육실에서 1주일적응시킨후제모한배부쪽피부색이 pink color인휴지기체모의 6주령을난괴법에의해 3군으로나누어군당 5마리씩 3주간경피도포하여실험하였다. 동물사육실은온도 22±1, 상대습도 50±5%, 조명주기 12시간씩밤낮을유지하였고, 실험전기간동안사료와물은자유로이공급하였다. 실험동물처치는실험 2주와 3주째날에 4시간동안절식시킨후 ether 마취하에후대정맥에서혈액을채취하여원심분리기를이용해혈청을분리한후효소측정에사용하였다. 피부는적출후일부는 10% 포르말린용액에고정하여조직학적관찰에사용하였고, 나머지는바로액화질소에동결시킨후 deep freezer에냉동보관하였다가효소측정및유전자발현검사에사용하였다. 실험동물의분류는정상군 (N): Saline 경피도포군, 양성대조군 (PC): 3% minoxidil(mxd) 경피도포군, 실험군 (E): Black sesame oil(bso) 경피도포군으로하였다. 3. 시료조제및투여경북예천군에서유기농재배된검은깨를구입하여 30분간볶은후 oil 제조기에넣어처음 1분간나오는 oil은버리고나머지를취한후거름종이에 24 시간걸러낸순수한 oil을시료로사용하였다. 발모의효과를보기위해동물용전기제모기를사용하여실험시작 1일전에마우스의배부털을제거하였고시료는 1일 1회, 주 6회, 매회 100μl씩 micro pipette을이용하여 3주간경피도포하였다. 양성대조군으로 3% minoxidil을사용하였고정상군은 saline을사용하였다. 4. 육안적관찰실험시작후털이자란상태를육안적으로관찰하기위해실험기간동안 6회 (0, 7, 10, 14, 17, 21일 ) 에걸쳐에테르로가볍게마취한후디지털카메라로사진촬영하였다. 각군의모발성장효과

4 94 Minkyu Kong and Youngchul Kim 는 scoring system에의해각각의동물을육안적으로판정하여군별로평균치를산정하였으며판정기준은발모정도에따라 0-19%(-), 20-39%(±), 40-59%(+), 60-79%(++), %(+++) 로정하였다. 5. 피부조직의조직학적관찰피부조직의조직학적관찰을위해적출한피부조직을 10% 중성포르말린에고정한다음 24시간후흐르는물에수세하고 alcohol, xylene, paraffin으로탈수, 투명, 침투과정을거쳐파라핀에포매하였다. 포매된조직을 4μm의박절편을만들어 hematoxylin and eosin(h&e) 염색한후광학현미경으로모낭크기와수, 모근의길이를관찰하였다. 6. 효소활성도측정 1) Alkaline phosphatase(alp) (1) 혈청내 ALP 측정 ALP 효소활성도측정은혈액을원심분리기를이용하여 3000rpm으로 30분간원심분리하여얻은혈청을생화학분석기 (Thermo, Konelab 20XT, Finland) 를이용하여분석하였다. (2) 피부조직내 ALP 측정 ALP의효소활성도측정은 phosphate buffer solution(pbs) 를피부조직의 4배량첨가한후 homogenizer를이용마쇄하고원심분리기를이용하여 12000rpm, 4, 20분간원심분리하여얻은상층액을생화학분석기 (Thermo, Konelab 20XT, Finland) 를이용하여분석하였다. 2) γ-glutamyl transpeptidase(γ-gt) (1) 혈청내 γ-gt 측정 γ-gt의효소활성도측정은혈액을원심분리기를이용하여 3000rpm으로 30분간원심분리하여얻은혈청을생화학분석기 (Thermo, Konelab 20XT, Finland) 를이용하여분석하였다. (2) 피부조직내 γ-gt 측정 γ-gt의효소활성도측정은 PBS를피부조직의 4배량첨가한후 homogenizer를이용마쇄하고원심분리기를이용하여 12000rpm, 4, 20분간원심분리하여얻은상층액을생화학분석기 (Thermo, Konelab 20XT, Finland) 를이용하여분석하였다. 7. 피부조직의분자생물학적관찰 1) Insulin-like growth factor(igf-1) (1) RNA 추출 Deep freezer에냉동보관하였던피부조직을액화질소에담아이송한후얼음으로저온을유지시키며조직 50mg당 1ml의 Trizol(Invitrogen, USA) 을첨가하여조직을마쇄하고실온에서 5분간 incubation 시킨후 chloroform 200μl를첨가하여실온에서 3분간방치후 15000rpm, 4, 10분간원심분리하였다. 상층액을취한후 isopropyl alcohol을 500μl첨가한다음 15000rpm, 4, 15분간원심분리후상층액은제거하고 70% ethanol 1ml을첨가하여 RNA pellet을 washing하고 15000rpm, 4, 2분간원심분리하여나온상층액은제거하고남은 RNA pellet을실온에서건조후 diethylpyrocarbonate (DEPC) 로희석하여 260nm에서 OD값을측정하여 RNA를정량하였다. 