(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 39/395 (2006.01) C12P 21/08 (2006.01) A61P 29/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2012-7016646 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2010 년 11 월 29 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2012 년 06 월 26 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2010/058188 (87) 국제공개번호 WO 2011/066501 국제공개일자 (30) 우선권주장 2011 년 06 월 03 일 61/265,079 2009 년 11 월 30 일미국 (US) (11) 공개번호 10-2012-0116947 (43) 공개일자 2012년10월23일 (71) 출원인 얀센바이오테크인코포레이티드 미국, 펜실베니아주 19044, 호샴, 릿지뷰드라이브 800/850 (72) 발명자 스트롤윌리엄 미국펜실베니아 19087 래드너킹오브프러시아로드 145 바파오미드 미국펜실베니아 19087 래드너킹오브프러시아로드 145 (74) 대리인 최규팔 전체청구항수 : 총 17 항 (54) 발명의명칭이펙터기능이제거된항체 Fc 돌연변이체 (57) 요약 Fc 영역에서변이를갖는항체및기타 Fc- 함유분자는 Fc 감마수용체에의결합및생성된활성을감소시키며, 다양한질환및장애의치료에사용될수있다. 대표도 - 도 1-1 -
특허청구의범위청구항 1 돌연변이된 IgG 불변영역을갖는항체 Fc 도메인을포함하고, 여기에서 EU 넘버링 (numbering) 시스템에의해정의된아미노산잔기 233, 234, 235, 237 및 238은 PAAAP ( 서열번호 4), PAAAS ( 서열번호 5), 및 SAAAS ( 서열번호 6) 로부터선택되는서열을포함하는, 야생형 Fc와비교하여적어도하나의 Fcγ 수용체에대한친화성이감소된 Fc-함유분자. 청구항 2 제1항에있어서, Fc 도메인이 EU 넘버링시스템에의해정의할때돌연변이 H268A 또는 H268Q, V309L, A330S 및 P331S를추가로포함하는 Fc-함유분자. 청구항 3 제1항에있어서, 상기도메인이 FcRn에특이적으로결합할수있는 Fc-함유분자. 청구항 4 제1항에있어서, Fc 도메인서열이인간 IgG2 중쇄 CH2 도메인과의동일성이 90% 이상인 Fc-함유분자. 청구항 5 제1항에있어서, 항체또는 Fc 융합단백질인 Fc-함유분자. 청구항 6 제1항에있어서, 잔기 228이 S로부터 P로돌연변이된 Fc-함유분자. 청구항 7 (i) 표적분자에결합할수있는결합도메인, 및 (ii) 인간면역글로불린중쇄의 CH2 및 CH3 불변도메인의전부또는일부에대하여사실상상동성인아미노산서열을갖는 Fc 도메인을포함하며, 여기서 EU 넘버링시스템에의해정의된잔기 233, 234, 235, 237 및 238은 PAAAP, PAAAS 및 SAAAS로부터선택되는아미노산서열을포함하고 ; 결합분자는표적의유의한보체의존성용해또는세포매개파괴의촉발 (triggering) 없이표적분자에결합할수있는재조합폴리펩티드기반결합분자. 청구항 8 제7항에있어서, Fc 도메인이 FcRn에특이적으로결합할수있는결합분자. 청구항 9 제8항에있어서, 결합도메인이항체의결합부위 ; 효소 ; 호르몬 ; 수용체 ; 사이토카인 ; 면역세포표면항원 ; 리간드및부착분자로부터선택되는결합분자. 청구항 10 제9항에있어서, 친화력 (avidity) 을나타내는결합분자. 청구항 11 제7항내지제10항중어느한항에있어서, 결합도메인이신경조직, 내분비조직, 맥관조직, 심장조직, 활막조직, 피부조직또는점막조직내의표적에특이적으로결합하는결합분자. 청구항 12 대상또는환자에게제1항내지제7항중어느한항에따른 Fc-함유단백질제제를투여하는단계를포함하는, - 2 -
대식세포의이동및집중을특징으로하는질환을치료하는방법. 청구항 13 대상또는환자에게제1항내지제7항중어느한항에따른 Fc-함유분자를투여하는단계를포함하는, 이식편대숙주질환 ; 숙주대이식편질환 ; 기관이식거부 ; 골수이식거부 ; 자가면역, 맥관염, 자가면역성용혈성빈혈, 자가면역성혈소판감소증및관절염 ; 태아 / 신생아동종면역성혈소판감소증등의동종면역 ; 천식및알러지 ; 만성또는급성염증성질환, 크론병 (Crohn's Disease) 또는경피증 ; 알츠하이머병 (Alzheimer's Disease), 또는관상동맥폐색증을치료하는방법. 청구항 14 대상또는환자에게제1항내지제7항중어느한항에따른 Fc-함유분자를투여하는단계를포함하되, 상기결합분자는환자에게투여되거나또는선택적으로환자가태어나지않은아이일경우환자의어머니에게투여되는, 병태의치료방법. 청구항 15 EU 넘버링시스템에의해정의된아미노산잔기 233, 234, 235, 237 및 238이 PAAAP, PAAAS 및 SAAAS로부터선택된서열을포함하는, IgG2 불변영역을기반으로하며 EU 넘버링시스템에의해정의할때돌연변이 H268A 또는 H268Q, V309L, A330S 및 P331S를추가로포함하는항체 Fc 도메인을포함하는, 야생형 Fc와비교하여 Fcγ 수용체에대한친화성이감소된 Fc-함유분자. 청구항 16 EU 넘버링시스템에의해정의된아미노산잔기 233, 234, 235, 237 및 238에서 IgG2 불변영역을기반으로하는 Fc 도메인의서열을변경시켜 PAAAP, PAAAS 및 SAAAS로부터선택되는서열을포함하게하고, 돌연변이 H268A 또는 H268Q, V309L, A330S 및 P331S를포함하게하는단계를포함하는, 야생형 IgG2 기반 Fc와비교하여 Fcγ 수용체에대한 IgG2 기반 Fc-함유분자의결합성을변경시키는방법. 청구항 17 본명세서에기재된임의의발명. 명세서 [0001] 기술분야본발명은표면표적항원들의 Fc 수용체매개된가교결합에의해면역세포에의해세포분열반응을활성화하거나또는 Fcγ 수용체에특이적으로결합하는능력이사실상손실되도록돌연변이된인간항체 IgG2 불변영역 (Fc 영역 ) 에관한것이다. 또한본발명은돌연변이된 IgG2 불변영역이포함될수있는신규한항체를제공한다. [0002] [0003] 배경기술세포표면항원을표적화하는항체는면역세포상에서의 Fc 수용체 (FcR) 참여 (engagement) 및보체활성화와관련된원하지않는면역자극및이펙터 (effector) 기능을촉발한다. 치료적항체및 Fc-융합제작물은표적리간드기능을표적화하여그를활성화하거나또는중화시키지만필요한국소적세포또는조직은손상시키지않거나파괴하지않도록의도되었기때문에, 이펙터기능이제거된 Fc 돌연변이체가추구되었다. 인간 IgG 아이소타입 (isotype)( 성숙감마글로불린클래스 G 항체의하위클래스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 은항체의존성세포독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity)(adcc, 예를들어, IgG1 및 IgG3), 항체의존성세포식작용 (antibody-dependent cellular phagocytosis)(adcp, 예를들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), 및보체의존성세포독성 (complement dependent cytotoxicity)(cdc, 예를들어, IgG1, IgG3) 과같은면역기능을모집하는차등적능력을나타낸다. 이러한면역기능의아이소타입-특이적참여는특유한면역세포상의 Fc 수용체에대한선택성및 C1q에결합하여막공격복합체 (membrane attack complex; MAC) 의어셈블리 (assembly) 를활성화시키는능력을기반으로한다. 다양한아이소토프들중에서, Fcγ 수용체 ( 예를들어, Fc γri, FcγRIIa/b/c, FcγRIIIa/b) 에대한상대적인친화성은 IgG1 및 IgG3에있어서높지만, IgG2 (FcγRIIa - 3 -
