식물병연구 Res. Plant Dis. 17(2) : 136 141 (2011) http://dx.doi.org/10.5423/rpd.2011.17.2.136 보문 Open Access Research in Plant Disease The Korean Society of Plant Pathology 은나노용액을활용한참나무시들음병방제연구 김상우 정진희 거비르람살 김윤석 심상준 1 김하선 1 장석준 1 김종국 2 김경수 3 이윤수 * 강원대학교식물자원응용공학과, 1 강원도산림개발원, 2 강원대학교산림환경보호학과, 3 서울대학교응용생물학전공 Control Efficacy of Nano-silver Liquid on Oak Wilt Caused by Raffaelea sp. in the Field Sang Woo Kim, Jin Hee Jung, Kabir Lamsal, Yun Seok Kim, Sang-Jun Sim 1, Ha-Sun Kim 1, Seok-Joon Chang 1, Jong Kuk Kim 2, Kyoung Su Kim 3 and Youn Su Lee* Department of Applied Plant Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea 1 Forest Research Institute of Gangwon Province, Chuncheon 200-140, Korea 2 Department of Forest Environment Protection, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea 3 Department of Agricultural Biotechnology, Center for Fungal Genetic Resources, and Center for Fungal Pathogenesis, Seoul National University, Seoul 151-724, Korea (Received on October 20, 2010; Revised on June 9, 2011; Accepted on June 22, 2011) In other previous in vitro tests, the hyphal growth of Raffaelea quercivorus was inhibited by the treatments of various concentration of nano-silver. In this field tests, treatment of different concentrations of nano-silver to oak trees in Cheolwon and Hongcheon sites showed the inhibition effects against wilt disease caused by Raffaelea quercivorus. However, nano-silver-treated oak tree in Chuncheon site showed mild wilt symptoms with no phytotoxicity. Scanning electron microscope (SEM) observation confirmed that the spore and hypha of Raffaelea sp. inside the vessels were damaged by nano-silver. This result indicates the application of nanosilver is effective for control of Raffaelea quercivorus in the field. Keywords : Nano-silver liquid, Oak wilt disease, Raffaelea quercivorus 서론 참나무류 (Quercus sp.) 는소나무와더불어우리나라의대표적인수종으로질좋은목재로고가에사용되고, 국내의경우최근표고버섯이나영지버섯등각종버섯의재배용으로그가치가잣나무, 낙엽송, 리기다소나무, 소나무를능가하고있다. 또한, 참나무류의추출성분인 polyphenol의 tannin은양주의숙성과정에서색과맛을바꾸는신비한효과를발휘하는것으로알려져있으며, 참나무류에서나오는숯과목초액은바베큐용, 무공해비료, 농약과의약품으로사용되는등그활용범위가넓다. *Corresponding author Phone) +82-33-250-6417, Fax) +82-33-244-6410 Email) younslee@kangwon.ac.kr 1980년대이후일본에서 Raffaelea quercivorus(kubono와 Ito, 2002) 에의해참나무시들음병이발생해막대한경제적손실을야기했으며, 산림청의보고에의하면한국의경우 R. quercivorus에의한참나무시들음병이 2004년이후전국 18개시 군 구를시작으로 2006년 9월현재전국 9개도 61개시 군 구에서 14만본이상이발생되었다. 피해면적은 1,305 ha 이상으로 22,000그루이상이고사했고, 2006년말까지산림청에서방제예산 13억이투입된것으로보고되었으며, 주요피해수종은신갈나무, 참나무속이보고되어있다. 매개충으로알려진광릉긴나무좀 (Platypus koryoensis) 은 1935년이미우리나라에서동정되어보고된종이며, 이는암컷의등쪽에위치한균낭 (mycangia) 속에 R. quercivorus 역시 1935년에이미있었음을의미한다. 2004년이후급속히번지기시작한참나