280nm에서 OD값을측정하고 absorbance ratio(a260/a280) 가 1.8~2.0 사이인지확인하였다. (2) cdna 합성 BioNEER사의 cyclescript RT PreMix kit에서제공하는 protocol에따라 total RNA 양이 0.1~1 μg / μl가되도록 RNA sample을넣고 DEPC를 20μl까지채운후 30 에서 1분간, 50 에서 4분간 12 cycle 반응시키고 95 에서 5분간가열하여반응을종결시켰다. (3) PCR과전기영동 BioNEER사의 Accupower PCR PreMix kit를구입하여사용하였다. Template 2μl, forward primer 와 reverse primer(10pmole/l, BioNEER, Korea) 를각각 1.4μl, 멸균된증류수 15.2μl를섞고 PCR 반응

5 Effect of Black Sesame Oil on Hair Growth in C57BL/6 Mice 95 Table 1. Nucleotide sequence of the primers and expected size of PCR products Items Primers Expected size(bp) 3) IGF-1 1) Forward (5 3) AGAGACCCTTTGCGGGGCTGA Reverse (5 3) CTTCTGAGTCTTGGGCATGT 255 GAPDH 2) Forward (5 3) AACGGATTTGGYCGTATTGG Reverse (5 3) AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC 302 1) IGF-1 : Insulin-like growth factor-1. 2) GAPDH : Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. 3) bp : basepair. (Bio-RAD, MycyclerTM thermal cycler, USA) 을실시하였다. Primer는대조군으로 GAPDH(58, 35 cycle), 실험군으로 IGF-1(60, 35 cycle) 을사용하였으며사용된 primer들의염기서열은 Table 1과같다. Tris-acetate ethylenediaminetetra acetic acid(tae) buffer를이용하여 1.5% agarose gel에전기영동시켜 ethidium bromide에염색한후수세하고 UV를조사하여 DNA band를확인하였고 KO- DAK 1D v3.6 image analysis system을이용하여발현량을수치화하여통계처리하였다. 분간시행하였다. 반응이끝난조직들은다시 0.1M PB로여러차례수세하고 hematoxylin으로 20초간대조염색한후통상적인방법에따라탈수와투명화를거친후봉입하여광학현미경으로관찰하였다. 8. 자료분석 SPSS WIN(v12.0) 통계프로그램을이용하여정상군, 양성대조군, 실험군간의결과자료비교를위하여 t-test로분석을하였고유의수준은 0.05이하로하였다. 2) Stem cell factor(scf) 모발성장과관련된 SCF를관찰하기위하여 SCF 1차항체를 1:50으로희석한후조직절편에떨어뜨려실온에서 12시간동안반응시켰다. 1차항체의희석은 0.1M phosphate buffer(pb) 에 1% normal goat serum(vector Laboratories Inc.) 과 0.3% Triton X-100(Sigma) 이섞여있는것을사용하였다. 그후조직절편들을실온에서 15분간 2회 0.1M PB 로세척하여 2차항체인 1:200으로희석된 biotinylated anti-rabbit IgG(Vector Laboratories Inc.) 에실온에서 1시간동안반응시켰다. 다시 15분간 2회 0.1M PB로수세과정을거친후 peroxidase가표지된 ABC 용액에담가실온에서 1시간동안반응시켰다. 그후다시 0.1 M PB로 15분간 2회수세하고 30mg의 3-3 diaminobenzidine를 150ml의 0.1M PB에녹인용액에서 5분간반응시킨후과산화수소를 0.005% 되게첨가하여갈색의발색반응을약 5 결과 1. 육안적변화제모한배부의발모상태를육안적으로관찰한결과는 Table 2, Fig. 1과같다. 실험 7일에는모발성장이관찰되지않았으나실험 10일째부터양성대조군과실험군의배부쪽에털이조금씩자라는것이관찰되었다. 실험 14일째에는양성대조군에서약 35%, 실험군에서약 27% 의집락형태의모발성장을관찰할수있었고, 정상군에서는약 5% 의모발성장이관찰되었다. 21일째에는약 10% 의모발성장을보인정상군을포함한모든군에서모발이성장했지만그중양성대조군에서약 87%, 실험군에서약 90% 의뚜렷한모발성장효과가나타났다. 2. 조직학적변화