131H 다형성에제한됨 ) 에있어서는친화성이최소이고단지 IgG4가 FcγRI에대하여측정가능한친화성을갖는다. 비교서열분석및동시결정구조를이용하면, 수용체결합에있어서의핵심접촉잔기는하부힌지 ( 힌지 ) 및 CH2 영역에스패닝하는 (spanning) 아미노산잔기에맵핑되었다. 표준단백질공학기술을이용하면, 보체의 C1q 성분및 Fc 수용체에대한항체제제의친화성의향상또는감소에서약간의성공이성취되었다. [0004] 아이소타입들중에서, IgG2 가 Fc 수용체의패밀리에가장적게결합할수있다. IgG2 를출발점으로이용하여, 이펙터기능이감소되었지만 FcRn 결합성, 장기간안정성및낮은면역원성을보유하는돌연변이원을찾으려는 노력이있어왔다. 이러한성질의개선된돌연변이체는안전성이유지된개선된항체치료제를제공할수있다. [0005] [0006] [0007] 발명의내용본발명은항체또는항체유사치료제의조작에서유용한변경된글리코실화면역글로불린불변도메인의조성물, 예를들어 Fc 영역을포함하고세포표면리간드를표적화하는것을제공한다. 본발명의조성물은감소된 FcγR 결합능력을나타내지만 FcRn 결합성이보존된 IgG2 Fc 돌연변이체이다. 이들 IgG Fc 돌연변이체는보체매개된세포독성및면역이펙터기능의 Fc-관련된참여를최소화하면서용해성항원또는세포표면항원의치료적표적화를가능하게한다. 일태양에서, IgG2 Fc 돌연변이체는 EU 넘버링 (numbering) 시스템에따라 V234A, G237A, P238S를포함한다. 다른태양에서, IgG2 Fc 돌연변이체는 EU 넘버링시스템에따라 V234A, G237A, H268Q 또는 H268A, V309L, A330S, P331S를포함한다. 특정태양에서, IgG2 Fc 돌연변이체는 EU 넘버링시스템에따라 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S, 및선택적으로 P233S를포함한다. 일실시형태에서, IgG2 Fc 돌연변이체조성물은치료적항체 ( 또는 Fc-융합물 ) 의반감기의유지가 FcRn과의상호작용을통하여보존되는반면면역및이펙터기능과관련된 FcγR의활성화로부터유래되는잠재적인독성, 예를들어 i) 항체의존성세포독성 (ADCC), ii) 보체의존성세포독성 (CDC), iii) 항체의존성세포식작용 (ADCP), iv) FcR-매개된세포활성화 ( 예를들어 FcR 가교결합을통한사이토카인방출 ), 및 v) FcR-매개된혈소판활성화 / 고갈이최소화되거나또는제거된징후에서사용된다. 일태양에서, IgG2 Fc 돌연변이는바인더 (binder), 예를들어다가바인더, 신경장애, 예를들어기저세포결절종 ; 면역계장애, 예를들어 B-세포또는 T-세포활성화에관련된것에연루된세포, 또는조직복구또는치유에연루된세포, 예를들어섬유아세포또는줄기세포상의표적화리간드의치료적항체또는 Fc-융합물내로포함된다. 다른실시형태에서, IgG2 Fc 돌연변이체는약학조성물에포함된다. 다른실시형태에서, IgG2 Fc 돌연변이체는약학적활성분자의일부분에포함된다. IgG2 Fc 돌연변이체또는활성 IgG2 Fc 돌연변이체-함유분자를포함하는약학조성물은대식세포또는단구의이동및집중을특징으로하는질환의치료에유용하다. 일태양에서, IgG2 Fc 돌연변이체-함유분자는신경조직, 내분비조직, 혈관조직, 심장조직, 활막조직, 피부조직또는점막조직내의표적의결합에유용하다. 본발명의 IgG2 Fc 돌연변이체의많은용도들중하나는이식편대숙주질환 ; 숙주대이식편질환 ; 기관이식거부 ; 골수이식거부 ; 자가면역, 예를들어맥관염, 자가면역성용혈성빈혈, 자가면역성혈소판감소증및관절염 ; 동종면역, 예를들어태아 / 신생아동종면역성혈소판감소증 ; 천식및알러지 ; 만성또는급성염증성질환, 예를들어크론병 (Crohn's Disease) 또는경피증 ; 알츠하이머병 (Alzheimer's Disease), 관상동맥폐색증의치료에있어서의것이있다. [0008] 도면의간단한설명 < 도 1> 도 1은각각의잔기에있어서의상응하는 EU 넘버링을나타내는야생형인간 IgG2 ( 서열번호 1), IgG4 ( 서열번호 2), 및 IgG1 ( 서열번호 3) 의아미노산서열의정렬을나타내며 ; IgG2의힌지영역은 EU 잔기 218에서시작한다. < 도 2> 도 2는변경된잔기 (EU 넘버링 ) 의표면위치를나타내는 Fc 단편의구조를나타낸다. < 도 3a 내지도 3c> 도 3a 내지도 3c는알파스크린 (AlphaScreen) 비드분석플랫폼 (platform) 을이용한, 항-Her2/neu 결합항체로서제작된각각의아이소타입및돌연변이체와인간 IgG1 야생형아이소타입의항체의경쟁을나타내는그래프이다 : FcgRI ( 도시되지않음 ), FcgRIIa ( 도 a), FcgRIIb ( 도 b), FcgRIIIa ( 도시되지않음 ), 및 FcRn ( 도 c). - 4 -
< 도 4a 내지도 4c> 도 4a 내지도 4c는알파스크린비드분석법을이용한, 항-Her2/neu 결합항체로서제작된각각의아이소타입및돌연변이체의직접적인결합을나타내는그래프이다 : FcgRIIIa ( 도 a), FcgRI ( 도 b), 및 FcgRIIa ( 도 c). < 도 5> 도 5는 ADCC 분석및항-Her2/neu 결합항체로서제작된그리고인간 PBMC (25X 과량 ) 및 SK-Br3 유방암세포를표적으로사용한선택된아이소타입및돌연변이체의결과를나타낸다. < 도 6> 도 6은인간보체및 WIL2-S 림프종세포를표적으로사용한선택된항-CD20 제작물의 CDC 분석의결과를나타낸다. < 도 7> 도 7은 Sk-Br3 표적세포및 GM-CSF-분화대식세포를사용한선택된항-Her2/neu 제작물의유세포분석법적분석으로부터의 ADCP 분석의결과를나타낸다. < 도 8> 도 8은 IgG2 야생형및 6가지의돌연변이체를비롯하여다양한제작물에있어서 IgG 아이소타입에결합된비드를이용하여 PBMC를자극한지 24시간후사이토카인 (TNFα) 방출을나타내는그래프이다. < 도 9> 도 9는다양한 Fc 영역을포함하거나또는 Fc-영역 (Fab')2가결여된항-CD20 결합도메인항체제작물을주사한사이노몰루구스 (cynomologous) 원숭이군에서시간이지남에따른평균순환 B-세포의수의그래프이다. 서열목록의간단한설명 발명을실시하기위한구체적인내용 - 5 -
[0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] 약어 ADCC = 항체의존성세포독성 ; ADCP, 항체의존성세포식작용 ; CDC = 보체의존성세포독성 ; IgG = 면역글로불린 G; ITAM = 면역수용체타이로신활성화모티프 (motif); ITIM = 면역수용체타이로신저해모티프 ; Mab = 단클론항체 ; FDCR = Fc 의존성사이토카인방출 (Fc-dependent cytokine release); FcγR, FcgR, 또는 Fc감마R = Fc 감마수용체정의및용어의설명 " 항체의존성세포매개세포독성 " 또는 "ADCC" 는분비된 Ig가소정의세포독성세포 ( 예를들어, 자연살해 (Natural Killer; NK) 세포, 호중구및대식세포 ) 상에존재하는 Fc 수용체 (FcR) 상에결합하는형태의세포독성을말하며, 이는이들세포독성이펙터세포가항원-보유표적세포에특이적으로결합하여후속적으로표적세포를세포독소로살해하는것을가능하게한다. 표적세포의표면으로인도된리간드특이적고친화성 IgG 항체는세포독성세포를자극하고이러한살해에절대적으로필요하다. 표적세포의용해는세포외적인것이며, 직접적인세포-세포접촉을필요로하고, 보체를수반하지않는다. 임의의특정항체가 ADCC에의해표적세포의용해를매개하는능력이분석될수있다. ADCC 활성을평가하기위하여, 관심있는항체는면역이펙터세포와조합된표적리간드를디스플레이하는표적세포에첨가되며, 이는항원항체복합체에의해활성화되어표적세포를세포분해시킬수있다. 