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주영 낭
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1 KISEP Rhinology Korean J Otolaryngol 2006;49: 상악동 후비공 비용과 비용에서의 Matrix Metalloproteinase-2/-9의 발현 한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실, 1 병리학교실 2 2 김진영 1 전진형 1 홍현정 1 김해영 1 김현수 1 박혜림 2 민수기 Expression of Matrix Metalloproteinase-2/-9 in Nasal Polyp and ntrochoanal Polyp Jin Young Kim, MD 1, Jin Hyoung Chun, MD 1, Hyun-Jeong Hong, MD 1, Hae Young Kim, MD 1, Hyun Su Kim, MD 1, Hye-Rim Park, MD 2 and Soo Kee Min, MD 2 1 Department of Otorhinolaryngology-Head & Neck Surgery; 2 Pathology, College of Medicine, Hallym University, nyang, Korea STRCT ackground and Objectives:Nasal polyp (NP) and antrochoanal polyp (CP) are soft tissue masses, featuring chronic inflammation and tissue remodeling. To elucidate the mechanism of tissue remodeling, we investigated the expressions of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MMP-9 in CP and NP and compared them with normal inferior turbinate mucosa. Subjects and Method:Nasal samples, obtained from controls (n=10), from CP (n=10) and from NP (n=13), were analysed by immunohistochemistry. MMP-2/-9 expression was identified in epithelial, endothelial, gland, inflammatory cells. We assessed MMP-2/-9 immunoreactivity of CP and NP in comparison with the normal inferior turbinate. The number of immunostained inflammatory cells were determined. Results:In CP, compared with controls, the MMP-2 expression was increased in vessel endothelium, while the MMP-9 expression was increased in vessel endothelium and inflammatory cells. In NP, compared with controls, increased expression of MMP-9 was observed in gland and inflammatory cells. Conclusion:CP showed increased expression of MMP-2/-9, while NP showed increased expression of MMP-9. It is concluded that MMP-2/-9 in CP and MMP-9 in NP may play a role in tissue remodeling. (Korean J Otolaryngol 2006;49:786-90) KEY WORDS:Nasal polyp ntrochoanal polyp MMP-2 MMP-9. 서 론 상악동 후비공 비용은 상악동 점막에서 기원하여 상악동 의 부공 또는 자연공을 통해 빠져나와 후비공과 비인강으 로 돌출하는 모양의 단일 비용으로 만성부비동염에서 보이 는 비용과는 조직학적으로 약간의 차이를 보이고 있다. 1) 비용 및 상악동 후비공 비용의 생성에 관하여는 정확한 기 전이 알려져 있지 않으나, 세포외 기질의 축적과 염증세포 의 침윤이 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다. 2) Matrix metalloproteinase(mmp)는 아연과 칼슘 의존 엔도펩티다아제(endopeptidase)의 일종으로 결체 조직들 의 여러 구성성분을 분해하여 염증반응, 조직재형성, 상처 논문접수일:2005년 11월 11일 / 심사완료일:2006년 5월 11일 교신저자:김진영, 경기도 안양시 동안구 평촌동 896번지 한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 전화:(031) 전송:(031) entkjy@hallym.or.kr 재생과정, 암전이 같은 생리학적인, 병적인 상태에 관여하 고 있다. 3) MMP 중 MMP-2(gelatinase )와 MMP-9 (gelatinase )은 type IV collagenase의 일종으로 젤라틴, 콜라겐, 일라스틴 등을 분해한다. 4) MMP-2는 거의 모든 세 포에서, MMP-9은 대식세포(macrophage), 호산구(eosinophil), 호흡기 상피세포에서 분비되는 것으로 알려져 있 으며, 이들은 미세혈관의 투과성을 변화시켜, 부종이나 세 포의 이동, 세포외 기질의 재형성에 관여하고 있다. 5) 비용 및 상악동 후비공 비용은 기질의 축적과 염증세포 의 침윤을 특징으로 하고 있다. 그러므로 저자들은 비용의 형성에 MMP가 어떠한 역할을 할 것이라 가정하여 본 연 구를 진행하였다. 저자들은 비용조직과 상악동 후비공 비 용에서 MMP-2, MMP-9이 어떻게 발현되는지 알아보기 위해 정상 하비갑개 조직과 비용조직, 상악동 후비공 비용 에서 MMP-2, MMP-9의 발현 양상을 면역조직학적 염 색법으로 비교 연구하였다. 786