6 96 Minkyu Kong and Youngchul Kim Table 2. Average score of hair growth in an alopecia model of C57BL/6 male mice applied with test compounds topically for 3 weeks Days Groups Normal Saline Positive Control 3% Minoxidil Experimental Black sesame oil ± ± Hair growth scoring index: 0-19%(-), 20-39%(±), 40-59%(+), 60-79%(++), (+++). 배부피부조직에서모낭의크기와수, 모근의 길이를광학현미경으로관찰한결과는 Fig. 2, Fig. 3 과같다. 모낭은정상군에서크기가작고수가적 으며모근의길이가작은상태이지만양성대조군과실험군에서는모낭의크기와수 (Fig. 2), 모근의길이 (Fig. 3) 가정상군보다더크거나많은것을확인하였다. 특히실험군은양성대조군과비교해서모낭의크기와수, 모근의길이가비슷하게나타남으로써모발성장촉진효과가우수한것으로확인되었다. 3. 효소활성변동 1) Alkaline phosphatase(alp) (1) 혈청내 ALP 활성변동혈청으로측정한 ALP의분석결과는 Fig. 4와같다. 혈청내 ALP 수치는실험 2주에양성대조군과실험군모두정상군에비해각각약 11%, 12% 높았으나유의성은없었다. 실험 3주에양성대조군은정상군에비해약 10% 높게나타났으나유의성은없었고실험군은정상군에비해약 37% 높게나타났다 (p<0.05). 결과는 Fig. 5와같다. 피부조직내 ALP의수치는실험 2주에양성대조군이정상군에비해약 159% 높았으며 (p<0.05) 실험군은정상군에비해약 129% 높았으나유의성은없었다. 실험 3주에양성대조군이정상군에비해약 58% 높았으며실험군은정상군에비해약 68% 높았으나유의성은없었다. 2) γ-glutamyl transpeptidase(γ-gt) (1) 혈청내 γ-gt 활성변동혈청으로측정한 γ-gt의분석결과는 Fig. 6과같다. 혈청내 γ-gt 수치는실험 2주에양성대조군이정상군에비해약 55%(p<0.01), 실험군에비해약 47%(p<0.05) 높았으며실험군은정상군에비해약 5% 높았으나유의성은없었다. 실험 3주에양성대조군이정상군에비해약 52% 높았으나유의성은없었고, 실험군은정상군에비해약 79% 높았다 (p<0.05). (2) 피부조직내 γ-gt 활성변동피부조직을이용한 γ-gt의효소활성도측정의결과는 Fig. 7과같다. 피부조직내 γ-gt의수치는실험 2주에양성대조군이정상군에비해약 300% 높았으며 (p<0.05) 실험군은정상군에비해약 196% 높았으나개체차로인해유의성은없었다. 실험 3주에양성대조군이정상군에비해약 122% 높았으며 (p<0.01) 실험군은정상군에비해약 158% 높았다 (p<0.001). 4. 분자생물학적변화 1) Insulin-like growth factor-1(igf-1) 피부조직의 IGF-1 발현량을측정한결과는 Fig. 8과같다. IGF-1과 GAPDH의비 (%) 는정상군 ±8.25, 양성대조군 ±8.04, 실험군 ±5.61로써, 양성대조군이정상군에비해약 53% 높았으며 (p<0.01) 실험군은정상군에비해약 36% 높았다 (p<0.01). (2) 피부조직내 ALP 활성변동피부조직을이용한 ALP의효소활성도측정의 2) Stem cell factor(scf) SCF에대한면역반응은양성대조군과실험군에

7 Effect of Black Sesame Oil on Hair Growth in C57BL/6 Mice 97 서는 bulge, stem cell 및모유두에서강한면역반응을나타내었고, 내 외모근초및표피의기저층에서는중등도의면역반응을나타내었다. 정상군에서는 stem cell, bulge, 피지선부위에서미약한면역반응을나타내었다 (Fig. 9). 고찰모발의역할은태양광선에서오는유해한자외선을차단하고추위와외부의충격으로부터머리를보호하며신체에불필요한비소, 수은, 아연등의중금속을체외로배출하는일차적인역할이외에도미용적인기능으로서중요도가더욱크게부각되고 Normal Positive Control Experimental Groups Days Saline 3% Minoxidil Black sesame oil Fig. 1. Comparison in hair growth in an alopecia model of C57BL/6 mice applied with test compounds topically for 3 weeks. E and PC groups promoted hair growth faster than N group.