일반적으로세포분해는용해된세포로부터의표지체 ( 예를들어, 방사능기질, 형광염료또는천연세포내단백질 ) 의방출에의해탐지된다. 이러한분석에유용한이펙터세포는말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell; PBMC) 및천연살해 (NK) 세포를포함한다. 시험관내 ADCC 분석법의구체적인예가문헌 [Wisecarver et al, 1985, 19:211]; 문헌 [Bruggemann et al, 1987, J Exp Med 166:1351]; 문헌 [Wilkinson et al, 2001, J Immunol Methods 258:183]; 문헌 [Patel et al, 1995 J Immunol Methods 184:29] ) 이들각각은참고로포함됨 ) 에기재되어있다. 대안적으로, 또는부가적으로, 관심있는항체의 ADCC 활성은생체내에서, 예를들어동물모델에서, 예컨대문헌 [Clynes et al, 1998, PNAS USA 95:652] 에개시된것에서평가될수있으며, 상기문헌의내용은전체적으로참고로포함된다. " 보체유도성세포독성 (Complement-directed cytotoxicity)" 또는 CDC는보체캐스케이드 (cascade) 가항체 Fc 에의보체성분 C1q의결합에의해활성화되는형태의세포독성을말한다. 본명세서에사용되는바와같이, 용어 "Fc", "Fc-함유단백질 " 또는 "Fc-함유분자 " 는적어도면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을갖는단량체형, 이량체형또는헤테로이량체형단백질을말한다. CH2 및 CH3 도메인은단백질 / 분자 ( 예를들어, 항체 ) 의이량체영역의적어도일부분을형성할수있다. 본명세서에사용되는바와같이, 용어 " 단클론항체 " 는동물항체의적어도하나의종의중쇄또는경쇄항체가변도메인의적어도하나에대하여상당한상동성을보유하는적어도하나의리간드결합도메인을포함하는 Fc-함유단백질의특정한형태이다. " 야생형인간 IgG2 Fc 영역 " 은서열번호 1의아미노산서열을포함하는인간 IgG Fc 영역또는그의단편을말하며, 이는카밧 (Kabat) 의 EU 넘버링에따르면인간 IgG 중쇄의잔기 K218 내지잔기 K447이다. 불변영역내의아미노산은인간 IgG1 항체, EU IgG1 ( 서열번호 3) 과의정렬에의해넘버링된다 ( 문헌 [Cunningham et al., 1970 J. Biol. Chem., 9: 3161-70] 참조 ). 즉, 항체의중쇄및경쇄는아미노산서열동일성이최대화되도록 EU의중쇄및경쇄와정렬되며, 항체에서의각각의아미노산은 EU에서의상응하는아미노산과동일한번호를할당받는다. EU 넘버링시스템은당업계에서통상적으로사용된다 ( 일반적으로, 문헌 [Kabat et al, Sequences of Protein of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services (1991)] 참조 ). 이러한관례에따르면, 기재된 " 야생형 IgG2" 불변영역은 236 위치의아미노산이결여되어있다 ( 도 1, 서열번호 1). 개관본발명은사이토카인방출을야기하는것에대한무능력또는표적리간드디스플레이세포및표적화세포를둘러싸고있는조직을손상시키거나또는살해하는것에대한무능력의견지에서안전성이개선된치료적항체, Fc-융합물및유사바이오의약품의제조에서사용하기위한 Fc 도메인을확인하는데있어서의관심에의해동기가부여되었다. 인간 IgG4 아이소타입항체및 Fc-융합단백질은유의한 ADCC ( 배타적으로 FcgRIIIa를발현하는 NK에의한 - 6 -
것임 ) 를불러일으키지않지만, 대식세포 (FcγRI, IIa 및 IIIa를발현함 ) 에의해식작용 (ADCP) 을유도하고가능하게는단구를활성화시키는능력을유지하는데, 이는면역복합체형태로있고특정면역세포상의활성화 FcγR의분포에기인할때그러하다. 잔여활성을최소화하려는노력은야생형 IgG4 Fc ( 서열번호 2) 내에 V234A, L235A (ala/ala) 를포함하는돌연변이체의개발및그의사용으로이어졌다. [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] 아무르 (Armour) 등은다수의점돌연변이를 IgG2 내에서생성하여 FcgRI에의결합 ( 문헌 [Armour et al, 1999]) 및 FcgRIIa 및 IIIa에의결합 ( 문헌 [Armour et al. 2003]) 을최소화하였다. 뮐러 (Mueller) 등의국제특허공개 WO97/11971호에개시된추가의돌연변이는 IgG2 CH2 및 IgG4 CH3 도메인으로이루어진 IgG2/IgG4 하이브리드로부터유래되며, 구체적으로잔기 330 및 331은본발명의 IgG2 돌연변이체에서의 IgG4로부터의것이다. 면역자극효과를감소시키기위한뮤팅 (muting) 또는사일런싱 (silencing) 노력이또한이용되었다. IgG1 ( 서열번호 3) 에있어서최소이펙터기능을갖는 mab를생성하기위한두하위클래스사이에서의 IgG2 또는 IgG4 또는도메인스와핑 (swapping) ( 문헌 [Tao et al, 1991]). 스트롤 (Strohl) 의미국특허공개제2007/0148167호에는잔기 EU 위치 268, 309, 330 및 331에서의 IgG2에서의 4개의돌연변이가개시되어있다. 문헌 [Shields et al. (2001)] 에는추가의치환, H268A가개시되어있다. 본발명은카밧 /EU 넘버링시스템에따라 IgG2 불변영역 (Fc) 의다수의위치에서의 IgG4 잔기 H268Q 또는 A, V309L, A330S 및 P331S에의한치환을처음으로보여준다. 예기치않게도, 다수의잔기치환의유도된선택은측정가능한이펙터기능이없는치료적실체 (entity) 를제공할가능성뿐만아니라융합폴리펩티드로서이용되는그리고항체공학에서사용하기위한기능적 Fc 도메인도제공하였다. 다중치환된 IgG2 돌연변이체는알파스크린경쟁분석법및 SPR/ 바이아코어 (Biacore) 분석법에의해평가되는인간 FcR (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 FcRn) 에대한그의상대적인친화성을바탕으로하여선발되었다. 이들돌연변이체는추가로 PBMC에의한 TNF-α 분비를촉발할뿐만아니라 CDC, ADCC 및 ADCP를유도하기도하는그의능력에대하여적절한세포시스템에서시험되고순위가매겨졌다. 본명세서에제공된실험데이터세트에서, IgG2 돌연변이체는야생형 IgG1 및 IgG2에더하여 IgG1 ag 및 IgG4 Ala/Ala를포함하는돌연변이체또는공지된제제와도비교되었다. 몇몇시험관내생물분석법에서의이들돌연변이체의추가의분석에의하면최소수준내지검출불가능한수준의활성및 FcR에대한크게제거된결합친화성이입증되었다. 이들스크린을기반으로하면, IgG2c4d로표기되는 IgG2 Fc 돌연변이체는 FcR에대한검출가능한친화성또는친화력이없는것으로확인되었으며 ( 단량체형리간드결합대바이-다량체형리간드결합 ), 이는다양한전술한이펙터 / 면역자극생물분석법에서활성이없다. IgG2c4d Fc는알라닌, 세린및류신치환, 즉 V234A, G237A, P238S, H28A, V309L, A330S, P331S (EU 넘버링 ) 를포함한다. 7개의잔기가치환된 IgG2, IgG2c4d는그의 FcR 에의결합에대한무능력, 이펙터기능을매개하는것에대한무능력또는 Fc-매개된사이토카인방출에의참여에대한무능력면에서첫번째의실제로 " 사일런싱된 " Fc로간주될수있다. 본발명의발견을기반으로하면, IgG2c4d의 7개의돌연변이의하위세트가사용될수있거나또는이것이다른아미노산돌연변이체와조합될수있거나, 또는당해돌연변이가다른 IgG 아이소타입에서사용되어본명세서에교시된그리고당업계에공지된것과조합된이펙터기능들의유사한또는선택적인사일런싱이성취되게할수있다. 본명세서에구체적으로예시된바와같이, 삼중 V234A, G237A, P238S 치환은당해분자의 FcRn 결합친화성을유지하면서 FcγRIIa 결합친화성및 FcγRIIa 결합친화력을감소시키고 ADCP 및 Fc-의존성사이토카인방출을제거한다. - 7 -
