(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2010년08월17일 (11) 등록번호 10-0975611 (24) 등록일자 2010년08월06일 (51) Int. Cl. G01N 35/00 (2006.01) G01N 33/53 (2006.01) G01N 33/48 (2006.01) (21) 출원번호 10-2008-0119363 (22) 출원일자 2008 년 11 월 28 일 심사청구일자 2008 년 11 월 28 일 (65) 공개번호 10-2010-0060671 (43) 공개일자 2010 년 06 월 07 일 (56) 선행기술조사문헌 JP2005261285 A KR100848811 B1 KR100709284 B1 (73) 특허권자 한국생산기술연구원 충청남도천안시서북구입장면홍천리 35-3 (72) 발명자 이상호 서울특별시관악구봉천 9 동 635-353 김승택 경기도수원시팔달구우만동 4 단지 405-802 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 공인복 JP2006006287 A 전체청구항수 : 총 12 항 심사관 : 양성연 (54) 세포주화성검사용마이크로플루이딕칩및제조방법 (57) 요약 본발명은세포주화성검사용마이크로플루이딕칩및제조방법에관한것으로, 마이크로플루이딕칩에있어서, 주화성샘플용액이주입되는제 1 채널과세포용액이주입되는제 2 채널이각각구비되는상부기판, 상기제 1 채널과제 2 채널로부터각각주화성샘플 (chemoeffector) 용액과세포용액을전달받아이를서로접촉시키기위한소정깊이의정션채널 (junction channel) 이구비되는하부기판을포함하여구성되는것을특징으로한다. 또한, 마이크로플루이딕칩제조방법에있어서, 몰딩원판을통해주화성용액이주입되는제 1 채널과샘플용액이주입되는제 2 채널을형성시켜상부기판을제조하는단계, 상기제 1 채널과제 2 채널이형성된상부기판을몰딩원판으로부터이형시키는단계, 하부기판에주화성용액과샘플용액이접촉하는정션채널을형성시키는단계및상기하부기판과상부기판을조립하는단계를포함하여구성되는것을특징으로한다. 대표도 - 도 4-1 -
(72) 발명자강희석서울강남구대치1동 888 아이파크 106동 802호이강원충청남도천안시안서동부경파크빌 108-1301 강경태 서울특별시서초구반포본동주공아파트 110-105 황준영 경기용인시수지구동천동수진마을써니벨리 101-806 호 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 마이크로플루이딕칩에있어서, 주화성샘플용액이주입되는제 1채널과세포용액이주입되는제 2채널이각각구비되는상부기판 ; 상기제 1채널과제 2채널로부터각각주화성샘플 (chemoeffector) 용액과세포용액을전달받아이를서로접촉시키기위한소정깊이의정션채널 (junction channel) 이구비되는하부기판 ; 을포함하여구성되는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기정션채널은, 세포크기의 90 내지 110% 의깊이를가지는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩. 청구항 3 제 1항에있어서, 상기상부기판은, 투명실리콘폴리머 (PDMS) 를포함하는폴리머재질인것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩. 청구항 4 제 1항에있어서, 상기하부기판은, 석영이나유리기판중어느하나의재질인것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩. 