8 98 Minkyu Kong and Youngchul Kim 있다. 현대사회에서는 식생활 습관의 서구적 변화 심해지게 하며, 대인관계에 있어서 부정적인 의미 를 고민하는 사람의 수가 늘어나고 있는 추세이며 이라 할 수 있다. 와 산업화로 인한 스트레스 증가 등으로 인해 탈모 연령층 또한 점점 낮아지는 실정이다. 외모를 중요 시하는 흐름에서 볼 때, 탈모는 한 개인의 경쟁력에 부정적인 영향을 끼쳐 자신감을 상실하게 하고, 소 를 제공하는 등 스트레스를 제공하는 중요한 요인 사람의 모발은 생장노쇠의 과정과 자연탈락의 현상을 가지고 있어 수명이 짧게는 수개월, 길게는 2-4년에 이르는데, 모발의 생장과 탈락이 평형을 2a 3a 2b 3b 2c 3c Fig. 2. Histological observation on hair follicles in an alopecia model of C57BL/6 mice applied with test compounds topically for 3 weeks. H&E stain, a: N group, 2b: PC group, 2c: E group. E and PC groups promoted the number and size of hair follicles in comparison with N group. Fig. 3. Histological observation on hair growth in an alopecia model of C57BL/6 mice applied with test compounds topically for 3 weeks. H&E stain, a: N group, 3b: PC group, 3c: E group. E and PC groups promoted elongation of hair follicles from subcutaneous to epidermis.

9 Effect of Black Sesame Oil on Hair Growth in C57BL/6 Mice 99 Unit(IU/mg protein) N PC E * * Unit(IU/mg protein) Weeks Weeks N PC E Fig. 4. Change in serum alkaline phosphatase activity in an alopecia model of C57BL/6 male mice applied with test compounds topically for 3 weeks. Each bar represents the mean±se of 5 mice. The value with an asterisk is significantly different from the normal group by t-test (*; p<0.05). 유지함으로써전체적인두부의모발은일정한기본외형을유지하고있다. 탈모증은정상적으로모발이존재해야할부위에서이들이소실되는질환들을총칭하는것으로주로두부에발생한다. 탈모증의원인에대해서는아직명확하게밝혀져있지않으나바이러스감염, 외상, 혈관운동불안정성, 유전적소인, 남성호르몬을중심으로한내분비이상, 정신적요인, 영양결핍, 흡연및음주, 모발공해, 약물복용, 아토피및지루성피부염등이관여될것으로생각되어왔으며최근에는자가면역적인질환일가능성도제시되고있다 [16]. 현재모발의성장을촉진하는약물로널리쓰이는것은미국 Food and Drug Administration(FDA) 의승인을받은 minoxidil과 finasteride가있다. 약물치료이외에많이사용되는방법으로는모발이식술과같은수술요법과부신피질호르몬제나기타다양한약물을국소에주입하는주사요법, 국소 UV 조사, 비특이성자극제의국소도포요법등이있다. 그러나탈모에대한명확한원인및기전이밝혀지지않은만큼아직까지뚜렷한치료방법이제시되지않은실정이며상기한여러치료법들도여러가지부작용과지속적이지못한치료효과등으로인해사용이제한되고있다. Fig. 5. Change in skin alkaline phosphatase activity in an alopecia model of C57BL/6 male mice applied with test compounds topically for 3 weeks. Each bar represents the mean±se of 5 mice. 모발은모낭 (hair follicle) 내의여러세포간상호작용에의해형성되며, 특히상피계세포인기질세포 (matrix cell), 외모근초세포 (outer root sheath cell) 와간엽계인모유두세포 (dermal papilla cell) 간의상호작용이중요한것으로알려져있다. 사람의모발은대개 5~6년을주기로다시생기며모낭이활발하게활동해모발이성장하는시기인성장기 (anagen) 와성장이감퇴하는시기인퇴행기 (cata- Unit(IU/mg protein) ** N PC E # 2 3 Weeks Fig. 6. Change in serum γ-glutamyl transpeptidase activity in an alopecia model of C57BL/6 male mice applied with test compounds topically for 3 weeks. Each bar represents the mean±se of 5 mice.the value with an asterisk is significantly different from the normal group by t-test (*; p<0.05, **; p<0.01). The value with a sharp note is significantly different from the positive control group by t-test (#; p<0.05). *