표 1 [0026] 표 2 [0027] 표 3 [0028] [0029] [0030] [0031] 변경된 Fc-함유분자의제조방법천연항체 Fc의구조적특징, 유지된 FcRn 결합성, 우수한안정성, 및보체캐스케이드, 세포용해, 세포식작용또는사이토카인방출의감소된자극능력을갖는조성물을생성하려는욕구를기반으로하여치환부위가선택되었다. IgG 클래스항체는 2가이기때문에, 이는기능적회합에있어서중쇄및경쇄가변도메인으로이루어진 2개의 - 8 -
전 Fv 도메인을갖는다. 2가는동일하거나또는특유한세포상의표적항원또는 Fc 수용체를가교결합시키는능력뿐만아니라친화력효과도제공하고, 이로써항체의표적비-특이적수용체결합유도생물활성의스펙트럼을유발하게된다. 이러한이유때문에, 본발명의 Fc 돌연변이체는 " 친화력맥락 " 내에서시험되었으며, 이는 IgG의 Fc 돌연변이체가표면상에서다량체화되었으며이것이특정 Fc 수용체의다량체와의상호작용에대하여시험되었음을의미하였다. [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] 돌연변이체의생물학적특성화 Fc-함유단백질은몇몇의잘알려진시험관내분석법에의해기능성에대하여비교될수있다. 특히, Fcγ 수용체의 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 패밀리의구성원에대한친화성이관심있다. 이들측정은재조합용해성형태의수용체또는세포-회합된형태의수용체를이용하여행해질수있다. 게다가, IgG의장기간순환반감기에책임이있는수용체인 FcRn에대한친화성이예를들어재조합용해성 FcRn을이용한 " 알파스크린 " 의리간드결합비드포맷을이용하여측정될수있다. 높은처리량의스크리닝에사용되는알파스크린은결합과같은분자적사건의검출을허용하는균질분석기술이다. 코팅된 " 도너 (donor)" 및 " 억셉터 (acceptor)" 비드는이분석기술의기초이다. 비드기반분석법으로서, 알파스크린은매우근접한비드들의상호작용을통하여작용하며, 이는크게증폭된시그널을생성하는작용을하는화학반응들의캐스케이드로이어진다. 직접적인또는간접적인, 예를들어경쟁적인결합의측정은단백질들중에서그리고그사이에서상대적인친화성및친화력을평가하는데적용될수있다. 인간 IgG 아이소타입 ( 예를들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 의자연진화는각각이면역기능, 예를들어항체의존성세포독성 (ADCC, 예를들어 IgG1 및 IgG3), 항체의존성세포식작용 (ADCP, 예를들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), 및보체의존성세포독성 (CDC, 예를들어 IgG1, IgG3) 을모집하는능력의상이한스펙트럼을나타내게하였다. 이들기능의아이소타입-특이적참여는특유한면역세포상에존재하는 Fc 수용체에대한차등적인선택성을기반으로하며, 이외에도 C1q에결합하여막공격복합체 (MAC) 의어셈블리를활성화시키는능력을기반으로하는데, 이는이펙터대식세포상의특정수용체결합보체성분을통한 CDC 및 CDP( 보체의존성식작용 ) 로이어진다. 인간아이소타입의, 보체캐스케이드의처음성분, C1q에결합하는능력의계급은, 미생물감염에있어서 IgG2 및 IgG4에의한보체활성화가잘입증되어있기는하지만, IgG1>IgG3>IgG2>IgG4 이다. 세포기반의기능분석, 예를들어 ADCC 및 CDC는특정한변이형구조의가능한기능적결과의통찰을제공한다. 항체의존성세포매개세포독성 (ADCC) 은 Fc 수용체 (FcR) 를발현하는비특이적세포독성세포 ( 예를들어, 천연살해 (NK) 세포, 호중구및대식세포 ) 가표적세포상의결합된항체를인식하고후속적으로표적세포의용해를야기하는세포-매개된반응이다. 일실시형태에서, ADCC 분석은일차이펙터세포로서 NK 세포를갖도록구성되며, 이는이들세포에의해발현되는것으로공지된유일한 Fcγ형수용체인 FcγRIIIA에대한기능적영향을반영한다. 또한식작용분석을이용하여상이한돌연변이체들의면역이펙터기능을비교할수있으며, 이는세포반응, 예를들어수퍼옥사이드 (superoxide) 또는염증매개자방출을측정하는분석법이그러할수있는바와같다. 생체내모델은 Fc 변이체의연구에유용한것으로증명되었다. 예를들어, 생쥐에서 T 세포활성화를측정하기위하여항-CD3 항체의돌연변이체를이용하여입증되는바와같이, 특정리간드, 예를들어 Fcγ 수용체에참여하는 Fc 도메인에의존적인활성. 대식세포의항체유도활성화는항체의존성세포식작용 (ADCP) 을매개하며, 이는옵소닌화된표적세포가대식세포에의해휩싸여져서소화되게한다. 시험관내에서, 높은수준의 FcR을발현하는분화된대식세포는 IFNγ 또는 GM-CSF를이용하여 M1 표현형으로분화시켜서단구에비하여상승된수준의모든 FcR((FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa) 이발현되게할수있다. 이러한분석법은항체공학기술분야의숙련자에게공지되어있다. 항체의제조방법 Fc 돌연변이체의생성및시험에서출발점으로사용되는인간 IgG2 불변도메인의서열에서의지시된돌연변이 (directed mutation) 를생성하기위하여일상적인재조합공정을이용하였다. 회수및시험을위하여다양한숙주세포에서원하는아미노산서열의발현에적합한벡터를생성하기위하여코딩서열에서변화를생성하는다양한기술이사용될수있음이당업자에게인식될것이다. 숙주세포선발또는숙주세포조작본명세서에기재된바와같이, 재조합 Fc-함유단백질또는단클론항체의발현용으로선택된숙주세포는제 - 9 -
한없이면역글로불린 CH2 도메인에서단백질을장식하는올리고당부분 (moiety) 의조성에서의변이를비롯하여 최종조성에의중요한기여자이다. 따라서, 본발명의일태양은원하는치료적단백질을발현하는생산세포 의사용및 / 또는개발에적절한숙주세포의선발을포함한다. [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] 또한, 숙주세포는포유류기원의것일수있거나, 또는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충또는식물세포, 또는이들의임의의유도체, 불사화또는형질전환세포로부터선택될수있다. 대안적으로, 숙주세포는폴리펩티드를글리코실화할수없는종또는유기체, 예를들어원핵세포또는유기체, 예를들어천연또는조작이. 콜라이 (E. coli) spp, 클렙시엘라 (Klebsiella) spp., 또는슈도모나스 (Pseudomonas) spp. 로부터선택될수있다. 항체본출원에기재된항체는임의의포유류, 예를들어, 그에한정되는것은아니지만인간, 생쥐, 토끼, 쥐, 설치류, 영장류, 염소, 또는이들의임의의조합을포함하거나또는그로부터유래될수있으며, 이는단리된인간, 영장류, 설치류, 포유류, 키메라, 인간화및 / 또는 CDR-그래프팅 (grafted) 항체, 면역글로불린, 이들의절단생성물및기타특정부분및변이체를포함한다. 본명세서에기재된항체, Fc-함유단백질또는 Fc 단편은당업계에잘알려진몇몇방식으로유도될수있다. 일태양에서, 항체는편리하게는생쥐또는기타동물을표적펩티드, 세포또는조직추출물로면역화함으로써제조되는하이브리도마로부터얻어진다. 이와같이항체는당업계에잘알려진임의의하이브리도마기술을이용하여얻어질수있으며, 예를들어전적으로본명세서에참고로포함된문헌 [Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 을참조하라. 항체또는 Fc-융합단백질또는이들의구성요소및도메인이또한이러한도메인또는구성요소의라이브러리, 예를들어파지라이브러리로부터의선발에의해얻어질수있다. 파지라이브러리는면역화된동물또는인간의 B-세포유래의것과같은관심있는서열을함유하는폴리뉴클레오티드의라이브러리또는랜덤올리고뉴클레오티드의라이브러리를삽입함으로써생성될수있다 ( 문헌 [Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317]). 