(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2015년05월21일 (11) 등록번호 10-1520534 (24) 등록일자 2015년05월08일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 5/0783 (2010.01) A61K 35/12 (2015.01) C12N 13/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2013-0051442 (22) 출원일자 2013 년 05 월 07 일 심사청구일자 2013 년 05 월 07 일 (65) 공개번호 10-2013-0124916 (43) 공개일자 2013 년 11 월 15 일 (30) 우선권주장 1020120048165 2012 년 05 월 07 일대한민국 (KR) (56) 선행기술조사문헌 Clin Cancer Res 2006;12(20) 6079-6086, October 15, 2006* * 는심사관에의하여인용된문헌 (73) 특허권자 고려대학교산학협력단 서울특별시성북구안암로 145, 고려대학교 ( 안암동 5 가 ) (72) 발명자 이경미 서울특별시강남구압구정로 151 신현대아파트 105 동 505 호 임선아 서울특별시종로구창경궁로 224 서울시티빌 604 호 캐시안이 서울성북구안암로 145, 318 호 ( 고려대학교안암캠퍼스 ( 자연계 ) 미래융합기술관 ) (74) 대리인 특허법인다나전체청구항수 : 총 8 항심사관 : 임혜준 (54) 발명의명칭말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법 (57) 요약 본발명은사이토카인의존재하에서방사선조사된 Jurkat 세포및방사선조사된 EBV-LCL 세포 (Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line) 를영양세포로서말초혈액단핵구와공배양하는것을포함하는말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법에관한것이다. 본발명에따르면, 고가의장비나고가의다양한사이토카인을사용하지않으면서도적은양의말초혈액단핵구으로부터다량의자연살해세포를유도및증식시킬수있으므로자연살해세포를이용한암의예방및치료의효율및효능을획기적으로증진시킬수있다. 대표도 - 도 3-1 -
이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명포치료기술의확립 기여율 1/2 K2070200199411A050003610 한국연구재단 의무산학협력팀 ( 국제 ) 글로벌연구실사업 종양및장기이식모델에서자연살상세포와조절 T 세포의면역방어 / 조절연구를통한세 주관기관 고려대학교산학협력단 연구기간 2011.09.01 ~ 2012.08.31 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 1/2 2011K000815 한국연구재단 원천기술개발사업 의무산학협력팀 나노체기반바이오메디컬융합형항암세포치료원천기술개발 주관기관 포항공과대학교 연구기간 2011.07.01 ~ 2012.06.30-2 -
명세서청구범위청구항 1 사이토카인의존재하에서방사선조사된 Jurkat 세포및방사선조사된 EBV-LCL 세포 (Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line) 를영양세포로서말초혈액단핵구와공배양하는것을포함하는말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법. 청구항 2 제1항에있어서, 말초혈액단핵구는정상인, 암의위험성을갖는환자또는암환자로부터얻은것인말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법. 청구항 3 제1항에있어서, 방사선조사된 Jurkat 세포또는방사선조사된 EBV-LCL 세포는각각 100 내지 500 Gy 방사선을처리하여수득된것인말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법. 청구항 4 제1항에있어서, 상기사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12, IL18 또는이들중 2종이상인말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법. 