(72) 발명자 로페스 아발라떼구이, 까를로스 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 11800, 알로요 나란 호, 로스피노스, 씨스네로 베탄쿠에르트 453 씨에라 바스쿠에스, 베아트리스 데 라 까리닫 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 17100, 리 리사, 칼 레 312 넘버.2

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1 (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2008년05월30일 (51) Int. Cl. A61K 39/12 ( ) A61K 39/295 ( ) C07K 14/18 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2008년04월15일 심사청구일자 없음 번역문제출일자 2008년04월15일 (86) 국제출원번호 PCT/CU2006/ 국제출원일자 2006년09월18일 (87) 국제공개번호 WO 2007/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2007년03월22일 년09월16일 쿠바(CU) 전체 청구항 수 : 총 8 항 (71) 출원인 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테 크놀로지아 쿠바, 씨. 하바나 10600, 플라야, 쿠바나칸, 아베. 31 엔트레 158와이 190 (72) 발명자 라소바스께스, 라우라 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 10700, 라우톤 10 데 악튜브레,아레아노 274 이/ 씨 와이 알탈리바 에르미다 크루스, 리쎄트 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 11000, 카스티오 61 이/1라 와이2다 레파르토 칼리포니아 산 미구엘 델 파드론 (뒷면에 계속) (74) 대리인 김성규, 김태규 (54) 보호 반응을 유도하는 댕기열 바이러스 캡시드 단백질 및약학적 조성물 (57) 요 약 본 발명은 항체-의존 면역증폭을 유도하지 않고 수용자에서의 바이러스성 항원투여에 대한 보호적 면역 반응을 유도할 수 있는 댕기열 바이러스의 혈청형의 캡시드의 단백질을 수득하는 방법에 대한 것이다. 수득된 재조합 단 백질은 댕기열 백신 제형을 수득하기 위해 약학 산업에서 사용할 수 있다

2 (72) 발명자 로페스 아발라떼구이, 까를로스 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 11800, 알로요 나란 호, 로스피노스, 씨스네로 베탄쿠에르트 453 씨에라 바스쿠에스, 베아트리스 데 라 까리닫 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 17100, 리 리사, 칼 레 312 넘버.2925 이/ 29 와이 31 후안 데 디오스 프라가 바스쿠에스 라문도, 수산나 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 17100, 레파르토 프 라가 리 리사,아베 31 넘버 이/ 316 와이 318 발데스 프라도, 이리스 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 10700, 산타 펠리시 아 427 이/ 로사엔리께 와이 멜로네스 루야노 구이엔 니에토, 게랄도, 엔리께 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 10400, 플라사 데 라 레볼루씨온,리나 6 이/엔 와이 오 피소 4 베다도 구스맨 티라도, 마리아, 구아달루페 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 11300, 플라야, 미라 마르, 칼레 28넘버. 116 이/1라 와이 3라 수루에타 모라레스, 아이다 쿠바, 씨우다드 데 라 하바나 17200, 알라마르, 에 디피씨오 77압토 32 소나

3 특허청구의 범위 청구항 1 댕기열 바이러스에 대한 면역 반응을 수용 생물에서 유도할 수 있는 백신이며, 여러 댕기열 바이러스 혈청형 중 하나의 캡시드 단백질을 단독으로 또는 다른 항원과 조합하여 포함함을 특징으로 하는 약학적 제제. 청구항 2 제1항에 있어서, 댕기열 바이러스 1, 2, 3 또는 4의 캡시드 단백질을 단독으로, 혼합하여 또는 이들 중에서 조 합하여 포함함을 특징으로 하는 약학적 제제. 청구항 3 제1항에 있어서, 체액성 및/또는 세포성 반응을 유도할 수 있는 항원과 혼합하거나 조합한 캡시드 단백질을 포 함함을 특징으로 하는 약학적 제제. 청구항 4 제1항 또는 제3항에 있어서, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22 및 서열 번호 23과 같은 서열 목록과 동일한 하나 또는 여러 단백질과 혼합된 캡시드 단백질을 포함함을 특징으로 하는 약학적 제제. 청구항 5 제1항 또는 제3항에 있어서, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19 및 서열 번호 20과 같은 서열 목록과 동일한 하나 또는 여러 단백질과 화학적으로 EH는 유전적으로 융합된 캡시드 단백질을 포함함을 특징으로 하는 약학적 제제. 청구항 6 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 응집 형태 또는 미립자 형태의 캡시드 단백질을 포함함을 특징으로 하는 약학적 제제. 청구항 7 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 용인가능한 부형제 및 유성 또는 비-유성 아쥬반트를 포 함함을 특징으로 하는 약학적 제제. 청구항 8 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 경구, 근육내, 피하, 점막 또는 정맥내 사용을 위한 댕기열 바이러 스에 대한 예방제 또는 치료제임을 특징으로 하는 약학적 제제. 명 세 서 <1> 기 술 분 야 본 발명은 생명공학 및 약학 산업 분야, 특히 현재 DEN으로 인용되는 댕기열 바이러스의 감염에 대한 면역 반응 을 유도할 수 있는 단백질의 수득에 관한 것으로, 이 바이러스에 재-감염된 사람에게 나타나는 항체-의존 강화 현상을 예방한다. <2> <3> 배 경 기 술 댕기열(Dengue fever; DF) 및 댕기 출혈열(dengue hemorrhagic fever; DHF)은 지구의 열대 및 아열대 지역의 여러 나라에 영향을 미치는, 매 시간 건강 문제로서 더 많은 중요성을 획득한다. 댕기열 바이러스는 100여개 이 상의 국가에서 발견되며 위험 지역에 사는 25억만명의 사람들이 발병한다. DF로부터의 5천 및 1억 사이의 경우 및 DHF의 25만 내지 50만 경우가 매해 보고되었다(Guzman M.G. and Kouri G Dengue: an undate. Lancet Infect. Dis. 2:33-42). 이러한 질병의 원인균은 이집트숲모기(Aedes aegypti)에 의해 전파되는 플라비바이러스 속, 플라비바이리대 - 3 -

4 (Flaviviridae) 과의 댕기열 바이러스이다(Leyssen P., De Clerco E., Neyts J Perspectives for the treatment of infections with Flaviviridae. Clin. Microbiol. Rev. 13:67-82). <4> <5> <6> <7> <8> <9> <10> 현재까지 4개의 혈청형이 동일한 영역에서 유포될 수 있음이 보고되었다. 댕기열 바이러스는 게놈이 오직 하나 의 리딩 프레임을 포함하는 RNA 양성 코팅 바이러스이다. 이 RNA는 3개의 구조 단백질 및 7개의 비-구조 단백질 에서 구성되는 폴리프로테인으로 변역된다(Ressell P.K., Brandt W.E., Dalrymple J.M Chemical and antigenic structure of flaviviruses. The togaviruses: biology, strucre, replication. Schelesinger R.W.(ed.) ). 다중 유전병학적 연구는 댕기열 질환의 가장 심한 형태를 일으키는 위험 인자를 결정하기 위한 것이다. 이는 고 열, 액체의 배출, 출혈 및 최종적으로 댕기열 쇼크에 의해 특징지어진다(Gubler D.J Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. Clin. Microbiol. Rev. 11: ). 가장 중요한 위험 인자 중 하나는 이질성 혈청형에 의한 이차 감염이다. 다른 혈청형의 감염 중 교차-보호(cross protection)는 존재하지 않는다(Kouri G., Guzman M.G., Bravo J., Trina C Dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome: lessons from the Cuban epidemic. WHO Bulletin OMS. 67: ). 여러 가설들이 이러한 현상을 설명하기 위해 존재한다. 가장 중요한 것 중 하나는 항체 의존 증가이다(Halstead S.B., Scanlon J.E., Umpaivit P., Udomsakdi S Dengue and Chikungunya virus infection in man in Thailand, IV. Epidemiologic stydies in the Bangkok metropolitan area. Am. J. Trop. Med. Hyg. 18: ). 일차 연구로부터, DEN 바이러스가 이미 바이러스에 감염된 환자의 혈액으로부터의 말초 단핵세포에서 더 높은 수치로 복제되었음이 보고되었다(Halstead S.B., O'Rourke E.J., Allison A.C Dengue viruses and mononuclear phagocytes. II. Identity of blood and tissue leukocytes supporting in vitro infection. J. Exp. Med. 146: ). 나중에, 잔여 항체가 이러한 효과에 반응함이 증명되었다(Morens DM, Halstead SB, Marchette NJ Profiles of antibody-dependent enhancement of dengue virus type 2 infection. Microb Pathog. Oct;3(4):231-7). 중화가 없는 항체의 특이성 또는 농축 조건에서, 항체-바이러스 복합체를 단핵구 및 대식세포와 같은 막에 Fcγ 수용체를 갖는 세포에 의해 내면화할 수 있다. 항체-의존 증가(antibodies-dependent enhancement; ADE)로서 알려진 이러한 메카니즘은 이차 감염 동안 발생한다(Morens DM, Halstead SB, Marchette NJ Profiles of antibody-dependent enhancement of dengue virus type 2 infection. Microb Pathog. Oct;3(4):231-7; Kliks S.C., Nimmannitya S., Nisalak A., Burke D.S Evidence that maternal dengue antibodies are important in the development of dengue hemorrhagic fever in infants. Am. J. Trop. Med. Hyg. 38: ). 태국 방콕에서의 3년간의 연구에 의한 (Halstead S.B., Scanlon J.E., Umpaivit P., Udomsakdi S Dengue and Chikungunya virus infection in man in Thailand, IV. Epidemiologic studies in the Bangkok metropolitan area. Am. J. Trop. Med. Hyg. 18: )Halstead 등의 문헌은 아동 중에서 DEN 감 염에 의한 입원 지침이 최대 7 및 8달 사이에 이름을 보고하였다. 이러한 지침은 1-3달된 유아에서 관찰된 것의 4-8배이고 3살된 유아에서 관찰된 것의 2배이다. Kliks 등의 문헌(Kliks S.C., Nimmannitya S., Nisalak A., Burke D.S Evidence that maternal dengue antibodies are important in the development of dengue hemorrhagic fever in infants. Am. J. Trop. Med. Hyg. 38: )에서 DEN-2에 대한 항체를 모계 중화 항 체 역가 및 동질성 바이러스의 감염에 의해 발생되는 FHD를 갖는 13명 아동의 나이 사이의 상관관계를 측정하였 다. 이 결과는 모계 항체 수준이 아-중화(subneutralizing) 수준으로 감소되었을 때 마이러스를 갖는 심한 경우 의 감염이 발생함을 보여준다. 이러한 데이타는 모계 항체가 우선 보호하고 나중에 DHF 발생을 촉진하는 이중 역할을 수행한다는 가설과 일치한다. 이러한 면역학적 현상에도 불과하고, 현재 세계적으로 가장 개선된 백신 후보들은 외피 단백질(envelope protein)을 포함하는 다른 4개의 혈청형의 약화된 바이러스에 기초한다. 이러한 후보들은 노출된 단백질(PrM/M 및 외피)에 대한 항원의 잠재적 증폭 및 인간 자원자의 4개의 바이러스성 혈청형에 대한 항체를 중화시키는 보 호제를 유도할 수 있다(Kanesa-thasan N., Sun W., Kim-Ahn G., Van Albert S., Putnak J.R., King A., Raengsakulsrach B., Christ-Schmidt H., Gilson K., Zahradnik J.M., Vaughn D.W., Innis B.L., Saluzzo J.F. y Hoke C.H Safety and immunogenicity of attenuated dengue virus vaccines (Aventis Pasteur) in human volunteers. Vaccine. 19: )