Soo Kee Min, MD 2 1 Department of Otorhinolaryngology-Head & Neck Surgery; 2 Pathology, College of Medicine, Hallym University, nyang, Korea STRCT ackground and Objectives:Nasal polyp (NP) and

2 김진영 외 대상 및 방법 대 상 2004년 1월부터 2005년 5월까지 본원 이비인후과학교 실에서 임상 및 조직검사로 진단된 비용(n=13) 및 상악동 후비공 비용(n=10) 환자에게서 채취한 조직을 대상으로 하였다. 상악동 후비공 비용은 비강 내의 조직을 대상으로 하였다. 비용 및 상악동 후비공 비용군은 알레르기 비염이 동반되지 않은 군으로, 수술 전 2주 이상 항생제, 항히스 타민제, 국소 혹은 경구용 스테로이드제제 등의 약물 치료 를 피하였다. 대조군으로는 비중격 만곡증 및 코골이 환자 10명에서 채취한 하비갑개 조직을 이용하였다. MMP-2/-9에 대한 면역조직화학 염색 10% 중성 포르말린 고정, 파라핀에 포매한 조직으로 통 상적인 면역조직화학적 검색인 streptavidin-biotin peroxidase 검색법(LS, Dako)을 시행하였다. 일차항체는 MMP-2, MMP-9 단백에 반응하는 래빗 다클론 항체(Sigma, St. louis, MO)를 각각 1:100, 1:400으로 희석하 였다. 5 μm 두께로 파라핀 포매조직을 박절하고 59 보 온기에서 30분간 처리 후 자일렌(xylene)에서 5분간 탈 파라핀 시킨 후 100%, 95%와 75% 알코올을 순차적으로 3분간 처리 후 증류수로 수세하였다. 전처치로 MMP-2 는 4분간 protease로 처치한 후 일차항체를 실온에서 1시 간 반응시켰으며, MMP-9은 citrate buffer에 5분씩 4회, microwave로 처리한 후 일차항체를 실온에서 1시간 반응 시켰다. 일차항체를 반응시키고 PS로 수세한 후 biotin 이 부착된 이차항체에 20분 동안 반응시키고 수세한 후 다시 streptavidin peroxidase로 20분간 처리하였다. Diaminobenzidine tetrachloride(d)(vector Labo-ratories, erlingame, C)를 5~10분간 도포하여 발색하고 10% Mayer s hematoxylin으로 대조염색 후 광학현미경 으로 관찰하였다. 양성 대조군으로는 유방의 선암종 조직 을 사용하여 같은 방법으로 염색하였다. 음성 대조군으로 는 일차항체 대신 인산완충용액을 사용하여 같은 방법으로 시행한 후 관찰하였다. MMP-2/-9에 대한 면역염색의 분석 면역염색의 강도 분석을 위해 임의의 10개의 시야(final magnification:200배)에서 상피세포, 혈관내피세포, 선세 포의 염색비율을 측정하였으며, 염증세포는 400배 확대된 시야에서 염증이 가장 심한 곳에서 염색된 염증세포의 수 를 측정하였다. 상피세포, 혈관내피세포, 선세포, 염증세포 에서 비용군과 하비갑개군, 상악동 후비공 비용과 하비갑 개군에 염색 비율의 차이가 있는지 비교하였으며, 염색된 염증세포의 수를 비교하였다. 통계학적 분석 모든 통계처리는 SPSS version 10(SPSS Inc. Chicago, IL)을 이용하였다. 통계학적 분석은 Mann-Whitney U test 를 이용하였으며 통계학적 유의성은 p<0.05를 기준으로 하였다. 결 과 하비갑개 조직에서 MMP-2, MMP-9은 상피세포, 선세 포, 혈관내피세포, 염증세포에서 약하게 발현되었으며, 상피 세포에서는 주로 기저층에서 발현되었다. 혈관내피세포에서 Fig. 1. Photomicrographs show MMP-2 () and MMP-9 () in nasal mucosa of control ( 100). 787