청구항 5 제1항에있어서, 상기사이토카인은 50U/ml 내지 1,000 U/ml의농도로사용되는말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법. 청구항 6 제1항에있어서, 상기공배양은 7일내지 30일동안수행되는것인말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법. 청구항 7 제1항에있어서, 상기말초혈액단핵구와영양세포의공배양시혼합비율은 1:5 내지 2:1인말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법. 청구항 8 제1항에있어서, 상기말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식후 NK 세포의유지를위한후배양시배양 1일내지 15 일째에방사선조사된 Jurkat 세포, 방사선조사된 EBV-LCL 세포및사이토카인을추가하는것을더포함하는말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법. 청구항 9-3 -
삭제 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술인체는면역반응에의해병원체로부터보호되고있고, 면역시스템은많은면역관련세포와사이토카인등에의해구성되어있다. 이러한면역시스템에서중요한역할을하는것이백혈구, 특히림프구이다. 림프구를구성하는세포로는대표적으로선천성면역계와후천성면역계가있다. 자연살해세포 (Natural Killer Cell, NK cell) 는대표적인선천면역세포중하나로, 비특이적으로암을살상할수있고바이러스, 박테리아등을인식하여이들을살상하며, 퍼포린 (perforin) 및그랜자임 (granzyme) 등의효소나 Fas-FasL 상호작용으로병원체를살상하는세포로알려져있다. 암환자의경우, 이러한자연살해세포 (NK 세포 ) 의암세포살상능의감소가폐암 (Carrega P, et al., Cancer, 2008: 112: 863-875), 간암 (Jinushi M, et al., J Hepatol., 2005: 43; 1013-1020), 유방암 (Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 2003: 33: 119-124), 자궁암 (Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 1999: 79: 244-250), 혈액암 (Tajima F., et al, Lekemia 1996: 10: 478-482) 등의질환의발생과깊은연관이있는것으로보고되고있다. 따라서암의치료를위해서암환자에게서자연살해세포의암세포살상능및활성증가가필수적이며, 현재이러한자연살해세포의살상능을이용하여고형암이나혈액암의치료가시도되고있는실정이다. 암세포살상의효과를얻기위해서는다량의자연살해세포가요구되나암환자의혈액을대량으로확보하는것이쉽지않으며혈액내에서자연살해세포가차지하는비율도약 5~20% 정도에불과하므로이를면역치료제로사용하기어려우므로자연살해세포를효과적으로확장및증식시키는것이중요하다. 기존의자연살해세포의증식방법은대표적으로 MACS (Magnetic Activated Cell Sorting), clinimacs 나 FACs Sorter 등의장비를사용하여혈액에있는단핵구나골수로부터자연살해세포를분리또는유도하고있다. 이러한방법에는다음의단계가선행된다. 1) 단핵구로부터초기에자연살해세포를분리하여사이토카인을사용하여확장배양, 2) 단핵구에공존하는 T 세포를제거한후사이토카인을사용하여자연살해세포를확장배양, 3) 골수에있는줄기세포 (stem cell) 로부터자연살해세포로유도하는방법. 그외, 영양세포 (feeder cell) 를이용하여말초혈액내단핵구 (PBMC) 를자연살해세포로유도하는방법으로는이탈리아 Torelli 그룹의 B세포 leukemia인 RPMI8866 세포주를이용하는방법과일본의 Ishikawa 그룹의 Wilms 종양세포인 HFWT 세포주를이용하는방법이보고되어있다. 그러나기존에보고된자연살해세포의증식방법은고가의장비를사용하여야하며, 고가의다양한사이토카인을고농도로이용하여야하는바경제적으로안정된일부환자에게만해당치료가가능한실정이다. 발명의내용 [0005] 해결하려는과제 본발명의목적은고가의장비나고농도의사이토카인을사용하지않고, 활성화된말초혈액유래자연살해세포 를효율적으로수득하기위한말초혈액유래자연살해세포의새로운유도및증식방법을제공하는데있다. [0006] [0007] [0008] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은사이토카인의존재하에서방사선조사된 Jurkat 세포및방사선조사된 EBV-LCL 세포를영양세포로서말초혈액단핵구와공배양하는것을포함하는말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법을제공한다. 