5 <11> <12> <13> <14> <15> <16> 면역화 후 중화 항체의 높은 수준은 증강 항체의 도입에도 불구하고 바이러스 복제를 예방할 수 있다. 중화 항 체에 의한 백신에서의 4개 혈청형으로의 총 혈청변환(seroconversion)이 이뤄지지 않았거나 낮은 혈중 농도로 감소되었을 때 문제가 발행할 수 있으며 개인은 보호 항원이 존재하지 않는 바이러스성 혈청형의 심한 이차감염 에 감염되기 쉽게 될 것이다. 사실, 원숭이 및 인간에서의 여러 실험은 백신 제형에서 바이러스 양을 정의하기 위한 것이다(Guirakhoo F., Arroyo J., Pugachev K.V., Miller C., Zhang Z.-X., Weltzin R., Georgakopoulos K., Catalan J., Ocran S., Soike K., Raterree M., Monath T.P Construction, safety, and immunogenicity in nonhuman primates of a chimeric yellow fever-dengue virus tetravalent vaccine. J. Virol. 75: ). 몇몇 경우에서, 혈청변환의 균형은 4개 혈청형으로 수득되지 않는다(Sabchareon A, Lang J, Chanthavanich P, Yoksan S, Forrat R, Attanath P, Sirivichayakul C, Pengsaa K, Pojjaroen-Anant C, Chokejindachai W, Jagsudee A, Saluzzo JF, Bhamarapravati N Safety and immunogenicity of tetravalent liveattenuated dengue vaccines in Thai adult volunteers: role of serotype concentration, ratio, and multiple doses. Am J Trop Med Hyg. 66(3): ). 게다가, 중화 항체에 의한 총 혈청변환을 위해 아동에게 3개까지의 투여량의 약화된 백신을 투여하는 것이 필수적이며 이것이 얼마동안 지속되는지는 아직 알려지지 않 았다(Sabchareon A, Lang J, Chanthavanich P, Yoksan S, Forrat R, Attanath P, Sirivichayakul C, Pengsaa K, Pojjaroen-Anant C, Chambonneau L, Saluzzo JF, Bhamarapravati N Safety and immunogenicity of a three dose regimen of two tetravalent live-attenuated dengue vaccines in five- to twelve-year-old Thai children. Pediatr Infect Dis J.;23(2):99-109). 이는 댕기열 바이러스의 외피 단백질을 포함하는 백신 제형에서의 가장 의심가는 관심사며 그 다음은 개선된 백신 후보들이다. 일반적으로 상 I/II에서 약화된 백신의 다른 결점은 안전성이다. 일차 투여에 따라 열, 근육통, 점상출혈 및 두 통과 같은 성인 및 아동의 부작용의 존재는 여러 연구에서 증명되었다(Sabchareon A, Lang J, Chanthavanich P, Yoksan S, Forrat R, Attanath P, Sirivichayakul C, Pengsaa K, Pojjaroen-Anant C, Chambonneau L, Saluzzo JF, Bhamarapravati N Safety and immunogenicity of a three dose regimen of two tetravalent live-attenuated dengue vaccines in five- to twelve-year-old Thai children. Pediatr Infect Dis J.;23(2):99-109). 일반적으로 생 백신에 잠재적으로 관련된 독성으로의 전환 현상이 존재할 수 있다. 새로운 대안의 탐색에서, 재조합 방식을 통해 수득된 외피 단백질 또는 이의 단편에 기초한 백신 후보의 다른 변형체를 개발하였다. 이러한 재조합체 후보는 생 바이러스의 접종에 관련된 안전성 문제를 예방하며, 혈청형의 균형잡힌 반응이 유도되지 않을 겨우 개인을 감작시킬 수 있다(Velzing J, Groen J, Drouet MT, van Amerongen G, Copra C, Osterhaus AD, Deubel V Induction of protective immunity against Dengue virus type 2: comparison of candidate live attenuated and recombinant vaccines. Vaccine. Mar 17;17(11-12): ). 다른 한편으로는, 이러한 후보들은 적합한 혈청형-특이 (Velzing J, Groen J, Drouet MT, van Amerongen G, Copra C, Osterhaus AD, Deubel V Induction of protective immunity against Dengue virus type 2: comparison of candidate live attenuated and recombinant vaccines. Vaccine. Mar 17;17(11-12): ). 다른 한편으로는 이러한 후보들은 적절한 혈청형-특이 보호 면역 반응을 자극하기 위해 인간에서는 아직 사용이 허용되지 않은 효과적인 아쥬반트를 요구한다(Hermida L, Rodriguez R, Lazo L, Silva R, Zulueta A, Chinea G, Lopez C, Guzman MG, Guillen G A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice. J Virol Methods Jan;115(1):41-9). 중화 항체의 체액성 반응은 동물에서 대규모로 연구되었으며 이의 보호 효과가 증명되었다. 댕기열의 보호제 메 카니즘으로서 세포독성 세포성 면역 반응이 자세히 조사되었다. 이에 반하여, 세포성 반응의 유도 및 질환의 가 장 중한 형태 사이의 상호관계가 조사된 여러 문헌이 있다(Rothman A.L. y Ennis F.A Immunopathogenesis of Dengue Hemorragic Fever. Virology. 257: 1-6). 이러한 연구는 DHF를 나타내는 개인들 에서 활성화된 T-세포의 높은 수준을 나타내는 것을 기초로 한다(Green S, Pichyangkul S, Vaughn DW, Kalayanarooj S, Nimmannitya S, Nisalak A, Kurane I, Rothman AL, Ennis FA Early CD69 expression on peripheral blood lymphocytes from children with dengue hemorrhagic fever. J Infect Dis. 180(5): ). T-세포 에피토프는 비구조 단백질로 주로 보고되었으나(Kurane I, Zeng L, Brinton MA, Ennis FA Definition of an epitope on NS3 recognized by human CD4+ cytotoxic T lymphocyte clones cross-reactive for dengue virus types 2, 3, and 4. Virology Jan 20; 240(2):169-74), 또한 외피 단백질 및 캡시드 - 5 -