은나노용액을활용한참나무시들음병방제연구 137 무시들음병을방제하기위해다양한방법이사용되고있지만, 방제에어려움을겪고있다 ( 김등, 2004, 2005, 2006). 최근환경보호와생태계보존에관한그린라운드 (Green Round) 협약이국제적인관심의대상이되면서무공해농약의개발이국제적으로경쟁이치열한핵심분야로등장하고있으며, 1992년리우세계환경회의에서는농약사용량의 20% 를생물농약및친환경농약으로대체하도록결의하였고, 우리나라도관련행동계획으로 2014년까지현재사용되고있는화학농약의 30% 를줄이거나대체하는추진계획이 2000년농림부에서발표하기도하였다. 하지만참나무시들음병방제에있어서일부선발된훈중제등의경우약해피해, 독성및환경오염등의문제로인해사용에제한을받고있는실정이다. 이에참나무시들음병을유발하는 R. quercivorus를방제할수있는방법및특별한약제가없으며친환경적인방제방법의개발이필요한상황이다. 최근나노기술을활용해다양한화합물이개발되고있으며, 살균력이있고인체에무해한것으로밝혀진은 (Ag) 을나노화한용액을병해방제에활용하는연구가진행중이다. 은 (Ag) 은옛부터건강에좋은금속이라고하여식기류로많이이용해오고있다. 우리나라에서는임금이먹는수저를은으로만들어음식에독이있는지판단할때사용했으며, 고대인도에서는전쟁터에나가는병사에게은화를주어상처치료에이용하게하였으며, 서부개척시대에는우유나물통에은화를넣어두면부패를방지한다는기록이있다. 유럽의경우, 로마와그리스에서은 (Ag) 식기에음식을보관하면오랜동안보관할수있다는설이있어은 (Ag) 식기류를많이사용했다고한다 ( 강등, 2000). 이러한이론을바탕으로 Berger에의해은이온의항균활성실험에대해보고되었다 (Berger 등, 1976). 또한실제로순수한은을그람양성및음성균이도말된 plate에얹었을때생육저지대를형성하는것을관찰할수있었다 (Jeong 등, 1998). 따라서, 본연구에서는나노화한은 (Ag) 용액을활용해 R. quercivorus를방제하고, 균낭 (mycangia) 에서식하는포자를방제함으로써병발생의전염원을감소시키고, 동시에매개충이운반하는 R. quercivorus를방제함으로써매개충의먹이사슬을차단시켜매개충의밀도감소를유도할수있는방제방법을규명하기위한일환으로본연구를실시하였다. 재료및방법 Nanosilver 용액. 본실험에사용한 nano-silver 용액은 WA-AT-WB13R로바이오플러스 ( 주 ) 에서 1,000 ppm 농도로제공받아각처리에맞는농도로증류수를이용하여희석하여사용하였으며, 저장은 4 o C 냉장보관하여필요할때마다꺼내어사용하였다 (Table 1). 실험장소. 강원도지역의참나무시들음병 (Oakwilt) 발생지역인철원 ( 자등리 : 21본 ), 춘천 ( 봉의산 : 15본 ) 및홍천 ( 강원대학교학술림 : 8본 ) 의참나무군락지에서참나무시들음병에걸린신갈나무 (Quercus mongolica) 를선발하여수간주사 (trunk injection) 를실시하였다. Raffaelea sp. 의포자및균사생장에미치는 Nano-silver 용액의영향조사 (SEM 관찰 ). Nano-silver 용액의처리가 R. quercivorus의균사생장에미치는영향을조사하기위하여 R. quercivorus를 potato dextrose agar(pda) 배지에서 7일간균사배양을하였다. 배양한후 nano-silver WA-AT-WB13R 용액을 10, 30, 50, 100 ppm의농도로처리 24 h 후 4% glutaraldehyde (in 0.2 M Phosphate buffer, ph 7.4) 에서고정하고 0.2 M Phosphate buffer, ph 7.4로 3회세정후 50, 60, 70, 80, 90% EtOH로각각 30분씩탈수시키며, 100% EtOH에서는 45분씩두번탈수시킨다. Isoamylacetate:100% EtOH=1:2, Iso-amylacetate:EtOH=1:1 Iso-amylacetate : EtOH = 2:1인시약으로각각 1시간씩처리하여 SEM(LV-SEMS-3500N Hitachi, Korea Basic Science Institute-Chuncheon) 으로균사의생장상태를관찰하였다. Nano-silver의농도별처리가 Platypus koryoensis의몸체표면및균낭에존재하는포자및균사의생장에미치는영향조사 (SEM 관찰 ). Nano-silver 농도별처리가매개충 P. koryoensis의충체표면과균낭주변및균낭에존재하는 Raffaelea sp. 의포자및균사생장에미치는영향을조사하였다. 참나무의천공에서포집한매개충의충제표면에 10, 30, 50, 그리고 100 ppm의농도로 nanosilver 처리 24 h 후매개충의표면및균낭을 SEM을이용하여관찰하였다. Nano-silver 용액을이용한수간주사 (Trunk injection) 실험. 철원 ( 자등리 ), 춘천 ( 봉의산 ), 홍천 ( 강원대학교학술림 ) 의참나무시들음병이걸린신갈나무를선발하여수간 Table 1. Characteristics of nano-silver liquid used in the experiment Type Physical form Particle size (nm) Silver contents (µg/ml) Solvent WA-AT-WB13R Colorless Colloid 7 25 nm 10,000 Pure water