달리정의되지않는한, 본명세서에서사용된모든기술적및과학적용어들은본발명이속하는기술분야에서숙련된전문가에의해서통상적으로이해되는것과동일한의미를갖는다. 일반적으로, 본명세서에서사용된용어및이하에기술하는실험방법은본기술분야에서잘알려져있고통상적으로사용되는것이다. 본발명자는적은양의혈액으로부터도다량의자연살해세포를수득하기위하여연구한결과, 방사선이조사된 Jurkat 세포를영양세포로이용하여말초혈액으로부터분리한단핵구를배양하는경우증식된자연살해세포를 - 4 -
얻을수있음을발견한바있다 ( 국내특허출원제 10-2010-007877 호 ). [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] 상기출원된특허의방법으로자연살해세포를선택적으로증식시키는기작을연구한결과단핵구내에 B 세포를제거하고방사선조사한 Jurkat 세포와공배양시자연살해세포의선택적증식이현저히저하되었음을알수있었으며이를통하여자연살해세포의증식에있어서 B 세포가중요한역할을한다는사실을발견하였다 ( 도 1a, 도 1b). 이러한결과를통하여 Jurkat 세포에의한 NK 세포의선택적증식이 B 세포에의존적으로일어난다는사실을알게되었으며이러한사실로부터 B 세포유래 immortalized 세포인 EBV-LCL을영양세포로사용하게되면더많은 NK 세포의증식을가능하게할것으로예상되었다. 그러나, 말초혈액으로부터분리한단핵구를 EBV-LCL과공배양을한경우 NK 세포는증식을하나 NK 세포의순도는현저히저하된것을알수있었다. 이에, 방사선을조사한 Jurkat 세포와함께방사선을조사한 EBV-LCL 세포를영양세포로이용한결과, Jurkat 세포또는 EBV-LCL 세포를단독으로이용하는경우에발생되는문제점을모두해결가능하여훨씬높은수율로증식된단핵구와자연살해세포를수득하는것이가능함을발견하고본발명을완성하였다. 따라서, 본발명은일관점에서, 사이토카인의존재하에서방사선조사된 Jurkat 세포및방사선조사된 EBV- LCL 세포를영양세포로서말초혈액단핵구와공배양하는것을포함하는말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식방법을제공한다. 본발명에서, 말초혈액단핵구 (Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC), PBMC" 또는 단핵구 (Mononuclear Cell) 는항암면역치료를위하여통상적으로사용되는말초혈액 (Peripheral Blood) 으로부터분리된단핵구 (Mononuclear Cell) 를의미한다. 말초혈액단핵구는채혈한사람의혈액을피콜-하이팩밀도구배분리법 (Ficoll-Hypaque density gradient method) 과같은공지의방법을사용하여수득할수있다. 본발명의한구체예에서 말초혈액단핵구 는정상인, 암의위험성을갖는환자또는암환자로부터얻은것일수있다. 본발명에서사용되는말초혈액단핵구는반드시자가유래일필요는없으며, 동종유래의말초혈액단핵구라면본발명에따른항암면역치료를위한자연살해세포의유도및증식을위해사용할수있다. 본발명에따라말초혈액단핵구를방사선을조사한 Jurkat 세포, 그리고방사선을조사한 EBV-LCL 세포와함께공배양하면증식된단핵구와증식된자연살해세포를얻을수있다. 이렇게얻은자연살해세포는암의예방과치료를위해정상인, 암의위험성을갖는환자, 또는암환자에처치할수있다. 본발명에서 Jurkat 세포 또는 Jurkat 세포주 는혈액암 (immortalized acute T cell leukemia) 세포주로 University of California at San Francisco의 Dr. Arthur Weiss가개발한세포주이다. 다양한케모카인수용체가발현하고있으며 IL-2를생산할수있는세포로서, 이는세포표면에자연살해세포활성억제인자인 MHC class I을높이발현하기때문에항암면역치료를위한영양세포 (feeder cells) 의후보로가능성이전혀대두되지못했던세포주였다. 그러나, 본발명자들이말초혈액단핵구로부터자연살해세포로의분화및증식을위해다수의혈액암세포주를스크리닝하여찾아낸결과 Jurkat 세포를영양세포로서사용할수있음은밝힌바있다 ( 국내특허출원제10-2010-0078777호참조 ). 본발명에사용되는 Jurkat 세포는 ATCC로부터입수할수있다 (ATCC TIB-152). 