6 단백질로서도 존재한다(Bukowski, J. F., I. Kurane, C.-J. Lai, M. Bray, B. Falgout, and F. A. Ennis Dengue virus-specific cross-reactive CD8 human cytotoxic T lymphocytes. J. Virol. 63: ; Gagnon S.J., Zeng W., Kurane I., Ennis F.A Identification of two epitopes on the dengue 4 virus capsid protein recognized by a serotype-specific and a panel of serotype-cross-reactive human CD4+ cytotoxic T-lymphocyte clones. J Virol. 70: ). 그럼에도 불구하고, 세포성 면역 반응의 도입에만 기 초한 이러한 단백질의 일부의 보호적 특성이 증명되지 않았다. <17> <18> <19> <20> 면역증강 환경을 예방는 백신 후보의 탐색에서, 비-구조 단백질 NS1 및 NS3을 사용한 연구가 수행되었다. NS1의 경우, 재조합체 단백질로 면역화된 마우스에서의 일부 수준의 보호가 이루어졌다. 유사한 결과는 ADCC 메카니즘 을 통해 NS1 유전자를 함유하는 나출 DNA를 사용하여 얻어졌다(Wu SF, Liao CL, Lin YL, Yeh CT, Chen LK, Huang YF, Chou HY, Huang JL, Shaio MF, Sytwu HK Evaluation of protective efficacy and immune mechanisms of using a non-structural protein NS1 in DNA vaccine against dengue 2 virus in mice. Vaccine. Sep 8;21(25-26): ). 그럼에도 불구하고, 인간 내피 세포를 인지하는 항체의 유도에 기인한 자 가면역 현상에서의 이들의 가능한 목록의 조사가 존재한다(Chiou-Feng Lin, Huan-Yao Lei, Ai-Li Shiau, Hsiao-Sheng Liu, Trai-Ming Yeh, Shun-Hua Chen, Ching-Chuan Liu, Shu-Chen Chiu, and Yee-Shin Lin Endothelial Cell Apoptosis Induced by Antibodies against Dengue Virus nonstructural Protein 1 via Production of Nitric Oxide. J. Immunol ). 게다가, NS3을 포함하는 나출 DNA를 사용하는 보호가 보 고되었다; 그러나, 수동 면역화를 사용한 동일한 보호가 얻어졌기 때문에 증가된 항체에 의해 이러한 보호가 매 개됨이 증명되었다(Tan CH, Yap EH, Singh M, Deubel V, Chan YC Passive protection studies in mice with monoclonal antibodies directed against the non-structural protein NS3 of dengue 1 virus. J Gen Virol Mar;71 ( Pt 3):745-9). 게다가, 세포성 반응이 NS3 단백질 에피토프의 연구를 기초로 하는 이질 성 바이러스의 감염에 직면하여 잠재적으로 해로울 수 있다는 가설이 필요없다(Zivny J, DeFronzo M, Jarry W, Jameson J, Cruz J, Ennis FA, Rothman AL Partial agonist effect influences the CTL response to a heterologous dengue virusserotype. J Immunol. Sep1; 163(5): ). 댕기열 바이러스의 캡시드 단백질의 경우, 치사의 댕기열 바이러스로 항원감염시 보호의 증거는 보고되지 않았 다.관련된 플라비바이러스에 관하여, 일본 뇌염(Japanese Encephalitis; JE) 캡티드 단백질의 유전자를 포함하 는 나출 DNA 제형으로 마우스를 접종시켰다는 보고서가 공지되었다. 이러한 제형은 세포독성 반응의 증명에도 불구하고, 마우스에서 치사의 JE로의 항원접종에 대한 보호 반응을 유도하지 않는다(Konishi E, Ajiro N, Nukuzuma C, Mason PW, Kurane I Comparison of protective efficacies of plasmid DNAs encoding Japanese encephalitis virus proteins that induce neutralizing antibody or cytotoxic T lymphocytes in mice. Vaccine. Sep 8;21(25-26): ). 재조합 단백질 캡시드를 사용한 보호는 인간 파필로마 바이러스의 경우에서만 증명되었다. 그러나, C형 간염 바 이러스와 같은 다른 바이러스를 갖는 이의 보호 역할이 제시되었다. 그럼에도 불구하고, 모든 경우에서, 이들은 세포성 세포독성 반응이 바이러스 감염을 제거하기 위한 면역계의 단지 한 수단인 만성 감염 또한 종양이다 (Duenas-Carrera S, Alvarez-Lajonchere L, Alvarez-Obregon JC, Herrera A, Lorenzo LJ, Pichardo D, Morales J A truncated variant of the hepatitis C virus core induces a slow but potent immune response in mice following DNA immunization. Vaccine. Nov 22;19(7-8):992-7; Suzich JA, Ghin SJ, Palmer-Hill FJ, et al Systemic immunization with papillomavirus L1 protein completely prevents the development of viral mucosal papillomas. Proc Natl Acad Sci USA; 92: ). 이러한 질환은 인간 에서 댕기열에 의한 감염에서 나타나는 급성 프로필에 해당되지 않는다(Vaughn D.W., Green S., Kalayanarooj S., Innis B.L., Nimmannitya S., Suntayakorn S., Endy T.P., Raengsakulrach B., Rothman A.L., Ennis F.A. y Nisalak A Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. J Infect Dis.181: 2-9). 댕기열 바이러스의 캡시드 단백질은 9 내지 12kDa( 아미노산)의 분자량을 가지며 이의 아미노산의 25%가 아르기닌 및 리신이므로 표시된 염기성을 갖는다. 이러한 아미노산의 존재는 그렇게 하기 위한 다양이온성 펩티 드의 능력에 기인한 면역계로의 항원 제공을 촉진한다(Lingnau K., Egyed A., Schellack C., Mattner F, Buschle M., Schmidt W Poly-l -arginine synergizes with oligodeoxynucleotides containing CpGmotifs (CpG-ODN) for enhanced and prolonged immune responses and prevents the CpG-ODN-induced systemic release of pro-inflammatory cytokines. Vaccine. 20: ). 단백질은 노출된 부분 없이 비리온 (virion) 구조 내에 모두 위치한다(Kuhn RJ, Zhang W, Rossmann MG, Pletnev SV, Corver J, Lenches E, Jones - 6 -

7 CT, Mukhopadhyay S, Chipman PR, Strauss EG, Baker TS, Strauss JH Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. Mar 8;108(5):717-25). <21> <22> <23> Jones 등의 문헌(Christopher T. Jones, Lixin Ma, John W. Burgner, Teresa D. Groesch, Carol B. Post, and Richard J. Kuhn Flavivirus Capsid Is a Dimeric Alpha-Helical Protein. Journal of Virology, p , Vol.77, No.12)에서 E.coli(Escherichia coli)에서 재조합 방식에 의해 수득된 VD2의 캡시드 단백 질을 정제하고 이러한 단백질은 핵산 없이 용액에서 디머(dimmer)와 같이 작용한다. 이의 이차 구조는 주로 알 파-헬릭스의 형태이며 C-말단에서 더 긴 길이의 것 중 하나인, 이러한 헬릭스 중 4개로 구성된다. N-말단은 정 의된 구조가 존재하지 않으며 이의 결실은 단백질의 구조 보존에 영향을 미치지 않는다. E.coli에서 재조합 방식으로 40%의 순도만으로 수득된 DEN-2 바이러스의 캡시드는 마우스에서 치사의 DEN-2 바 이러스로의 항원투여에 대한 보호적 면역반응을 유도할 수 있음을 본 발명에서 처음으로 기재하였다. 보호 능력 을 계속 유지하는 이러한 고순도 단백질이 분자의 미립자 형태로 마우스를 면역화시키는 것에 더 뛰어남이 증명 되었다. 게다가, 이루어진 보호가 C지금까지 캡시드에 대한 보고된 T-세포가 CD4+ T-세포에 의해 인지된다는 것 을 고려한 새로운 요소인 D8+ T-세포에 의해 매개됨이 증명되었다(Gagnon SJ, Zeng W, Kurane I, Ennis FA Identification of two epitopes on the dengue 4 virus capsid protein recognized by a serotypespecific and a panel of serotype-cross-reactive human CD4+ cytotoxic T-lymphocyte clones. J Virol. 70(1): 141-7; Simmons CP, Dong T, Chau NV, Dung NT, Chau TN, Thao le TT, Dung NT, Hien TT, Rowland- Jones S, Farrar J Early T-cell responses to dengue virus epitopes in Vietnamese adults with secondary dengue virus infections. J Virol. 79(9): ). 게다가, 이러한 재조합체 분자를 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 P64K 단백질 및 댕기열-2 바이러스의 외피 단백질의 III 도메인에 의 해 형성된 PD5 단백질과 혼합되었다. 이러한 융합 단백질은 항체 의존 증가의 현상을 생성하는 낮은 가능성을 갖는 높은 혈청형 특이적이고, 보호적이고 중화적인 면역 반응을 생성할 수 있다(Hermida L, Rodriguez R, Lazo L, Silva R, Zulueta A, Chinea G, Lopez C, Guzman MG, Guillen G A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice. J Virol Methods Jan;115(1):41-9). 캡시드 단백질 및 외피 단백질의 III 도메인의 융합에 의해 형성된 유전자 구성의 수득은 또한 같은 목적을 이 루기 위해 기술되었다. 결과로서, 캡시드가 DEN-2의 III 도메인과 결합된 두 제형이 캡시드 단독에 의해 생성된 것보다 더 높은 림프세포증식성 반응을 마우스에서 생성시키며 또한 PD5 단독에 의해 생성된 것보다 더 높은 혈 청형 특이 항체 반응을 나타낸다. 후자 결과는 이질성 항원에 의한 Abs의 생성에서 댕기열 바이러스의 캡시드 단백질의 면역증강 능력, B형 간염 바이러스와 같은 기타 바이러스로부터의 다른 재조합 캡시드에 대해 기술된 현상을 증명한다(Alvarez JC, Guillen G. Formulations containing virus like particles as immunoenhancers by mucosal route. Cuban office of the Industrial property. CU 1998/183). <24> <25> <26> 발명의 상세한 설명 본 발명의 목적은 마우스에 접종되었을 때 치사 바이러스의 감염에 대한 보호 반응을 생성하는, 댕기열 바이러 스의 캡시드 단백질에 상응하는 재조합 단백질을 수득하는 것이다. 댕기열 바이러스의 캡시드 단백질을 코드하는 유전자는 파지 T5 프로모터를 포함하는 플라스미드 내로 삽입된다. 재조합 플라스미드로 형질전환된 세포 XL-1블루가 높은 수준의 결과적으로 생성된 단백질을 발현한다. 이 단백질은 약 40%의 순도가 될 때까지 정제되었으며 Balb/c 마우스에 접종될 수산화알루미늄으로 보조화되었 다. 마지막 투여한 달에 항바이러스성 항체 반응이 관찰되었다. 동시에 댕기열 바이러스로 생체외 자극된 비장 에서 림프세포증식성 반응이 검출되었다. 결과로서 상당한 림프세포증식성 반응이 검출되는 동안에는 항바이러 스성 항체가 유도되지 않는다. 동시에, 출혈하지 않은 마우스에서 보호 검정을 실행하였다. 댕기열 바이러스의 100LD 50 에 상응하는 치사량을 접종하였으며 질환 증상 및 사망이 21일 동안 발견되었다. 결과로서 생존-면역화 마우스의 44%가 발견되었으나 음성 대조군에서는 모든 마우스가 사망하였다. 이는 캡시드 단백질로만 면역화됨 에 의한 댕기열 바이러스에 대한 보호 반응의 첫 증거이다. <27> <28> 나중에, 고-분해 정제 과정이 수행되어 95% 순도의 재조합 단백질을 수득하였다. 반정제 및 정제된 두 제제를 각 시료에서 단백질의 응집 상테를 알기 위해 HPLC로 분석하였다. 반정제 제제에서 - 7 -