138 김상우 정진희 거비르 람살 김윤석 심상준 김하선 장석준 김종국 김경수 이윤수 주사를 놓았다. Nano-silver 용액은 WA-AT-WB13R을 이 용하여 지상부와 지상부로부터 50 cm 부위에 직경 4 mm, 깊이 5 cm로 구멍을 뚫어 수간주사 Kit을 이용하여 각각 의 농도 300, 500, 1,000 ppm으로 희석하여 각각의 나무 에 2 l씩 주입하였으며, 7일 간격으로 4회 처리하면서 나 무의 상태를 관찰하였다. 봉의산의 경우 지상부로부터 1.5 m까지 모기망을 이용하여 실험진행 기간 동안 외부 매개충의 공격을 차단시킨 후 실험을 실시하였다(Kuroda, 1998). 결과 및 고찰 Raffaelea sp.의 포자 및 균사생장에 미치는 Nano-silver 용액의 영향 조사(SEM 관찰). Nano-silver 용액의 처리 가 R. quercivorus의 균사생장에 미치는 영향을 조사한 결 과(Fig. 1), 균사의 모양이 처리하지 않은 무처리 대조구 (Fig. 1A)의 경우 정상적인 균사의 형태를 보였으나, 10 ppm 을 처리한 경우(Fig. 1B) 균사 표면의 손상이 관찰되기 시작 하였고, 30 ppm을 처리한 경우(Fig. 1C) 균사의 표 면 손상과 더불어 포자와 균사의 형태가 일그러져 있는 것을 확인하였다. 50 ppm을 처리한 경우(Fig. 1D)와 100 ppm을 처리한 경우(Fig. 1E) 모두 30 ppm을 처리한 경우 보다 포자와 균사의 모양이 비정상적으로 쪼그라들 어 균사 생장을 억제하는 것을 확인하였다. 이로서 매개 충의 충체 표면에 존재하는 R. quercivorus의 포자 및 균 사의 생장을 억제할 가능성을 확인하였다. Fig. 1. Effect of nano-silver treatment upon body surface of Platypus koryoensis carrying Raffaelea quercivorus around the mygangia. Results showed the inhibition effects of nano-silver with different concentrations the mycelia and spores of R. quercivorus. A: Control, B: 10 ppm, C: 30 ppm, D: 50 ppm and E: 100 ppm treatment.
은 나노 용액을 활용한 참나무 시들음병 방제 연구 139 Fig. 2. Scanning electron micrographs (SEM) of spores and mycelia of Raffaelea quercivorus treated with different concentrations of nano-silver on plates. Figure showed the damages caused by different concentrations of nano-silver on mycelia and spores of Raffaelea quercivorus. Results were obtained 48 hrs after the AgNPs treatments. A: Control, B: 10 ppm, C: 30 ppm, D: 50 ppm, and E: 100 ppm treatment. Nano-silver의 농도별 처리가 P. koryoensis의 몸체 표 면 및 균낭에 존재하는 포자 및 균사의 생장에 미치는 영 향 조사. Nano-silver 농도별 처리가 매개충 P. koryoensis 의 충체 표면과 균낭 주변 및 균낭에 존재하는 R. quercivorus의 포자 및 균사 생장에 미치는 영향을 조사 하였다. 이는 nano-silver 용액을 수간 주사하여 물관부를 통해 이동시킨 후 매개충인 P. koryoensis의 몸체 표면 및 균낭에 존재하는 포자 및 균사의 생장을 억제할 수 있는 가능성을 확인하고자 실시하였다. Nano-silver의 농도가 증가함에 따라 매개충인 P. koryoensis의 충체 표면에 존 재하는 R. quercivorus의 포자 및 균사 생장을 억제한 것 을 관찰하는 것이 본 실험의 목표로 참나무의 천공에서 포집한 매개충의 충제 표면에 10, 30, 50, 그리고 100 ppm 의 농도로 nano-silver를 처리한 후 24시간이 지나서 nanosilver를 살포한 매개충 P. koryoensis을 SEM으로 포자 및 균사의 생장상태를 관찰하였다. 그 결과(Fig. 2), 무처리 대조구에 비하여 nano-silver 처리 농도가 높아짐에 따라 매개충 P. koryoensis의 충제 표면과 균낭의 포자와 균사 의 형태가 변형되고 사멸하였다. 