결핵고위험군코호트구축 발간등록번호 학술연구용역과제 최종결과보고서 결핵고위험군코호트구축및운영 및 운 영 A cohort study of high-risk populations infected with M. tuberculosis 2

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1 결핵고위험군코호트구축 발간등록번호 학술연구용역과제 최종결과보고서 결핵고위험군코호트구축및운영 및 운 영 A cohort study of high-risk populations infected with M. tuberculosis 주관연구기관 : 대한결핵협회결핵연구원 질병관리본부 질병관리본부 - 1 -

2 주의내용 이보고서는질병관리본부에서시행한학술연구용역과제의최종결과보고서입니다 이보고서내용을발표할때에는반드시질병관리본부에서시행한학술연구용역과제의 연구결과임을밝혀야합니다 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개하여서는아니됩니 다 - 2 -

3 목 차 Ⅰ. 연구개발결과요약문 ( 한글 ) 결핵고위험군코호트구축및운영 3 ( 영문 ) A cohort study of high-risk populations infected with M. tuberculosis 4 Ⅱ. 학술연구용역과제연구결과 제 1 장최종연구개발목표 최종연구개발목표 목표달성도 13 제2장국내 외기술개발현황 14 제3장최종연구개발내용및방법 연구의내용 연구방법 27 제 4 장최종연구개발결과 코호트대상자모니터링현황 코호트대상자모집현황 대상자의일반적특성 차접촉자조사결과 추구검사결과 결핵발생환자 생체자원확보 70 제 5 장연구결과고찰및결론 73 제 6 장연구성과및활용계획 활용성과 정책활용및제안 활용계획 79 제 7 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 80 제 8 장기타중요변경사항 81 제 9 장연구비사용내역및연구분담표 연구비사용내역 연구분담표 83 제 10 장참고문헌 84 제 11 장첨부서류 연구진행지침서 동의서및설문지 실험실프로토콜

4 표, 그림목차 Table 1. Estimated sample size calculation for the TB cohort study in S. Korea 11 Table 2. Trend of annual tuberculosis mortality rate 15 Table 3. Risk factors of active tuberculosis among tuberculin positive reactors 17 Table 4. Criteria for the positive tuberculin reaction by the risk factors 19 Table 5. Target study population by setting for the 5nd year 33 Table 6. Age of recruited study population by setting(the year 1-5) 35 Table 7. Follow-up rate for recruited subjects by setting 36 Table 8. General characteristics of study population (All) 38 Table 9. Result of Chest X-ray 39 Table 10. Result of initial TST 41 Table 11. Result of Quantiferon gold-in tube (IGRA) 43 Table 12. Result of initial test TST and IGRA by group 43 Table 13. Agreement between TST and IGRA test 45 Table 14. Correlation between TST and IGRA in serial examination 45 Table 15. Effect of BCG vaccination on agreement between TST (cut-off point=10) and IGRA 47 Table 16. Effect of BCG vaccination on agreement between TST (cut-off point=15) and IGRA 48 Table 17. Multivariate analysis for risk factors associated with positive TST results( 10mm) 49 Table 18. Multivariate analysis for risk factors associated with positive TST results( 15mm) 50 Table 19. Multivariate analysis for risk factors associated with positive IGRA results 50 Table 20. IGRA response among TST positive convertors 52 Table 21. Serial variation of TST according to the follow up examinations 53 Table 22. Mean tuberculin size of positive and negative reactors in each examinations 54 Table 23. Serial variation of tuberculin negative reactors in the first follow up examination 54 Table 24. Serial variation of IGRA results according to the follow up examinations 56 Table 25. Onset of TB cases according to the period of preventive chemotherapy among IGRA positives in initial or 1 st follow up examination 58 Table 26. Characteristics of contacts who had developed tuberculosis 60 Table 27. Relationship between BCG vaccination and development of tuberculosis cases 61 Table 28. Tuberculosis incidence among close contacts according to each school 61 Table 29. Positive predictive value for TB development according to the initial testing 63 Table 30. Crude incidence rate by major variables 63 Table 31. Distribution of subjects according to initial and first follow up examinations 64 Table 32. Crude relative risk for tuberculosis 66 Table 33. Relative risk for TB adjusting major variables I 67 Table 34. Relative risk for TB adjusting major variables II 67 Table 35. Test results for tuberculosis patient in the study 68 Table 36. Risk factors of tuberculosis in the study subjects 69 Table 37. Status in the strain acquisition of index cases (as of 26 October 2012) 71 Table 38. Status in the strain acquisition of incident cases among subjects (as of 26 October 2012) 71 Table 39. Status in the acquisition of bio-specimens by type 71 Figure 1. Annual notification rate 15 Figure 2. Meta-analysis data for comparison between TST, IGRA and ELISPOT among TB patients 24 Figure 3. Flow chart of the study method by setting 30 Figure 4. Study population profile ( ) 34 Figure 5. Histogram of TST induration (mm) 40 Figure 6. Distribution of tuberculin reactors expect 0 mm responders. 40 Figure 7. Distribution of TST responses among IGRA positive reactors in the initial examination 42 Figure 8. Histogram of positive proportions of test results 43 Figure 9. Proportion(%)of tuberculin reactors according to the BCG scar 47 Figure 10. Profile of incident TB cases according to the initial and 1 st follow up examinations 59 Figure 11. Variation of TST size among incident cases who have negative tuberculin responses in initial contact examination 65 Figure 12. Comparison of RFLP pattern index

5 최종결과보고서요약문 과제명 색인어 결핵, 코호트, 잠복감염, TST, IGRA 주관연구기관대한결핵협회결핵연구원주관연구책임자김희진 연구기간

6 Title of Project Key Words M. tuberculosis, latent tuberculosis infection (LTBI), Cohort, IGRA, TST Institute Korean Institute of Tuberculosis Project Leader Hee Jin Kim Project Period

7 학술연구용역과제연구결과 - 5 -

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13 α α 질병관리본부국립보건연구원이사업총괄을담당한다. 결핵및호흡기세균과에서사업수행지침, 행정적지원, 사업에대한모니터링, 확보된생체자원보관을하였다. 사업진행중월보고서및수시로용역수행기관과의회의를통해사업을조정하였다. 연구용역수행기관인결핵연구원에서사업참여병원선정및참여유도, 학교내결핵발생확인및학교측과의협의를통한밀접접촉자에대한연구참여설득을하였다. 또한연구간호사를동원하여일차접촉자조사시설문조사, 혈액검사를위한채혈, 투베르쿨린피부검사를하였다. 추구검사 3회시필요한검사도담당하였으며추구검사에서결핵이의심되는경우에는확진을위해대상자가흉부단층촬영을받을수있도록지원하였다. 흉부엑스선검사는대한결핵협회검진반을이용하였다. 협력기관에서는대상자등록및참여유도를담당하였다

14 구분 질병관리본부국립보건연구원 용역수행기관 협력기관 ( 참여병원, 학교, 보건소등 ) 담당업무및기능 사업총괄기획운영 : 결핵호흡기세균과 - 사업수행지침제공및지원 - 용역수행기관과주기적협의를통한사업진도관리 - 사업심사및평가 - 환자시료보관및정보관리 - 생체시료보관 행정지원 : 에이즈결핵관리과 연구용역사업수행 - 코호트전반의운영및관리 - 코호트주관기관및협력기관 ( 참여병원, 보건소등 ) 의네트워크구축 - 협력기관사업수행상황관리 - 검사내용 : 투베르쿨린검사, 엑스선검진, Quantiferon assay, 결핵균항원에대한 whole blood assay 등 - 생체시료기탁 - 코호트대상자의추구조사관리 - 코호트운영을위한 database 구축 - 자료분석및입력 - 보고서및결과물제출 코호트대상자모집및검체채취 - 도말양성환자의최근접촉자대상코호트참여자모집 - 엑스선검진, 투베르쿨린피부반응검사, 채혈등실시 - 주관기관에시료이송및정보보고