8 적은 유지시간을 갖는 검출 분획을 갖는 반면, 정제된 시료에서는 분자의 이량체 형태에 상응하는 유지 시간이 검출되었다. <29> <30> <31> <32> <33> <34> <35> 정제된 변이체에서 응집 상태를 수득하기 위해, 적은량의 올리고누클레오티드를 사용한 생체외 미립화 과정이 실시되었다. 과정의 결과로서, 21nm 지름의 입자를 수득하였다. 이량체 및 미립화 제제 둘다 95% 이상의 순도를 가지며, 마우스에 접종하였다. 이량체 제제를 프로인트 아쥬반 트 및 수산화알루미늄으로 보조화하였으며, 미립화 변이체는 수산화알루미늄으로만 보조화하였다. 반정제된 제제와 유사하게, 고수준의 림프세포증식이 검출되었다. 보호 검정에서, 각각 프로인트 아쥬반트 및 알루미늄으로 보조화된 이량체 제제에서 40% 및 20%의 생존율을 나타낸다; 그러나 알루미늄으로 보조화된 미립 화된 단백질은 높은 보호율을 나타내었다. 반정제된 단백질에서 얻어진 결과와 함께 이러한 결과들은 Balb/c 마우스에서 보호 반응을 유도하는 캡시드 단 백질의 능력을 나타내며 아쥬반트로서 수산화알루미늄과 함께 인간에게 사용될 수 있는, 단백질의 미립화 형태 의 우수성을 증명한다. 추가로, 항바이러스성 반응을 유도하지 않는 것은 가장 심한 형태의 질환(댕기출혈열)의 발생에 대한 위험 인자로서 항체 의존 증가의 현상을 제거한다. 이의 증명된 결여에 의한 항체의 도입에 관련되지 않은 보호의 가능한 메카니즘을 결정하기 위한 목적으로, CD8+ 세포 고갈의 연구를 실시하였다. 결과로서, 각 변이체의 순수 단백질로 이루어진 보호는 이러한 마커가 존 재하는 세포의 존재에 의한 것인데, 이는 이들이 제거하면 유도된 보호 효과가 사라지기 때문이다. 유사하게, 체액성 반응을 유도하는 항원을 갖는 미립화된 재조합 캡시드의 조합은 림프세포증식성 반응의 생성 에 영향을 미치지 않을 경우를 알기 위해 연구를 진행하고, 면역 반응의 두 배치를 구성할 수 있는 면역원의 혼 합물을 계수하기 위해 연구를 진행하였다. 마지막으로, 캡시드 및 댕기열-2 바이러스의 외피 단백질의 III 도메 인을 포함하는 융합 단백질의 정제된 미립화 변이체를 마우스에 접종하여 ADE의 현상을 감소시키는 혈청형-특이 면역 반응을 생성할 수 있다(Hermida L, Rodriguez R, Lazo L, Silva R, Zulueta A, Chinea G, Lopez C, Guzman MG, Guillen G A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional response against the virus in mice. J Virol Methods Jan;115(1):41-9). 세 투여량을 투여하고 증가된 항체를 분석할 때, 항바이러스성 혈청형 특이 항체의 높은 유도가 증명되었다. 마찬가지로, 캡시드만에 의해 유도된 것보다 높고 융합 단백질에 의해 유도된 것보다 상당히 높은 림프세포증식성 반응이 검출되었다. 동시에, 두 항원의 유전적 융합을 사용한 조합 효과를 얻는 것이 가능한지를 알기 위해 캡시드 단백질 유전자의 N-말단과 융합된 DEN-2 바이러스의 외피 단백질의 III 도메인을 포함하는 플라스미드를 구성하였다. 40% 순도를 갖는, Balb/c 마우스에서 생성된 결과 단백질은 캡시드 단독에 의해 유도된 것 보다 더 높은 림프세포증식성 반 응을 나타내며 PD5에 의해 유도된 것 보다 더 높은 혈청형 특이 항체 반응을 나타낸다. <48> <49> <50> <51> 실 시 예 실시예 1. PDC-2의 클로닝 및 발현. DEN-2 바이러스로부터의 캡시드 단백질의 아미노산 1-99를 코드하는 누클레오티드 서열(서열 번호 3)을 DEN-2 바이러스 균주 자메이카(Dengue virus type 2 Jamaica/N.1409; NCBI 기탁 번호 제M20558호)로부터의 서열 번호 1 및 서열 번호 2와 같은 서열 목록에서 확인된 올리고누클레오티드로 증폭시켰다(Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology : ). 벡터를 BamHI/HindIII를 갖는 플라스미드 pqe-30을 절단하여 생성하였으며, 이 플라스미드는 N-말단 영역에서 파지 T5 프로모터 및 6-히드톤 테일(tail)을 포함한다(서열 번호 6). 연결됨에 따라, 잠재적 재조합체를 제한효 소 절단으로 분석하고 양성 클론을 결합점을 찾기 위해 서열결정하였다. 콤피덴트 세포(competent cell) XL-1 블루(Hanahan D Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: )를 pdc-2로 명명된 선별 클론으로 형질전환시켰다(도 1 및 서열 번 호 4). 형질전환된 E.coli 균주를 37 에서 10시간 동안 50μg/mL의 암피실린을 보충한 루리아 베르타니(LB) 배 지에 배양하였다. 이소프로필-B-D-티오칼락토피라노시드(IPTG)를 1mM의 최종 농도가 되도록 사용하여 프로모터 - 8 -

