임앙병리검 At 과악외 l'q : 머 133 뀐머 12 호, 237-244, 2001. 노화된마우스피부에서 Squalene 의효과 : 분자생물학적및미세구조적연구 (11) 광양보건대학임상병리과 최완수 Effects of Squalene in the Skin of Aged Mouse : Molecularbiology and Ultrastructural Study(II) αloi, Wan Soo Department of Clinical Pathology, Gwangyαng H ealth College, Chonnam, Korea To evaluate the effect of squalene (SQ) on the skin of the aged mouse, SQ was applied to the skin of the back of 10 month-aged ICR female mouse with 12 hour-interval for 10 days. Biochemical quantitative ana1ysis of total protein, the expression of epidermal growth factor (EGF) and histologic alterations in the SQ-treated skin using electron microscopes were performed. Total protein quantity was increased with the period of SQ treatment in SQ-treated group rather than in normal aged control group. The increment was especially remarkable on protein with 42kDa. In electron microscopic observation, there were only few germ cells in normal aged skin, however, the number of the cells started to increase after 3 days of SQ πeatment and were remarkable after 10 days. The differentiating cells in germ cell layers of SQ treated skin had relatively high electron-density of nucleus, and well developed RER, mitochondria, tonofilaments and free ribosome compared to normal aged S 잉 n. The application of SQ to the skin of aged mouse could induce the increment of skin tissue total protein quantity and expression of EGF, and promote germ cell differentiation. Therefore, it is suggested that SQ plays a major role in differentiation or renewal of skin tissue of aged mouse. Key words squalene, epiderma1 growth factor, electron microscopic, aged mouse 1. 서로찰되는변화들로는피부를구성하는각종세포 들의형태학적변화와각질층의습윤감소로인 인간에있어서노화와관련하여피부에서관한거칠어짐과주름등이일어나며 (Freedberg et 237
al, 1999), 나이의증가와더불어표피를구성하 합하여수용체의 tyrosin kinase를활성화시켜세 고있는각질세포, 기저세포의형태학적변화와 포의 증식과분화를촉진시키는기능과 DNA, keratinocytes 표면의증가나 melanocytes와 Lan-냈NA, 및 단백질 합성을촉진한다고하였다 gerhans 세포들의감소그리고피부부속기관인 (Cohen, 1962). 분비션의수적감소등이있다 (Marks, 1981). 노 피부조직과관련한 SQ에대한연구들로는피 화현상을억제시키는방법의 하나로유해산소, 부의외과적창상이나화상에의한상처회복효 자유라디갇등각종유해인자를제거하는방 과등이 있다. 그러나 SQ 이 피부노화과정에서 법들이연구되고있다 (Recknagel, 1997). 노화지연과정이어떠한과정을통해이루어지고 Squalene(hexamethyltetracosahexane; C 3삐삐 이 있는가에대한연구보고는거의없는실정이다. 