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21 Reaction 5mm of induration Reaction 10mm of induration Reaction 15mm of induration HIV positive persons Recent immigrants (i.e., within the last 5 yr) from high prevalence Persons with no risk factor for TB countries Recent contacts of tuberculosis case patients Injection drug users Fibrotic changes on chest radiograph consistent with prior TB Patients with organ transplants and other immunosuppressed patients (receiving the equivalent of 15mg/d of prednisone for 1 mo or more Resisdents and employees of the following high-risk congregate settings: prisons and jails, nursing homes and other long-term facilities for the elderly, hospitals and other health care facilities, residential facilities for patients with AIDS, and homeless shelters Mycobacteriology laboratory personnel Persons with the following clinical conditions that place them at high risk: silicosis, diabetes mellitus, chronic renal failure, some hematologic disorders (e.g., leukemias and lymphomas), other specific malignancies (e.g., carcinoma of the head or neck and lung), weight loss of 10% of ideal body weight, gastrectomy, and jejunoileal bypass Children younger than 4 yr of age or infants, children, and adolescents exposed to adults at high-risk

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34 μ μ μ μ μ μ μ

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36 1. All 2. School outbreak setting 3. Household setting

37 15.1± ± ± ±17.1로

38 * 추구검사대상자 : 예방화학치료자, TB 발생자, 제외대상자를제외한검사대상자 예방화학치료자 : 이전시점이후, 당해시점도래이전예방화학치료를받은자 제외대상자 : 거부등의이유로제외된대상자 미검자 : 추구실패, 연락두절등의이유로해당시기추구불가 FW(follow up) rate = 조사시점의추구검사실시자 / 조사시점의추구검사대상자

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47 Agreement between tuberculin skin test and IGRA test

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62 Case Age when treatment Start Sex Date of enrollment TB Txt Start Date Recruitment to TB development (Mo) Smear* Culture* Occupation at enrollment BCG scar CT 결과 1 33 M Neg Neg unemployed Neg - 결핵 TPQP TPQPCXR Family 2 19 F Neg Neg student Neg 결핵결핵의심 TPQPCXR Family 3 18 F Neg Neg student Pos - 결핵 TPQPCXR Family 4 16 F ND ND student Pos - 결핵 TPQPCXR Family 5 19 M Neg Pos student Pos 결핵결핵 TPQP TPQP School 6 17 M Pos Pos student Neg - 결핵 TPQP TPQP School 7 18 M Neg Pos student Neg 결핵결핵의심 School 8 18 M Neg Neg student Pos 결핵결핵 TPQP TPQP School 9 19 M Pos Pos student Pos - - TPQP TPQP School M Pos Pos student Neg - 결핵 School M Neg Neg student Pos 결핵의심결핵의심 TPQPCXR School M ND ND student Pos School M Neg Neg student Pos - 결핵 After PR test School M Neg Pos student Pos 결핵결핵 AN TPQPCXR School M Neg Neg student Pos 결핵결핵요관찰 TPQP School M Neg Neg student Pos 결핵결핵 AN TPQN School M Neg Neg student Pos 결핵결핵 School M Neg Pos student Neg 결핵결핵 School M Neg Neg student Pos 결핵결핵요관찰 TPQPCXR School M Neg Neg student Pos - 결핵 TPQPCXR School M Neg Neg student Neg 결핵결핵의심 TPQPCXR School F Neg Neg student Pos 결핵의심결핵의심 TPQPCXR School M Neg Neg student Pos - 결핵 TPQPCXR School M Neg Neg student Pos 결핵결핵 School M Neg Neg student Pos 결핵결핵 TPQPCXR School M Neg Pos student Neg 결핵결핵 TPQP TPQP School M Neg ND student Neg 결핵경증결핵 After PR test School X-ray 결과 1st Test Result 2nd Test Result 3rd Test Resultǁ Prop BMI at enrollment Duration of Index's cough (days) Number of Index's cough per 1day index (Smear) Setting

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70 치료제 예방화학지표환자와 복용기간 치료유무의관계 ( 개월 ) 치료거부가족 비대상가족 비대상가족 치료거부가족 치료거부동급생 치료거부동급생 치료거부동급생 치료거부동급생 치료거부동급생 치료거부동급생 치료중단 3 동급생 치료완료 6 이동수업 비대상이동수업 비대상이동수업 치료완료 6 이동수업 비대상 이동수업 비대상 겨울방학보 충수업 비대상 겨울방학보 충수업 치료중단 1 겨울방학보 충수업 치료중단 1 겨울방학보 충수업 비대상 겨울방학보 충수업 치료중단 겨울방학보 충수업 치료거부 겨울방학보 충수업 비대상 동급생 비대상동급생 비대상동급생 비대상이동수업

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78 6.1 활용성과 과제명 과제책임자성명 / 소속 / 전공 번호논문제목저자명저널명집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 2 국내 / 국외 SCI여부 번호 발표제목 발표형태 발표자 학회명 연월일 발표지국내 국제 / Japan-China 1 -Korea TB Preliminary data 2009년 Research analysis for TB contact Presentation Hyejon Lee 11월 Institutes study in S. Korea 05-06일 Academic - 국제 Forum Effect of BCG scar International on tuberculosis infection in close Oral or Poster 2 Hee Jin Kim contacts of smear presentation positive tuberculosis patients U n i o n A g a i n s t 2011년 10월국제 Tuberculosis and Lung Disease 번호출원 / 등록 1 2 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류

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80 타연구및차기연구에활용된예를구체적으로기술함. 언론홍보및대국민교육내용, 일자등을간략히기술함. 임상시험, 관련 DB 구축, 워크샾또는심포지움개최등의경우구체적으로기술함

81 6.3 활용계획

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84 구 분 비 목 금액구성비비고

85 구분소속직위성명분담내용참여율 책임연구원 결핵연구원 연구원장 김희진 연구원 결핵연구원 책임연구원 이은표 연구원 결핵연구원 교육훈련과장 오수연 연구원 결핵연구원 교육훈련계장 이진범 연구설계, 기획및관리, 결과보고 연구설계, 기획및관리, 자료분석 집단발생코호트모집, 투베르쿨린검사, 추구조사연락총괄 투베르쿨린검사, 샘플채취추구조사연락및관리 20% 50% 50% 50% 연구원 연구원 대한결핵협회 결핵연구원 중앙지회 본부장 진단검사의학 부장 연구원결핵연구원진단검사의학과박영길 / 유희경 김영란엑스선검진지원 10% 김창기세균검사총괄 10% 분자생물검사총괄 ( 결핵균보관 및 DNA 지문검사 ) 연구원결핵연구원결핵관리의사박선옥엑스선판독 10% 10% 연구원경기도청결핵관리의사윤영자보건소행정지원 10% 연구원 연세대학교의과대학미생물학교실 교수한미영연구설계, 실험실검사지원 10% 연구원결핵연구원연구원김준현연구관련행정업무처리 20% 연구원결핵연구원연구원이윤용연구관련행정업무처리 20% 연구원 결핵연구원 역학조사연구원 연구보조원결핵연구원간호사서연숙 연구보조원결핵연구원간호사이지현 연구보조원결핵연구원임상병리사서재호 이경호자료관리및분석 20% 연구자료관리, 수행, 코호트대상자관리, 투베르쿨린검사, 샘플채취및운송, 추구조사연락 수행, 자료입력, 대상자관리, 투베르쿨린검사, 샘플채취및운송 IGRA 검사외시료보관및 자원관리 100% 100% 100%

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91 부록 1: 연구진행지침서 [ 날짜선택 ]

92 부록 1: 연구진행지침서 [ 날짜선택 ] n n n n n n n

93 부록 1: 연구진행지침서 [ 날짜선택 ] n n n n 1차조사후대상자와협의를거쳐 6개월-1년후에 2차조사를실시한다 n 보건소, 대한결핵협회복십자의원, 참여의료기관에서추구조사를받을수있도록한다

