pissn eissn J. Milk Sci. Biotechnol. 2018;36(4): ARTICLE 초음파를이용한프로바이오틱스분말의유통기한연

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1 pissn eissn J. Milk Sci. Biotechnol. 2018;36(4): ARTICLE 홍동기 정성은 이명희 이호진 이재호 나국남 최일동 이정열 심재헌 * 한국야쿠르트중앙연구소 Shelf-Life Extension and Increase in Survivability of Probiotics Powder by Ultrasonic Treatment Received: December 20, 2018 Revised: December 24, 2018 Accepted: December 25, 2018 *Corresponding author : Jae-Hun Sim Research and Business Development Center, Korea Yakult Co., Ltd., Yongin, Korea Tel : Fax : jhsim@re.yakult.co.kr Copyright 2018 Korean Society of Milk Science and Biotechnology. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( creativecommons.org/ licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. ORCID Dong-Ki Hong Seong-Eun Jung X Myoung-Hee Lee Ho-Jin Lee Jae-Ho Lee Guk-Nam Na Il-Dong Choi Jung-Lyoul Lee Jae-Hun Sim Dong-Ki Hong, Seong-Eun Jung, Myoung-Hee Lee, Ho-Jin Lee, Jae-Ho Lee, Guk-Nam Na, Il-Dong Choi, Jung-Lyoul Lee, and Jae-Hun Sim* Research and Business Development Center, Korea Yakult Co., Ltd., Yongin, Korea Abstract The purpose of this study was to investigate the effect of ultrasonic treatment during probiotics production process on the shelf life and the survival rate. Once Lactobacillus plantarum and Bifidobacterium longum were cultured in edible culture medium, ultrasonic treatment was performed at 100 Hz for 1, 2, 5, 7, and 10 minutes. Ultrasonic-treated L. plantarum HY7715 and B. longum HY8001 were centrifuged, mixed with a cryoprotectant, and lyophilized. The prepared lactic acid bacteria powder was individually packaged. After 6 months, viable cell counts were measured separately under cold storage and room temperature. In vitro digestion experiments were performed to determine the survival rate at digestive tract. As a result, it was observed that shelf life and survival rate were increased compared to untreated control group. Keywords probiotics, shelf-life, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium longum, survivability, ultrasonic treatment 서론 프로바이오틱스 (Probiotics) 는 장내균총을개선시켜줌으로써숙주동물에게유익한영향을주는 생균제제 라고 Fuller(1989) 가정의한것을시작으로 FAO/WHO 는 2001 년에 충분한양을섭취하 였을때숙주의건강에도움이되는살아있는미생물 이라고정의하였다. 이에더하여 숙주에유익 한작용을갖는미생물제제또는미생물의성분 으로정의하여생균에서사균으로까지프로바이오틱 스의범위를확대시킨해석도있다 (Salminen 등, 1999). 프로바이오틱스를포함한인간의장내미생 물이인간의건강에중요한영향을미친다는연구결과 (Singh 등, 2013; Butel, 2014) 및기능성 자료가증가함에따라프로바이오틱스에대한소비자들의인식이더욱확대되어프로바이오틱스제 품의수요가점차증가하고있다. 현재식약처에서등재한 Lactobacillus 11 종 (L. acidophilus, L. casei, L. gasseri, L. delbruekii subsp. bulgaricus, L. helveticus, L. fermentum, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. salivarius) 과 Lactococcus 1 종 (Lc. lactis), Enterococcus 2 종 (E. faecium, E. faecalis), Streptococcus 1 종 (S. thermophilus), 그 리고 Bifidobacterium 4 종 (B. bifidum, B. breve, B. longum, B. animali subsp. lactis) 까지 220 J Milk Sci Biotechnol Vol. 36, No. 4