하 SQ라함 ) 은 6 개의이중결합을포함하는 307H 이에본실험에서는노화된마우스피부조직에 탄화수소 사슬로 연결되어 있으며 분자량은 일정기간동안 SQ을처리하였을때어떠한변화 410.70, ß-carotene과구조적으로유사하다. SQ는생체내에서 cholester이합성과정중생성되는중간산물로척추동물및식물등에서합성되며, 를보이는가를알아보고자, 분자생물학적인방법을통하여피부조직나 } 총단백절량을정량해보고, 형태학적인방법으로전자현미경적관찰을 특히심해상어 ( Centrophorusatromarginatus) 의 간 통해피부노화과정에서 SQ 의 효과를알아보고 에 많이함유된탄화수소이 q(george, 1976). SQ 자하였다. 은 hydroxycarboxyl group을함유하고있지않기 때문에 oil 이아니며, 특히산소이온과쉽게결합 하는성질을갖고있다. SQ 은일본과한국에서 n. 재료및밤법 오랫동안전통적인건강식품으로사용되었으며, 특히고지혈증, 동맥경화, 섬근경색, 간질환및 1. 실험동물및사육조건 위장관질환에효과적이라고하였으며 (Budiarso, 본실험에사용한동물은삼육실험동물센터 1990), 노화지연뿐만아니라조직의회복이나에서생산공급하는다산의출산경험이있는 10 재생과정및염증반응, 유사분열, 선생혈관형성, 개월령 ( 체중 35~40g) 의 ICR 계통의노화된암컷합성및세포외기질등은복잡한생물학적과 mouse를사용하였다. 정을통해이루어진다고하였다 (Neil et al, 1993). 이런조직의재생에서개시와재생유지에 2. 시약 peptide growth factor가중요한역할을하는데, Peptide growth factor인자는 in vitro에서는이런 99.9% 이상의 SQ은 ( 주 ) 세모에서구입하였다. 과정을조절한다고알려져있으며 in vivo에서는 Anti-human EGF monoclonal antibody는 R&D 상처회복에있어서중요한 phase를조점하는 System (Minneapolis, USA) 에서구입하였다. peptide growth factor생성을유도한다고알려져 있다. epidermal growth factor( 이하 EGF라함 ) 는열에안정하고투석이안되며, 생물학적활성에필요한 3 개의분자내 disulfide bond가있는분자량이 6,045 인 53 개의아마노산으로구성된폴리렘티드로 alanine, phenylalanine, lysine 이결여되어있다. 또한 EGF는표피성장인자수용제에결 3. 실험동물군및처리방법실험동물군은 SQ을처리하지않은정상대조군, SQ을처리한실험군으로각각분류하였다. SQ 처리군은처리 1 일, 2 얼, 3 엘, 4 얼, 5 임, 6 일, 7 일 8 일, 9 일, 및 10 일동안하였고, 각처리일군 238
별로 5 마리씩배정하였다. SQ 처치는실험동물을 등쪽에 3x3cm 크기로삭모한후삭모된부위에 멸균된면봉을사용하여 SQ 윤오전 9 시와오후 9 시 12 시간마다 1 일 2 회도포하였다. 각일별로 경추탈골로안락사시킨다음피부를절개하여 각각의조직처리과정을설시하였다. 4. Skin 에서단백질분리와단백질정량 피부조직 Ig 을 2 아 nm MOPS, ph7.5; 5mM EDTA; 5n 메 1 EGTA; 60mM 2-mercaptoethanol; 10% glycerol; lmm PMSF(phenyl methyl sulfonyl fluoride) 가함유된 extraction buffer 에서 polytron 으 로조직을균질화시켰다. 균질화사컨용액을 13,OOOg 로 10 분간원심분리하고상층액을얻어 단백질양을정량한후 -20t 에보관하면서실험 에이용하였다. 5. SDS-PAGE(polyacrylamide gel electorphoresis) 단백갑은 Laetm 피 i(1970) 의방법올이용한 SDS PAGE 를실시하여단백철의양상을비교분석하 였다. 전기영동에사용한장치는 Bio-Rad Laboratories 사의제품을이용하였다. 6. 전자현미경관찰 절개된피부조직을 lxl mm 크기로세절한다음 2.5 % glutaraldehyde(o.1 M sodium cacodylate hydrochloride buffer, ph 7.4, 온도 4 0 C) 에서 2 시간전고정하였다. 동임 buffer를사용하여 15 분씩 3 회세척하였다. 1 % osmium tetroxide 용액에서 2 시간후고정하고, 동일 buffer를사용하여 15 분씩 3 회세척하였다. 저농도 50% ethan이로부터고농도 ethan이계열하에탈수하고 propylene oxide를사용하여치환하였다. Epon mixture를만들어 propylene oxide와 1:1, 1:2로 3 시간침투시켰으며, Epon mixture원액에서 overnight후포매하였다. 35t 에서 12 시간, 45t 에서 12 시간, 60t 에서 24 시간열증합하였다. Epon block을 1μm로박절하여특정부위를정하고삭정한뒤 diatome을부착시킨 ultramicrotome(rcm MT7000형 ) 으로 60 nm의초박절편을만틀어 Reynold 법 (1 963) 에의한 uranyl acetate와 lead citrate으로이중염색하여전자현미경 (JEM l 00c XII 형,TEM) 으로가속전압 80kV하에서관찰하였다. m. 