본발명에서, EBV-LCL 세포 또는 EBV-LCL 세포주 는엡스테인바르바이러스가형질전환된임파구연속세포주 (EBV-LCL, Epstein-Barr virus transformed lymphocyte continuous line, D.M. Koelle et al., 1993,supra,) 이다. EBV-LCL 세포는발암과정연구용등에사용된바는있으나말초혈액으로부터단핵구와자연살해세포를증식시키기위한영양세포로사용된바는없다. 본발명의 EBV-LCL 세포는통상실험실에서직접제조하여사용할수있다. 본발명의실시예에서는 EBV-LCL을직접제조하여사용하였다. EBV-LCL은시험관내에서사람의 B 세포에 Epstein-Barr Virus를감염시켜서만든 B 세포주로서 PBMC에서 EBV를감염시켜서만드는세포주로만드는과정중 EBV에반응하는 T 세포를억제하기위하여사이클로스포린 A를넣어주었다. 구체적으로, 30 X 10 6 의 PBMC를배양배지 9 ml에넣고, 이를 T 25 배양플라스크에넣고 EBV 상층액을 9ml 넣었다. 80 ul의사이클로스포린 A를넣은후 37 에서배양하였다. 배양 7일후상층액을 1/2 제거한후새로운배양배지를넣어주고 40ul의사이클로스포린 A를넣어주었다. 배양 28일까지매 7일에한번 7일째와같은과정을반복하였다. 배양 28일후부터세포주는사용가능하며이때부터배양배지에사이클로스포린 A를넣지않고배양하였다. [0017] 상기 Jurkat 세포및 EBV-LCL 세포는암세포의증식을억제하기위한방사선조사를통해비로소영양세포로서 사용할수있다. 본발명의한구체예에있어서, 방사선조사된 Jurkat 세포또는방사선조사된 EBV-LCL 세포 - 5 -
는각각 100 내지 500 Gy 방사선을처리하여수득할수있다. [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] 본발명에서, 사이토카인 은말초혈액단핵구를자연살해세포로유도하는데사용가능한면역활성화사이토카인을의미한다. 본발명의한구체예에서, 이러한사이토카인으로는예를들어 IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-12, IL18 또는이들을 2종이상혼합하여사용할수있다. 특히 IL-2, IL-15 또는 IL-21이자연살해세포로의분화및증식에탁월한효과가있는사이토카인으로알려져있으므로, 이들사이토카인을이용하는것이바람직하다. 본발명의실시예에서는 IL-2를이용하였으나, 이에제한되는것은아니다. 상기사이토카인들이 NK 세포로의유도에관여한다는사실은여러문헌에서찾을수있다. 사이토카인 (Cytokine) 수용체의 γc의발현이결핍된쥐에서 B세포와 T세포는발견이되지만 NK 세포는발견되지않는점에서 γc를지닌수용체들이 NK 분화에중요한역할을한다고알려져있다 (Singer, B et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 377-381, 1995). 수용체의 γc 형태는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21의수용체이며, 이중 IL-2는성숙된 NK 세포의증식과활성화를증진시키는기능을지니고있음이보고되고있다 (Shibuya, A. et al.,blood 85, 3538-3546, 1995). IL-2가결핍된인간과마우스에서는 NK 세포의수가현저히감소한다는보고가전해지고있으나 (DiSanto, J. P. et al., J. Exp. Med. 171, 1697-1704, 1990), 한편으로는 IL-2 및 IL-2Ra 결핍은간접적으로 NK 세포의수와활성화에영향을미친다는연구결과도있다. 게다가, IL-2R 사슬은 IL-15의수용체를형성하는데관여한다고알려져있다. 상기 IL-15는 NK 세포분화에관여하고, 이것은 IL-15 생성에요구되는전사인자인터페론 (transcription factor interferon, IFN)-조절인자 1이결핍된쥐에서는 NK 세포가결핍되며 (Kouetsu et al., Nature 391,700-703, 1998), IL-15 또는 IL-15Rα가결핍된쥐에서는 NK 세포가발견되지않는다는것에의해알게되었다. 이로써 IL-15는 NK 세포에서발현되는 IL-15 수용체를통해서 NK 세포의성장과분화를직접적으로증진시킨다는것이보고되었다 (MrozekE et al., Blood 87, 2632-2640,1996). 