2 19종의균에대해프로바이오틱스로고시하였고, 많은기업체들이프로바이오틱스에연구및제품을판매하고있다. 대표적인프로바이오틱스의기능성으로는유해균억제, 유산균증식, 배변활동을원활하게도와주는기본적인기능성뿐만아니라, 다양한연구와임상결과에따르면정장작용, 과민성장증후군, 아토피, 변비, 여성질환등다양한효능을가지고있다. 하지만이러한프로바이오틱스는섭취시위산및담즙산에의해세포막이손상이되면서프로바이오틱스본래의기능성이감소할수있다. 따라서이러한문제점을극복하고자현재프로바이오틱스를생산하는업계에서는고농도의균주를투입하거나혹은추가적인공정을통해서코팅을하여제품을판매하고있지만, 프로바이오틱스원료의과투입은제품의가격이상승하여소비자에게큰부담을줄수있을뿐만아니라, 일일섭취량의이상의생균을섭취하게되면부작용이일어날수있는문제점이있다. 또한코팅기술적용은고가의설비와코팅제투입으로인하여제품가격이상승하고, 추가적인공정이추가됨에따라공정관리및제품오염에대한안정성을확보하기힘든단점도있다. 초음파는세포파괴, 기능성성분의추출효율개선, 유화, 분산, 기포제거, 원재료세척등전처리및나노화에대한연구가지속적으로진행되고있으며, 다양한식품산업분야에서안전하게적용이가능한기술이다 (Stoffer 등, 1991; Vinatoru 등, 1997; Singh 등, 2001; Freitas 등, 2005; Raviyan 등, 2005). 또한프로바이오틱스배양중저온, 고온의온도스트레스나산, 염기의 ph 스트레스와같은즉각적인배양환경의변화는특이적인유전자발현등방어기작을유발하여저장안정성에영향을주는것으로알려져있다 (Arnau 등, 1996; Guchte 등, 2002). 따라서본연구에서는프로바이오틱스분산및코팅제효율향상이가능한초음파처리를사용하여제품의유통안정성을확인하였고, 소화관생존율미치는영향을확인하고자실험을수행하였다. 재료및방법 1. 사용균주및배양조건실험에사용된 Lactobacillus plantarum HY7715 및 Bifidobacterium longum HY8001 균주는 한국야쿠르트에서분양받아 37, 18시간동안최소 3번계대배양하여사용하였다. 초음파코팅에사용할균주생산을위해 L. plantarum HY7715, 34, ph 5.0, 18시간조건그리고 B. longum HY8001 은 34, ph 6.0, 21시간배양을하였다. 2. 초음파처리및분말제조배양이완료된유산균을초음파를 100Hz 조건에서 1분, 2분, 5분, 7분및 10분간격으로일정한파장으로물리적자극을가하였다. 초음파처리가완료된 L. plantarum HY7715 및 B. longum HY8001 의균주를 8,000 rpm, 15분간원심분리후유산균만획득하여동결보호제를혼합후 70 에서 6시간동결후동결건조를하여유산균분말을제조하였다. 3. 소화관생존율측정 Minekus 등 (2014) 의방법에따라초음파코팅된균주의소화관생존율을확인하였다. 동결건조분말을최종농도가 CFU/mL 가되도록 PBS 완충용액에용해하였다. 구강단계에서는 CFU/mL PBS 완충용액에제조한프로바이오틱스시료에 SSF(Simulated Salivary Fluid) 전해질용액및인체유래알파- 아밀라제 (α-amylase) 를첨가하고 ph 7.0로조절하여 37 에서 2분간반응시켰다. 위단계에서는구강단계에서소화된시료에 SGF(Simulated Gastric Fluid) 전해질용액과돼지유 J Milk Sci Biotechnol Vol. 36, No