청구항 5 제 1항에있어서, 상기상부기판은, 상기정션채널내부의공기를외부로배출시키기위해연통되는에어벤트를더포함하여구성되는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩. 청구항 6 제 1항에있어서, 상기상부기판은, 주화성샘플용액과세포용액을각각상기제 1채널과제 2채널에제공하기위해연통된제 1채널저장부와제 2 채널저장부가더형성되어있는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩. 청구항 7 마이크로플루이딕칩제조방법에있어서, 몰딩원판을통해주화성용액이주입되는제 1채널과샘플용액이주입되는제 2채널을형성시켜상부기판을제조하는단계 ; 상기제 1채널과제 2채널이형성된상부기판을몰딩원판으로부터이형시키는단계 ; 하부기판에주화성용액과샘플용액이접촉하는정션채널을형성시키는단계 ; 및상기하부기판과상부기판을조립하는단계 ; 를포함하여구성되는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩제조방법. 청구항 8 제 7항에있어서, 상기정션채널은, 세포크기의 90 내지 110% 깊이로식각하여형성시키는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루 - 3 -
이딕칩제조방법. 청구항 9 제 7항에있어서, 상기하부기판은, 상기하부기판과상부기판을조립하는단계전에조립정렬을실시하기위해메탈박막을일정영역패터닝하는단계를더포함하여구성되는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩제조방법. 청구항 10 제 9항에있어서, 상기메탈박막은, 100nm 이하의두께로패터닝하는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩제조방법. 청구항 11 제 9항에있어서, 상기상부기판제조단계는, 펀칭과정을통해상기제 1, 2채널과연통되는제 1 채널저장부와제 2채널저장부를형성시키는단계 ; 를더포함하여구성되는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩제조방법. 청구항 12 제 9항에있어서, 상기몰딩원판은, MEMS 공정을이용하여실리콘을식각하거나, 후막감광제를패터닝하여몰딩원판을제작하되, 상기상부기판에형성될상기제 1, 2채널의깊이를 20 내지 100μm로형성되도록몰딩원판을제조하는것을특징으로하는세포주화성검사용마이크로플루이딕칩제조방법. 명세서 발명의상세한설명 [0001] 기술분야본발명은세포주화성검사용마이크로플루이딕칩및제조방법에관한것으로, 좀더상세하게는세포주화성검사를위해주화성샘플용액과세포용액을용이하게접촉시키기위한세포주화성검사용마이크로플루이딕칩및제조방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] 배경기술주화성 (chemotaxis) 은화학물질의농도차가자극이되어일어나는주성으로농도가높은쪽을향하는것을양의주화성, 낮은쪽으로향하는것을음의주화성이라고한다. 1884년독일의 W. 페퍼가고사리의정자 ( 精子 ) 가말산 ( 사과산 ) 에대하여양의주화성을나타내는것을발견했다. 짚신벌레는진한식염수에대하여음의주화성을, 묽은아세트산에대하여양의주화성을나타낸다. 백혈구도세균에대하여주화성을나타낸다생물산업에있어미생물및세포의약물과반응성을밝히고미생물의기능과활용성을판단할수있는중요한인자이다. 주화성검사를위한종래의방법으로박테리아의주화성검사법은도 1에도시된바와같이약물과젤의혼합물모세관에삽입한후이를박테리아용액에접촉시켜반응시간에따라용액에노출된끝부분에박테리아의이동여부를분석하여주화성의양성반응과음성반응을검사한다. 이러한방법은항상젤과약물을혼합해야하는불편한점과세포의개별적인움직임이나이동성을관찰하기어렵다. 매크로 (macro) 한스케일에서관찰이진행되므로다수샘플의동시분석이어렵다. 한편, 현재까지의마이크로플루이딕칩 (microfluidic chip) 기반주화성검사실험은연속유동흐름 (continuous flow) 제어를이용한다. 실린지펌프를사용하여샘플주입하며샘플사용량도수십 ml 이상으로소모량도많고검사시간도수시간이상으로길다. 특히 Laminar flow를유지하기위해서일정이상의유속이필요 - 4 -