항체파지라이브러리는하나의파지내에중쇄 (H) 및경쇄 (L) 가변영역쌍을함유하는데, 이는단쇄 Fv 단편또는 Fab 단편의발현을허용한다 ( 문헌 [Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8]). 파지미드라이브러리의다양성은추가의바람직한인간단클론항체를생성하고후속적으로확인하기위하여라이브러리의단클론항체의면역특이성을증가시키고 / 시키거나변경하도록조작될수있다. 예를들어, 중쇄 (H) 및경쇄 (L) 면역글로불린분자코딩유전자는어셈블링된면역글로불린분자에서새로운 HL 쌍을생성하도록랜덤하게혼합될 ( 셔플링될 ) 수있다. 부가적으로, 어느하나의또는둘모두의 H 및 L 사슬코딩유전자는면역글로불린폴리펩티드의가변영역의상보성결정영역 (complementarity determining region; CDR) 에서돌연변이되고, 후속적으로바람직한친화성및중화능력에대하여스크리닝될수있다. 또한항체라이브러리는하나이상의인간프레임워크 (framework) 서열을선발하고, 인간항체레퍼토리로부터유래된또는설계된변이를통하여유래된 CDR 카세트의콜렉션 (collection) 을도입함으로써합성에의해생성될수있다 ( 문헌 [Kretzschmar and von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602]). 다양성의위치는 CDR에한정되지않지만, 가변영역의프레임워크절편을또한포함할수있거나, 또는펩티드와같은항체가변영역이외의것을포함할수도있다. 항체가변영역이외의것을포함할수도있는표적결합성분의다른라이브러리로는리보좀디스플레이, 효모디스플레이및박테리아디스플레이가있다. 리보좀디스플레이는단백질이 RNA에계속하여부착되게하면서 mrna를그의동계단백질로번역하는방법이다. 핵산코딩서열은 RT-PCR에의해회복된다 ( 문헌 [Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022]). 효모디스플레이는교배형시스템의일부인막- 회합된알파-응집소효모부착수용체, aga1 및 aga2의융합단백질의제작을기반으로한다 ( 문헌 [Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7]). 박테리아디스플레이는세포막또는세포벽과회합된엑스포트된 (exported) 박테리아단백질에의표적의융합을기반으로한다 ( 문헌 [Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503]). 하이브리도마기술과비교하여, 파지및기타항체디스플레이방법은시험관내에서그리고항원에대한숙주의영향의가능성의제한없이항원표적에대한선발을조작할기회를주거나또는반대의경우도마찬가지이다. - 10 -
[0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] 또한본발명은본발명의조성물을코딩하는핵산을조성물또는그의유도된돌연변이원의원핵, 진핵또는사상파지발현, 분비및 / 또는디스플레이와상용성인벡터를포함하는발현벡터의부분으로서또는단리된폴리뉴클레오티드로서제공한다. Fc-함유분자의용도임의의상기에기재된방법에의해생성된조성물 ( 항체, Fc-융합물, Fc 단편 ) 은세포, 조직, 기관, 유체, 또는일반적으로숙주에서인간질환또는특정병상을진단, 치료, 탐지또는조정하기위하여사용될수있다. 본명세서에교시된바와같이, Fc 감마수용체결합및특정이펙터기능이감소되거나또는제거되지만항체가원래의표적화특성을유지하도록항체, Fc-융합단백질, 또는 Fc 단편의 Fc 부분을변경시키면탁월한스펙트럼의활성, 생물물리학적특성, 안정성및숙주의신체내에서지속되는능력을갖는항체및 Fc-제작물이제공된다. 본발명에의해제공되는조성물을이용한치료에따를수있는질환또는병상은알츠하이머병과같은그러나이에한정되지않는그리고신경병증성통증을포함하는신경장애 ; 피부병 ; 대사성질환 ; 골관절염 ; 및화상또는상해에서생긴병태 ; 심근경색, 울혈성심부전, 뇌졸중, 허혈성뇌졸중및출혈을포함하지만이에한정되지않는심혈관장애와 ; 이외에도류마티스성질환, 건선및경피증을포함하는전신적면역매개장애를포함하지만, 이에한정되지않는다. 본발명을일반적인개념으로개시하였지만, 본발명의실시형태는특허청구범위의범주를제한하는것으로이해되어서는안되는하기실시예에서추가로개시될것이다. 실시예 1: Fc 돌연변이체의제작및시험표 4에나타낸인간 IgG2 항체로부터유래시킨돌연변이된일련의제작물을표준재조합방법을이용하여제작하였다. 전가변도메인을갖는항체에있어서, 항-HER2 및항-CD20 항체의공지된 CDR 서열을이용하여아이소타입및 Fc 돌연변이체를제작하였으며, 이는나타낸바와같았다. 항체돌연변이체는표준클로닝및발현절차를이용하여 293T 세포에서일시적으로발현시켰다. 단백질 A 컬럼을이용하여 Mab를 95% 초과의균질성이되도록정제한후추가의실험분석을하였다. 표 4 [0056] [0057] [0058] 바이아코어친화성연구 바이아코어 3000 광바이오센서 ( 스웨덴웁살라소재의바이아코어아베 (Biacore AB); 현재지이헬스케어 (GE - 11 -
Healthcare) 의일부 ) 를이용하여표면플라스몬공명실험을실시하였다. 실험은 3 mm EDTA 및 0.01% 계면활성제 P20을함유하는 D-PBS 완충제에서 25 에서실시하였다. 수용체와 Fc 돌연변이체의상호작용을분석하기위하여, 생쥐항-His IgG ( 알앤디시스템즈 (R&D systems) 카탈로그번호 MAB050) 를 CM-5 센서칩에공유적으로커플링시킴으로써포획표면을생성하였다. 항-His Ab를 ph 4.5의 10 mm 아세트산나트륨완충제 ( 바이아코어아베 ) 내에희석시키고, 아민-커플링화학에대한제조업자의지시를이용하여 CM-5 칩 ( 대략 3000 RU) 의카르복시메틸화덱스트란표면에커플링시켰다. 표면상의남아있는반응기를에탄올아민-HCl을이용하여불활성화시켰다. 동력학적실험을실시하기위하여, 각각 165, 351 및 208 반응단위 (response unit; RU) 의 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을이표면상에포획하였다. 수용체포획에이어서연속희석의야생형또는 Fc 돌연변이체 (4배희석단계에서 4000 nm로부터 3.9 nm까지 ) 를 30 ul/min으로주입하였다. 회합시기를 3분동안모니터링하였다. 이것에이어서 20분동안완충제를유동시켜결합해리를모니터링하였다. 포획표면은 100 ul/min 의 100 mm 인산의 9초펄스, 이어서러닝 (running) 완충제의주입을이용하여재생시켰다. [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] 기준을위하여스크루버 (Scrubber) 소프트웨어버전 1.1g ( 바이오로직소프트웨어 (BioLogic Software)) 를이용하여시그널및기기노이즈 (noise) 에대한완충제기여에대하여보정하기위하여데이터의이중기준차감 (Double reference subtraction) 을실시하였다 ( 문헌 [Myszka 1999]). 이러한초기의데이터프로세싱후, 간단한 1:1 결합모델을가정하여 BIA 평가소프트웨어, 버전 4.0.1 ( 바이아코어, 아베 ) 을이용하여데이터의동력학적분석을실시하였다. 알파스크린및결합연구다양한 FcγR에의 IgG의경쟁적및직접적결합둘모두를균질비드-기반결합분석법, 알파스크린 ( 미국매사추세츠주월탐소재의퍼킨엘머 (PerkinElmer)) 을사용하여평가하였다. 간략하게는, 실험을이전에기재된바와같이수행하였으며 ( 문헌 [Lazar et al 2006 Proc Natl Acad Sci U S A 103(11): 4005-10]), 이때약간변경하여수행하였다. FcγRI, IIa를알앤디시스템즈로부터구매하였다. FcγRIIIa 및 FcRn을클로닝하고, 발현시키고, 정제하였다. 2:1의비로피어스 (Pierce) 의 NLS-바이오틴을이용하여바이오티닐화한바이오티닐화 CNT06234( 비특이적대조인간 IgG1 하위클래스항체 ) 또는항 -Her2/neu ( 인간 IgG2 항체 ) 에대한경쟁적결합에서 IgG Fc 돌연변이체를시험하였다. 경쟁적결합연구에서, 바이오티닐화항체를 200 ng/ml의최종분석농도가되도록첨가하고, 이어서경쟁시험항체들을각각의실험도면에명시된표기된최종농도로첨가하였다. FcγR를 96웰플레이트에 200 ng/ml의최종농도로첨가하고, 이어서스트렙타비딘도너및 Ni-킬레이트억셉터비드를연속적으로첨가하였다. 플레이트를밀봉하고실온에서진탕시킨후, 플레이트를엔비전 (Envision) 플레이트판독기를이용하여판독하고, 데이터를그래프패드프리즘 (GraphPad Prism) 에서그래프화하여도시하였다. 시험 IgG 분자를 2:1의비로바이오티닐화하고직접적인 FcR 결합을대조항체에대한경쟁의부재하에평가한것을제외하고는, 완료연구와유사하게친화력연구를수행하였다. 결과 TSPR/ 바이아코어분석에의해평가하고센소그램 (sensogram) 으로부터유도한인간 FcR (FcγRI, FcγRIIa, Fcγ RIIb, 및 FcγRIIIa) 에대한 IgG 변이체의상대적인친화성이표 5에예시되어있다. - 12 -