9 를 유도하였다. 콜로니의 성장에 따라, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 실행하였다. 결과로서, 15kDA 밴드가 수득되 었다. 단백질은 항-DEN-2 고도면역 복수액(HMAF; hyperimmune ascitic fluid )에 의해 인지된다. 이러한 단백 질은 PDC-2로 명명되었다(서열 번호 5) <52> <53> <54> <55> 실시예 2. PDC-2의 반정제 및 특성화. pdc-2로 형질전환되고 37 에서 성장된 E.coli로부터 수득된 바이로매스를 프렌치 프레스(French press)로 파열 시켰디. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 분획 사이에서 동일하게 파열시켜 수득하였다. 가용성 분획을 Q 세 파로스 FF 컬럼 및 ph 8의 10mM 트리스 완충용액을 사용하여 음이온 상호교환 크로마토그래피하였다. 비-흡수 분획에서의 단백질을 40%의 순도로 수득하였으며 면역학적 연구에 사용하였다(도 2). 실시예 3. 반정제된 PDC-2의 면역학적 평가. 30마리의 Balb/c 마우스의 세 그룹을 사용하였다. 이들 중 둘은 그룹 중 하나에는 프라운트 아쥬반트(FA)를 사 용하고 다른 하나에는 수산화알루미늄을 사용하여 복강내 경로로 10ug의 재조합 단백질로 면역화시켰다. pqe- 30-형질전환 세포의 파열로부터 생성된 가용성 분획을 FA로 보조하는 음성 대조로서 사용하였다; 10마리 동물을 세 번째 투여 후 15일에 채혈하고 DEN-2에 대한 항체 역가를 ELISA로 측정하였다. 상기 아쥬반트 중 하나로 제 형화된 재조합 단백질로 면역화한 후, 항체 역가가 나타나지 않았다. 표 1 <56> 반정제된 PDC-2로 마우스를 면역화시킴에 의해 수득된 혈청으로부터의 DEN-2에 대한 항체 역가 마우스 DEN-2에 대한 ELISA 역가 PDC-2 FA. PDC-2 수산화알루미늄 XL-1 블루 프라운트 (음성 대조) 1 < 1: 100 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 < 1: 100 <57> <58> 실시예 4. 보호 검정. 기재된 변이체로 면역화됨에 의해 동질성 치사 DEN 바이러스로의 항원투여에 대하여 마우스에 주어진 보호의 평 가에서, 10 마리의 마우스를 수산화알루미늄에 흡수된 재조합 단백질 및 대조 제제로 면역화된 각 그룹으로 사 용하였다. 두개내 접종에 의한 치사 DEN-2 바이러스의 100 LD 50 의 투여량이 투여된 각 동물에서 21일간 바이러스 뇌염에 의한 죽음에 의한 치사율을 나타내었다. 양성 대조로서, 10 마리의 마우스를 감염성 DEN-2 바이러스(10 4 pfu)로 면역화하여 사용하였다. 양성 대조군의 모든 마우스가 생존하였으나, 음성 대조군에서는 모든 마우스가 항원투여 후 7-11일에 아프기 시작하여 21일에는 100% 사망하였다. 최종적으로, 재조합 단백질 PDC-2로 면역화 한 그룹은 44.4%의 보호를 나타낸다(표 2) 표 2 <59> 동질성 치사 댕기열 바이러스로 항원투여함에 의한 PDC-2 면역화 마우스에서의 생존율 면역원 생존율 XL-1 블루 0 DEN PDC-2 알루미늄 44,4-9 -

10 <60> <61> <62> * 다음과 같이 계산되었다: (생존개체수)/(마우스 중 총 생존수). 생존개체의 데이타는 항원투여 후 21일에 얻 어진 것이다. 실시예 5. 림프세포증식성 반응 수산화알루미늄으로 보조화된 캡시드 단백질로 면역화된 그룹에서 남아있는 동물들을 마지막 투여 후 30일에 희 생시켰다. 그런 다음, 동물의 비장을 추출하여 DEN-2에 대한 림프세포증식성 반응을 연구하였다. 표 3의 결과는 수득된 자극 인덱스를 나타낸다. 표 3 <63> 면역화된 마우스로부터 림프구의 동질성 혈청형에 대한 자극 인덱스 PDC-2 수산화알루미늄 DEN-2** 8* 대조 항원*** 1.5 PHA**** 7 <64> <65> <66> <67> <68> <69> <70> <71> <72> <73> <74> <75> * 자극 인덱스: ADN 자발 합성 대조의 계수/분 사이의 시료의 대조/분의 지수 평균. ** DEN-2 감염된 마우스 뇌의 제제 *** 감염되지 않은 마우스 뇌의 제제 **** 피토헤마글루티니아 미토젠(양성 대조) 실시예 6. PDC-2의 정제 pdc-2로 형질전환되고 37 에서 성장된 E.coli로부터 수득된 바이로매스를 프렌치 프레스로 파열시켰디. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 분획 사이에서 동일하게 파열시켜 수득하였다. 가용성 분획을 Q 세파로스 FF 컬럼 및 완충용액 ph 8의 10mM 트리스, 트윈 0.5%, ph 8의 7M 요소(urea)fmf 사용하여 양이온 상호교환 크로마토그래 피하였다. 컬럼을 완충용액 30mM 디에탄올아민, 350mM NaCl, ph 10.3으로 세척하였다. 대상 단백질의 용출물을 완충용액 30mM 디에탄올아민, 750mM NaCl, ph 10.3으로 세척하였다. 최종적으로, 완충용액 트리스 10mM, EDTA 1mM에서 96%의 순도로 단백질을 수득하였다(도 3). 실시예 7. 반정제 및 정제된 변이체의 특성화 반정제 및 정제된 제제의 응집 상태를 특성화하기 위한 목적으로, 겔 여과 크로마토그래피를 TSK-5000 컬럼 (Tosoh bioscience, Japan)을 사용하여 실시하였다. 반정제 시료를 적용시킨 후, 15 내지 20분 범위의 체류시간 을 갖는 상동성 및 주요 피크를 수득하였으며 이는 높은 분자량의 종이 존재함을 증명하는 것이다(도 4의 A). 이에 반하여, 캡시드 단백질의 상당히 정제된 분획으로부터의 시료에서 30분의 체류시간이 관찰되었으며 이는 이량체 형태의 분자에 상응하는 것이다(도 4의 B). 실시예 8. "생체외" 재미립화(reparticulation)의 연구. 이량체 형태의 순수한 캡시드 단백질을 재미립화하기 위해, 완충용액을 헤페스(Hepes) 25mM, KAc 100mM, MgAc2 1.7mM, ph 7.4로 교환하였다. 37 에서 1분간 올리고누클레오티드의 혼합물 및 단백질을 가열한 후, 단백질을 올리고누클레오티드 없이 항온하였다. 두 제제를 전자현미경으로 관찰하고, 대략 21nm 지름의 대량의 입자가 올 리고누클레오티드의 혼합물과 함께 미리 항온한 단백질의 시료에서 발견되었으나 대조 시료에서는 입자가 발견 되지 않았다(도 5). 실시예 9. 정제된 캡시드의 마우스에서의 면역학적 평가. 20마리 Balb/c 마우스의 5그룹을 사용하였다. 이들 중 둘은 수산화알루미늄 및 프로인트 아쥬반트를 사용하여 복강내 경로를 통해 이량체 정제 재조합 단백질 10ug으로 면역화시켰다. 다른 그룹은 수산화알루미늄으로 보조 화된 정제되고 미립화된 캡시드 단백질 10ug으로 면역화시켰다. 플라스미드 pqe-30으로 형질전환되고 PDC-2보다

11 동일한 정제 단계를 거친 XL-1 블루 세포의 파열로부터의 가용성 분획을 프로인트 아쥬반트로 보조화하여 음성 대조로서 사용하였다. 다섯번째 그룹은 양성 대조로서 DEN-2 바이러스로 면역화시켰다. 마지막 투여 후 1달에 각 그룹에서 10마리 동물에게 두개내 접종에 의해 치사 DEN-2의 100LD 50 의 투여량을 투여하였으며 21일에 생존율 을 수득하기 위해 관찰하였다. 양성 대조군에서의 모든 마우스는 생존하였으나 음성 대조군에서의 모든 마우스 는 항원투여 후 7-11일에 아프기 시작해 0%의 사망률을 보였다. 마지막으로, 재조합 단백질로 면역화된 그룹들 에서, 순수한 이량체 PDC-2로 면역화시킨 그룹은 수산화알루미늄을 사용하였을 때 20%의 보호를 나타내며 프로 인트 아쥬반트를 사용했을 때 40%의 보호를 나타낸다. 추가로, 수산화알루미늄으로 보조화된 재미립자화된 순수 한 단백질을 투여한 그룹은 마우스의 90%가 보호되었다(표 4). 표 4 <76> 동질성 치사 댕기열 바이러스로 항원투여함에 의해 검정된 단백질 변이체로 면역화시킨 마우스의 생존율. 면역원 생존율* (아쥬반트) Xl-1 블루 (프로인트) 0 이량체 순수 PDC-2 20 (알루미늄) 이량체 순수 PDC-2 40 (프로인트) 순수 재미립화 90 PDC-2 (알루미늄) DEN <77> <78> <79> * 다음과 같이 계산되었다: (생존개체수)/(마우스 중 총 생존수). 생존개체의 데이타는 항원투여 후 21일에 얻 어진 것이다. 실시예 10. 림프세포증식성 반응 수산화알루미늄으로 보조화된, 이량체 또는 재미립화된 캡시드 단백질로 면역화시킨 그룹으로부터의 나머지 동 물(10 마리 동물)을 마지막 투여 후 15일에 희생시켰다. 그런 다음, 이들의 비장을 추출하여 DEN-2에 대한 림프 세포증식성 반응을 연구하였다. 표 5의 결과는 수득된 자극 인덱스를 보여준다. 표 5 <80> 면역화된 마우스로부터의 림프구의 동질성 혈청형에 대한 자극 인덱스 순수 재미립화 PDC-2 순수 PDC-2 DEN-2** 10* 4 항원 대조*** 1,5 1,2 PHA**** 7 8 <81> <82> <83> <84> <85> <86> * 자극 인덱스: ADN 자발 합성 대조의 계수/분 사이의 시료의 대조/분의 지수 평균. ** DEN-2 감염된 마우스 뇌의 제제 *** 감염되지 않은 마우스 뇌의 제제 **** 피토헤마글루티니아 미토젠(양성 대조) 실시예 11. PD5 및 PDC-12에 의해 형성된 혼합물의 면역학적 평가 12마리 동물들을 미립자화된 순수한 캡시드 단백질 10ug 및 단백질 PD5 10ug의 혼합물을 15일 간격으로 3회 투 여로 접종하였다. 순수한 캡시드 단백질 10ug으로 면역화시킨 그룹, PDC-2의 동가 부피와 혼합된 단백질 PD5 20ug으로 면역화시킨 그룹을 음성 대조로 사용하였으며, PD5의 구성물에 존재하는 담체 단백질인 단백질 P64K로