상기 IL-21은활성화된 CD4+ T세포에의해분비되는사이토카인이며 (Nature, 5:688-697, 2005), IL-21의수용체 (IL-21R) 는수지상세포, NK 세포, T 세포및 B 세포와같은림프구에서발현되어있다 (Rayna Takaki, et al., J. Immonol 175: 2167-2173, 2005). IL-21은구조적으로 IL-2 및 IL-15와매우유사하며, IL-21R은 IL- 2R, IL-15, IL-7R 및 IL-4R 등과사슬을공유하고있다 (Asao et al., J. Immunol, 167: 1-5, 2001). IL-21은골수로부터의 NK 세포전구체의성숙을유도하는것으로보고되었고 (Parrish-Novak, et al., Nature, 408: 57-63, 2000), 특히 NK 세포의사이토카인생성능및세포사멸능과같은효과기기능 (effector functions) 을증가시키는것으로보고되었으며 (M. Strengell, et al., J Immunol, 170, 5464-5469, 2003; J. Brady, et al., J Immunol, 172, 2048-2058, 2004), CD8+ T 세포의효과기기능도증가시킴으로써내재, 적응면역계의항암반응을촉진시키는것으로보고되었다 (Rayna Takaki, et al., J Immunol 175, 2167-2173, 2005; A. Moroz, et al., J Immunol, 173, 900-909, 2004). 또한, 인간의말초혈액에서분리한 NK 세포를활성화시키며 (Parrish-Novak, et al., Nature, 408, 57, 2000), 제대혈에서분리한조혈줄기세포로부터성숙한 NK 세포를유도하는데중요한역할을하는것이보고되었다 (J. Brady, et al., J Immunol, 172, 2048, 2004). 본발명의한구체에에서, 상기사이토카인은 50U/ml 내지 1,000 U/ml, 예컨대 200 U/ml 내지 800 U/ml, 400 U/ml 내지 600 U/ml 등의농도로사용될수있다. 종래의자연살해세포증식방법은고농도의다양한사이토카인을필요로하였으나, 본발명에따른자연살해세포증식방법은 2종의영양세포의사용으로인해하나의사이토카인을낮은농도로사용하더라도높은수율과순도로자연살해세포를증식할수있다. 본발명에있어서, 말초혈액단핵구의배양시사용가능한배지는말초혈액단핵구의자연살해세포로의유도및증식에사용하고있는통상의배지를제한없이사용할수있다. 이러한배지로는예를들어, RPMI, DMEM, x- vivo10, x-vivo20, cellgro SCGM 배지를사용할수있다. 그외온도등의배양조건은통상의말초혈액단핵구의배양조건을따를수있다. 본발명의한구체예에있어서, 말초혈액단핵구와방사선조사된 Jurkat 세포및방사선조사된 EBV-LCL 세포의공배양은 7일내지 30일, 예를들어, 10일내지 20일동안수행될수있다. 바람직하게는 10일내지 14일동안공배양을수행하는것이효율적이다. 본발명의다른구체예에서, 상기말초혈액단핵구와영양세포의공배양시혼합비율은 1:5 내지 2:1일수있다. 본발명의일실시예에서는영양세포로서 Jurkat 세포및 EBV-LCL 세포가자연살해세포의유도및증식에미치는영향을알아보기위해, 단핵구를 IL-2 존재하에서배양한군 ( 대조군 1), 단핵구를방사선이조사된 Jurkat 세포와함께 IL-2 존재하에서배양한군 ( 대조군 2), 단핵구를방사선이조사된 EBV-LCL 세포와함께 IL-2 존재 - 6 -
하에서배양한군 ( 대조군 3) 을대조군으로하고, 단핵구를방사선이조사된 Jurkat 세포및방사선이조사된 EBV-LCL 세포와함께 IL-2 존재하에공동배양한군을실험군으로하여이들을일정기간배양한후 PBMC와 NK 세포의수를측정하였다 ( 실시예 2, 도 2, 도 3 참조 ). 그결과, IL-2존재하에 Jurkat 세포및 EBV-LCL 세포와공동배양한실험군은다른대조군과비교하여 PBMC의수가약 147배증가함을확인하였다 ( 도 2). 또한 NK 세포의증식뿐만아니라분포 (enrichment) 의정도를확인한결과, 배양 14일경과후 IL-2존재하에 Jurkat 세포및 EBV-LCL 세포와공동배양한실험군에서는 NK 세포의표현형인 CD56+, CD3-세포의비율이 70% 이상까지증가함을확인하였다 ( 도 4a). [0027] 한편, 본발명의자연살해세포증식방법은상기말초혈액단핵구유래자연살해세포의유도및증식후 NK 세포의유지를위한후배양시배양 1일내지 15일째에방사선조사된 Jurkat 세포, 방사선조사된 EBV-LCL 세포및사이토카인을추가하는것을더포함할수있다. 활성화된자연살해세포는생존시간이짧기때문에활성화된자연살해세포를이용한면역치료에있어서문제점을가지고있다. 