3 Hong et al. 래펩신을첨가하고, ph 3.0으로조절하여 37 에서 2시간동안반응시켰다. 소장단계에서는위단계에서소화된시료에돼지유래판크레아틴및담즙산을첨가하여 ph 7.0으로조절한뒤 37 에서 2시간동안반응시켰다. 마지막흡수단계에서는소장단계에서소화된시료에자연막소포 (Brush Border Membrane Vesicles) 를첨가하고 ph 7.0으로조절한뒤 37 에서 4시간동안반응시켰다. 4. 유통안정성측정프로바이오틱스완제품의유통과정에서의안정성을확인하기위하여프로바이오틱스동결건조분말 10% 에식이섬유 35%, 올리고당 10%, 향미분말 25% 및유당혼합분말 10% 를첨가하여고속회전혼합기에서완전혼합한후포장하여제조하였다. 결과및고찰 초음파의처리시간에따른유산균의생존율을확인하기위하여유산균동결건조분말 100% 를스틱포장하여온도 40, 습도 70% 의조건에서 4주동안가속시험을진행하였다 (Fig. 1과 Fig. 2). 대조군은유산균을배양후초음파처리를제외하고는동일한방법으로제조하였다. 생존율 은가속안정성시험진행후생존균수를가속안정성시험진행전생균수로나눈값의백분율을나타내었다. 대조군의 L. plantarum HY7715 의생존율은 25.3%, 대조군의 B. longum HY8001 의생존율은 20.0% 인반면, 실험군은초음파처리의시간과상관없이대조군보다높은생존율을보였다. 본연구의목적인초음파코팅의효과가확인됨을알수있다. 또한처리시간에따른생존율을확인한결과, L. plantarum HY7715 및 B. longum HY8001 은초음파코팅 5분에서가장높은생존율을보였다. 5분처리시간을기준으로추가적으로초음파코팅처리시생존율이낮아짐을확인하였다. 최적처리시간은 5분임을확인하였다. 초음파코팅처리된유산균을소화관생존율을확인조사결과, Fig. 3에나타난바와같이 L. plantarum HY7715 의소화관생존율은대조군의생존율보다 4% 높았고, B. longum HY8001 의소화관생존율은대조군의생존율보다 8% 높았다. 따라서초음파코팅 (100 Hz, 5 min) 기술은산, 담즙및고온등의가혹한환경에서도유산균의생존율을향상시킬수있음을확인하였고, 이러 Fig. 1. An experimental study on the increase of the survival rate of the freeze-dried L. plantarum HY7715 powder after ultrasonic treatment. 222 J Milk Sci Biotechnol Vol. 36, No. 4

4 Fig. 2. An experimental study on the increase of the survival rate of the freeze-dried B. longum HY8001 powder after ultrasonic treatment. Fig. 3. The survival rate of L. plantarum HY7715 and B. longum HY8001 after passing in vitro digestive tract. 한기술은다양한식품에활용될수있을것이라판단된다. 가장높은생존율을보인초음파처리조건 (5분, 100 Hz) 을적용하여유산균분말제형의완제품을제작하여유통환경에따른조건인냉장 (10 이하, 습도 40% 이하 ), 상온 (25, 습도 40 60%) 및가속 (40, 습도 70%) 생존율을 6개월동안확인한결과, 냉장보관의경우의생존율은대조군과초음파처리군의차이는없었으나, 상온보관의경우에는 L. plantarum HY7715 의생존율은대조군의생존율보다약 14 15% 높았고, B. longum HY8001 의생존율은대조군의생존율보다약 13 15% 확인되었다. 가속실험의경우에는 L. plantarum HY7715 의생존율은대조군의생존율보다약 15 16% 높았고, B. longum HY8001 의생존율은대조군의생존율보다약 15 17% 높았다 (Fig. 4). J Milk Sci Biotechnol Vol. 36, No

Hong et al. Fig. 4. The survival rate of probiotics under various storage conditions (6 month). 이러한결과를바탕으로초음파처리는프로바이오틱스생산에적용하여유산균의생존율을증가시킬수있음을알수있었다.