하며, 이는미생물의운동성을방해하며미생물운동에의한정확한주화성분석을해석하긴어렵다. [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] 이러한단점을극복하기위해서외부시린지펌프를정지시켜서유체의흐름을정지시키기도하나, 그제어가불규칙적이고이러한방법은제품으로사용자가사용하기에매우부적합하다. 도 2에도시된바와같이스탠포드대학병리학과의 Buthcher교수가발표한검사법으로상부의 Y 채널의양쪽으로 buffer용액과주화성샘플을외부에서시린지펌프를이용하여주입한다. 이때가운데주채널 (main channel) 에서농도구배가생기게된다. 그다음, 주채널의양측면에형성된좁은채널을통해세포용액을주입하면서세포의주화성을검사하게된다. 또다른방법으론주화성검사용시료와세포 ( 미생물 ) 의 interface를유지하기위해다공성멤브레인, 젤을사용하기도한다, 이러한방법은다공서의다공밀도를제어하기가어려우며, 다공성젤같은경우확산속도가매우느려검사시간이많게는하루이상도걸리게된다. 도 3은또다른종래기술로써코넬대학의 Wu 교수가발표한주화성검사용칩으로 agarose gell을마이크로채널모양으로패터닝한후상부마이크로채널에는주화성시료를채우고, 중앙에세포용액을채운다. 케미컬 sink로작용하는하부채널에는 Buffer 용액을채워서상부채널과하부채널간농도구배를형성시켜서중앙의채널에서세포의주화성을검사한다. 상기기술된마이크로플루이딕기반의주화성검사법은 High throughput, parallelism의장점을확보하기어렵고, 칩집적도를높이기어려울뿐만아니라, 현장에사용하기엔불편하긴복잡하고재현성이뒤떨어지는프로토콜을사용하므로반복적인다수의샘플을분석하기엔어렵다. 발명의내용 [0011] [0012] 해결하고자하는과제상기와같은문제점을해결하기위한본발명은적은샘플용액사용과검사시간을단축시키고보다정확한주화성분석을달성할수있는마이크로플루이딕칩을제공하고자하는데그목적이있다. 또한, 사용상의편의성과다수의샘플분석을용이하게달성하고자하는데그목적이있다. [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] 과제해결수단상기와같은목적을달성하기위한본발명은마이크로플루이딕칩에있어서, 주화성샘플용액이주입되는제 1채널과세포용액이주입되는제 2채널이각각구비되는상부기판, 상기제 1채널과제 2채널로부터각각주화성샘플 (chemoeffector) 용액과세포용액을전달받아이를서로접촉시키기위한소정깊이의정션채널 (junction channel) 이구비되는하부기판을포함하여구성되는것을특징으로한다. 또한, 상기정션채널은, 세포크기의 90 내지 110% 의깊이를가지는것을특징으로한다. 또한, 상기상부기판은, 투명실리콘폴리머 (PDMS) 를포함하는폴리머재질인것을특징으로한다. 또한, 상기하부기판은, 석영이나유리기판중어느하나의재질인것을특징으로한다. 또한, 상기상부기판은, 상기정션채널내부의공기를외부로배출시키기위해연통되는에어벤트를더포함하여구성되는것을특징으로한다. 또한, 상기상부기판은, 주화성샘플용액과세포용액을각각상기제 1채널과제 2채널에제공하기위해연통된제 1채널저장부와제 2채널저장부가더형성되어있는것을특징으로한다. 또한, 마이크로플루이딕칩제조방법에있어서, 몰딩원판을통해주화성용액이주입되는제 1채널과샘플용액이주입되는제 2채널을형성시켜상부기판을제조하는단계, 상기제 1채널과제 2채널이형성된상부기판을몰딩원판으로부터이형시키는단계, 하부기판에주화성용액과샘플용액이접촉하는정션채널을형성시키는단계및상기하부기판과상부기판을조립하는단계를포함하여구성되는것을특징으로한다. 또한, 상기정션채널은, 세포크기의 90 내지 110% 깊이로식각하여형성시키는것을특징으로한다. 또한, 상기하부기판제작단계후에는, 상기상부기판을조립하기전조립정렬을용이하게실시하기위해메 - 5 -