94 부록 1: 연구진행지침서 [ 날짜선택 ] n 2차조사시항목은설문조사, 투베르쿨린검사 ( 협의에따라미실시 ), 인터페론감마검사, 흉부엑스선검사를포함한다. n 결핵원구원은정기적으로접촉자의건강상태를전화 / 메일등으로관리한다. n 2차검사이후에는 2년마다 ( 최장 10년 ) 정기적인검사를실시하며매년결핵정보감시체계, 심평원자료를이용하여결핵발병유무를확인한다

95 부록 1: 연구진행지침서 [ 날짜선택 ] 1. 대상자선정 2. 참여자동의와설문지작성 3. 검사실시

96 지표환자국가결핵사업참여안내문 ( 결핵고위험군코호트구축및운영 : 질병관리본부, 결핵연구원 ) 사업의배경과목적 결핵은결핵균의감염에의하여주로폐에서발생하는질병으로조기에발견하여규칙적으로치료하면대부분완치될수있습니다. 우리나라에서는 1 년에 30,000 명이상의환자가발생하고 3,000 명가량의사람이결핵으로사망하고있습니다 대의젊은층에서결핵환자가많이발생하고있으며최근일부고등학교에서집단으로결핵이발병하는경우가많아지고있습니다. 결핵환자가기침을할때결핵균이공기중으로퍼지게되고공기중의결핵균을주변의다른사람들이마시게되면결핵균이폐로들어가감염을일으키게됩니다. 그러므로결핵에걸릴가능성이있는사람들은아직치료를받지않아전염성이있는결핵환자와함께지냈던주변사람들이나가족입니다. 보건복지부질병관리본부와결핵연구원은결핵환자가발생했을때주변에서결핵균에감염된사람들을대상으로주기적인검사를통해결핵의발생을진단할뿐아니라감염된사람들중에서결핵이발생하는사람들의특징을찾는연구를진행하고있습니다. 이러한연구의결과는결핵이발생할가능성이높은사람들만을골라서치료하여결핵의발생을막는것과동시에우리사회전체로결핵이퍼져나가는것을방지하기위한국가결핵관리사업에매우중요한자료로활용됩니다. 이와같은사업을통하여앞으로결핵으로고생하는환자의수를줄이고모든사람들이결핵에대한걱정이없이살수있는보다건강한우리사회를만들고자합니다. 이에보건복지부질병관리본부및대한결핵협회결핵연구원이주관하는연구사업 ( 결핵고위험군코호트구축및운영 ) 에참여해주실것을부탁합니다. 이사업에참여하심으로써최신결핵진단기술을이용하여일정기간동안지속적인관리를받게되고자신의건강을지킬수있을뿐만아니라우리나라에서결핵을퇴치하기위한국가사업에도기여하게됩니다

97 참여하시는내용 연구진행에필요한연락처를포함한최소한의개인정보를수집하기위하여설문조사를실시하고의료기록지를열람합니다. 또한객담검사에서분리된결핵균을이용하여약제감수성검사와유전학적분석을실시하므로참여자의신체에미치는영향은없습니다. 개인정보는연구목적이외의용도로는사용하지않습니다. 참여하시는분에게는메일 / 문자 / 전화를통하여결핵관련유용정보와안내사항을알려드리겠습니다. 선생님 ( 또는선생님의자녀 ) 의건강을지키는것과함께, 우리나라에서보다빨리결핵을퇴치하여모든사회구성원들이모두건강하게살수있도록이사업에참여를허락해주시기를다시한번간곡한부탁의말씀을드립니다. 결핵에관하여궁금한것이나이안내문의내용을보다자세히알고싶으시면아래홈페이지를참고하거나담당자에게연락해주시기바랍니다. 보건복지부질병관리본부결핵바로알기 : 대한결핵협회 : 담당자 : 대한결핵협회결핵연구원이혜존 ( ), 오수연 ( ) 책임연구원 : 대한결핵협회결핵연구원김희진 ( )

98 설문지 ( 지표환자 ) 코호트관리번호 (study ID number) : / 학교 / 학년 / 반 / 번호 ( 학교코호트의경우 ): 학교 / 학년 / 반 / 번 Page 1 of 2 인적사항 1. 코호트고유 ID/ 병원등록번호 / 2. 진료기관명 ( 병원 / 보건소 ) 3. 조사일자년월일 4. 이름 5. 보호자이름 6. 성별 1) 여 2) 남 7. 주민등록번호 ( 생년월일포함 ) 8. 집주소 9. 전화번호 ( 집전화 / 휴대폰 ) 1) 집전화 : ( ) 2) 휴대폰 : 10. 부모님연락처 11. 이메일주소 < 설문지앞 뒷면모두작성해주시길바랍니다.>

99 설문지 ( 지표환자 ) 코호트관리번호 (study ID number) : / 학교 / 학년 / 반 / 번호 ( 학교코호트의경우 ): 학교 / 학년 / 반 / 번 Page 2 of 신체지표 1) 몸무게 kg 2) 키 cm 13. 과거치료력 1) 유 2) 무 3) 모름 1개월이상항결핵제복용한경우 13 a) 과거력이있는경우치료횟수 : 번 (1개월이상치료력을포함 ) 13 b) 마지막진단년도 ( ) 년 14. 진단경로 * 1) 자가증상으로 2) 신체검사에서 1) 기침 2) 가래 3) 열 4) 체중감소 15. 증상 5) 피로 6) 흉통 7) 호흡곤란 8) 객혈 9) 무증상 10) 기타 : 기침있을시기재 15 a) 기침지속기간 ( ) 일, 발생부터치료시작일 15 b) 1일기침횟수 1) 1 9 2) ) ) ) ) 50이상 16. 객담도말검사결과 grade가높은검체기준 1) 2) + 3) ++ 4) +++ 5) 미검 17. 배양검사결과 grade가높은검체기준 1) 2) + 3) ++ 4) +++ 이상 5) 검사중 6) 오염 7) 미검 18. 감수성검사결과 1) 실시 2) 미실시 18 a ) 실시한경우 1) 전체감수성 2) 내성 ( 내성약제명 : ) 19. 치료시작일자 항경핵제복용을시작한날자 년 월 일 20. 신고일자 년 월 일 l 대상여부 대상 비대상 보류 l l 비대상사유 검체확보여부 확보, 미확보, 진행중, ( 미확보사유 : ) * 자가증상 : 유증상으로의료기관에내원하여진단된경우, * 신체검사 : 우연히신체검사에서발견되거나다른질환으로검사중발견된경우 * 객담배양양성시결핵연구원에보내서감수성검사와 RFLP 를향후실시한다

100 는환자의수를줄이고모든사람들이결핵에대한걱정이없이살수있는보다건강한우 리사회를만들고자합니다. 이에부모님의자녀가보건복지부질병관리본부및대한결핵협회결핵연구원이주관하는연구사업 ( 결핵고위험군코호트구축및운영 ) 에참여해주실것을부탁합니다. 이사업에참여하는학생은최신결핵진단기술을이용하여일정기간동안지속적인관리를받음으로써자신의건강을지킬수있을뿐만아니라우리나라에서결핵을퇴치하기위한국가사업에도기여하게됩니다. 참여하시는내용 연구진행에필요한연락처를포함한최소한의개인정보를수집하기위하여설문조사를실 시합니다. 개인정보는연구목적이외의용도로는사용하지않습니다. 투베르쿨린반응검사 ( 결핵감염검사 ) 와가슴엑스선사진을촬영하고 10 ml의혈액을채취합니다. 채혈과투베르쿨린반응검사를실시할때주사바늘에의하여약간의통증과상처가날수있으나일반적으로사용되는매우안전한방법입니다. 채취된혈액을대상으로몇가지혈액의성분들을분석하며인터페론감마검사 ( 결핵감염정밀검사 ) 를실시합니다. 혈액의일부는연구사업이끝날때까지보관되며필요할경우나중에다시분석됩니다. 모든검사는무료입니다. 1차검사후학교일정에따라 3 6개월후에 2차검사를실시하고 1 2년후에 3차검사를실시합니다. 2, 3차검사는질병이발생할수있는위험성이높은시기에집중적인검사가반복적으로이루어질수있게하기위한것입니다. 그후에는 2년마다 ( 최장 10년 ) 정기적인검사를실시하며, 매년국가결핵정보망을이용하여결핵으로진단되어치료를하고있는지확인됩니다. 모든검사결과는개별적으로알려드리고, 연구를위하여이름이알려지지않은상태로분석 됩니다. 참여자의개인정보와결과는엄격하게관리되며비밀이유지됩니다. 참여하시는분께는메일 / 휴대폰문자메세지 / 전화를통하여결핵관련유용정보와안내사항