12 면역화시킨 그룹을 대조로서 사용하였다. 모든 경우에서, 수산화알루미늄을 아쥬반트로서 사용하였다. <87> 마지막 투여 후 15일에 동물들을 채혈하고 혈청을 ELISA에 의해 항바이러스성 항체에 대해 실험하였다. 표 6 및 표 7에 보여진 바와 같이, 혼합물로 면역화시킨 그룹은 단백질 PD5로만으로 면역화된 그룹에서보다 높은 역가를 갖는 혈청형-특이 항체가 전개되며 동시에 이러한 두 그룹에서의 역가가 DEN-2 바이러스에 대한 항체가 검출되 지 않은 단백질 PDC-2로 면역화된 그룹에서보다 높다. 이에 반해, 각 그룹으로부터 10마리의 추가 동물을 림프 세포증식 검정을 실시하였다. 이러한 동물의 비장으로부터의 세포를 추출하여 감염성 DEN-2 바이러스로 자극하 였다. 표 8에서 보여진 바와 같이, 혼합물로 면역화시킨 그룹에서 자극 인덱스는 캡시드 단백질로만 면역화시킨 그룹에서보다 높다. 가장 낮은 자극 인덱스는 단백질 PD5로 면역화시킨 그룹에서 나타났다. 표 6 <88> 표 7 <89> 표

13 <90> 면역화된 마우스로부터의 림프구의 동질성 혈청형에 대한 자극 인자 PDC-2 PDC-2/PD5 PD5 P64k DEN-2** 9* 11 2,1 1,1 항원*** 1,3 1,6 1,5 1,2 대조 (-) PHA**** 7,5 7,3 7,9 8 <91> <92> <93> <94> <95> <96> <97> * 자극 인덱스: ADN 자발 합성 대조의 계수/분 사이의 시료의 대조/분의 지수 평균. ** DEN-2 감염된 마우스 뇌의 제제. *** 감염되지 않은 마우스 뇌의 제제. **** 피토헤마글루티니아 미토젠(양성 대조). 실시예 12. CD8 고갈 연구 세포성 면역 반응의 도입의 몇몇 증거를 얻기 위해 재미립화 및 이량체 캡시드 단백질을 Balb/c 마우스에 접종 하였다. 플라스미드로 형질전환된 세포로부터 수득된 제제를 pdc-2를 생성하기 위해 사용하였으며 단백질 PDC-2 에 사용되는 것과 유사한 정제 방법에 의해 음성 대조로서 사용하였다. 단백질의 세 투여량(20ug)을 아쥬반트로서 수산화알루미늄을 사용하여 20마리 동물의 그룹에 투여하였다. 마지 막 투여 후 1달에, 이러한 마커를 포함하는 마우스 면역계의 세포를 감소시킬 수 있는 랫 항-마우스 CD8 mab 1mg을 각 그룹으로부터의 동물의 절반에 투여하였다. 다음날에, 모든 동물에게 DEN-2 바이러스의 100LD 50 (반치사 량)을 항원투여하였다. 질병의 신호의 발생에 대해 발견되었으며 사망을 기록하였다. <98> 면역화된 비-처리 그룹의 경우에서, 20 및 80% 보호가 이량체 및 재미립화 캡시드로 면역화된 그룹에서 각각 나 타났다. 동시에, 처리 그룹에서 보호 백분율은 비-처리 그룹에서보다 낮다: 이량체 PDC-2에서 0% 보호 및 재미 립자화 단백질에서 10%. 음성 대조 그룹의 경우에서, 처리 동물 또는 비-처리 동물에서는 발견되지 않았다. 표 9 <99> <100> <101> 실시예 13. DEN-1 단백질의 수득 및 반정제. DEN-1 바이러스의 캡시드 단백질의 아미노산 1 내지 100을 코드하는 누클레오티드 서열(서열 번호 7)을 DEN-1 바이러스 균주로부터 서열 번호 8 및 서열 번호 10과 같은 서열 목록에서와 동일한 올리고누클레오티드로 증폭 시켰다. 벡터를 플라스미드 pqe-30의 BamHI/HindIII으로 절단하여 생성하였으며, 이 플라스미드는 N-말단 영역 에서 파지 T5 프로모터 및 6-히드톤 테일을 포함한다(서열 번호 6). 연결됨에 따라, 재조합체를 제한효소로 분 석하고 양성 클론을 결합점을 찾기 위해 서열결정하였다. 콤피덴트 세포 XL-1 블루(Hanahan D Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: )를 pdc-1로 명명된 선별

14 클론으로 형질전환시켰다(도 6 및 서열 번호 10). 형질전환된 E.coli 균주를 37 에서 10시간 동안 50μg/mL의 암피실린을 보충한 LB 배지에 배양하였다. 이소프로필-B-D-티오칼락토피라노시드(IPTG)를 1mM의 최종 농도가 되 도록 사용하여 프로모터를 유도하였다. 콜로니의 성장에 따라, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 실행하였다. 결과로서, 15kDA 밴드가 수득되었다. 단백질은 항-DEN-1 HMAF에 의해 인지된다. 이러한 단백질은 PDC-1로 명명 되었다(서열 번호 11). <102> <103> <104> <105> 실시예 14. PDC-1의 반정제 및 특성화. pdc-1로 형질전환되고 37 에서 성장된 E.coli로부터 수득된 바이로매스를 프렌치 프레스로 파열시켰디. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 분획 사이에서 동일하게 파열시켜 수득하였다. 가용성 분획을 Q 세파로스 FF 컬럼 및 ph 8의 10mM 트리스 완충용액을 사용하여 음이온 상호교환 크로마토그래피하였다. 비-흡수 분획에서의 단백 질을 45%의 순도로 수득하였으며 면역학적 연구에 사용하였다. 실시예 15. 반정제된 PDC-1의 면역학적 평가. 30마리의 Balb/c 마우스의 두 그룹을 사용하였다. 이들 중 하나에는 수산화알루미늄을 아쥬반트로 사용하여 복 강내 경로로 10ug의 재조합 단백질로 면역화시켰다. 수산화알루미늄으로 보조화된 pqe-30-형질전환 세포의 파열 로부터 생성된 가용성 분획을 음성 대조로서 사용하였다. 동물 중 일부(10마리 마우스)를 세 번째 투여 후 15일 에 채혈하고 DEN-1에 대한 항체 역가를 ELISA로 측정하였다. 재조합 단백질로 면역화한 후, 항바이러스성 항체 역가가 나타나지 않았다. 표 10 <106> 반정제된 PDC-1로 마우스를 면역화시킴에 의해 수득된 혈청으로부터의 DEN-1에 대한 항체 역가 마우스 항- DEN-1 ELISA 역가 XL-1 블루 PDC-1 대조 (-) 1 < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: < 1: 100 < 1: 100 <107> <108> 실시예 16. 보호 검정 기재된 변이체로 면역화됨에 의해 동질성 치사 DEN 바이러스로의 항원투여에 대하여 마우스에 주어진 보호의 평 가에서, 10 마리의 마우스를 수산화알루미늄에 흡수된 재조합 단백질 및 대조 제제로 면역화된 각 그룹으로 사 용하였다. 두개내 접종에 의한 치사 DEN-1 바이러스의 100 LD 50 의 투여량이 투여된 각 동물에서 21일간 바이러스 뇌염에 의한 죽음에 의한 치사율을 나타내었다. 양성 대조로서, 10 마리의 마우스를 감염성 DEN-1 바이러스(10 4 pfu)로 면역화하여 사용하였다. 양성 대조군의 모든 마우스가 생존하였으나, 음성 대조군에서는 모든 마우스가 항원투여 후 7-11일에 아프기 시작하여 21일에는 100% 사망하였다. 최종적으로, 재조합 단백질 PDC-1로 면역화 한 그룹은 44.4%의 보호를 나타낸다(표 11). 표