표 5 [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] 이들수는하나의실험의전체적피팅 (fit) 을위하여생성한파라미터에상응한다. 이들 4개의세트의데이터에있어서, 단순 1:1 결합모델의동력학적피팅을이용하여피팅을실시함으로써친화성을얻었다. 모든기타의것에있어서, 친화성은단순 1:1 결합정상상태친화성분석법을이용하여피팅을실시함으로써얻었다. 인간 IgG1(CNTO6234) 을이용하는알파스크린 경쟁분석법을이용하여측정한, 짙은표적필드 (field) 에의 2가항체결합에대한것인친화력맥락에서의인간 FcR (FcγRIIa, FcγRIIb, 및 FcRn) 에대한 IgG 돌연변이체의상대적인친화성이각각도 3a 내지도 3c에도시되어있다. 데이터는 IgG1 ag 및 IgG4 Ala/Ala뿐만아니라 IgG2 돌연변이체도, FcRn ( 생체내반감기를부여하는신생아 Fc 수용체 ) 에결합하는그의능력은유지하면서 IgG1과비교하여 Fc 감마수용체에대하여유의하게감소된결합친화성을나타냄을입증하였다. 구체적으로, IgG2에대한경쟁적결합에서그리고 FcgRIIa에의결합에서높은친화성으로부터최저친화성으로등급을매기면그순서는하기와같다 : IgG1>IgG2c4a>IgG2m4>IgG2=IgGc4c>IgG2c4b>IgG4 ala/ala>igg4 agly>igg2c4d. 이순서는 FcgRIIb에의결합에있어서 IgG1 (CNTO6234) 에대한경쟁에서일치한다. ph 6.4에서의 FcRn에의결합에있어서의 IgG1 (CNTO623 4) 에대한추가의경쟁적결합분석은모든아이소타입및돌연변이체가 FcRn에상대적으로동일하게결합함을나타냈다. 중요하게는, IgG2c4d 및 IgG1 agly는, 만약에있다면, FcgRIIa 및 FcgRIIb에의최소의검출가능한결합을나타낸다. 실시예 2: ADCC 및 CDC CDC는하기 3가지카테고리의경로에서개시되며, 이들모두는표적세포또는미생물을결국용해시키게되는막공격복합체의어셈블리에이르게되는단백질분해단계들의캐스케이드를생성한다 : 항체의존성 ( 고전적인경로 ), 다당류의존성 ( 렉틴의존성 ), 및외래표면구조 ( 대안적인경로 ) ( 문헌 [W.E. Paul Immunology] 참조 ). 실시예 1에기재한 Fc 돌연변이체및아이소타입의하위세트를항-CD20 항체의가변도메인을이용하여제조하고, 인간혈청의존재하에 WIL2-S B-세포림프종표적세포를용해시키는그의능력에대하여평가하였다. WIL2-S 세포의 CDC를매개하는것으로공지된치료적항-CD20인구매가능한리툭산 (Rituxan)( 등록상표 ) 을용해의양성대조군으로사용하였다. CDC 분석에있어서, Wil2-S 표적세포를 96웰플레이트에접종하고, 인간혈청보충물 (1/6 희석 ) 과함께인큐베이션하고, 상대적인세포생육성을알라마르블루 (AlamarBlue) 를이용하여평가하였다. ADCC 분석은표적으로서 SkBr3 유방암세포, 그리고실시예 1에서설명한상이한 IgG 아이소타입또는변이체의다양한 Fc 도메인과조합된항-HER2/neu 가변도메인을이용하여실시하였다. 이분석은세포용해탐지의 - 13 -
EuTDA법 ( 미국매사추세츠주월탐소재의퍼킨엘머 ) 을이용하여이전에설명한바와같이수행하였다. TDA-로딩된 SkBr3 유방암표적세포를 U자형바닥의 96웰플레이트에접종하고, 표기된농도의항체를이용하여옵소닌화하고, 37 에서류코팩 (leukopack) 으로부터단리한 25x 과량의 PBMC와함께동시배양하였다. 3시간후, 플레이트를원심분리하고, 상청액을 TDA 방출에대하여분석하였는데, 이는제조업자의지시에따른것이었다. 미가공데이터를그래프패드프리즘을이용하여정규화하여도시하였다. CDC 분석에있어서, Wil2-S 표적세포를 96웰플레이트의웰당 50,000개로접종하고, 인간혈청보충물 (1/6 희석 ) 과함께인큐베이션하고, 상대적인세포생육성을알라마르블루를이용하여평가하였다. [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] 결과 NK 세포상의 FcgRIIIa를주로참여시키는 ADCC는 IgG2, IgG2m4, IgG2c4d 및 e, IgG1 agly 및 IgG4 ala/ala를포함하는시험제작물시리즈에있어서는검출불가능하였으며 ( 도 5), 이는알파스크린 분석법에서의친화력결합의결여뿐만아니라더욱높은친화성의 FcgRIIIa (V) 수용체에대하여나타낸감소된결합특징과도일치한다 ( 도 4a). 이연구에서와같이유방암세포상의 HER2/neu와같은고밀도표적의이용은 FcgRIIIa에대한 Fc 친화성 (40 um보다낮음 ) 이표적세포용해를유도하기에불충분한것으로보임을입증하였다. 이와유사하게, IgG1은별도로하고서항체또는 Fc-돌연변이체중어느것도시험한항-CD20 제작물에서 WIL2-S 표적세포에대하여유의한수준의 CDC를보이지않았다 ( 도 6). 시험한 IgG 하위클래스들및돌연변이체들중에서, IgG1만이검출가능한수준의 CDC를보였으며, 이는 C1q 결합과관계없이나머지돌연변이체들중어느것도 CDC 를촉발할수없음을시사하는것이었다 ( 도 6). 이전의노력은고전적인경로의 C1q 결합및활성화를통하여최소 CDC를갖는것으로서 IgG2를지적하였지만, 본출원인은항-CD20 맥락에서유의한수준의활성을관찰하지못하였으며이는이전의관찰과일치하였다 ( 문헌 [Idusogie, Presta et al. 2000 J Immunol 164(8): 4178-84]). 더욱이, 잔여보체활성을갖는 IgG1 agly의이전의증거는또한항-cd20 및인간혈청을이용해서는검출되지않았다 ( 문헌 [Dorai, Mueller et al. 1991 Hybridoma 10(2): 211-7]). 이러한불일치에대한설명은낮은수준의보체활성화가 IgG2에의해매개될수있지만활성화는옵소닌화세포를용해시키기에충분한막공격복합체 (MAC) 의어셈블리를촉발하기에는불충분할수있다는것이다. 이들데이터는보체활성화수준에관계없이, 결국표적세포를용해시키는막공격복합체의어셈블리가결합 IgG1 이외의아이소타입의항체에대해서는부족하거나불충분함을시사한다. 실시예 3: 항체의존성세포식작용항-HER2/neu 결합 Fc 돌연변이체를옵소닌화표적유방암세포, Sk-Br3 및대식세포를이용하여항체의존성세포식작용 (ADCP) 을매개하는그의능력에대하여평가하였다. 항체의존성세포식작용 (ADCP) 말초혈액단핵세포를류코팩 ( 바이올로지칼스페셜티코포레이션 (Biological Specialty Corporation) 으로부터표준피콜-파크 (Ficoll-Paque) ( 지이헬스케어 ) 밀도구배제조에의해단리하고, 세포를분취하고, 질소중에보관하였다. PBMC를해동시키고, CD14 양성세포를제조업자의지시에따라 CD16 고갈이없는 CD14 단리키트 ( 스템셀테크놀로지즈 (Stem Cell Technologies) 를이용하여음성고갈 (negative depletion) 에의해단리하였다. 