101 을알려드리겠습니다. 자녀의건강을지키는것과함께, 우리나라에서보다빨리결핵을퇴치하여모든사회구성원 들이모두건강하게살수있도록이사업에선생님자녀의참여를허락해주시기를다시 한번간곡한부탁의말씀을드립니다. 결핵에관하여궁금한것이나이안내문의내용을보다자세히알고싶으시면아래홈페이지 를참고하거나담당자에게연락해주시기바랍니다. 보건복지부질병관리본부결핵바로알기 : 대한결핵협회 : 담당자 : 대한결핵협회결핵연구원이혜존 ( ), 오수연 ( ) 책임연구원 : 대한결핵협회결핵연구원김희진 ( ) * 결핵감염검사 ( 투베르쿨린검사 ): 결핵감염여부를판정해주는검사입니다. 그러나우리나라에서는 BCG 예방접종으로이검사가정확하지않습니다. * 결핵감염정밀검사 ( 인터페론감마검사 ): BCG 예방접종과무관하게결핵감염여부를정확히알려주는검사입니다. 현재의료보험적용이되지않아 8만원정도비용이부담됩니다만연구참여시에는무료입니다. * 예방화학치료 : 1가지또는 2가지약물을 3 9개월복용하여감염자가활동성결핵환자로발병하는것을 80 90% 정도예방할수있습니다

102 [ 별지제 20 호서식 ] 유전자검사ㆍ연구동의서 동의서관리번호 검사ㆍ연구대상자성명주소전화번호생년월일남 / 녀 법정대리인성명전화번호 유전자검사ㆍ연구기관기관명 유전자검사 연구의목적 전화번호 위의검사 연구목적으로기사용한검사대상물의처리 검사 연구후즉시폐기 검사 연구종료후보존 년 년 유전자은행ㆍ유전자연구기관에제공된검사ㆍ연구대상물은해당목적에따라보존됩니다. 3. 위의검사 연구목적으로사용후남은검사대상물을유전자은행 유전자연구기관등에제공하여질병의예방 치료법의개발등에활용하는것에대한동의여부 동의함 동의하지않음 3-1 동의시귀하의개인정보또는임상ㆍ역학정보포함여부 : 개인정보및임상 역학정보포함 임상 역학정보만포함 모두동의하지않음 개인정보란성명등특정개인을식별할수있는정보를말합니다. 다음각항목에대해서는상담자로부터충분한설명을듣도록하십시오 보존기간이경과한검사대상물은 폐기물관리법 제 조에따른기준과방법에따라폐기되며 유전자검사기관의폐업 그밖의부득이한사정으로검사대상물을보존할수없는경우에는법에서정한절차에따라검사대상물을이관합니다 귀하가위사항에대하여동의를하였더라도연구가시작되기이전에는언제든지동의를철회할수있고 유전자검사의결과 연구결과는제외 는 년간보존되며 유전자검사결과 유전자검사 연구동의서 유전자연구기관 유전자은행으로의검사대상물제공기록은본인또는법정대리인이요구하는경우언제든지열람할수있습니다 본기관은귀하의개인정보보호를위하여필요한조치를취하여야하며 모든연구는기관생명윤리심의위원회의심의와승인을얻은후진행될것입니다 귀하의검사대상물을이용한연구결과에따른새로운약품이나진단도구등상품개발및특허출원등에대해서는귀하의권리를주장할수없으며 검사대상물과공여한정보를이용한연구는학회와학술지에연구자의이름으로발표되고귀하의신상은드러나지않습니다 본인은유전자검사 연구에대하여충분한설명을들었으며 위의사항에대한동의는자발적의사에의한것임을밝히는바입니다 서명 년월일검사ㆍ연구대상자 법정대리인 상담자 구비서류 법정대리인의경우법정대리인임을증명하는서류

103 설문지 ( 코호트대상자 ) 코호트관리번호 (study ID number) : / 학교 / 학년 / 반 / 번호 ( 학교코호트의경우 ): 학교 / 학년 / 반 / 번 Page 2 of 2 인터뷰 13. 신체지표 1) 몸무게 kg 2) 키 cm 14. 지표환자와의관계 1) 가족 2) 친구 3) 기타 ( ) 4) 모름 15. 지표환자외가족결핵력 1) 없음 2) 있음 15 a) 있는경우 1) 관계 ( ) 2) 진단시기 ; 년 16. 병력 1) 없음 2) 있음 16 a) 있는경우 1) 질환 ( ) 2) 진단시기 ; 년 16 b) 있는경우 1) 질환 ( ) 2) 진단시기 ; 년 17. BCG 접종력 1) 접종했음 2) 접종안했음 3) 모름 구두질문상응답기준 1) 동급생 2) 이동수업 3) 동아리 4) 가족 18. 지표환자와의접촉분류 5) 기타 ( ) 18 a) 가족인경우 1) 동거 2) 비동거 19. 지표환자와의접촉시간 (/ 주 ) 평균접촉시간 : ( ) 시간 / 주 20. BCG 반흔유뮤 1) 있음 2) 없음 3) 미검 연구자가직접검사 1) 반흔부위 2) 접종방법 : 피내 경피 20 a) 있는경우 3) 반흔개수 ( ) 21. 접촉한기간 1) 첫접촉일 ( ) 2) 마지막접촉일 ( ) * PPD 1) Batch No.: 2) Lot No.: 3)Available: l 대상여부대상 비대상 보류 l 비대상사유 기타특이사항 : < 색칠한부분은작성하지마세요!!^^.>

104 검사기록 ( 등록 2-4 회차 ) 코호트관리번호 (study ID number) : / 학교 / 학년 / 반 / 번호 ( 학교코호트의경우 ): 학교 / 학년 / 반 / 번 인적사항 Page 1 of 2 1. 코호트고유 ID/ 병원등록번호 / 2. 진료기관명 ( 병원 / 보건소 ) 3. 조사일자년월일 4. 이름 5. 주민등록번호 ( 생년월일포함 ) - 6. 집주소 8. 직업 1) 군인 2) 가정주부 3) 학생 4) 무직 5) 기타직업 8 a) 기타직업 인경우 7. 전화번호 ( 집전화 / 본인핸드폰 ) 1의회의원, 고위임직원및관리자 2전문가 3기술공및준전문가 4사무종사자 5서비스종사자 6판매종사자 7농업및어업숙련종사자 8기능원및기능관련종사자 9장치, 기계조작및조립종사자 10단순노무종사자 11기타 ( ) 1) 집전화 : ( ) 2) 휴대폰 : 8. 부모님전화번호 ( 핸드폰 ) 9. < 설문지앞 뒷면모두작성해주시길바랍니다.>