MMP-2/-9에 대한 면역조직화학 염색 10% 중성 포르말린 고정, 파라핀에 포매한 조직으로 통 상적인 면역조직화학적 검색인 streptavidin-biotin peroxidase 검색법(LS, Dako)을 시행하였다. 일차항체는 MMP-2, MMP-9 단백에 반응하는 래빗 다클론 항체(Sigma, St.

3 상악동 후비공 비용과 비용에서의 MMP-2/-9의 발현 는 거의 발현이 관찰되지 않았으며, 선세포에서는 MMP- 9이 MMP-2보다 약간 증가된 발현이 관찰되었다(Fig. 1). 염증세포에서는 염증세포의 수가 적어 염색된 염증세포는 미미하였다. 상악동 후비공 비용에서는 선세포를 거의 관찰할 수 없 었으며, MMP-2는 대조군에 비해 혈관내피세포에서 증가 된 염색이 관찰되었으며(p<0.01), MMP-9은 대조군에 비 해 혈관내피세포(p<0.01)와 염증세포(p<0.05)에서 통계 학적으로 유의하게 강하게 발현되었다(Figs. 2, 5 and 6). 비용조직에서는 MMP-2는 대조군에 비해 상피세포, 선 세포, 혈관내피세포, 염증세포에서 많은 염색비율을 보였 으나 통계학적으로 유의성은 보이지 않았다(Figs. 3, 5 and 6). MMP-9은 대조군에 비해 선세포(p<0.01)와 염증세 포(p<0.01)에서 통계학적으로 유의하게 강한 발현을 보였 다(Figs. 4, 5 and 6). 상악동 후비공 비용에서는 혈관내피 세포에서 MMP-2/-9, 비용에서는 선조직에서 MMP-9, 염증세포에서는 두 군 모두 MMP-9의 발현이 통계학적 으로 유의하게 강한 발현을 보였다(Figs. 5 and 6). 고 찰 상악동 후비공 비용과 만성 부비동염에서 보이는 비용은 만성 염증과 기질의 축적을 특징으로 하고 있다. 하지만 두 조직은 다른 양상을 많이 보이고 있는데, 상악동 후비공 비 용은 inducible nitric oxide synthase의 분포, 6) arachidonic acid metabolites의 대사에 7) 있어 비알러지 비용과 다른 C Fig. 2. Photomicrographs show MMP-2/-9 in CP. :MMP-2 immunostaining is seen in epithelium and edema is seen in stroma ( 40). :MMP-2 immunostained endothelium is seen ( 200). C:MMP-9 immunostained inflammatory cells is seen in subepithelial layer ( 200). Fig. 3. MMP-2 immunostaining of nasal polyp. :Immunoreactivity is seen in epithelial layer ( 200). : Immunostained submucosal gland is seen ( 100). C Fig. 4. Photomicrographs show MMP-9 in nasal polyp. :Immunostaining is seen in epithelium and some immunostained inflammatory cells is seen in subepithelial layer ( 100). :Immunostained submucosal gland is seen ( 200). C:MMP-9 immunostained inflammatory cells is seen in subepithelial layer and epithelium ( 200). 788 Korean J Otolaryngol 2006;49:786-90

비용조직에서는 MMP-2는 대조군에 비해 상피세포, 선 세포, 혈관내피세포, 염증세포에서 많은 염색비율을 보였 으나 통계학적으로 유의성은 보이지 않았다(Figs. 3, 5 and 6). MMP-9은 대조군에 비해 선세포(p<0.01)와 염증세 포(p<0.01)에서 통계학적으로 유의하게 강한 발현을 보였 다(Figs. 4, 5 and 6).