탈박막을일정영역패터닝하는단계를더포함하여구성되는것을특징으로한다. [0022] [0023] [0024] 또한, 상기메탈박막은, 100nm 이하의두께로패터닝하는것을특징으로한다. 또한, 상기상부기판제조단계는, 펀칭과정을통해상기제 1, 2채널과연통되는제 1 채널저장부와제 2채널저장부를형성시키는단계를더포함하여구성되는것을특징으로한다. 또한, 상기몰딩원판은, MEMS 공정을이용하여실리콘을식각하거나, 후막감광제를패터닝하여몰딩원판을제작하되, 상기상부기판에형성될상기제 1, 2채널의깊이를 20 내지 100μm로형성되도록몰딩원판을제조하는것을특징으로한다. [0025] [0026] 효과상기와같이구성되고작용되는본발명은샘플용액사용을절감할수있으며, 검사기간을극히단축시키고사용상높은편의성을제공하는이점이있다. 또한, 다수의샘플분석이용이하고보다정확하게세포의주화성을분석할수있는장점이있다. 상세하게는첫째, 외부의실린지펌프나마이크로펌프등을사용하지않고모세관현상으로샘플을주입할수있어유체를제어하기위한주변부대장비가필요없다. 또한, Hydrodynamic injection 방식에구동되는칩은유속에세포나미생물의움직임이영향을받지만, 본발명은정지된흐름에서검사를함으로 chemoeffector에대한오직세포나미생물의움직임을검사할수있다. [0027] [0028] 둘째, 제작공정이단순하여저가로제작할수있으며, 마이크로플루이딕칩의집적도를높일수있고, 샘플사용량이수십μl이하로기존방법에비해매우적다. 셋째, 세포용액과 Chemoeffector용액을직접적으로접촉시켜서 liquid/lquid interface를만들수있으므로, 기존방법과같이 chemoeffector와젤과섞어서반응시킬필요가없는효과가있다. [0029] [0030] 발명의실시를위한구체적인내용이하, 첨부된도면을참조하여본발명에따른세포주화성검사용마이크로플루이딕칩및제조방법에따른바람직한실시예를상세히설명하면다음과같다. 도 4는본발명에따른세포주화성검사용마이크로플루이딕칩의상부기판을나타낸평면도, 도 5는본발명에따른세포주화성검사용마이크로플루이딕칩의사시도, 도 6은도 5의 A-A' 와 B-B' 를나타낸단면도, 도 7은본발명에따른세포주화성검사용마이크로플루이딕칩의제조공정도를나타낸순서도, 도 8은본발명에따른마이크로플루이딕칩을칼라잉크를이용한유체제어방법의시현을나타낸상태도, 도 9는본발명에따른일실시예로 1% peptone 용액과대장균의주화성검사를나타낸도면이다. [0031] [0032] [0033] 본발명에따른세포주화성검사용마이크로플루이딕칩은, 주화성샘플용액이주입되는제 1채널 (110) 과세포용액이주입되는제 2채널 (120) 이각각구비되는상부기판 (100) 과, 상기제 1채널과제 2채널로부터각각주화성샘플 (chemoeffector) 용액과세포용액을전달받아이를서로접촉시키기위한정션채널 (junction channel ; 210) 이구비되는하부기판 (200) 을포함하여구성되는것을특징으로한다. 상부기판 (100) 은주화성샘플 (chemoeffector) 이주입되는제 1채널 (110) 과세포 (ell) 용액이주입되는제 2채널 (120) 이각각마이크로채널형태로구비되는것으로, 각각의용액을전달하기위한것이다. 