105 검사기록 ( 등록 2-4 회차 ) 코호트관리번호 (study ID number) : / 학교 / 학년 / 반 / 번호 ( 학교코호트의경우 ): 학교 / 학년 / 반 / 번 인터뷰 Page 2 of 신체지표 1) 몸무게 kg 2) 키 cm 11. 흡연 1) 흡연중 2) 비흡연 3) 금연상태 12. 음주 1) 음주 2) 비음주 12 a) 음주시한달음주량 : 소주 ( ) 병 13. 증상 1) 기침 2) 가래 3) 열 4) 체중감소 5) 피로 6) 흉통 7) 호흡곤란 8) 객혈 9) 무증상 10) 기타 ( ) 14. 최근결핵진단 1) 예 2) 아니오 3) 기타 ( ) 14 a) 결핵인경우 진단일자 ; 20 년 월 일, 진단의료기관 ; * PPD 1) Batch No.: 2) Lot No.: 3)Available: l 대상여부 대상 비대상 보류 l 비대상사유 기타특이사항 : < 색칠한부분은작성하지마세요!!^^.>

106 설문지 ( 예방화학치료대상자 ) 코호트관리번호 (study ID number) : / 학교 / 반 / 번호 ( 학교코호트의경우 ): 인적사항 Page 1 of 2 1. 코호트고유 ID/ 병원등록번호 / 2. 진료기관명 ( 병원 / 보건소 ) 3. 조사일자년월일 4. 이름 5. 주민등록번호 ( 생년월일포함 ) 6. 집주소 1 차등록후변경시 7. 전화번호 ( 집전화 / 핸드폰 ) 1차등록후변경시 8. 이메일주소 1차등록후변경시

107 설문지 ( 예방화학치료대상자 ) 코호트관리번호 (study ID number) : 학교 / 반 / 번호 ( 학교코호트의경우 ): / Page 2 of 2 예방화학치료 9. 예방화학치료약제명 1) isoniazid 2) rifampicin 3) isoniazid+rifampicin 4) other 10. 용량 ( ) mg 11. 치료시작일 200 년월일 12. 치료종료일 200 년월일 13. 치료기간 ( ) 개월 Ÿ 기타특이사항 :

108 설문지 ( 발생환자 ) 인적사항 설문정보

109 설문지 ( 발생환자 ) 기록자료

110 설문지 ( 발생환자 ) 영상촬영 추가정보

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113 부록 3: 실험실프로토콜 결핵고위험군코호트연구실험실프로토콜

114 부록 3: 실험실프로토콜 목 차 Ⅰ. Blood 채취및처리법 1. Blood 채취방법및도구 2. 학교 sample 처리방법 3. 보건소및병원 sample 처리방법 Ⅱ. Sample 보관방법 1. Heparin tube (1) Quantiferon TB gold (Intube) sample (2) 7 day Whole blood sample (3) Plasma 2. Plain tube (1) Blood clot (2) Serum Ⅲ. Whole blood assay 및 ELISA 방법 1. Quantiferon TB gold (Intube) assay protocol - IGRA ELISA set manual 2. In-house 7 day whole blood assay (WBA) protocol - In-house ELISA protocol Ⅳ. 참고자료 1. Assay 에사용하는 programs 2. Assay 에사용하는기구및실험재료 3. Assay 에사용하는서식

115 부록 3: 실험실프로토콜 Ⅰ. Blood 채취및처리법 1. Blood 채취시필요한재료 (1) Plain tube 의경우안쪽벽이응고과정을활성화시키는 microscopic silica particle 이 coating 되어져있다. 혈액을약 1~2 ml 채취한다. 이 tube 에서 Serum 및 Blood clot 을채취한다. (2) Heparin tube 의경우안쪽벽이 Lithium, sodium, ammonium 또는 heparin 으로 coating 되어있다. 이는 anti-thrombin 을활성화시켜혈액이응고되는 과정을억제시키는역할을하게된다. 혈액을약 4~5 ml 채취한다. 이 tube 에서 Plasma 를얻으며 7 day whole blood assay 실험에사용된다. < Plain tube > < Heparin tube > 2. 학교 sample 처리방법 u Lab 에 sample 도착전, 준비단계 (1) IGRA-IT kit (Nil, TB-antigen, Mitogen), RPMI (RPMI medium 1640, invitrogen TM ) In-house 7 day whole blood assay에필요한 template 를 sample 수에맞춰실온에꺼내둔다. (2) IGRA-IT kit (Nil, TB-antigen, Mitogen) 와 15 ml conical tube를 sample 수에맞춰꺼낸후cohort 번호를 labeling 한다. (3) 15 ml conical tube에 RPMI를 1:4의비율로담아둔다. Ex> Blood 1 ml : RPMI 4 ml Lab에 sample 도착후, 실험단계 Day 0 (1) Blood samples in Heparin tube, plain tube 도착

116 부록 3: 실험실프로토콜 (2) Heparinized blood를 IGRA-IT로 1 ml씩, 15 ml conical tube로 1:4 비율에맞춰분주한다. (3) IGRA-IT를흔들어잘섞어준뒤37 CO 2 incubator에넣는다. (4) Plain tube를 3000 rpm, 15분 centrifuge( GIBCO, effendorf centrifuge 5810R, Germany) 를돌린다. (5) Antigen plate(template) 1) 에 RPMI로 1:4 비율로희석된 blood를 100 ul씩분주한다. (6) Plate를 pipetting으로잘섞어준뒤 sealing 후 37 CO 2 incubator에넣는다. (7) Centrifuge를돌린 plain tube로부터 serum, blood clot을 300 ul, 500 ul씩따서 eppendorf tube에담은후 -80 defreezer에보관한다. (duplicate로실행 ) Day 1 (1) Heparin tube를 3000 rpm, 15분 centrifuge 를돌린다. (2) Centrifugation시킨 heparin tube로부터 plasma를 300 ul씩따서 eppendorf tube에담은후 -80 defreezer에보관한다. (duplicate로실행 ) (3) 37 CO 2 incubator 에서 16~20시간 incubation시킨 IGRA-IT를꺼내 2500 g, 15분centrifuge를돌린다. (4) Centrifugation된 IGRA-IT의상층액을 200ul씩따서 96well plate에담은후 -80 defreezer에보관한다. (duplicate로실행 ) Day 2 (1) 96well plate 를꺼내실온에두고 IGRA-ELISA 를실시한다. *IGRA-ELISA 별도매뉴얼참조. (Page 7~9) Day 3 ~Day 6 (1) 혈액분주된 Antigen plate(template) 가 37 CO 2 incubator 에서 incubation 중. Day 6 (1) 7day WBA ELISA 를실시하기위해 Immulon 4HBX plate 를 coating 한다. *7day ELISA 별도매뉴얼참조. (Page 10~14) 1) Antigen plates (Templates) 참조

117 부록 3: 실험실프로토콜 Day 7 (1) 실험한Antigen plate (Template) 2) 를 incubator에서꺼내상층액을 80 ul씩 96well plate 에분주한후상온에두고 ELISA day2를실시한다. (quadruplicate로수행 ) (2) 같은날 7day WBA ELISA day2를실시하지않을경우 harvest 후 labeling 한후 -8 0 defreezer에보관한다. *7day ELISA 별도매뉴얼참조. (Page 10~14) Day 8 (1) 7day WBA ELISA day3 를실시한다. *7day ELISA 별도매뉴얼참조. (Page 10~14) 3. 보건소및병원 sample 처리방법 Lab에 sample 도착전, 준비단계 (1) IGRA-IT kit (Nil, TB-antigen, Mitogen), RPMI (RPMI medium 1640, invitrogen TM ) In-house 7 day whole blood assay에필요한 template 를 sample 수에맞춰실온에꺼내둔다. (2) IGRA-IT kit (Nil, TB-antigen, Mitogen) 와 15 ml conical tube를 sample 수에맞춰꺼낸후cohort 번호를 labeling 한다. (3) 15 ml conical tube에 RPMI를 1:4의비율로담아둔다. Ex> Blood 1 ml : RPMI 4 ml Lab 에 sample 도착후, 실험단계 Day 0 (1) Blood samples in Heparin tube, plain tube 도착 (2) Heparinized blood 를 IGRA-IT 로 1 ml 씩, 15 ml conical tube 로 1:4 비율에맞춰 분주한다. (3) IGRA-IT 를흔들어잘섞어준뒤 37 CO 2 incubator 에넣는다. (4) Plain tube 를 3000 rpm, 15 분 centrifuge( GIBCO, effendorf centrifuge 5810R, Germany) 를돌린다. (5) Antigen plate(template) 3) 에 RPMI 로 1:4 비율로희석된 blood 를 100 ul 씩 2) Antigen plates (Templates) 참조 3) Antigen plates (Templates) 참조