4 김진영 외 Fig. 5. Percentages of MMP-2, MMP-9 immunostained area in control, CP and nasal polyp. p< MMP-2 (epithelium) Control Nasal polyp CP MMP-9 (epithelium) MMP-2 (vessel) 양상을 보이고 있다. 조직학적인 면에서도, 분비선을 거의 보이지 않고 비용에 비해 적은 호산구를 나타내고 있는 것 으로 알려져 있다. 1) 이번 연구에서는 기질의 축적과 재형성 의 측면에서 MMP-2/-9의 역할을 알아보기 위해, MMP- 2/-9의 면역조직화학 염색을 실시하였고 발현 양상 비교 하였다. 연구결과 비용조직에서 MMP-9은 대조군보다 선세포, 염증세포에서 발현이 증가하였다. Emmanuele 등의 결과 에서도 MMP-9은 MMP-2에 비해 상피세포, 혈관내피세 포, 선, 염증세포에서 증가된 발현을 보였다. 8) Watelet 등 의 만성부비동염과 비용조직에서 시행한 MMP-7, MMP- 9, TIMP-1의 발현 연구에서도 MMP-9은 정상 하비갑 개 조직보다 만성부비동염과 비용조직에서 증가된 양상을 보였으며, MMP-7/-9과 TIMP-1의 발현 양상이 정상군 에 비해 다르게 관찰되었다고 보고하였다. 9) handari 등 은 비용조직에서 실시한 RT-PCR과 면역조직화학염색상 MMP-2만이 비용에서 발현되었다고 보고하였다. 10) MMP- 9이 전혀 발현이 안된 것은 본 연구결과와 이전의 연구결 과와도 많은 차이를 보이는 것이라 생각된다. MMP-9 (vessel) Control Nasal polyp CP MMP-2 (inflammatory cells) Fig. 6. The number of immunostained inflammatory cells in control, CP and nasal polyp ( 400). p<0.05. MMP-2 (gland) MMP-9 (gland) MMP-9 (inflammatory cells) 만성 부비동염에서는 염증성 싸이토카인이 증가되어 있 으며, 염증성 싸이토카인은 in vitro상 MMP의 분비를 촉진 시킨다고 알려져 있다. 11) 이러한 염증세포에서 MMP-9의 발현이 증가되었으며, 염증 시에는 염증세포 이외에 호흡 기 상피세포, 섬유모세포, 혈관 내피세포 등 다양한 세포에 서 MMP-9을 분비한다. 염증세포에 의해 증가된 MMP- 9은 내피세포와 상피 기저막을 파괴하여 혈관 투과성을 증 가시키고, 기저막을 통한 염증세포의 이동을 촉진시키며, 염 증성 싸이토카인의 활성화를 통하여, 염증을 더욱 심화시 킬 수 있다. 또한 MMP-9은 천식, 12) 급성 폐 손상, 13) 알 러젠 반응 후기 반응 시 증가하는 것으로 14) 볼 때 상하기도 호흡기의 조직, 세포외 기질 재형성에 관여할 것으로 생각 된다. 상악동 후비공 비용에서는 혈관내피세포에서 MMP-2와 MMP-9의 발현이 증가되었으며, 염증세포에서는 MMP- 9의 발현이 증가되었다. 상악동 후비공 비용의 혈관내피세 포에서 MMP-2/-9의 증가된 발현은 비용과의 차이점이 라 볼 수 있다. 이는 상악동 후비공 비용이 비용조직보다 심한 부종과 많은 혈관을 보였으며, 전자 현미경상 상악동 후비공 비용은 손상된 혈관내피세포를 특징으로 하기 때문 이라 생각된다. 1) 결론적으로 이번 연구에서는 상악동 후비공 비용에서는 증가된 MMP-2/-9의 발현을 모두 관찰할 수 있었으며, MMP-2/-9 모두 상악동 후비공 비용 생성에 관여할 것 으로 생각된다. 만성 부비동염의 비용에서는 MMP-9이 선조직, 염증세포에서 증가된 발현을 보였으며, MMP-9 은 MMP-2보다 비용 생성 및 재형성에 더 많은 관여를 할 것으로 생각된다. 중심 단어:비용 상악동 후비공 비용 MMP-2 MMP-9. 이 연구는 2005년도 한림대학교 의료원 연구비(050023)의 지 원에 의하여 이루어졌음. REFERENCES 1) Ozcan C, Zeren H, Talas DU, Kucukoglu M, Gorur K. ntrochoanal polyp: transmission electron and light microscopic study. Eur rch Otorhinolaryngol 2005;262: ) Maldonado M, Martinez, lobid I, Mullol J. The antrochoanal polyp. Rhinology 2004;42: ) Delacourt C, Le ourgeois M, D Ortho MP, Doit C, Scheinmann P, Navarro J, et al. Imbalance between 95 kda type IV collagenase and tissue inhibitor of metalloproteinases in sputum of patients with cystic fibrosis. m J Respir Crit Care Med 1995;152: ) Hoshino M, Nakamura Y, Sim J, Shimojo J, Isogai S. ronchial subepithelial fibrosis and expression of matrix metalloproteinase-9 in asthmatic airway inflammation. J llergy Clin Immunol 1998;102:

1) 이번 연구에서는 기질의 축적과 재형성 의 측면에서 MMP-2/-9의 역할을 알아보기 위해, MMP- 2/-9의 면역조직화학 염색을 실시하였고 발현 양상 비교 하였다. 연구결과 비용조직에서 MMP-9은 대조군보다 선세포, 염증세포에서 발현이 증가하였다.

5 상악동 후비공 비용과 비용에서의 MMP-2/-9의 발현 5) Okada S, Kita H, George TJ, Gleich GJ, Leiferman KM. Migration of eosinophils through basement membrane components in vitro: Role of matrix metalloproteinase-9. m J Respir Cell Mol iol 1997;17: ) Ozcan C, pa DD, Pata YS, Gorur K, kbas Y. Expression of inducible nitric oxide synthase in antrochoanal polyps. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2003;67: ) Jang YJ, Rhee CK, Oh CH, Ryoo HG, Kim HG, Ha M. rachidonic acid metabolites in antrochoanal polyp and nasal polyp associated with chronic paranasal sinusitis. cta Otolaryngol 2000;120: ) Lechapt-Zalcman E, Coste, d'ortho MP, Frisdal E, Harf, Lafuma C, et al. Increased expression of matrix metalloproteinase-9 in nasal polyps. J Pathol 2001;193: ) Watelet J, achert C, Claeys C, Van Cauwenberge P. Matrix metalloproteinases MMP-7, MMP-9 and their tissue inhibitor TIMP-1: Expression in chronic sinusitis vs nasal polyposis. llergy 2004;59: ) handari, Takeuchi K, Suzuki S, Harada T, Hayashi S, Imanaka- Yoshida K, et al. Increased expression of matrix metalloproteinase-2 in nasal polyps. cta Otolaryngol 2004;124: ) Namba M, sano K, Kanai K, Kyo Y, Watanabe S, Hisamitsu T, et al. Suppression of matrix metalloproteinase production from nasal fibroblasts by fluticasone propionate in vitro. cta Otolaryngol 2004;124: ) Dahlen, Shute J, Howarth P. Immunohistochemical localisation of the matrix metalloproteinases MMP-3 and MMP-9 within the airways in asthma. Thorax 1999;54: ) Gibbs DF, Shanley TP, Warner RL, Murphy HS, Varani J, Johnson KJ. Role of matrix metalloproteinases in models of macrophagedependent acute lung injury. m J Respir Cell Mol i iol 1999;20: ) Kelly E, usse WW, Jarjour NN. Increased matrix metalloproteinase-9 in the airway after allergen challenge. m J Respir Crit Care Med 2000;162: Korean J Otolaryngol 2006;49:786-90

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721 KISEP Rhinology Korean J Otolaryngol 1999;42:720-6 비용조직에서 비반세포 및 호산구의 침윤과 접착분자의 발현: 중비갑개 및 하비갑개 점막과의 비교 이봉재 김홍철 신현수 Mast Cells, Eosinophils, and ICAM-1 Expression in the Nasal Polyps Comparison with the