여기서상기상부기판 (100) 은폴리머재질로구비되며, 바람직하게는투명실리콘폴리머용액 (PDMS) 을경화시켜서형성된다. 또한, 상기제 1, 2채널과연결되어주화성용액또는세포용액을저장하고있는제 1채널저장소 (140) 와제 2 채널저장소 (150) 가구비되어상기제 1, 2채널저장소에용액이주입되면모세관현상 (capillary phenomenon) 에의해상기제 1, 2채널로용액이주입된다. 따라서 Micro pipette를이용하여상기제 1, 2채널저장소 (140, 150) 에용액을떨어뜨리면, 모세관현상에의해유입되게된다. - 6 -
[0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] 한편, 상기상부기판 (100) 은제 1채널과제 2채널을구획하는부분에는외측으로공기를배출시킬수있는에어벤트 (air vent ; 130) 가형성되어있다. 이것은제 1채널에서유입되는주화성샘플용액과제 2채널에서주입되는세포용액이후술할정션채널 (210) 에서상호접촉시포획 (trap) 될수있는공기가원활하게외부로배기시키도록하기위한것이다. 하부기판 (200) 은상기상부기판 (100) 에하부에접하여구비되는것으로, 석영이나유리기판을식각하여중앙으로정션채널 (junction channel ; 210) 이형성되어있다. 상기정션채널 (210) 은주화성샘플용액과세포용액을접촉시키기위한하나의공간부로써상기제 1채널과제 2채널사이에위치하도록마주하며구비된다. 따라서제 1채널과제 2채널에서주화성샘플용액과세포용액이모세관현상에의해유입되면, 상기정션채널 (210) 을통해만나면서확산반응이시작된다. 또한, 상기하부기판 (200) 은상부기판 (100) 과용이한조립공정을위하여상부면양측으로대응되게메탈박막 (220) 이패터닝된다. 또한도면에도시하진않았지만. 상부기판에형성된정렬마크를이용하여메탈박막과정렬시키게되는것이다. 이때메탈박막은반사도가높은알루미늄과같은금속박막을사용하는것이바람직하며, 패터닝두께는 100nm 이하로형성시키는것이바람직하다. 하부기판에형성된졍션체널의깊이가경우에따라서 1 내지 2μm정도로낮아현미경의분해성능에따라서관찰이어려울뿐만아니라, 현미경에서조사된빛이투과하여관찰이힘들다. 그리하여반사도가높은상기메탈박막 (220) 에의해현미경의렌즈로입사되는조명이반사되어관찰이쉬운이점도있다. 도 7은칼라잉크를이용하여유체제어방법의시현단계를나타낸것이다. (a), (b), (c), (d) 각각의상태에따른 C-C' 단면도를우측에나타낸것으로, (a) 는마이크로플루이딕칩을현미경으로보여주고있다. (b) 는제 2 채널저장부를통해보라색잉크를주입함에따라모세관현상에따라제 2채널로유입되면서하부기판의정션채널일부까지채워진다. 이때제 1채널과제 2채널의경계선에해당하는위치까지채워지게된다. 그리고 (c) 에나타낸바와같이제 1채널저장부로주화성샘플용액을주입함에따라제 1채널을통해정션채널까지유입되어 (d) 에나타낸바와같이혼합된다. 이로써세포의주화성을검사할수있다. [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] 다음으로본발명에따른세포주화성검사용마이크로플루이딕칩의제조방법을설명하면다음과같다. 도 8에도시된바를보면, 우선상부기판을제조하기위한몰딩원판을 MEMS공정을이용하여마이크로채널형태로실리콘을식각하거나, 후막감광제를패터닝하여제조한다. 이때제 1채널과제 2채널의높이를 20 내지 100μm로제작하여야하기때문에이에대응하도록몰딩원판을제조한다. 제조된몰딩원판으로상부기판 (100) 을제조하기위해폴리머용액을붓고경화시킨다. 이때폴리머용액은투명실리콘폴리머용액 (PDMS) 을사용하여제작한다. 경화된상부기판은몰딩원판으로부터분리시킨후펀칭을통해제 1, 2채널저장부가제 1채널과제 2채널에각각연통되도록상부기판 (100) 을제작한다. 