5 Hong et al. Fig. 4. The survival rate of probiotics under various storage conditions (6 month). 이러한결과를바탕으로초음파처리는프로바이오틱스생산에적용하여유산균의생존율을증가시킬수있음을알수있었다. 본실험에사용된초음파코팅기술은가공공정및저장기간그리고다양한유통조건에서도유산균의생존율을향상시킬수있는방법으로사용될수있을것으로판단된다. 추가적으로시제품의상온보관또는가혹조건으로보관시균주의생존율증가에유의적인영향을미칠수있어, 본연구에사용된기술은다양한프로바이오틱스에적용가능한효율적이고, 저비용의초음파코팅기술이라고판단된다. 초음파스트레스에따른유전자발현변화와유통안정성에관한추가적인연구가필요할것을판단되며, 프로바이오틱스균종별, 코팅제종류및초음파처리조건에대한조합을통하여최적공정에대한연구도추가적으로필요할것으로판단된다. 요약 프로바이오틱스의배양및동결건조과정에서프로바이오틱스가사멸하지않을정도의초음파처리를통하여프로바이오틱스의생존율및안정성이높아지고, 코팅제가골고루분산되어코팅효율이높아져프로바이오틱스의유통안정성및소화생존율이개선됨을확인하였다. References Arnau, J., Sørensen, K. I., Appel, K. F., Vogensen, F. K. and Hammer, K Analysis of heat shock gene expression in Lactococcus lactis MG1363. Microbiology. 142: Butel, M. J Probiotics, gut microbiota and health. Med. Maladies. Infect. 44:1-8. Freitas, S., Hielscher, G., Merkle, H. P. and Gander, B Continuous contact-and contamination-free ultrasonic emulsification- A useful tool for pharmaceutical development and production. Ultrason. Sonochem. 13: Fuller, R Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66: J Milk Sci Biotechnol Vol. 36, No. 4

6 Guchte, V. M., Serror, P., Chervaux, C., Smokvina, T., Ehrlich, S. D. and Maguin, E Stress responses in lactic acid bacteria. Pages In Lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications. Siezen, R. J., Kok, J., Abee, T., Schasfsma, G., ed. Springer, Dordrecht. Minekus M, Alminger, M., Alvito, P., Ballance, S., Bohn, T., Bourlieu, C., Carri`ere, F., Boutrou, R., Corredig, M., Dupont, D., Dufour, C., Egger, L., Golding, M., Karakaya, S., Kirkhus, B., Le Feunteun, S., Lesmes, U., Macierzanka, A., Mackie, A., Marze, S., McClements, D. J., Menard, O., Recio, I., Santos, C. N., Singh, R. P., Vegarud, G. E., Wickham, M. S. J., Weitschies, W. and Brodkorb, A A standardised static in vitro digestion method suitable for food - An international consensus. Food Funct. 5: Raviyan, P., Zhang, Z. and Feng, H Ultrasonication for tomato pectinmethylesterase inactivation: Effect of cavitation intensity and temperature on inactivation. J. Food Eng. 70: Salminen, S., Ouwehand, A., Benno, Y. and Lee, Y. K Probiotics: How should they be defined? Trends Food Sci. Tech. 10: Singh, H., MacRitchie, F Use of sonication to probe wheat gluten structure. Cereal Chem. 78: Singh, V. P., Sharma, J., Babu, S., Rizwanulla and Singla, A Role of probiotics in health and disease: A review, J. Pak. Med. Assoc. 63: Stoffer, J. O. and Fahim, M Ultrasonic dispersion of pigment in water based paints. J. Coating Technol. 63: Vinatoru, M., Toma, M., Radu, O., Filip, P. I., Lazurca, D. and Mason, T. J The use of ultrasound for the extraction of bioactive principles from plant materials. Ultrason. Sonochem. 4: J Milk Sci Biotechnol Vol. 36, No

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DBPIA-NURIMEDIA Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(4): 251-255 (2017) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.4.251 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 Research Paper 유산균의생존율향상을위한동결건조보호제로서호박분말의효과