118 부록 3: 실험실프로토콜 분주한다. (6) Plate를 pipetting으로잘섞어준뒤 sealing 후 37 CO 2 incubator에넣는다. (7) Centrifuge를돌린 plain tube로부터 serum, blood clot을 300 ul, 500 ul씩따서 eppendorf tube에담은후 -80 defreezer에보관한다. (duplicate로실행 ) (8) Heparin tube를 3000 rpm, 15분 centrifuge 를돌린다. (9) Centrifugation시킨 heparin tube로부터 plasma를 300ul씩따서 eppendorf tube에담은후 -80 defreezer에보관한다. (duplicate로실행 ) Day 1 (1) 37 CO 2 incubator 에서 16~20시간 incubation시킨 IGRA-IT를꺼내 2500 g, 15분centrifuge를돌린다. (2) Centrifugation된 IGRA-IT의상층액을 200ul씩따서 96well plate에담은후 -80 defreezer에보관한다. (duplicate로실행 ) Day 2 (1) 96well plate 를꺼내실온에두고 IGRA-ELISA 를실시한다. *IGRA-ELISA 별도매뉴얼참조. (Page 8~9) Day 3 ~Day 6 (1) 혈액분주된 Antigen plate(template) 가 37 CO 2 incubator 에서 incubation 중. Day 6 (1) 7day WBA ELISA 를실시하기위해 Immulon 4HBX plate 를 coating 한다. *7day ELISA 별도매뉴얼참조. (Page 10~17) Day 7 (1) 실험한Antigen plate (Template) 를 incubator에서꺼내상층액을 80 ul씩 96well plate 에분주한후상온에두고 ELISA day2를실시한다. (quadruplicate로수행 ) (2) 같은날 7day WBA ELISA day2를실시하지않을경우 harvest 후 labeling 한후 -8 0 defreezer에보관한다. *7day ELISA 별도매뉴얼참조. (Page 10~17)

119 부록 3: 실험실프로토콜 Day 8 (1) 7day WBA ELISA day3 를실시한다. *7day ELISA 별도매뉴얼참조. (Page 10~17)

120 부록 3: 실험실프로토콜 Ⅱ. Sample 보관방법 1. Heparin tube heparin tube 에서 IGRA IT 3 ml, 7day whole blood assay 1~2 ml 의 blood 사용. (1) IGRA (Quantiferon IT) - 병원 / 보건소 sample : Nil, Antigen, Mitogen tube로부터 supernatant 분리 각각 effendorf tube에 0.4 ml씩 aliquot 병원 / 보건소 IGRA box에보관 - 학교 sample : Nil, Antigen, Mitogen tube로부터 supernatant 분리 96well culture plate 2개에각 0.2 ml씩 aliquot 학교별로 wrapping하여보관 (2) 7day WBA( Whole blood assay) - 병원 / 보건소 / 학교 sample : 96MicroWell Plate로부터 supernatant 분리 96well Cell Culture Plate 2개에 80 ul씩 quadruplicate로 aliquot 학교의경우학교별로 wrapping하여보관 (3) Plasma - Heparin tube를 4 에서 overnight. 다음날 supernatant 분리 (or 당일18, 3000rpm, 15min centrifugation) effendorf tube 2개에 0.3 ml씩 aliquot. 병원 / 보건소 sample box, 학교는학교별 box 새로만들어보관 - Supernatant 분리후버림. 2. Plain tube 18 시간내에 centrifuge (18, 3000rpm, 15min) (1) Serum 분리 effendorf tube 2 개에 0.3 ml 씩 aliquot 병원 / 보건소 sample box, 학교 는학교별 box 새로만들어 -80 에보관. (2) Blood clot 분리 effendorf tube 2 개에 0.5 ml 씩 aliquot (pipette tip 으로 clot 찢어서 aliquot) 병원 / 보건소 sample box, 학교는학교별 box 새로만들어 -80 에보관

121 ml (triplication 할때 S1 150 ul, S2, S3 : 70 로각각 serial dilution 한다 )( 제조된 8.0 IU/ standard 는 2-8 에서 3개월간보관가능 W300 ul 의 D를 conjugate 100X 에넣어용해시키고매실험시마다 GD 배씩희석해서 1X concentrate 로사용한다 (Table 참조 ). 부록 3: 실험실프로토콜 Ⅲ. Whole blood assay 및 ELISA 방법 1. QuantiFERON-TB Gold (in-tube) assay (Cellestism, Ltd, Melbourne, Australia) IGRA ELISA set manual 미리준비할시약 conjugate 100X concentrate 를제외하고는미리상온에옮겨놓는다. IFN-gamma standard 제조 (1) Kit 에포함된 standard 에적절한양 (standard table 에표기되어있음 ) 의 DW 를채워 8.0 IU/ml 을만든다. (2) 4 개의 effendorf tube 를준비하고각각의 tube 에 150 ul 의 Green diluent 를넣음. (triplication 할때 S1 : 150 ul, S2~S4 : 210 ul GD 를넣는다 ) (3) 그림처럼차례로 150 ul, 50 ul, 50 ul 를각 tube 에넣어 4 개의 standard 로만듬. (triplication 할때 S1 : 150 ul, S2, S3 : 70 ul 로각각 serial dilution 한다 ) ( 제조된 8.0 IU/ml standard 는 2-8 에서 3 개월간보관가능 ) Conjugate 제조 (1) 300 ul 의 DW 를 conjugate 100X concentrate 에넣어용해시키고매실험시마다 GD 로 100 배씩희석해서 1X concentrate 로사용한다 (Table 참조 )

122 부록 3: 실험실프로토콜 - 거품이생기지않도록조심해서 pipetting - conjugate 100X 는사용직후냉장보관 - Reconstitution 된 conjugate 는 6 시간이전에사용하도록한다 1X washing buffer 제조 20 배희석해서상온 2 주간보관 (20 ml/strip 필요 ) ELISA assay (1) 배양이끝난 plate 를다시 clean bench 로옮기고조심스럽게 80 ul (x4) 의혈장을미리준비된 96well plate 로옮긴후 sealing tape 로 plate 를감싸고보관한다. (2~8 14 일, -20 이하 3 개월보관가능 ) (2) 사용전 sample 을미리 vortex 한다. (3) standard 와 1x conjugate solution 을만든다 (Table 참조 ). (4) 50 ul 의 conjugate solution 을 kit 에포함된 strip 에넣고 50 ul 의 sample 을넣은후마지막으로 standard well 에 50 ul 의 standard 를넣는다

123 부록 3: 실험실프로토콜 (1) Microplate shaker 를이용하여골고루섞은후호일로싸서 2 시간동안실온에방치한다. (2) washing buffer 로 6 회 wash. (3) well 의물기를타월에두드려서완전히제거. (4) 100 ul 의 Enzyme substrate solution 을각 well 에넣고 microplate shaker 로섞은후호일에싸서 30 분간실온에방치한다. - 처음 well 에넣는순간부터 30 분시작 (5) 50 ul 이 Enzyme Stopping solution 을넣고섞은후 5 분이내에 450 nm 파장에서 microplate reader 로읽는다