하부기판 (200) 은유리나석영기판을식각하여정션채널 (210) 을형성시킨다. 이때상기정션채널 (210) 의깊이는검사를요구하는세포크기의 90 내지 110% 정도로식각하여형성시켜하부기판을준비한다. 또한, 하부기판의상부면으로상기상부기판 (100) 을조립하게되는데, 이때조립의용이성을위하여상부면일정위치에대응하도록메탈박막 (220) 을패터닝한다. 상기메탈박막 (220) 은알루미늄 (Al) 과같은반사도가높은금속을이용하여패터닝하는데그두께는 100nm 이하로패터닝하는것이바람직하다. 상기메탈박막이패터닝완료되면, 상부기판 (200) 을하부기판상면에접합하여제작을완료한다. 간단히설명하면, 상하부기판을일정간격을유지한후, 상부기판은고정하고하부기판을 X-Y-θ방향으로이동시켜현미경을이용하여상하부기판에형성된메탈박막과정렬마크를겹쳐서정렬한후하부기판을수직으로이동하여상부기판과접촉시켜접합한다. 도 9는 1% peptone 용액에대한대장균 (E Coli.) 의주화성검사결과를나타낸다. 도 7을설명한바와같이유체조작법과동일하게, 먼저제 2채널 (120) 에대장균이포함된용액을모세관현상에의해서주입한후, 제 1채널 (110) 에두번째로 1% peptone 용액을주입한다. - 7 -
[0048] 빨간색점선은상부기판에형성된제 1, 2채널의경계를나타내며, 검정색원과노란색화살표는대장균을나타낸다. 실험결과로알수있듯이, 대장균용액과 1% peptone용액접촉한직후의대장균초기개체수보다반응시간이길어질수록개체수가증가함을알수있다. 이는 1% peptone 용액에대해서대장균이양성반응을보임을알수있다. 하부기판에형성된정션채널에서 1% peptone 용액과대장균용액간의확산반응은진행되지만, 대장균의이동은억제함을알수있다. [0049] [0050] [0051] 이와같이구성되는본발명은검사시간을크게단축시키고샘플용액을절감하면서세포의주화성을정확하게검사할수있으며, 현장에서용이하게사용할수있는이점이있다. 이상, 본발명의원리를예시하기위한바람직한실시예와관련하여설명하고도시하였지만, 본발명은그와같이도시되고설명된그대로의구성및작용으로한정되는것이아니다. 오히려, 첨부된청구범위의사상및범주를일탈함이없이본발명에대한다수의변경및수정이가능함을당업자들은잘이해할수있을것이다. 따라서그러한모든적절한변경및수정과균등물들도본발명의범위에속하는것으로간주되어야할것이다. [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] 도면의간단한설명도 1은종래기술에따른박테리아주화성검사법을나타낸도면, 도 2는종래기술에따른마이크로플루이딕칩기반의주화성검사법을나타낸도면, 도 3은또다른종래기술에따른 Agarose gel 마이크로채널을이용한주화성검사방법을나태난도면, 도 4는본발명에따른세포주화성검사용마이크로플루이딕칩의상부기판을나타낸평면도, 도 5는본발명에따른세포주화성검사용마이크로플루이딕칩의사시도, 도 6은도 5의 A-A' 와 B-B' 를나타낸단면도, 도 7은본발명에따른마이크로플루이딕칩을칼라잉크를이용한유체제어방법의시현을나타낸상태도, 도 8은본발명에따른세포주화성검사용마이크로플루이딕칩의제조공정도를나타낸순서도, 도 9는본발명에따른일실시예로 1% peptone 용액과대장균의주화성검사를나타낸도면. < 도면의주요부분에대한부호의설명 > 100 : 상부기판 110 : 제 1채널 120 : 제 2채널 130 : 에어벤트 140 : 제 1채널저장부 150 : 제 2채널저장부 200 : 하부기판 210 : 정션채널 220 : 메탈박막 - 8 -
도면 도면 1 도면 2-9 -
도면 3 도면 4-10 -
도면 5 도면 6-11 -
도면 7 도면 8-12 -
도면 9-13 -