15 <109> 동질성 치사 DEN 바이러스로 항원투여에 따라 검정된 단백질 변이체로 면역화된 마우스에서 생존율 면역원 생존율* XL-1 블루 0 (대조 -) DEN (대조l +) PDC-1 50 <110> <111> <112> * 다음과 같이 계산되었다: (생존개체수)/(마우스 중 총 생존수). 생존개체의 데이타는 항원투여 후 21일에 얻 어진 것이다. 실시예 17. 림프세포증식성 반응 단백질 PDC-1로 면역화된 그룹에서 남아있는 동물들을 마지막 투여 후 15일에 희생시켰다. 그런 다음, 동물의 비장을 추출하여 DEN-1에 대한 림프세포증식성 반응을 연구하였다. 표 3의 결과는 수득된 자극 인덱스를 나타낸 다. 표 12 <113> 면역화된 마우스로부터 림프구의 동질성 혈청형에 대한 자극 인덱스 PDC-1 수산화알루미늄 DEN-2** 8* 대조 항원*** 1.5 PHA**** 7 <114> <115> <116> <117> <118> <119> <120> <121> <122> * 자극 인덱스: ADN 자발 합성 대조의 계수/분 사이의 시료의 대조/분의 지수 평균. ** DEN-2 감염된 마우스 뇌의 제제. *** 감염되지 않은 마우스 뇌의 제제. **** 피토헤마글루티니아 미토젠(양성 대조). 실시예 18. PDC-2 DomIII의 클로닝 및 발현 단백질의 도메인 III의 영역에 상응하는, DEN-2 바이러스로부터의 외피 단백질의 아미노산 286 내지 426을 코드 하는 누클레오티드 서열(서열 번호 12)을 DEN-2 바이러스 균주 자메이카로부터의 서열 번호 13 및 서열 번호 14 와 같은 서열 목록에서 확인된 올리고누클레오티드로 증폭시켰다(Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the nonstructural proteins of Dengue type 2 virus, Jamaica genotype: Comparative analysis of the full-length genome. Virology : ). 벡터를 BamHI/BamHI를 갖는 플라스미드 pdc-2을 절단하여 생성하였으며, 이 플라스미드는 N-말단 영역 및 DEN-2 바이러스의 캡시드 단백질의 100개 아미노산에 상응하는 영역에서 파지 T5 프로모터 및 6-히드톤 테일을 포함한 다. 연결됨에 따라, 잠재적 재조합체를 제한효소 절단으로 분석하고 양성 클론을 결합점을 찾기 위해 서열결정 하였다. 마지막으로 선별된 클론을 pdc-2 Dom III(서열 번호 15)으로 명명하였다. 콤피덴트 세포 XL-1 블루(Hanahan D Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: )를 pdc-2 Dom III으로 명명된 선별 클론으로 형질전환시켰다. 형질전환된 E.coli 균주를 37 에서 10시간 동안 50μg/mL의 암피실린을 보충한 루리아 베르타니(LB) 배지에 배양하였다. 이소프로 필-B-D-티오칼락토피라노시드(IPTG)를 1mM의 최종 농도가 되도록 사용하여 프로모터를 유도하였다. 콜로니의 성 장에 따라, 세포 용해질의 SDS-PAGE를 실행하였다. 결과로서, 30kDA 밴드가 수득되었다. 단백질은 항-DEN-2 HMAF에 의해 인지된다. 이러한 단백질은 PDC-2 Dom III으로 명명되었다(서열 번호 16). 실시예 19. PDC-2 Dom III의 반정제 및 특성화

16 <123> <124> <125> pdc-2로 형질전환되고 37 에서 성장된 E.coli로부터 수득된 바이로매스를 프렌치 프레스로 파열시켰디. 재조합 단백질을 가용성 및 불용성 분획 사이에서 동일하게 파열시켜 수득하였다. 가용성 분획을 Q 세파로스 FF 컬럼 및 ph 8의 10mM 트리스 완충용액을 사용하여 음이온 상호교환 크로마토그래피하였다. 비-흡수 분획에서의 단백 질을 40%의 순도로 수득하였으며 면역학적 연구에 사용하였다(도 2). 실시예 20. 반정제된 PDC-2의 면역학적 평가. 30마리의 Balb/c 마우스의 다섯 그룹을 사용하였다. 이들 중 하나에는 수산화알루미늄을 아쥬반트로 사용하여 복강내 경로로 10ug의 재조합 단백질로 면역화시켰다. 플라스미드 pqe-30으로 형질전환된 XL-1 블루 세포의 파 열로부터 얻어진 가용성 분획을 수산화알루미늄으로 보조화하여 음성 대조로서 사용하였다. 다른 두 그룹을 대 조로서 포함하였다. 이들 중 하나를 단백질 PDC-2로 면역화하고 다른 하나를 단백질 PD5(이 단백질은 DEN-2 바 이러스의 외피 단백질의 도메인 III 영역을 포함한다)로 면역화하였다. 각 그룹으로부터 10마리의 동물을 세 번 째 투여 후 15일에 채혈하고 DEN-2에 대한 항체 역가를 ELISA로 측정하였다. 표 13 및 14에 보여진 바와 같이, PDC-2 Dom III로 면역화된 그룹은 단백질 PD5에 의해 유도되는 것 보다 더 높은 DEN-2에 대한 혈청형-특이 항체 의 높은 역가를 나타낸다. 이러한 결과는 캡시드 단백질과의 유전적 조합이 외피 단백질의 도메인 III에 의해 유도되는 항바이러스성 면역반응을 증가시킴을 증명한다. 표 13 <126>

17 표 14 <127> <128> 반면에, 각 그룹으로부터의 추가 10마리 동물을 림프세포 검정하였다. 이러한 동물들의 비장으로부터 세포를 추 출하고 감염성 DEN-2 바이러스로 자극하였다. 표 15는 조합으로 면역화된 그룹에서 자극 인덱스가 캡시드 단백 질만으로 면역화된 그룹에서보다 더 높음을 나타낸다. 단백질 PD5로 면역화된 그룹에서의 자극 인덱스가 가장 낮다. 표 15 <129> 면역화된 마우스로부터 림프구의 동질성 혈청형에 대한 자극 인덱스 PDC-2 PDC-2 PD5 P64k Dom III DEN-2** 9.5* 11,6 2,2 1,2 항원*** 1,2 1,1 1,2 1,6 대조 (-) PHA**** 7,6 7,4 7,5 7,9 <130> <131> <132> <133> * 자극 인덱스: ADN 자발 합성 대조의 계수/분 사이의 시료의 대조/분의 지수 평균. ** DEN-2 감염된 마우스 뇌의 제제. *** 감염되지 않은 마우스 뇌의 제제. **** 피토헤마글루티니아 미토젠(양성 대조). 도면의 간단한 설명 <36> <37> <38> <39> <40> <41> <42> <43> 도 1은 PDC-2를 생성하기 위한 DEN-2 바이러스의 캡시드 단백질의 클로닝 전략을 나타낸 것이다. DEN2 C: DEN-2의 캡시드 단백질의 단편 도 2는 15%의 PDC-2 반정제 과정에서 SDS-PAGE에 의한 분석을 나타낸 것이다. 1. 파열 상청액, 2 및 3. Q 세파로스 FF에 흡수되지 않은 분획, 4. NaCl 1M으로 용출된 분획. 도 3은 15% PDC-2 정제 과정에서 SDS-PAGE에 의한 분석을 나타낸 것이다. 1. 파열 상청액, 2. 겔에 흡수되지 않은 분획, 3. 세척액(350mM NaCl), 4. 용출된 분획(750mM NaCl), 5. 트리 스 10mM, EDTA 1mM에서의 분획. 도 4는 PDC-2의 반정제(A) 및 순수(B) 제제의 수퍼덱스 200dpt의 크로마토그래피 프로필을 나타낸 것이다. 도 5는 올리고누클레오티드로 처리하기 전(A) 및 후(B) 순수한 PDC-2 제제의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다

18 <44> <45> <46> <47> 도 6은 PDC-1을 생성하는 DEN-1 바이러스의 캡시드 단백질의 클로닝 전략을 나타낸 것이다. DEN1 C: DEN-1의 캡시드 단백질의 단편. 도 7은 15%의 PDC-1 반정제 과정에서 SDS-PAGE에 의한 분석을 나타낸 것이다. 1. 분자량 마커, 2. 파열 상청액, 3. Q 세파로스 FF에 흡수되지 않은 분획. 도면 도면1 도면2-18 -

19 도면3 도면4-19 -

20 도면5 도면6-20 -

21 도면7 서열목록 SEQUENCE LISTING <110> Center for Genetic Engineering and Biotecnology <120> The capsid protein of Dengue virus inducer of a protective immune response and pharmaceutical composition. <130> Dengue <160> 24 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <223> Sequence of the oligonucleotide BamH-I to the amplification of the

22 capsid protein of dengue 2 virus <400> 1 cgggatccaa taaccaacga aaaa 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(23) <223> Sequence of the oligonucleotide Hind-III to the amplification of the capsid protein of DEN-2 virus <400> 2 acaagctttt acctgcgtct cct 23 <210> 3 <211> 339 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> gene <222> (1)..(339) <223> Nucleotide sequence that codes for amino acids 1 to 113 of the capsid protein of dengue 2 virus <400> 3 aataaccaac gaaaaaaggc gagaagtacg cctttcaata tgctgaaacg cgagagaaac 60 cgcgtgtcaa ctgtgcaaca gctgacaaag agattctcac ttggaatgct gcaaggacga 120 ggaccattaa aactgttcat ggcccttgtg gcgttccttc gtttcctaac aatcccacca 180 acagcaggga tactgaaaag atggggaacg atcaaaaaat caaaagctat caatgttttg 240 agagggttca ggaaagagat tggaaggatg ctgaacatct tgaacaggag acgcaggaca