결과 1. EGF 활성분석 SQ 처리전과후의 s빼1을분리하여총단백질을분리하고 12% SDS-PAGE를실시한결과를나타내었다 (Fig. 1). Fig. l. 에서나타난것처럼.....,.... Iþilll * :!. 1'" k '1 냉... 23456 7 생 9 HJ 11 12... 2.". Il.. Fig. 1. Patterns of total protein from mouse skin by SDS-PAGE. lane 1; Low molecular weight maker; lane 2; Normal; lane 3; Squalene-treated skin for 24h; lane 4; 48h; lane 5; 72h; lane 6; 96h lane 7; 120h; lane 8; 144h; lane 9; 168h; lane 10; 192h; lane 11; 216h; lane 12; 240h; 239
SQ을처치하지않는군에서는단백질양상이뚜렷하지않았으나 SQ을처치한군에서는많은단백질이발현되었음을확인할수있었다. 이는 SQ 이단백질활성을유도시킨다는결론을내릴수있었다. 또이러한단백질중에서 EGF의활성을확인하기위하여 immunoblot 분석을실시하였다 (F ig. 2). Fig. 2. 에서와같이 SQ을처리한군에서는처리하지않은군보다훨씬더강한 EGF signal 이관찰되었다. 이는노화된피부에서는 EGF 발현이되지않지만 SQ을처치할경우 EGF 발현이활성화되었음을확인할수있었다. 리보솜과다수의세사들이함유하고있었다. 이들발아층세포들은비교적드물게관찰되었다 (Fig. 3). SQ를처치한 3 일경과군의표피는진피층과접하는기저막위쪽에서대조군에비하여활발하게증식된발아층세포들이관찰되었다. 핵의핵질은비교적고르게발달되어있었고세포절내에는많은유리리보솜과대조군에비해다소발달된조면세포체가관찰되었다. 가시층세포들은세포질내에세사들을소수함유하고있었고소수의 mitochondria들이관찰되었으며세포사이의간극들이미약하게나타났다 (Fig. 4). SQ 처치후 3 일경과군처럼핵은세포질에비 2. 형태학적관찰 하여비교적크게관찰되었으며, 핵질은비교적 고르게나타났다. 세포질내에서는조면소포체가 1) 전자현미경적관찰 발달되어있었으며, 유리리보솜과전자밀도가높 노화된대조군흰쥐의상피세포는각질화된 은장세사들이다수관찰되었다 (Fig. 5). SQ를처 각질층은뚜렷하였으나과립층과발아층의구분 치후 10 일경과군의표피세포는기저막위쪽에 은뚜렸하지않았으며대체로세포층이앓게나 서관찰되는발아층세포들의수가대조군에비 타났다. 세포의핵은핵질이비교적고르며커다 하여 매우증가하였다. 세포내에서는조면소포 란인을갖고있었다. 세포질소기관으로는조면 체가비교적잘발달해있었고, 다수 mitochon- 소포체가비교적미약하게발달되었으며, 유리 dria들이나타났다. 세포질에서는세사와유리리.! J.. ~ tl '7 ~ 'J n.. ~ l..u Fig. 2. Immunoblot analysis of proteins sep없ted by SDS-PAGE. Arrow indicat않 the EGF protein. Primary antibody; anti-egf. Second antibody; HRP-conjugate anti -IgG. lane 1; Nonnal skin; lane 2; Sq뻐 lene-πeat떼 skin for 24h; lane 3; 48h; lane 4; 72h; lane 5; 96h; lane 6; 120h; lane7;144 h; lane 8; 168h; lane 9; 192h: lane 10; 216h; lane 11; 240h; 240
보솜들이매우많이관찰되었다. 가시층을구성하는세포들의수는대조군에비하여현저히증가하였다 (Fig. 6). N. 고한세포의노화에는세포막의노화, 세포잔의노화, 핵의노화및단백잘의노화등이있으멘서l 를포막의노화는세포막의 cholesterol 의함량이증 가하며 상대적으로인지질은감소하고, 지질과 산화및단백질산화는증가하기때문에지방갈 색이축적되고지절파단백질이중합처l 틀형성 하게되어막의유동성이떨어지게되는데이는 세포막기능의감소와직 간집적으로관련되어 있다 피부에존자 } 하는세포외기질불칠의변화도 Fig. 3. An electron micrography of the skin of aged mouse. A few of gemlative cells(gc) and a l아 of iπegu1없 granul않 of keratohyalin( arrows) are observed.d, dermis. Bar indicates l.um. Fig. 4. An electron micrography of the skin treated with squalene at 3 days. A few