10 100 Minkyu Kong and Youngchul Kim Unit(IU/mg protein) * N PC E Fig. 7. Change in skin γ-glutamyl transpeptidase activity in an alopecia model of C57BL/6 male mice applied with test compounds topically for 3 weeks. Each bar represents the mean±se of 5 mice. The value with an asterisk is significantly different from the normal group by t-test (*; p<0.05, **; p<0.01, ***; p<0.001). gen), 그리고성장이멈추는시기인휴지기 (telogen) 를반복하는이른바모주기 (hair cycle) 를가 지고성장과탈락을반복한다. 사람에있어서휴지기모낭의비율은정상인의경우매우낮은비율을가지고있지만남성탈모증환자에서는휴지기모낭이높은비율로존재한다. 따라서탈모방지나발모를위한약재의효과는휴지기모낭을성장기모낭으로전이시키는정도를평가하는방법이주로이용되고있다. 발모, 양모및탈모예방연구에이용되는실험방법으로는실험동물을이용한 in vivo 평가와모낭세포및조직배양을이용한 in vitro 평가가주로이용되고있다. In vitro 평가에서는모낭을구성하고있는핵심세포인모유두세포 (dermal papilla cell) 와외모근초세포 (outer root sheath cell) 의배양을통해모낭에서분화기전을연구하지만, 이방법은모낭조직내에서의세포간의상호작용과모낭조직과주위를둘러싼진피조직과의상호작용, 그리고혈액순환이배제되는등모발성장에직, 간접적으로영향을미칠수있는많은요소들이배제되어있어한계성을지니고있다. 따라서각종생화학적평가를통해탐색되는많은약물들의실제효과를검증하기 ** 2 3 Weeks *** IGF-1/GAPDH(%) 위해서는아직까지실험동물을이용한효능평가및임상실험이주로이용되고있고이러한목적에부합하기위해사람과달리모주기가일정하고휴지기가길어휴지기모낭을성장기로이행시키는약재의효과를관찰하기에적합한 C57BL/6, C3H 마우스와토끼를실험동물로사용하고있다. 특히본연구에서사용한 C57BL/6 마우스는유전적인특성이잘알려져있으며생후 6주령부터모발주기가휴지기 (telogen) 로들어간다. 또한자발적탈모가일어나는특징을지니고있으며 melanocyte가모낭에만한정적으로존재하고 melanin 합성이모발성장주기와잘일치하여피부색의관찰만으로모발의성장주기를판정할수있는장점을가지고있어모발연구의대표적인실험동물이라할수있다. 본실험에서사용한생후 6주령웅성 C57BL/6 마우스는배부털을제거하였을때분홍색을띄어 telogen기로접어들었음을알수있었고, 실험을진 ** ** N PC E Groups Fig. 8. Comparison in skin IGF-1 expression in an alopecia model of C57BL/6 male mice applied with test compounds topically for 3 weeks. Each bar represents the mean±se of 5 mice. The value with an asterisk is significantly different from the normal group by t-test (**; p<0.01). IGF-1 : Insulin-like growth factor-1 GAPDH : Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

11 Effect of Black Sesame Oil on Hair Growth in C57BL/6 Mice 행함에 따라 피부색이 분홍색에서 검정색으로 변해 갔다. 이는 모발 주기가 telogen기에서 anagen기로 바뀜을 뜻한다. 6주령의 휴지기 배부에 검은깨 오일 을 1일 1회, 주 6회, 매 회 100 씩 3주간 경피 도포 101 한 결과, 실험 시작 후 1주째에는 모발성장의 육안 적인 소견이 관찰되지 않았으나 실험 2주째부터 양 성대조군과 실험군의 배부 쪽에 털이 조금씩 자라 는 것이 관찰되었으며, 3주째에는 양성대조군과 실 험군 모두 약 87% 이상의 뚜렷한 모발 성장 효과를 보임을 확인하였다. 모낭은 모아라고 불리우는 표피 9a 내 기저층의 원주상 세포핵 집합이 진피층으로 침입 해 들어가 진피층에 있는 모유두 세포와의 상호 작 용에 의해 모낭이 형성되면서 피하지방층까지 성장 한다. 이에 조직학적인 관찰을 위해서 배부 피부 조 직에서 모낭의 크기와 수, 모근의 길이를 광학 현미 경으로 관찰한 결과 모낭은 정상군에서 크기가 작고 수가 적으며 모근의 길이가 작은 상태이지만 양성대 조군과 실험군에서는 모낭의 크기와 수, 모근의 길 이가 정상군보다 더 크거나 많은 것을 관찰 할 수 있 9b 었다. 