무처리 대조구의 경우 (Fig. 2A) P. koryoensis 충체 표면과 균낭 내의 포자 및 균사가 아무런 영향을 받지 않았지만, 10 ppm의 농도로 처리한 경우(Fig. 2B) 포자 및 균사에 변형이 생기기 시 작 하였고, 30 ppm(fig. 2C) 이상의 농도로 처리한 경우 (Fig. 2D, E) 포자와 균사의 변형과 사멸을 눈으로 쉽게 확인할 수 있었다. 특히 50 ppm과 100 ppm으로 처리한 경우 균사 및 포자의 완전 사멸을 관찰할 수 있었다. Nano-silver 용액을 이용한 수간주사(Trunk injection) 실험. 기내 실험에서 nano-silver 용액의 효과를 확인하 고 실제로 감염목에 적용해 보기 위해서 강원도 소재의 철원(자등리), 춘천(봉의산), 홍천(강원대학교 학술림)에서 2008년과 2009년 2차례에 걸쳐 5월부터 10월까지 각각 철원 21본, 춘천 15본, 홍천 8본을 대상으로 광릉긴나무
140 김상우 정진희 거비르람살 김윤석 심상준 김하선 장석준 김종국 김경수 이윤수 Table 2. Monitoring of disease symptoms on naturally infected trees treated with various concentrations of nano-silver in Cheolwon May Jun. Jul. Aug. Sep. Oct. 300 ppm-1 H a H H H H H 300 ppm-2 H H H H H H 300 ppm-3 H H H H H H 300 ppm-50-1 H H H H H H 300 ppm-50-2 H H H H H H 300 ppm-50-3 H H H H H H 500 ppm-1 H H H H H H 500 ppm-2 H H H H H H 500 ppm-3 H H H H H H 500 ppm-50-1 H H H H H H 500 ppm-50-2 H H H H H H 500 ppm-50-3 H H H H H H 1,000 ppm-1 H H H H H H 1,000 ppm-2 H H H H H H 1,000 ppm-3 H H H H H H 1,000 ppm-50-1 H H H H H H 1,000 ppm-50-2 H H H H H H 1,000 ppm-50-3 H H H H H H Control-1 H H H D c D D Control-2 H H H W b D D Control-4 H H H H H H H a : Health, W b : Wilt and D c : Dead. Table 3. Monitoring of disease symptoms on naturally infected trees treated with various concentrations of nano-silver in Chuncheon May Jun. Jul. Aug. Sep. Oct. 300 ppm-1 H a H H H H H 300 ppm-2 H H H H H H 300 ppm-50-1 H H W H H H 300 ppm-50-2 H H H H H H 500 ppm-1 H H H H H H 500 ppm-2 H H H H H H 500 ppm-50-1 H H H H H H 500 ppm-50-2 H H H H H H 1,000 ppm-1 H H H H H H 1,000 ppm-2 H H H H H H 1,000 ppm-50-1 H H H H H H 1,000 ppm-50-2 H H H H H H Control-1 H H H W b D D Control-2 H H H H H H Control-4 H H H D c D D H : Health, W : Wilt and D : Dead. a b c Table 4. Monitoring of disease symptoms on naturally infected trees treated with various concentrations of nano-silver in Hongcheon May Jun. Jul. Aug. Sep. Oct. 300 ppm H a H H H H H 300 ppm-50 H H H H H H 500 ppm H H H H H H 500 ppm-50 H H H H H H 1,000 ppm H H H H H H Control-1 H H H H W b W Control-2 H H H H W W Control-4 H H H H W W H : Health, W : Wilt and D : Dead. a b c 좀이만들어놓은침입공이확인된감염목에대한수간주사를실시하였다. 본실험에서는 WA-AT-WB13R 용액을이용하여실험을하였다. 용액의농도는 300 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm 3가지농도로제조하여 2l씩수간주사를놓았으며, 7일간격으로 4회처리후 6달동안경과를지켜본결과, 철원의감염목 18본에서는 300, 500, 1000 ppm 모두에서약해 (Phytotoxicity) 를발견하지못하였으며, 18본모두시들음증상없이건강한것을확인하였다 (Table 2). 춘천의봉의산에서총 12본의침입공이있는나무를선발하여실시한결과 300 ppm, 50 cm에수간주사를놓은곳에서 7월중순에시들음증상을보였으며, 8월이후에는시들음증상및약해등을확인할수없었다. 