따라서, 본발명에따른자연살해세포증식후배양 1일내지 15일째에방사선조사된 Jurkat 세포, 방사선조사된 EBV-LCL과사이토카인을추가함으로써활성화된자연살해세포의생존기간을연장시킬수있으며, 더많은수의자연살해세포를얻을수있다. [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] 본발명은또한상기방법에따라얻어진말초혈액단핵구유래자연살해세포를포함하는암의예방및치료용조성물, 상기방법에따라얻어진말초혈액단핵구유래자연살해세포의암예방및치료용의약의제조를위한용도또는상기방법에따라얻어진유효량의말초혈액단핵구유래자연살해세포를대상체에투여하는것을포함하는암의예방및치료방법을제공한다. 본발명의일실시예에서는단핵구를방사선이조사된 Jurkat 세포와함께 IL-2 존재하에서배양한군 ( 대조군 2), 단핵구를방사선이조사된 EBV-LCL 세포와함께 IL-2 존재하에서배양한군 ( 대조군 3) 과, 단핵구를방사선이조사된 Jurkat 세포및방사선이조사된 EBV-LCL 세포와함께 IL-2 존재하에공동배양한군 ( 실험군 ) 에대하여각군에서얻어진자연살해세포의암세포살상능을평가하였다. 그결과, 대조군에비해약 800배로증식된실험군의자연살해세포가암세포살상능측면에서도약화됨없이강력한살상능을나타내는것으로확인되었다. 따라서, 본발명의방법에따라얻어진자연살해세포는암의예방및치료를위한용도로유용하게사용될수있다. 본발명에있어서, 대상체는암의예방및 / 또는치료를필요로하는인간일수있다. 대상체에는암환자뿐만아니라암의위험성을갖는환자또는정상인도포함된다. 본발명에따른말초혈액단핵구유래자연살해세포를포함하는암의예방및치료용조성물은필요에따라적절한성분을함유하는수용액 ( 예를들면, 인산염완충액, 통상의주사제용수용액등 ) 에적절한농도로말초혈액단핵구유래자연살해세포가현탁되어있는형태로제제화될수있다. 본발명에의한암의예방또는치료용의약조성물은정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내등의경로를통해통상적인방식으로투여할수있다. 본발명의의약조성물에포함되는말초혈액단핵구유래자연살해세포의유효량은암의예방또는치료효과를이루는데요구되는양을의미한다. 따라서, 질환의종류, 질환의중증도, 조성물에함유된다른성분의종류및함량, 및환자의연령, 체중, 일반건강상태, 성별및식이, 투여시간, 투여경로, 치료기간, 동시사용되는약물을비롯한다양한인자에따라조절될수있다. 이에제한되는것은아니나, 예컨대, 성인의경우, 1일 1회내지수회투여시, 본발명의말초혈액단핵구유래자연살해세포는 1X10 6 cells/kg 내지 1X10 11 cells/kg, 예컨 대 1X10 6 cells/kg 내지 1X10 8 cells/kg 의용량으로투여할수있다. [0035] 발명의효과본발명에따르면, 고가의장비나고가의다양한사이토카인을사용하지않으면서도적은양의말초혈액단핵구으로부터다량의자연살해세포를유도및증식시킬수있으므로자연살해세포를이용한암의예방및치료의효율및효능을획기적으로증진시킬수있다. 도면의간단한설명 - 7 -
[0036] 도 1a 는말초혈액에서분리한단핵구 (PBMC) 를 Jurkat 세포주와함께공동배양 (PBMC), PBMC 에서 T 세포만을 제거하여 Jurkat 세포주와함께공동배양 (PBMC-T), PBMC 에서 B 세포만을제거하여 Jurkat 세포주와함께공동 배양 (PBMC-B) 한뒤자연살해세포로의유도정도를관찰하여그결과를나타낸것이다. 도 1b는 PBMC와 Jurkat 세포주를공동배양하여자연살해세포를증식함에있어서, B 세포가단핵구내에없는경우에는자연살해세포가선택적으로증식되지않음을나타낸것이다. 도 2는사람에게서분리한 PBMC ( 말초혈액단핵구 ) 에 IL-2만처리한군 (, PBMC), PBMC를방사선이조사된 Jurkat 세포주및 IL-2와공동배양한군 (, PBMC + Jurkat), PBMC를방사선이조사된 EBV-LCL 세포주및 IL-2와공동배양한군 (, PBMC + LCL), 그리고 PBMC를방사선이조사된 Jurkat 세포주, 방사선이조사된 EBV-LCL 세포주및 IL-2와함께공동배양한군 (, PBMC + Jurkat + LCL) 의 PBMC의수를측정하여나타낸그래프이다. 도 3는 PBMC에 IL-2만처리한군 (, PBMC), PBMC를방사선이조사된 Jurkat 세포주및 IL-2와공동배양한군 (, PBMC + Jurkat), PBMC를방사선이조사된 EBV-LCL 세포주및 IL-2와공동배양한군 (, PBMC + LCL), 그리고 PBMC를방사선이조사된 Jurkat 세포주, 방사선이조사된 EBV-LCL 세포주및 IL-2와함께공동배양한군 (, PBMC + Jurkat + LCL) 의자연살해세포 (NK) 의수를측정하여나타낸그래프이다. 