특히 실험군은 양성대조군과 비교해서 모낭의 크기와 수, 모근의 길이가 비슷하게 나타남으로써 모발 성장촉진 효과가 뛰어난 것으로 확인 되었다. 본 연구에 사용된 검은깨(black sesame)는 오랜 옛날부터 재배되어온 작물로 아프리카 대륙의 초원 이 원산지이며 한국, 중국, 일본, 인도, 터키, 북아메 리카, 아프리카 등에 분포한다. 참깨의 한 종류인 검 은깨는 옛날부터 먹는 알약 또는 불로장수의 비약 으로 불리 울 만큼 그 효용가치가 큰 음식이다. 검 9c 은깨는 민간요법과 한방에서는 자양강장 및 변비치 료에 쓰고, 다른 생약과 배합하여 허약체질 및 병후 회복용으로 쓰고, 염증 등에 외용되며 연고제로서 도 널리 응용되어 왔다[17]. 또한 최근에는 검은깨 의 항산화 효과에 대한 연구가 꾸준히 진행되어 그 효과가 입증되고 있다[18]. 검은깨에는 genistein 및 isoflavone이 다량 함유되어 있는데 genistein은 5α-reductase의 저해제 역할을 하며 isoflavone은 Fig. 9. Immunolocalization of SCF antigens in an alopecia model of C57BL/6 mice applied with test compounds topically for 3 weeks. Immunohistochemical stain, a: N group, 9b: PC group, 9c: E group. Immunolocalization of SCF antigens was observed as heavy stained density in bulge, stem cell, dermal papilla and middle stained density in inner root sheath, outer root sheat and epidermis in E and PC groups. 혈중 DHT의 농도를 유의적으로 낮춘다는 것이 확 인되었다[19]. 이렇듯 검은깨 오일은 식용과 치료 제로 널리 사용되고 있고 탈모방지 및 모발성장 효 과가 기대되는 식품임에도 불구하고 모낭이나 모발 성장에 대한 실험적인 연구보고는 아직 없었다. 발모와 관련된 생화학적 효소인 γ-glutamyl transpeptidase(γ-gt)는 membrane-bounded en-

12 102 Minkyu Kong and Youngchul Kim zyme으로 glutathione 대사의세포막을통한아미노산과팹티드의흡수, 배출에관여하는효소로서 γ-glutamyl peptide로부터아미노산또는다른 peptide로 γ-glutamyl기를전달하는데촉매역할을하는효소이다 [20]. 특히 anagen기의가장좋은지표로서 γ-gt는증식과분열이활발한세포내에서많이발현되고, telogen에접어들면감소했다가 anagen기에들어가면증가하는것으로밝혀져있다. Hair follicle 세포내 γ-gt의역할은 glutamate, cystein, glycine으로구성된 glutathione tripeptide 로부터 cysteine moiety가분리되는과정에작용하여 cysteine을얻어 keratin을합성하는것으로알려져있다. Alkaline phosphatase(alp) 는발모기전에관여하는바가규명되어있지않지만 Machwate 등 [21] 은쥐에게매일 IGF-1을주입시킨결과 ALP 및 osteocalcin이증가되었다고보고함으로써, ALP 가골세포의분화와증진에관여함을시사하였다. ALP는모발생성과정중 hair matrix내혈관신생에관여하여진피유두에밀집되어있는모세혈관으로영양을공급함으로써발모작용을원활하게해주는것으로알려져있다. 본실험에서혈청및피부조직에서 γ-gt와 ALP 를측정해본결과 3주차에서 γ-gt와 ALP 활성은혈청및피부조직모두에서실험군이양성대조군보다효소활성이높은성향을보였다. 이와같은결과는모발생장기유도 C3H 생쥐에미녹시딜과생약추출혼합조성물을도포하여 ALP 및 γ-gt 효소활성치가증가하였다는선행연구 [6] 결과와 C57BL/6 마우스에복합생약제인황금궁을도포하였을때 ALP 및 γ-gt 효소활성치가증가하였다는보고 [22] 와일치하는결과로서검은깨오일은 glutathione으로부터 cysteine을얻어 keratin을합성시키고내혈관신생을확장시켜혈류량을증가시킴으로써모세혈관으로부터의영양공급을원활하게하여발모를촉진시키는것으로사료된다. 최근에는생화학적, 분자생물학적실험방법을이용하여모발성장과관련된각종 cytokine이나유전자의동정, 작용기전연구및약물탐색연구가활발히진행되고있다. 그중에서여러종류의 cyto- kine들은모발의성장주기에따라서다양한역할을수행하여양모또는탈모를유발하므로탈모의연구에널리사용되고있다. 특히모유두세포는주위의상피계세포의분열을조절하는능력이있는데, 이러한기능도분비성 cytokine 즉분비성성장인자에의해조절된다고알려져있다 [23]. 지금까지밝혀진탈모기전에관련된 cytokine을살펴보면, 피부에존재하는 cytokine 중 IL(interleukin)-1 과 TNF(tumor necrosis factor)-α는모발세포의세포사를유발함으로써탈모를일으킨다 [24]. 