23 gcaggcgtga ttattatgtt gattccaaca gcgatggcg 339 <210> 4 <211> 339 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> gene <222> (1)..(339) <223> Nucleotide sequence that codes for the quimeric protein PDC-2 in the plasmid pqe-30 <400> 4 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccaata accaacgaaa aaaggcgaga 60 agtacgcctt tcaatatgct gaaacgcgag agaaaccgcg tgtcaactgt gcaacagctg 120 acaaagagat tctcacttgg aatgctgcaa ggacgaggac cattaaaact gttcatggcc 180 cttgtggcgt tccttcgttt cctaacaatc ccaccaacag cagggatact gaaaagatgg 240 ggaacgatca aaaaatcaaa agctatcaat gttttgagag ggttcaggaa agagattgga 300 aggatgctga acatcttgaa caggagacgc taaaagctt 339 <210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> CHAIN <222> (1)..(111) <223> Aminoacidic sequence coresponding to the protein PDC-2. <400> 5 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asn Asn Gln Arg

24 Lys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Phe Asn Met Leu Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ile Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn Arg Arg Arg Arg <210> 6 <211> 3461 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> plasmid pqe-30 <220> <221> misc_feature <223> Nucleotide sequence of the plasmid pqe-30. In italic the restriction sites BamHI/Hind III are underlined. <400> 6 ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60 attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga 120 ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc gcatgcgagc tcggtacccc gggtcgacct 180 gcagccaagc ttaattagct gagcttggac tcctgttgat agatccagta atgacctcag

25 aactccatct ggatttgttc agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt attggtgaga 300 atccaagcta gcttggcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc 360 actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt 420 cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta 480 aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc 540 ctgatgaatg ctcatccgga atttcgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg 600 gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc 660 tggagtgaat accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg 720 tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc 780 tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac 840 ttcttcgccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc 900 cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta 960 atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt 1020 attggtgccc ttaaacgcct ggggtaatga ctctctagct tgaggcatca aataaaacga 1080 aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 1140 ctgagtagga caaatccgcc gctctagagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 1200 aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 1260 agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 1320 acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga

26 ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 1440 accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtctgtcggc 1500 tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 1560 ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 1620 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 1680 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 1740 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 1800 ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 1860 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 1920 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 1980 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 2040 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 2100 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 2160 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 2220 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 2280 gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 2340 aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 2400 aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagctg 2460 cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 2520 ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc

27 cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 2640 ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 2700 ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 2760 ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 2820 gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 2880 ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 2940 ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 3000 gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 3060 ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 3120 cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 3180 ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 3240 aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 3300 gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 3360 gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 3420 cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca c 3461 <210> 7 <211> 300 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> gene <222> (1)..(300) <223> Nucleotide sequence that codes for amino acids l 1 to

28 100 of the capsid protein of Dengue 1 virus. <400> 7 atgaacaacc aacggaaaaa gacggctcga ccgtctttca atatgctgaa acgcgcgaga 60 aaccgcgtgt caactgtttc acagttggcg aagagattct caaaaggatt gctctcaggc 120 caaggaccca tgaaattggt gatggccttc atagcattcc taagatttct agccataccc 180 ccaacagcag gaattttggc tagatggggc tcattcaaga agaatggagc gatcaaagtg 240 ctacggggtt tcaagaaaga aatctcaaac atgttgaata taatgaatag aaggaaaaga 300 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(26) <223> Sequence of the oligonucleotide BamH-I to the amplification of the capsid protein of DEN-1 virus. <400> 8 ggatccatga acaaccaacg gaaaaa 26 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(24) <223> Sequence of the oligonucleotide Hind-III to the amplification of the capsid protein of DEN-1 virus <400>

29 aagctttctt ttccttctat tcat 24 <210> 10 <211> 345 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> gene <222> (1)..(345) <223> Nucleotide sequence that codes to the quimeric protein PDC-1 in the plasmid pqe-30 <400> 10 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccatga acaaccaacg gaaaaagacg 60 gctcgaccgt ctttcaatat gctgaaacgc gcgagaaacc gcgtgtcaac tgtttcacag 120 ttggcgaaga gattctcaaa aggattgctc tcaggccaag gacccatgaa attggtgatg 180 gccttcatag cattcctaag atttctagcc atacccccaa cagcaggaat tttggctaga 240 tggggctcat tcaagaagaa tggagcgatc aaagtgctac ggggtttcaa gaaagaaatc 300 tcaaacatgt tgaatataat gaatagaagg aaaagataaa agctt 345 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> CHAIN <222> (1)..(112) <223> Aminoacidic sequence corresponding to the protein PDC-1 <400> 11 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Met Asn Asn Gln

30 Arg Lys Lys Thr Ala Arg Pro Ser Phe Asn Met Leu Lys Arg Ala Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Ser Gln Leu Ala Lys Arg Phe Ser Lys Gly Leu Leu Ser Gly Gln Gly Pro Met Lys Leu Val Met Ala Phe Ile Ala Phe Leu Arg Phe Leu Ala Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ile Leu Ala Arg Trp Gly Ser Phe Lys Lys Asn Gly Ala Ile Lys Val Leu Arg Gly Phe Lys Lys Glu Ile Ser Asn Met Leu Asn Ile Met Asn Arg Arg Lys Arg <210> 12 <211> 426 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> gene <222> (1)..(426) <223> Nucleotide sequence that codes for DomB of the envelope protein of DEN-2 virus <400> 12 aggctgagaa tggacaaact acagctcaaa ggaatgtcat actctatgtg tacaggaaag 60 tttaaaattg tgaaggaaat agcagaaaca caacatggaa caatagttat cagagtacaa 120 tatgaagggg acggctctcc atgtaagatc ccttttgaga taatggattt ggaaaaaaga 180 cacgtcttag gtcgcctgat tacagttaac ccgatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc 240 aacatagaag cagaacctcc attcggagac agctacatca tcataggagt agagccggga

31 caattgaaac tcaactggtt taagaaagga agttccatcg gccaaatgtt tgagacaaca 360 atgagaggag cgaagagaat ggccatttta ggtgacacag cctgggattt tggaagcctg 420 ggaggg 426 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(21) <223> Sequence of the oligonucleotide 5 for the amplifcation of the region that codes for the amino acids 286 to 426 of the envelope protein of DEN-2 virus <400> 13 cttggatcca ttctgagaat g 21 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> primer_bind <222> (1)..(33) <223> Sequence of the oligonucleotide 3 for the amplification of the region that codes for the amino acids 286 to 426 of the envelope protein of DEN-2 virus <400> 14 tgtggatcct cctcctaggc ttccaaaatc cca 33 <210> 15 <211>

32 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> gene <222> (1)..(753) <223> Nucleotide sequence that codes for the quimeric protein pdc-2 DomIII <400> 15 catcaccatc accatcacgg atccaggctg agaatggaca aactacagct caaaggaatg 60 tcatactcta tgtgtacagg aaagtttaaa attgtgaagg aaatagcaga aacacaacat 120 ggaacaatag ttatcagagt acaatatgaa ggggacggct ctccatgtaa gatccctttt 180 gagataatgg atttggaaaa aagacacgtc ttaggtcgcc tgattacagt taacccgatc 240 gtaacagaaa aagatagccc agtcaacata gaagcagaac ctccattcgg agacagctac 300 atcatcatag gagtagagcc gggacaattg aaactcaact ggtttaagaa aggaagttcc 360 atcggccaaa tgtttgagac aacaatgaga ggagcgaaga gaatggccat tttaggtgac 420 acagcctggg attttggatc cctgggagga ggatccaata accaacgaaa aaaggcgaga 480 agtacgcctt tcaatatgct gaaacgcgag agaaaccgcg tgtcaactgt gcaacagctg 540 acaaagagat tctcacttgg aatgctgcaa ggacgaggac cattaaaact gttcatggcc 600 cttgtggcgt tccttcgttt cctaacaatc ccaccaacag cagggatact gaaaagatgg 660 ggaacgatca aaaaatcaaa agctatcaat gttttgagag ggttcaggaa agagattgga 720 aggatgctga acatcttgaa caggagacgc taa 753 <210> 16 <211> 250 <212> PRT <213> Dengue virus

33 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(250) <223> Aminoacidic sequence of PDC-2 Dom III <400> 16 His His His His His His Gly Ser Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Phe Asn Met Leu Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg

34 Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly Ile Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile Lys Lys Ser Lys Ala Ile Asn Val Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn Arg Arg Arg <210> 17 <211> 142 <212> PRT <213> Dengue virus type 1 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(142) <223> Aminoacidic sequence corresponding to DomB of the envelope protein of DEN-1 virus <400> 17 Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Val Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Ile Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly

35 Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly <210> 18 <211> 142 <212> PRT <213> Dengue virus type 3 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(142) <223> Aminoacidic sequence corresponding to DomB of the envelope protein of DEN-3 virus <400> 18 Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Thr Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Val Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly

36 Ile Gly Asp Asn Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly <210> 19 <211> 142 <212> PRT <213> Dengue virus type 4 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(142) <223> Aminoacidic sequence corresponding to Dom B of the envelope protein of DEN-4 virus <400> 19 Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly

37 Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly <210> 20 <211> 749 <212> PRT <213> Dengue virus type 1 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(749) <223> Aminoacidic sequence corresponding to the protein PLH3. <400> 20 Met Gly His His His His His His Ala Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu

38 Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn

39 Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His Pro Thr Leu Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Arg