도 4a는 PBMC에 IL-2만처리한군 (PBMC), PBMC를방사선이조사된 Jurkat 세포주및 IL-2와공동배양한군 (PBMC + Jurkat), PBMC를방사선이조사된 EBV-LCL 세포주및 IL-2와공동배양한군 (PBMC + LCL), 그리고 PBMC를방사선이조사된 Jurkat 세포주, 방사선이조사된 EBV-LCL 세포주및 IL-2와함께공동배양한군 (PBMC + Jurkat + LCL) 의자연살해세포의분포를유세포분석기를이용하여분석한결과이다. 도 4b는 PBMC에 IL-2만처리한군 (, PBMC), PBMC를방사선이조사된 Jurkat 세포주및 IL-2와공동배양한군 (, PBMC + Jurkat), PBMC를방사선이조사된 EBV-LCL 세포주및 IL-2와공동배양한군 (, PBMC + LCL), 그리고 PBMC를방사선이조사된 Jurkat 세포주, 방사선이조사된 EBV-LCL 세포주및 IL-2와함께공동배양한군 (, PBMC + Jurkat + LCL) 의자연살해세포 (NK 세포 ) 의분포를나타낸그래프이다. 도 5는 PBMC를 IL-2와방사선조사된 Jurkat 세포주와공동배양한군 ( ), PBMC를 IL-2와방사선조사된 EBV-LCL 세포주와공동배양한군 ( ) 과 PBMC를 IL-2와방사선조사된 Jurkat 세포주및 EBV-LCL 세포주를모두이용하여공동배양한군 (*) 에서의암세포살상능이평가한그래프를보여준다. 도 6은본발명에따라제조된 NK 세포의활성화를분석한결과를보여준다. [0037] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명의이점및특징, 그리고그것들을달성하는방법은상세하게후술되어있는실시예들을참조하면명확해질것이다. 그러나본발명은이하에서개시되는실시예들에한정되는것이아니라서로다른다양한형태로구현될것이며, 단지본실시예들은본발명의개시가완전하도록하고, 본발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자에게발명의범주를완전하게알려주기위해제공되는것이며, 본발명은청구항의범주에의해정의될뿐이다. [0038] [0039] [0040] [0041] [ 실시예 ] 실시예 1 : 말초혈액단핵구로부터 NK 세포의제조사람의혈액을채혈한후, Ficoll(Ficoll-paqueTM PLUS, GE healthcare) 을이용하여 2500 rpm에서 30분간원심분리한후연막층 (buffy coat) 에서단핵세포 (PBMC) 를분리하였다. 그후트립판블루 (Tryphan Blue) 로염색하여손상된세포를제거하고, 염색되지않은세포만을헤마토사이토미터 (hematocytometer) 를이용하여계수하였다. 영양세포 (feeder cell) 로사용되는 Jurkat 세포주와 EBV-LCL 세포주는 RPMI1640 배지에 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin을넣은 human RPMI 배지에 75T 플라스크에 37, 5% CO 2 의조건에서배양하였다. 2-3 일마다한번씩 IL-2 가 500 U/ml 로첨가된 hrpmi 배지를넣어주었으며, 5 일간격으로세포를모두수확한후 IL-2 가첨가된새로운 hrpmi 배지를넣어주었다. [0042] 세포수를헤마토사이토미터를이용하여측정한후각각 1 10 6 /ml 의농도의 Jurkat 세포주와 EBV-LCL 세포주에 - 8 -
2.22 Gy/min 의세기로 100 Gy 방사선을조사하였다. [0043] IL-2 가 500 U/ml 농도로첨가된 hrpmi 배지를 24 웰플레이트에넣은후, 방사선이조사된각각의 Jurkat 세포주, EBV-LCL 세포주와앞서분리한단핵구를각각 1:0.5:0.5 비율로 37, 5% CO 2 가공급되는배양기에서 배양하였다 ( 실험군 ). [0044] 또한상기와동일한방법을이용하여영양세포주를첨가하지않고단핵구를 IL-2 존재하에서배양한군 ( 대조 군 1), 단핵구를방사선이조사된 Jurkat 세포를첨가하고 IL-2 존재하에서배양한군 ( 대조군 2), 단핵구를방 사선이조사된 EBV-LCL 세포를첨가하고 IL-2 존재하에서배양한군 ( 대조군 3) 을대조군으로하였다. [0045] [0046] [0047] 실시예 2: NK 세포의증식능측정영양세포가자연살해세포의증식에미치는영향을보기위하여, 실시예 1에따른실험군과, 대조군 1, 대조군 2 및대조군 3에대해배양 0일, 5일, 11일, 14일에각각세포수를측정하고형광이부착된 CD56과 CD3에대한항체를이용하여염색한후유세포분석기 (flow cytometry) 로분석하여 NK 세포 (CD56+, CD3-) 군을분석하였다. 