또한 transforming growth factor(tgf)-β2는모발의 anagen기를짧게함으로써정상보다빨리 catagen 기로접어들게하여탈모를유발한다 [25]. IGF-1은간엽계세포에서만생성되는것으로알려져왔으나근래에는연골과골조직을포함한여러조직에서생성분비되어국소적으로작용한다는보고가있으며상피계세포에그수용체가존재한다. 특히모낭의경우에는모유두세포로부터분비되는 IGF-1이배양중인상피계세포의증식을촉진할뿐만아니라, 모낭조직의길이를현저히증가시키는것이보고되었다. 또한남성호르몬이모유두세포에서 IGF-1 생성에직접적으로영향을미치는것으로알려져있어, IGF-1은모발성장을조절하는가장중요한성장인자의하나로생각되고있다 [26]. IGF는지방세포와근육세포에대한효과와구조가인슐린과유사하여명명되었으며 insulin과 47% 의 sequence homology를갖고있다고알려져있다 [27]. 이에본연구에서는모발성장에직접적으로관련이있는것으로알려진세포성장인자인 IGF-1의유전자발현변화를 RT-PCR 을이용하여평가한결과실험군과양성대조군군에서다른군에비해통계적으로유의하게높은발현을확인하였다. Nam 등 [28] 은 C57BL/6 마우스의배부에 NDM 발모제를 1일 1회씩 2주간도포한결과 IGF-1의발현량이 saline을도포한군보다높음을확인하였다 (p<0.05). 이는본연구의결과와일치하는것으로 IGF-1이모발성장을촉진하는성장인자라는것을뒷받침해준다. Stem cell factor(scf) 는 Kit-tyrosine kinase re-

13 Effect of Black Sesame Oil on Hair Growth in C57BL/6 Mice 103 ceptor를가진피부의 mast cell과 melanocyte의성숙과증식을조절하는물질로서성장기모낭에강한면역반응을나타내며, 주로진피유두나색소침착부위에강한양성반응을보이고털의성장주기에의존적으로강하게반응하는것으로알려져있다 [29]. 이에본연구에서 SCF를피부의면역조직화학적염색을통하여관찰하였으며양성대조군과실험군에서는 bulge, stem cell 및모유두부위에서강한면역반응을나타내었고, 내, 외모근초및표피의기저층에서는중등도의면역반응을나타내었다. 정상군에서는 stem cell, bulge, 피지선부위에서미약한면역반응을나타냄을관찰할수있었다. 이러한결과는나현욱 [30] 이상백피추출물을 C57BL/6 마우스의배부에하루 2회씩도포하여육모효과를관찰한논문에서 bulge와 stem cell 부위에서강한면역반응을나타낸것과일치한다. 참고문헌 1. Lee YK, Kim JK, Cho HG. The clinical study using oriental medicine extract on male pattern hair loss. J Exp Biomed Sci 200;10: Kim YS, Kim JY. A study on hair care of alopecia man and stress. Kor Soc Esthet & Cosme 2006;1: Paus R, Cotsarelis G. The biology of hair follicles. N Engl J Med 1999;34: Zhao J, Liu LQ, Wang YJ, Yang W, Geng WX, Wei J, Li LW, Chen FL. Treatment of alopecia by transplantation of hair follicle stem cells and dermal papilla cells encapsulated in alginate gels. J Med Hypo 2007;10: Krause K, Foitzik K. Biology of the hair follicle: the basics. J Semin Cutan Med Surg 2006;25: 이계호, 한선일, 박길홍, 권영이. 모발생장기유도 C3H 생쥐에있어서미녹시딜과생약추출혼합조성물의모발재성장유도효능. 약학회지 2003;47: Kurbel S, Kurbel B, Matanic DZ. Minoxidil and male-pattern alopecia: a potential role for a local regulator of sebum secretion with vasoconstrictive effects? J Med Hypo 1999;53: McClellan KJ, Markhan A. Finasteride: a review of its use in male pattern hair loss. Drugs 1999;57: Kari HN, James GM. Pseudoacromegaly induced by the long-term use of minoxidil. Am Aca Dermatol 2003;48: Hageman T, Schlutter-Bohmer B, Allam JP, Bieber T, Novak N. Positive lymphocyte transformation test in a patient with allergic contact dermatitis of the scalp after short-term use of topical minoxidil solution. Cont Derm 2005;53: 김혜자, 고영수. 흰깨, 검은깨, 들깨중의무기질및 Saponin 함량. 