124 부록 3: 실험실프로토콜 2. In-house 7 day whole blood assay protocol DAY 1 (1) 4HBX plate(96well) 준비, A-1 well은 blank 로표시하고비워둔다. (2) 4 에있는 carbonate coating buffer(0.1m NaHCO 3, ph8.2) 준비 (3) 4 에있는 anti-human IFN-γ mab (Pharmingen ) 준비 ( 파란색뚜껑, cap이라고표기 ) (4) Protocol 참조하여 coating buffer에 IFN-γ mab를넣는다. (5) 각 well에 50 ul 분주 (A-1 제외 ) 하고 plate를 tapping하여 buffer가 well의바닥에골고루깔릴수있도록해준다. (6) 4 에서 overnight DAY 2 (1) FBS, human AB serum (-20 freezer) 을꺼내 Room Temperature(RT) 에서녹인다. (2) PBS(from tablet), RPMI (4 freezer) 를 RT 에꺼내놓는다. (3) standard, positive control (-80 defreezer) 을꺼내 RT 에서녹인다. (4) washing solution (PBST = PBS % Tween-20) 만든다. (5) wash x 4 (6) blocking solution (PBS(from tablet) + 10% FBS) 을 protocol 참조하여만든다. (7) 각 well 에 blocking sol. 150 ul 분주 (A-1 제외 ) 한다. (8) 2 시간상온에서 incubation (9) -80 defreezer 에있는 sample 꺼내녹인다. (10) Diluent 만들기 (RPMI 19 ml + AB serum 1 ml 넣고 0.2 또는 0.4 um filter 로 filtering) (11) Standard 만들기 (diluent 5ml + STD 20 ul = 4000 pg/ml 농도의 STD) (12) wash x 3 (13) STD 넣기 (B1 에서 H1 까지 diluent 100 ul 넣는다. E12 에 11 의 STD 100 ul, B1 에도 11 의 STD 100 ul 를넣어 B1 에서부터 H1 까지 1/2 로 serial dilution 한다. 그러면농도 는 B1:2000 pg/ml ~ H1:31.25 pg/ml 까지측정된다.) (14) Positive control : A12, B12, negative control : G12, H12, 4000 pg/ml 농도의 standard : D12 에각각 100 ul 씩 loading 한다

125 부록 3: 실험실프로토콜 (15) Sample 을각 50 ul 씩 loading 한다. (16) 4 에서 overnight DAY 3 (1) FBS (-20 freezer) 을꺼내 RT에서녹인다 (2) 4 에있는 PBS(from tablets), Citric Acid, Na 2 HPO 4 4) 도 RT에꺼내놓는다. (3) -80 defreezer에있는 Avidin Peroxidase(AVP) 를꺼내 RT에서녹인다. (4) 4 에있는 plate 꺼내 wash x 4 (5) Wash하는동안 blocking solution(pbs(from tablets) + 10% FBS) 을 protocol을참조해만든다. (6) Protocol 참조하여 blocking solution (5번의 1/2양 ) 에 detection Antibody ( 흰뚜껑 ) 를넣는다. (7) Add 100 ul detection Antibody per well (except well A-1 the blank) (8) Incubate for 45minutes at Room Temperature(RT). (9) Protocol 참조하여남은 blocking solution에 AVP를넣는다. (10) Wash x 4 (11) Add 100 ul AVP per well (except well A-1 the blank) (12) Incubate for 30minutes at RT. (13) Prepare OPD(4 ) substrate buffer (0.2M Na 2 HPO 4 : 0.1M citric acid : 3 DW = 1 : 1 : 2) (14) Wash x 5 (the first and last washes being by hand) (15) Protocol 참조하여사용하기직전에 OPD tablet 을 substrate buffer에넣어녹이고 (0.4 mg/ml) solution에 H 2 O 2 을넣는다 (0.4 ul/ml). 5 plates까지는 substrate buffer 50 ml 에 20 mg OPD tablet 1개, H 2 O 2 20 ul 넣음 (16) Add 100 ul OPD solution to all wells and develop in the dark (17) 7분후 stop solution (2M H 2 SO 4 ) 50 ul 첨가해 490nm의파장에서흡광도측정. 4) Buffer 에관한내용은 14 page Buffers 참조

126 부록 3: 실험실프로토콜 In house ELISA protocol ( 참고내용 ) Day 1 No plates Interferon-γ coat antibody Coating buffer 1/ ul 5 ml 2 20 ul 10 ml 3 30 ul 15 ml 4 40 ul 20 ml 5 50 ul 25 ml 6 60 ul 30 ml 7 70 ul 35 ml 8 80 ul 40 ml 9 90 ul 45 ml ul 50 ml ul 55 ml ul 60 ml ul 65 ml ul 70 ml ul 75 ml Day 2 No plates PBS(from tablet) 10% FBS 1 15 ml 1.5 ml 2 30 ml 3 ml 3 45 ml 4.5 ml 4 60 ml 6 ml 5 75 ml 7.5 ml 6 90 ml 9 ml ml 10.5 ml ml 12 ml ml 13.5 l ml 15 ml ml 16.5 ml ml 18 ml ml 19.5 ml ml 21 ml ml 22.5 ml

127 부록 3: 실험실프로토콜 Day 3 No plates Total Blocking solution Detect 용 Blocking solution Interferon-γ detection antibody 1 20 ml 10 ml 20 ul 2 40 ml 20 ml 40 ul 3 60 ml 30 ml 60 ul 4 80 ml 40 ml 80 ul ml 50 ml 100 ul ml 60 ml 120 ul ml 70 ml 140 ul ml 80 ml 160 ul ml 90 ml 180 ul ml 100 ml 200 ul ml 110 ml 220 ul l ml 120 ml 240 ul ml 130 ml 260 ul ml 140 ml 280 ul ml 150 ml 300 ul Day 3 No plates AVP용 Blocking AVP 0.2 M 0.1 M 2 M solution Na2HPo4 Citric acid H2O ml 25 ul 12.5 ml 12.5 ml 20 ul 2 20 ml 50 ul 12.5 ml 12.5 ml 20 ul 3 30 ml 75 ul 12.5 ml 12.5 ml 20 ul 4 40 ml 100 ul 12.5 ml 12.5 ml 20 ul 5 50 ml 125 ul 12.5 ml 12.5 ml 20 ul 6 60 ml 150 ul 25 ml 25 ml 40 ul 7 70 ml 175 ul 25 ml 25 ml 40 ul 8 80 ml 200 ul 25 ml 25 ml 40 ul 9 90 ml 225 ul 25 ml 25 ml 40 ul ml 250 ul 25 ml 25 ml 40 ul ml 275 ul 37.5 ml 37.5 ml 60 ul ml 300 ul 37.5 ml 37.5 ml 60 ul ml 325 ul 37.5 ml 37.5 ml 60 ul ml 350 ul 37.5 ml 37.5 ml 60 ul ml 375 ul 37.5 ml 37.5 ml 60 ul BUFFERS: Carbonate Coating Buffer (0.1M NaHCO 3, ph 8.2) To make 250 ml, use 2.1 g NaHCO 3 20X PBS Na 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 NaCl dh 2 O 33.4 g 11.4 g 170 g Up to 1 L

128 부록 3: 실험실프로토콜 OPD Substrate Buffer 100 ml 250 ml 0.2M Na 2 HPO g g 0.1M citiric g g 2M H 2 SO 4 acid MW=98.07 g, 98% pure so 18.4 M (do a 1/9.2 dilution). Specific gravity ml in 500 ml (446 ml water) Add acid to water slowly! PBS Tween To make 5 L use 250 ml 20X PBS and 4.75 L dh 2 O