7일동안 20ng/ml의 GM-CSF ( 알앤디시스템즈 ) 의존재하에 RPMI/5% 의가열불활성화 FBS/50μg/ml의겐 티미신중 0.1 10 6 개의세포 /cm 2 로세포를도말하여단구-유래된대식세포를생성하였다. SK-BR-3 종양세포를제조업자의지시에따라 PKH67 ( 시그마 (Sigma)) 로표지하였다. 표적세포를세척하고, 항체의존재하에 4개의이펙터세포에대하여 1개의표적세포의비로단구-유래된대식세포와함께 5% CO 2 인큐베이터에서 37 에서 4 시간동안인큐베이션하였다. 인큐베이션후, 세포를아큐타아제 (Accutase) ( 밀리포어 (Millipore)) 를이용하여탈리시키고, 대식세포를알렉사플루오르 (AlexaFluor)-647 ( 인비트로겐 (Invitrogen)) 에콘쥬게이션된항-CD11b 항체 ( 비디바이오사이언시즈 (BD Biosciences)) 로표지하였다. 세포를유세포분석법으로분석하였더니단독의종양세포 (PKH67 pos,cd11b neg ), 단독의대식세포 (PKH67 neg, CD11b pos ), 및식작용된 (phagocytosed) 종양세포 (PKH67 pos, CD11b pos ) 인것으로결정되었다. 식작용퍼센트를하기등식으로결정하였다 : ( 식작용된종양세포 )/( 식작용된종양세포 + 단독의종양세포 ) 100%. 세포를 FACS 칼리버 (Calibur) ( 벡톤디킨슨 (Becton Dickinson)) 에서획득하고, 그결과를플로조 (FloJo) 소프트웨어 ( 트리스타 (Tree Star)) 로분석하였다. [0080] 단리된단구를시험관내에서 GM-CSF 를이용하여분화시키고, 유세포분석법적분석에의해 FcR 의발현수준에 대하여추가로특성화하였다. 다른이들에의한이전의연구에서나타낸바와같이, GM-CSF 활성화된대식세포 - 14 -
는모단구에비하여상승된수준의모든 FcR (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa) 을발현하였다 ( 데이터는예시하지 않음 ). 항 -HER2/neu IgG Fc 돌연변이체제작물을후속적으로 M1 대식세포를이용하여식작용분석에서시험하 였다. [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] 결과각각의 mab의존재하에 SkBr3 세포와함께 4시간동시배양한후, 유의한수준의 ADCP가 IgG1에있어서명백하였지만, 항체의더욱높은농도에서비글리코실화 (aglycosylated) IgG1, IgG2, IgG2m4, 및 IgG4 S>P ala/ala 에있어서최소수준의 ADCP가또한관찰되었다 ( 도 7). 이와는대조적으로, IgG2c4d는검출가능한수준의 ADCP를보이지않았다. 이러한관찰은 FcR에대한다양한 IgG의이전에입증된결합프로파일과일치한다. 예를들어, IgG1, IgG agly 및 IgG4 ala/ala는다수의리간드디스플레이비드를사용함에있어서 ( 예를들어, 알파스크린 ( 등록상표 ) 시스템을사용함에있어서 ) FcγRI에대하여결합을보였지만, 상기의모든 3가지는 ADCP를또한보였다. IgG2 및 IgG2M4 및 IgG4 ala/ala는더욱높은농도에서는최소 ADCP를나타냈다. 친화력연구에의해나타낸바와같이 IgG2 및 IgG2m4에의한 FcγRIIa의참여는 FcγRIIa의기여가그자체로는그리고제스스로는유의한수준의 ADCP를유도하기에불충분할수있음을시사한다. 추가로바이아코어및알파스크린 결과 ( 표 5 및도 4b 및도 4c) 는 IgG agly가 FcγRI에의결합성을유지한반면 IgG4 ala/ala는 FcγRI 및 Fc γriia 둘모두에대하여친화력을나타내지만 ADCP는 IgG4 ala/ala보다 IgG1 agly에있어서비교적더강함을나타냈다. IgG1 agly는, 만약에있다면, FcγRIIa에대하여최소의결합성을갖기때문에그리고고도로유사한저해 FcγRIIb ( 세포외도메인에서서열동일성 >95% 를기반으로함 ) 까지의연장에의하면, FcγRI 시그널링을통한 ITAM의활성화는 FcγRIIb 활성화와관련된 ITIM을통한시그널링에의해무효로되지않는다. 이와는대조적으로, IgG4 S>P ala/ala는약해진식작용을나타내며, 이는 FcγRIIb의활성화로인한것일가능성이있다. 마지막으로, 추가로다양한 FcR에의 IgG2c4d의결합을기반으로한검출가능한단량체또는친화력의완전한결여는이 Fc 골격의유일무이한무효화식작용능력을지원한다. 실시예 4: 항체-매개된사이토카인방출면역세포상의 FcR의 Fc-참여는가교결합될때사이토카인방출을촉진한다. 면역세포상의 FcR의친화력-기반의참여를모방하기위하여, mab를폴리스티렌비드에결합시켰다. 항-HER2/neu IgG 돌연변이체를이용한사이토카인방출은하룻밤인큐베이션후의라텍스비드에의 IgG의직접적인결합후실시하였다. 세척한비드를 ml 당약 1500 내지 250,000개의명시된다양한농도로단리된인간 PBMC에첨가하였으며, 하룻밤인큐베이션한후동시배양물상청액을제거하여분비된 TNFα를측정하였는데, 이는퍼킨엘머 ( 미국매사추세츠주월탐소재 ) 로부터의표준알파ELISA 키트를이용하였다. 시험한 IgG 아이소타입및 Fc 돌연변이체는 PBMC로부터의 Fc 수용체매개된 TNF알파분비를통하여사이토카인방출을자극하는차등적인능력을보유한다 ( 도 8). 따라서, 다양한아이소타입및그의 Fc 돌연변이체에의한 TNF 분비의수준은높은것으로부터낮은것으로하기와같다 : IgG1>IgG2>IgG2m4>IgG2c4a>IgG1agly>IgG4ala/ala> IgG2c4b> IgG2c4c> IgG4c4d 및 e. 중요하게는, IgG4d 및 e Fc 돌연변이체둘모두는, 만약에있다면, 검출가능한사이토카인 (TNF) 방출을유도하는최소의능력을보유한다. 실시예 5: 생체외 (Ex vivo) B 세포고갈아이소타입및돌연변이체의, 그의사일런싱수준에있어서의능력을더욱잘이해하기위하여, 헤파린처리한인간전혈의존재하에 WIL2-S B-세포의생체내, 생체외고갈을측정하였다. 항-CD20 IgG1은모든이펙터기능 (ADCC, CDC, ADCP) 에참여하는것으로공지되어있기때문에, 과도한 IgG, 인간보체및 PMN( 호중구, 호염기구등 ) 의존재를포함하는전혈시스템은각각의변이체에의해주어지는 ' 사일런싱 ' 의수준을나타내는것으로간주하였다. 간략하게는, 인간전혈은 ADCC 분석에있어서의표적세포로서의역할을하는 WIL2-S 세포및이펙터세포를제공하였다. 표적세포를 BATDA ( 퍼킨엘머 ) 로 37 에서 30분동안사전표지시키고, 2회세척하고, DMEM/5% 가열 불활성화 FBS에재현탁시키고, 이어서 50 μl의표적 (2 10 4 개의세포 / 웰 ) 을 96웰 U자형바닥플레이트의웰에첨가하였다. 추가의 50 μl를다양한농도의항체와함께또는상기항체없이첨가하고, 세포를실온에서 20분동안인큐베이션하였다. 이어서인간전혈 (100 μl ) 을웰에첨가하였다. 모든샘플을세벌로실시하였다. 플레이트를 200 g에서 3분동안원심분리하고, 37 에서 5% CO 2 인큐베이터에서 3시간동안인큐베이션하 - 15 -