of germative cells(gs) are differentiated. mitochondria(m). Bar indicates 1 μm. Fig. 5. An electron micrography of the skin treated with squalene at 5 days. germative cells(gs) tonofilaments(tf). Bar indicates 1μm. Fig. 6. An electron micrography of the skin treated with squalene at 5 days. A lot germative cells (GS) are obseved. D; dermis, MC; Merkel s cell. Bar indicates 111m. 241
노화와더불어다양한변화가나타나며, 기질물 UVB 에 의한변화를관찰한결과 6-8 일째에과 질의주성분은다당류인밍yco댔ninogllycan(GAG) 립층이 3층으로증가하였으며, 기저층, 세포층은 과이들의단백질간에결합하고있는 proteoglycan 8 일째에 유사분열이 최고지에 달했는데, SQ을 (PG) 등과같은거대분자로이루어져있다고하였 처리한본실험에서는 6-7 일사이에 7-11 층정도 다 (Silbert, 1993). GAG은피부질량의 0.1% 정도 의세포층이형성되어전등 (1 986) 보다는 4층이 차지하고있지만, 분자구조적특성으로많은수 상의세포층차이를보였으며, 8 엘째부터전형적 분을포유할수있는친수성물절로피부조직 인각질층, 과립층, 발아층이관찰되었다. 그이 의 변화특히세포기능, 성장주기, 상처치유, 면 유는어떠한자극를가하지안했을때보다화 역기능및피부노화과정등에큰영향을끼친다 상이나자극을주었을때 SQ 이 보다빠르게세 고하였다 (Pearce et al, 1972). 포활성분열을촉진시킨것으로사료된다. Saito( 1994) 등은 무게가 330-440g되는 웅성 김등 (1 991) 은무게가 250-300mg된 7-8주사이 Wister rat을이용하여삭모된등쪽 25% 에 해당 의 백서을이용하여대조군은 Silvadene 크림만 되는표피에 10초간피부화상을입혀조사한결 창상에도포하고시험군은 EGF를창상에도포 과유리되는자유기및유해산소 SOD의치료효 하여 12시간마다 14 일동안창상에도포한경과 과를확인하였다. Kohno( 1995) 등은 SQ가유해산 4 일째부터표피층이대조군에비하여더현저하 소와쉽게 결합되어 제거됨으로서 피부재생에 였고, 각질세포도많아나타나기시작하였으며, 도움이된다고하였다. 김등 (1 999) 은 8-10주령의웅성 mouse를이용하여 2도화상을입힌후 SQ 를처치한결과 2 일째부터세포분열이활발하게나타났으며, 이는화상을입을때발생하는유해 진피층의섬유아세포가많아졌고교원절이션상으로고르게배열되였음을보여결체조직의성숙이빨라졌다고하였다. 본실험에서도단백질활성화양상을알아보 산소가 SQ 에의해제거되어피부의재생을위한 기 위해 skin을분리하여총단백질을분리하고 환경이만들어졌다고하였다. EGF는세포와의결합은매우특이적이고신 12% SDS-PAGE로실시한결과 SQ 처치군에서는많은단백질이발현되었음을확인할수있었다. 속해서호르몬-수용처1 상호작용의특성을갖고 결론적으로본실험에서나타난노화된마우 있으며, 사람의피부섬유모세포에서 EGF의 결 스피부에 SQ처치시피부내총단백질량및전 합부위는세포당약 90, 아U개 정도로추정되고 자현미경학적관찰을통해선행연구자들의결 있으며, EGF수용체는 당단백질로 분자량이 과를종합하여볼때여러피부재생인자중하나 150, 000-170, 아U 정도로알려져있다 (Carpenter et 인 SQ 이 EGF를활성화시키고, EGF등의활성화 al, 1975). 본실험에서도노화된마우스피부에 에 의해세포증식을활성화시켜노화된피부를 서 SQ의효과를보기위해 10 일간노화된마우 재생하는것으로사료된다. 그러나 SQ 이 피부 스피부에 SQ을처치하였을때전자현미경을통 노화과정을지연시키고, 피부에서의정확한작 한관찰에서는 SQ을처치한 3 일군부터발아층의 용기전을보다폭넓은연구가있어야한다고 배아세포들이대조군에비하여조밀하게나타나 사료된다. 기 시작하여 10 열 경과군의배아세포들의수가 매우증가하였으며, 이는검 등 (1 999) 의 웅성 V. 결 론 mouse음이용하여 2도화상을입힌후 SQ처치후 2 얼째부터세포분열이활발하게나타난것과임 노화된생쥐피부조직에 SQ 이 미치는영향을 치하였다. 전등 (1986) 은흑색생쥐를이용하여 알아보고자 10개월령의 ICR 계통암컷생쥐의등 242