129 부록 3: 실험실프로토콜 Antigen plates (Templates) To prepare for 300 subject (150 plates) (800 μl /plate 120 ml : make 135 ml ; 45 ml for 3 days) 1) PHA-M Stock : 5 mg / ml ( 200 μl Stock+800 μl RPMI Stock concentration 1 mg / ml ) Stock : 1 mg / ml Final concentration : 5 μg / ml Dilute to 10 μg / ml 45 ml x 10/1000 = 450 μl μl ( 44 ml +550 μl ) 2) M. tuberculosis PPD Stock : 49 mg /vial ( Insert to vial 49 ml RPMI Stock concentration 1 mg / ml ) Stock : 1 mg / ml Final concentration : 5 μg / ml Dilute to 10 μg / ml 45 ml x 10/1000 = 450 μl μl ( 44 ml +550 μl ) 3) M. avium PPD (#17 : heat-killed ; Yonsei university ) Stock : mg / ml ( 902 μl Stock+98 μl RPMI Stock concentration 1 mg / ml ) Stock : 1 mg / ml Final concentration : 5 μg / ml Dilute to 10 μg / ml 45 ml x 10/1000 = 450 μl μl ( 44 ml +550 μl ) 4) BCG Pasteur Stock : 5.6 x 10 7 cfu/ ml ( 5.6 x 10 x 10 6 = 56 x 10 6 ) Stock : 56 x 10 6 Final concentration : 1/56 Sonication/Vortex for 1h. Dilute to 1/28 45 ml x 1/28 = ml ml 5) BCG Tokyo Stock : 1.3 x 10 8 cfu/ ml ( 1.3 x 10 2 x 10 6 = 130 x 10 6 ) Stock : 130 x 10 6 Final concentration : 1/130 Sonication/Vortex for 1h. Dilute to 1/

130 부록 3: 실험실프로토콜 45 ml x 1/65 = 693 ml ml 6)BCG Danish Stock : 2.8 x 10 7 cfu/ ml (2.8 x 10 x 10 6 = 28 x 10 6 ) Stock : 28 x 10 6 Final concentration : 1/28 Sonication/Vortex for 1 h. Dilute to 1/14 45 ml x 1/14 = ml ml 7) ESAT-6 ( Yonsei university ) Stock : mg / ml ( μl Stock μl RPMI Stock concentration 1 mg / ml ) Stock : 1 mg / ml Final concentration : 2 μg / ml Dilute to 4 μg / ml 45 ml x 4/1000 = 180 μl μl ( 44 ml +820 μl ) 8) CFP10 ( Yonsei university ) Stock : mg / ml Final concentration : 2 μg / ml Dilute to 4 μg / ml 45 ml x 4/825 = μl μl ( 44 ml μl ) 9) HSPX ( Yonsei university ) Stock : mg / ml ( μl Stock μl RPMI Stock concentration 1 mg / ml ) Stock : 1 mg / ml Final concentration : 5 μg / ml Dilute to 10 μg / ml 45 ml x 10/1000 = 450 μl μl ( 44 ml +550 μl )

131 부록 3: 실험실프로토콜 Ⅳ. 참고자료 1. Assay 에사용하는 programs (1) IGRA-gold_v2.50.exe (2) SoftMax Pro

132 부록 3: 실험실프로토콜 2. Assay 에사용하는기구및실험재료 (1) Model 1575 Immunowash microplate washer Residual well volumn Soak time Available manifolds Storage capacity Compatible plate types Dimensions Weighr < 2 ul sec instrip mode 0 59 min in plate mode 8 and 12 way 75 kits Any flat or round-bottom plate 32.5 x 40.5 x 19.3 cm (WxDxH) 9.6 kg Operating temperature (2) Vmax Kinetic Microplate Reader Wavelength Range Kinetic Read Time Photometric Range Endpoint Read Time Photometric Analysis Modes Cross Talk Control Calculated Mean Time Between Failure (MTBF) AUTOmix nm 5 second minimum between readings to > OD 6 seconds Single wavelength, optical density Dual wavelength, optical density Kinetics, kinetics graphics Range Blank pattern Single well sequential illumination of microplate eliminates well-to-well cross talk of stray light > 20,000 hours Automatic mixing of well prior to a reading and between readings

133 부록 3: 실험실프로토콜 (3) QuantiFERON -TB Gold & QuantiFERON -TB Gold In-tube Minimises blood handling and simplifies the blood stimulation step of QuantiFERON - TB Gold. Is highly compatible with automated ELISA platforms, allowing large Volume screening. The simplified blood stimulation step allows the test to be used in any Location. The blood collection Tubes are easily transported for ELISA testing. High sensitivity (~90%) has been shown in culture confirmed TB patients, Exceeding that of the Mantoux test. Specificity is also very high (>98%) even In BCG vaccinated individuals

134 부록 3: 실험실프로토콜 3. Assay 에사용하는서식 (1) Log book Qf 코호트번호 date and time for blood collection date and time r e ceive d(la b) blood collection 7da y WBA comme nts heparin plain time in incubator time out incubator TMP date and time date and time in culture out culture 1 SC13-10-CH-001-PR : :00 O O : : : :00 OO고 PR CH-001-FW : :00 O O : : : :00 OO구보건소FW1 QFT (2) IGRA Lot# 일련번호 코호트번호 nil lot# a ntige n lot# mitoge n lot# ELIS A kit lot # 1 SC13-10-CH-001-PR CH-001-FW QFT (3) 자원 List 병원 / 보건소의경우 Box NO. 바로옆에기입. 일련번호 코호트번호 자원화목록번호 검체채취일자 Y/ N 용량 (ml) 검사결과 X-ray PPD 판독결과 (mm) QFT 결과 비고 Box NO. 1 SC01-08-CH-002-PR SC01-08-CH-002-PR-qc :30 Y 0.4 정상 15mm 양성 양성 OO고 PR 2 SC01-08-CH-002-PR SC01-08-CH-002-PR-wc :30 Y 0.3 정상 15mm 양성 양성 3 SC01-08-CH-002-PR SC01-08-CH-002-PR-p :30 Y 2 정상 15mm 양성 양성 4 SC01-08-CH-002-PR SC01-08-CH-002-PR-s :30 Y 1.5 정상 15mm 양성 양성 5 SC01-08-CH-002-PR SC01-08-CH-002-PR-bc :30 Y 1 정상 15mm 양성 양성 CH-021-PR CH-021-PR-qc :20 Y 0.4 정상 17 양성 양성 OO구 PR QFT harvest BOX# CH-021-PR CH-021-PR-wc :20 Y 0.3 정상 17 양성 양성 CH-021-PR CH-021-PR-p :20 Y 0.6 정상 17 양성 양성 병원 / 보건소 BOX# CH-021-PR CH-021-PR-s :20 Y 0.6 정상 17 양성 양성 병원 / 보건소 BOX# CH-021-PR CH-021-PR-bc :20 Y 1 정상 17 양성 양성 병원 / 보건소 BOX#10 (4) 자원 BOX NO. 학교의경우만해당

135 부록 3: 실험실프로토콜 일련번호 코호트번호 comme nts Plas ma Serum Blood clot Box NO. Box NO. Box NO. 1 SC07-09-CH-001-PR OO고PR/hemolysis OO고 PR #1 OO고 PR #1 OO고 PR #1 2 SC07-09-CH-002-PR OO고PR OO고 PR #1 OO고 PR #1 OO고 PR #1 3 SC07-09-CH-003-PR OO고PR OO고 PR #2 OO고 PR #2 OO고 PR #2 4 SC07-09-CH-004-PR OO고PR OO고 PR #3 OO고 PR #3 OO고 PR #3 5 SC07-09-CH-005-PR OO고PR OO고 PR #3 OO고 PR #3 OO고 PR #3 (5) Lab Result IGRA(IU/ml) 7day(pg/ml) result 7day(pg/ml) 일련번호코호트번호성명 Nil TB Ag Mitogen TB Ag-Nil Mitogen-Nil Nil ESAT-6 CFP-10 ESAT-6 Nil CFP-10 Nil IGRA 7day PHA-M PPD(Mtb) PPD (Mavium) Pasteur Tokyo Danish HSP-X TMP ELISA coment 1 SC01-08-CH-001-PR 음성 음성 ㅇㅇ고PR 2 SC01-08-CH-002-PR 양성 양성 ㅇㅇ고PR CH-009-PR 양성 양성 ㅇㅇ구PR CH-001-FW 양성 음성 ㅇㅇ구PR