고, 이어서 200 g에서 3분동안다시원심분리하였다. 웰당총 20 μl의상청액을제거하고, 200 μl의델피아 (DELPHIA) 유로퓸-기반시약 ( 퍼킨엘머 ) 의첨가에의해세포용해를측정하였다. 엔비전 2101 다중표지체판독기 ( 퍼킨엘머 ) 를이용하여형광을측정하였다. 세포를트리톤 (Triton) X-100 ( 시그마알드리치 (Sigma Aldrich)) 으로처리함으로써얻은최대세포독성및표적세포단독으로부터의 BATDA의자발적인방출에의해결정한최소대조군에대하여데이터를정규화하였다. 데이터를그래프패드프리즘 v5.01을이용하여 S자형용량-반응모델에피팅시켰다. [0090] 인간혈액의존재하에서의 WIL2-S 의동시배양물은 IgG1 을사용하면그리고어느정도는 IgG2 및 IgG2M4 에의 해표지 WIL2-S 의극심한이펙터 - 매개고갈을나타냈다. 중요하게는, (Fab') 2 및 Fab 항 -CD20 단편둘모두는 약간의수준의 WIL2-S 고갈을유도하였으며, 이는이펙터기능을회복시킬수있는혈청중절단 IgG 자가항체의존재를나타낼수있다 ( 예를들어, 문헌 [Breski et al. 2008 J Immunol 181:3183-3192] 참조 ). 이전의 ADCC, CDC 및 ADCP 데이터와일치하여, 유의한또는검출가능한수준의사이토카인방출은 IgG2c4e에서전혀관찰되지않았다. [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] 실시예 6: CD20 표적화에서의생체내 B 세포생존성 IgG2c4e와관련된생체내이펙터기능은항-CD20의확립된사이노몰로구스 B-세포고갈모델을이용하여평가하였다 ( 문헌 [Reff et al, 1994, Blood 83:435-445]). 사이노몰로구스원숭이 (n=3마리/ 군 ) 는 0.2 mg / kg또는 2 mg / kg의 IgG1 또는 IgG2Σ의단회볼루스정맥내용량 7일전에염수를주사하였다. 주사후표기된날에, 전혈샘플로부터의 B 세포수준을각각항-CD20 및항-CD3 을마커로이용하여 B 및 T 세포의유세포분석법적분석에의해결정하였다. 각각의군에있어서의평균 B-세포수준 (CD20+/CD3-) 을주사후 3주동안도시하였다 ( 도 9). 낮은용량의 IgG1 (0.2 mg / kg ) 은주사한지 1일후모든 B-세포의거의완전한고갈을유도한반면 (99%), 항-CD20 IgG2c4e에의해서는유의한고갈이유도되지않았다 ( 군내에서평균 15%). B 세포수준은후속적인날들에걸쳐항-CD20 IgG2c4e 처리동물에있어서상대적으로정상으로남아있었으며, 후속적인주동안 IgG1 처리원숭이에있어서는 B 세포수준의회복쪽으로의점진적인추세가관찰되었다. 중요하게는, IgG2c4e 및 IgG1 둘모두는 2 mg / kg의더욱높은용량에서 B 세포의거의완전한고갈을유도하였다. 항-CD20 매개된 B-세포고갈은 ADCC, CDC 및아폽토시스 (apoptosis) 를비롯한몇몇메커니즘에의해매개되는것으로생각된다. IgG2c4e에의한더욱높은용량 (2 mg / kg ) 에서의 B 세포의고갈을나타내는원숭이 B-세포고갈데이터를고려하여, B-세포고갈의기본메커니즘을단리 B-세포에서의항체에의해유도된아폽토시스의수준의측정에의해추가로평가하였다. 단리된 B-세포를 0, 0.26, 2.6 및 26 μg /ml의농도의 IgG1, IgG2c4e, (Fab') 2 및 IgG2와, 비-결합대조 mab (BM21) 로 4 시간동안처리하고, 아넥신 (Annexin) V 양성, 7AAD 음성세포를유세포분석법에의해 정량화하였다. 2.6 및 26 μg /ml 의특정최종농도를선택하여, 0.2 및 2 mg / kg의볼루스주사후혈청중 IgG 의 개산된최대생체내농도를반영하였다. [0096] 모든 3 가지결합항체에있어서, 아폽토시스의용량의존적유도가 (Fab') 2 를비롯한모든 IgG 에대하여관찰되 었으며, 이는항-CD20 매개된가교결합이더욱높은용량에서는세포사멸의유도에충분하지만더욱낮은용량에서는그러하지못함 - IgG2c4e의경우 - 을나타냈다. 중요하게는, (Fab') 2 는또한 Fc의부재하에유의한아폽토시스를보였으며, 이는항-IgG 매개된아폽토시스가 Fc 매개된가교결합과관계없이유도될수있다는견해를확인해주는것인데, 이는이전에관찰된바와같았다. [0097] 따라서, 세포상의표적항원의가교결합과관련된정상적인기능은변경된 Fc 변이체에의해제거되지않는다. - 16 -
도면 도면 1 도면 2-17 -
도면 3a 도면 3b - 18 -
도면 3c 도면 4a - 19 -
도면 4b 도면 4c - 20 -
도면 5 도면 6-21 -
도면 7 도면 8-22 -
도면 9 서열목록 SEQUENCE LISTING <110> CENTOCOR ORTHO BIOTECH INC. <120> Antibody Fc Mutants with Ablated Effector Functions <130> CEN5279PCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2010-11-29 <150> 61/265,079 <151> 2009-11-30 <160> 6 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <220><221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Hinge start, residue EU 218 <220><221> MUTAGEN <222> (13)..(17) <223> PVAGP, PAAAP, PAAAS, and SAAAS <220><221> MUTAGEN <222> (47)..(47) - 23 -
<223> May be H (wt), Q, or A <220><221> MUTAGEN <222> (88)..(88) <223> May be V (wt) or L <220><221> MUTAGEN <222> (109)..(110) <223> May be AP (wt) or SS <400> 1 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Xaa Xaa Ala Xaa 1 5 10 15 Xaa Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Xaa Glu 35 40 45 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Xaa His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Xaa Xaa Ile Glu 100 105 110 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 130 135 140 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 145 150 155 160 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 165 170 175 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 180 185 190-24 -
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 195 200 205 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 210 215 220 Gly Lys 225 <210> 2 <211> 227 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro - 25 -
165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Gly Lys 225 <210> 3 <211> 230 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 130 135 140-26 -
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> human IgG residues and mutations <400> 4 Pro Ala Ala Ala Pro 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> human IgG residues and mutations <400> 5 Pro Ala Ala Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence - 27 -
<220><223> human IgG residues and mutations <400> 6 Ser Ala Ala Ala Ser 1 5-28 -