쪽에 3x3cm 크기로삭모한후 SQ을 12시간간격으로 10 일간처라하여, 피부조직내단백질함량과 EGF 발현양상및전자현미경학적을통한조직의변화를관찰한결과다음과같은결론을얻었다. 총단백질함량은대조군에비해 SQ 처리군에서전반적으로처리기간에비례하여증가하였으며, 특히 42kDa 의단백질이특이적으로증가하였다. 전자현미경학적결과, 노화된생쥐의피부에서는발아층의세포들이소수관찰되었으나, SQ 을처치후 3 일경과군부터발아층의배아세포들이대조군에비하여조밀하게관찰되었다. SQ 을처치후 10 일경과군의배아세포들의수가매우증가하였다. 배아층에서분화되어가는세포들은핵의전자밀도가배아세포에비하여비교적높게관찰되었으며, 잘발달된조면소포체, mitochondria, 장세사및유리리보솜들을함유하고있었다. 이와같은결과는 SQ 처리가노화된생쥐의피부에서조직내단백걷량함량파 EGF의발현플 증가시켰으며, 전자현미경겸색결과발아세포의증가및분화가활성되는것으로보아노화된생쥐의피부분화또는재생에영향을미치는것으로사료된다. 칩고문흰 1. Budiarso IT. Fish oil versus olive oil. lμncet 336: 1313-1314, 1990 2. Carpenter G, Iλ~mbach J, Martin M, and Cohen S. Charcterization of the binding of 1251-1abeled epidermal growth factor to human fibroblasts. J Biol Chem 250:4297, 1975 3. Cohen S. Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelrating incisoreruption and eyelid opening in the new-bom animal. J Biol Chem 237: 1555-1562, 1962 4. Freedberg 1M, Eisen AZ, Wolff K, Austen KF, Goldsmith LA, and Katz SI. Aging of s에n. Fitzpatrick s Dermatology in General Medicine. 5th p, 1697-1706 McGraw Hill, New York. 1999 5. George CK, Liu EH, Ahrens Jr, Paul HS, and John RC. Measurement of Squalene in human tissues and plasma Validation and application. J Lipid Res 17:38-45, 1976 6. Kohno Y, Egawa Y, Itoh S, Nagaoka S, T, 빼따 IaShi M, and Mukai K. Kinetic study of quenching reaction of singlet oxygen and scavenging reaction of free radical by squalene in n-butanol. Biochim Biophys Acta 1256(1):52-56, 1995 7. Marks R. Measurement of bi 이 ogical aging in human epidermis. Bri J Dermatol 104:627-633, 1981 8. Neil TB, Gregory, and Schultz S. Growth Factors and Wound Healing; Biochemical Properties of Growth Factors. Am J Surgeη 165:728-737, 1993 9. Pearce BH, and Grimmer BA. Age and the chemical constitution of normal human dermis. J Inverst Dermatol 58:347-361, 1972 10. Recknagel RO, Glende Jr. EA, Hruszkewycz AM. Free Radicals in Biology in Biology. Vol 3. p.97 New York Academic press. 1997 11. Saito D, Okada Y, Okawara T, Yamashita H, Ta없hara T, and Ishihara S. Prevention of ongoing lipid peroxidation by wound excision and superoxide dismutase treatment in the bumed rat. Am J Emerg Med 12:142-146, 1994 12. Silbert GE. Preotogluycans and glycosaminoglycans of skin in fitzpaπic, eds. Dermatology in General Medicine. 4th ed. p.350-358 New york: MC Graw-Hill. 1993 13. 김성우, 홍성표, 이두형. 표피성장인자가창상치유에미치는효과에대한실험적연구. 대한성형외과학회지 18:5-12, 1991 14. 김종세, 김정상, 윤중식, 최영복, 조광필, 김 243
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