대한가정학회지 1986;24: Tiemann U, Schneider F, Vanselow J, Tomek W. In vitro exposure of porcine granulosa cells to the phytoestrogens genistein and daidzein: Effects on the biosynthesis of reproductive steroid hormones. J Rep Toxicol 2007;24: 박근형, 현규환, 안찬영. 검은깨의항산화활성물질. 한국식품과학회지 1992;24: Kim WJ, Lee JK, Chang YS. Development of combined method for extraction of sea tangle. J Food Sci Technol 1994;26: Lee CS, Kim HH. A study on the soybean effects for scalp hair treatment. J Beau Tricho 2005;1: Karyn S, Matthew B, Daniel LS. Common hair loss disorders. J Am Family Phys 2003;68: Han BJ. A study of use of sesame and sesame oil in traditional korean cuisine. J East Asian Soc Dietary Life 2005;15: Fereidoon S, Chandrika M, Liyana P, Dana SW. Antioxidant activity of white and black sesame seeds and their hull fractions. J Food Chem 2006;99: 김무영. 생약추출물을이용한탈모방지및발모촉진에관한연구. 석사학위논문, 경산대학교대학원

14 104 Minkyu Kong and Youngchul Kim 20. Antonio M, Tiziana D, Loris T, Serena V. Localization of gamma-glutamyl transferase activity and protein in zea may organs and tissues. J Plant Physiol 2007;164: Machwate M, Zerath E, Holy X, Pastoureau P, Marie PJ. Insulin like growth factor-1 increase trabecular bone formation and osteoblastic cell proliferation in unloaded rats. J Endocrinol 1994;134: ;121: 나현욱. 상백피추출물의발모효과에관한실험적연구. 박사학위논문, 우석대학교대학원 허진주, 리란, 유설혜, 백인정, 연정민, 남상윤, 윤영원, 황석연, 홍진태, 이범준. C57BL/6 마우스에서복합생약제인황금궁의육모효과. 약학회지 2005;49: Randall VA, Hibberts NA, Thornton MJ, Merrick AE, Hamada K, Kato S, Jenner TJ, Oliveira I, Messenger AG. Do androgens influence hair growth by altering the paracrine factors secreted by dermal papilla cells? Eur J Dermatol 2001;11: Lim TG, Park JH, Choi GS. Effects of TNF-α and minoxidil on human hair growth in vitro. Kor J Dermatol ;4: Makoto O, Yasuhiko T. In vivo promoted of mice hair follicle by the controlled release of growth factors. J Biomaterial 2002;24: Itami S, Kurata S, Takayasu S. Androgen induction of follicular epithelial cell growth is mediated via insulin-like growth factor-1 from dermal papilla cells. Biochem Biophys Res Commun 1995;212: Rinderknecht E, Humbel RE. The amino acid sequence of human insulin-like growth factor-i and It s structural homology with proinsulin. J Biol Chem 1997;253: Nam SY, Mun JH, Yun YW, Beak IJ, Yon JM, Kim YC, Ryu KC, Lee BJ. Effect of NDM hair tonic on hair growth promotion in an alopecia model of C57BL/6 Mice. Kor J Lab Animal Sci 2004;20: Eva M, Peters J, Marcus M, Vladimir BA, Karin JD, Welker P, Scott AG, Ralf P. Kit is expressed by epithelial cells in vivo. J Invest Dermatol