그후 NK 세포수를총 PBMC와 NK 세포의분포를이용하여계산하였다. 그결과도 2에서볼수있듯이, PBMC 세포는 Jurkat 세포와 EBV-LCL 세포를함께넣고공동배양한실험군 (, PBMC + Jurkat + LCL) 의경우, 배양 14일째에대조군 1 (, PBMC), 대조군 2 (, PBMC + Jurkat), 대조군 3 (, PBMC + LCL) 에비하여약 147배증가하였음을확인하였다. 또한도 3에서볼수있듯이 NK 세포의증가는다른대조군에비해 Jurkat 세포와 EBV-LCL 세포를함께넣고공동배양시다른대조군에비해실험군에서 14일째에는약 800배증가함을확인하였다. [0048] [0049] 실시예 3: NK 세포의 enrichment 정도측정영양세포와사이토카인이 NK 세포로의 enrichment 에미치는영향을분석하기위하여, 실시예 1에따른실험군과, 대조군 1, 대조군 2 및대조군 3에대해배양 0일, 5일, 11일, 14일에각각형광이부착된 CD56, CD3 항체를이용하여염색한후유세포분석기로분석하였다. 그결과, 14일경과후 Jurkat 세포주와 EBV-LCL 세포주와단핵구를공동배양한경우자연살해세포의표현형인 CD56+, CD3- 세포의비율이 70% 이상까지증가함을확인하였다 ( 도 4a). 도 4b는배양 14일째유세포분석기를이용하여 NK 세포의분포를그래프로나타낸것이다. [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] 실시예 4 : 본발명에따라제조된 NK 세포의암세포살상능측정실시예 1에따라방사선조사된 Jurkat 세포주및방사선조사된 EBV-LCL 세포주를영양세포로이용하여제조된 NK 세포의암세포살상능을평가하기위하여, 종양세포 (K562, Jurkat) 를표적세포로하여 51Cr release assay를수행하였다. 먼저, 암세포인 K562와 Jurkat 세포의세포수를측정한후동위원소인 51Cr을각각암세포에표지하여 1시간동안세포배양기에서반응시켰다. 동위원소로표지된암세포를 hrpmi 배지로동위원소를 3회씻어주었다. 실시예 1의실험군, 대조군 2 및대조군 3에따라얻어진세포들을 hematocytometer를이용하여계수한후동위원소가표지된암세포와 10:1, 3:1, 1:1의비율로 4시간동안공동배양하였다. 4시간후 2500 rpm에서 5분간원심분리한후상등액을튜브에넣어감마카운터 (gamma counter) 로측정하였다. 도 5에서볼수있는바와같이, IL-2와방사선조사된 EBV-LCL 세포주를사용한대조군 3 ( ) 과방사선조사된 Jurkat 세포주및 EBV-LCL 세포주를모두이용하여공동배양한실험군 (*) 에서암세포살상능이 IL-2와방사선조사된 Jurkat 세포주를이용한대조군 2( ) 와비슷한것을확인하였다. 또한, E:T( 효력세포 : 표적세포 ) 의비율이 1:1 임에도불구하고상당한살상능을보유하고있음을확인할수있었다. 이러한결과들을종합해볼때, 본발명에따른 IL-2와방사선조사된 Jurkat 세포및방사선조사된 EBV-LCL 세포를처리한말초혈액단핵구의경우자연살해세포로의높은 enrichment 뿐만아니라높은암세포살상능을보임을확인할수있었다. - 9 -
[0055] [0056] [0057] 실시예 5 : 본발명에따라제조된 NK 세포의활성화측정실시예 4에서실시예 1에따라방사선조사된 Jurkat 세포주및방사선조사된 EBV-LCL 세포주를영양세포로이용하여제조된 NK 세포의암세포살상능이높았기때문에이에따른활성화마커를평가하기위하여 11일동안배양한 NK세포에서다양한 NK세포관련활성화및억제수용체의발현을유세포분석기를사용하여조사하였다. 도 6에서보는바와같이 ICAM-1, CD11a, CD48, CD2, CD49d, CD58과같은세포부착분자, NKp30, NKp44, 2B4, DNAM-1, NKG2D와같은활성화수용체, CD69, CD25와같은활성화마커의발현이증가되어있고 CD183, CD184, CCR7과같은케모카인수용체의발현이약간증가되어있고 CD158a, CD158b, CD94, NKB1, KIRNKAT2와같은억제수용체의발현이증가되어있는것을알수있다. 도면 도면 1a 도면 1b - 10 -
도면 2-11 -
도면 3 도면 4a - 12 -
도면 4b 도면 5-13 -
도면 6-14 -