7월에시들음증상을일시적으로보인이유는실험당시이미침입공의밀도가높은것으로보아이미증상이많이진행되어있는상태라판단된다. 다른 17본의나무에서는약해및시들음증상을확인할수없었다 (Table 3). 홍천에서는총 5본의참나무를선발하여실시한결과, 5본모두약해및시들음증상은확인할수없었다 (Table 4). 요약 본연구는세계적으로참나무류집단고사를일으켜문제가되고있는 R. quercivorus 균의방제를위한연구로최근나노기술을활용하여참나무시들음병 (Oak wilt) 의원인균인 R. quercivorus를방제하고매개충인광릉긴나무좀 (Platypus koryoensis) 의생태및형태연구에관한것이다. Nano-silver 용액 WA-AT-WB13R 을이용하여 R. quercivorus 균에대한 in vitro 실험을실시하였으며, WA- AT-WB13R 용액이 100 ppm에서균사및포자의생장억제효과가있음을확인하였다. 각각 10, 30, 50, 100 ppm 처리하여 SEM 관찰결과, 무처리구에서는균사의형태
은나노용액을활용한참나무시들음병방제연구 141 가정상적임을확인하였고 30 ppm에서부터균사의형태가조금씩변형이일어나다가 100 ppm에서는균사및포자가비정상적으로일그러져있는것을확인하였다. 또한매개충인 P. koryoensis의충체에붙어있는균사와포자를 SEM을이용하여위와같은방법으로처리관찰결과, 표면과균낭의균사및포자의형태가 100 ppm에가까울수록형태적인변화를관찰할수있었다. 기내에서의 R. quercivorus의균사생장억제효과를바탕으로수간주사 (Trunk injection) 를실시한결과, 철원과홍천에서는시들음및약해증상을확인할수없었다. 또한춘천은 7월시들음증상을보였으나그후시들음증상및약해를보이지않았다. 본연구를통하여 nano-silver 용액을이용한참나무시들음병의원인균인 R. quercivorus의생장억제효과를확인하였으며, nano-silver를이용한 R. quercivorus 방제할수있음을확인하였다. Acknowledgements This research was supported by grants from the Korea Forestry Service, and in part, the Agriculture and Life Science Research Institute (ALSRI) of Kangwon National University. We would like to thank Bio-Plus Co. Ltd. (Pohang, Korea) for providing silver nanoparticle used in this study. 참고문헌 강환열, 정명주, 정영기. 2000. 금속은 ( 銀 ) 으로제조한 Ag + 용액의항균효과와안전성. 한국생물공학회지 15: 521 524. 김경희. 2004. 일본에서문제가되고있는참나무류집단고사산림과학정보 139: 46 52. 김경희. 2005. 참나무시들음병생태및방제 산림과학정보 179: 32 33. 김경희. 2006. 참나무시들음병의확산과훈증방제 산림과학정보 183: 4 5. 홍기정, 권영대, 박상욱, 류동표. 2006. 참나무시들음병을매개하는광릉긴나무좀 ( 딱정벌레목 : 긴나무좀과 ) 에대하여. Korea J. Appl. Entomol. 45: 113 117. Barranco, S. D., Spadaro, T. A., Berger, T. J. and Becker, R. O. 1974. In vitro effect of weak direct current on Staphylococcus aureus. Uin. Orthop. Relat. Res. 100: 250 255. Berger, T. J., Spadaro, J. A., Chapin, S. E. and Becker, R. P. 1976. Elctrically generated silver ions: quantitative effects on bacterial and mammalian cells. Antimicrob. Agents Chemother 7: 357 358. Ito, S., Kubono, T., Sahashi, N. and Yamada, T. 1998. Associated fungi with the mass mortality of oak trees (in Japanese with English abstract). J. Japan. For. Soc. 80: 170 175. Kuroda, K. 1998. Determinant factor of oak mortality in Japan: xylem discoloration and dysfunction associated with beetle invasion and fungal infection. Abstracts presented at the7th Int'l Cong. Pl. Pathol. Aug. 9-16, Edinburgh, Great Kingdom. Kinuura, H. 1995. Life history of Platypus quercivorus (Murayama) (Coleoptera: Platypodidae). Hawaii, pp. 373 383.