Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 2, April 2018, Article 금전초추출물및분획물의항산화활성및세포보호효과 김아랑 정민철 * 정혜인 * 송동기 * 서영빈

Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 2, April 2018, 176-184 https://doi.org/10.14478/ace.2017.1113 Article 김아랑 정민철 * 정혜인 * 송동기 * 서영빈 * 전영희 * 박소현 신혁수 이상래 박수남 서울과학기술대학교정밀화학과, 나노바이오화장품연구실, 화장품종합기술연구소, * 한성과학고등학교 (2017 년 11 월 18 일접수, 2017 년 12 월 2 일심사, 2017 년 12 월 22 일채택 ) Antioxidative and Cellular Protective Effects of Lysimachia christinae Hance Extract and Fractions A Rang Kim, Min Chul Jung*, Hye In Jeong*, Dong Gi Song*, Young Bin Seo*, Young Hee Jeon*, So Hyun Park, Hyuk Soo Shin, Sang Lae Lee, and Soo Nam Park Department of Fine Chemistry, Nanobiocosmetic Lab., Cosmetic R&D Center, Seoul National University of Science and Technology, 232 Gongneungro, Nowon-gu, Seoul 01811, Korea *Hansung Science High School, Seoul 03732, Korea (Received November 18, 2017; Revised December 2, 2017; Accepted December 22, 2017) 초록본논문에서는금전초로부터 50% 에탄올추출물, 에틸아세테이트분획및아글리콘분획을제조하였고이들의항산화활성, 세포보호효과및성분분석에대한연구를수행하였다. 항산화능평가에서 50% 에탄올추출물, 에틸아세테이트분획및아글리콘분획의라디칼소거활성 (FSC 50 ) 은각각 146.8, 22.2 및 27.2 µg/ml이었고, 총항산화능 (OSC 50 ) 은 29.3, 2.9 및 4.5 µg/ml이었다. 에틸아세테이트분획의자유라디칼소거활성및총항산화능이가장크게나타났다. 또한 1 O 2 로유도된적혈구광용혈에대한세포보호효과 (τ 50 ) 는금전초 50% 에탄올추출물, 에틸아세테이트분획및아글리콘분획 5 µg/ml에서각각 26.9, 57.5 및 103.9 min을나타냈다. 특히아글리콘분획물의 τ 50 은 (+)-α-tocopherol (37.7 min) 보다훨씬큰세포보호효과를나타내었다. UVB로유도된세포손상에서에틸아세테이트분획물은최대 90.1% 까지세포생존율을증가시켰다. 과산화수소로유도된세포손상에서도에틸아세테이트분획물은 5-25 µg/ml에서농도의존적으로세포보호효과를나타내었다. 금전초에틸아세테이트분획물의성분분석을위해 TLC, HPLC, UV-vis spectrum, LC-MS로분석한결과, quercetin, kaempferol 및그배당체가주성분들로확인되었다. 결론적으로금전초가자외선에노출된피부를보호하는항산화제로서작용할수있고, 기능성화장품원료로응용가능성이있음을시사한다. Abstract In the present study, we investigated the antioxidative properties, cellular protective effects and component analyses of 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction obtained from Lysimachia christinae Hance (L. christinae Hance). In the evaluation of antioxidative properties, the free radical scavenging activities (FSC 50) of 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction were 146.8, 22.2 and 27.2 µg/ml, respectively and total antioxidant capacities (OSC 50) were 29.3, 2.9 and 4.5 µg/ml, respectively. The ethyl acetate fraction showed the highest free radical scavenging activity and total antioxidant capacity. Also, the cellular protective effects (τ 50) of 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction on 1 O 2 induced photohemolysis of human erythrocytes were 26.9, 57.5 and 103.9 min at 5 µg/ml, respectively. In particular, τ 50 of the aglycone fraction exhibited a higher cellular protective effect than that of (+)-α-tocopherol (37.7 min). The cell viability of the ethyl acetate fraction on the UVB-induced cell damage increased up to 90.1%. In addition, the ethyl acetate fraction (5-25 µg/ml) showed cellular protective effects on the H 2O 2-induced cell damages in a dose-dependent manner. TLC, HPLC, UV-vis spectroscopy and LC-MS were used to analyse components of the ethyl acetate fraction and the main components were quercetin, kaempferol and their glycosides. In conclusion, L. christinae Hance extract/fraction can function as antioxidants to protect the skin exposed to UV radiation and may also be used as a novel functional cosmetic material, for example, an antioxidant against skin photoaging. Keywords: Lysimachia christinae Hance, reactive oxygen species, antioxidant, component analysis, cellular protective effect 1) Corresponding Author: Seoul National University of Science and Technology, Department of Fine Chemistry, Nanobiocosmetic Lab., Cosmetic R&D Center, 232 Gongneungro, Nowon-gu, Seoul 01811, Korea Tel: +82-2-970-6451 e-mail: snpark@seoultech.ac.kr pissn: 1225-0112 eissn: 2288-4505 @ 2018 The Korean Society of Industrial and Engineering Chemistry. All rights reserved. 1. 서론 피부는자외선이나공해와같은해로운외부환경으로부터신체를보호하는중요한역할을담당하는동시에외부의산화적스트레스에쉽게노출될수도있다 [1,2]. 피부에서자외선은광증감반응으로 sin- 176

177 양한생리활성에관한연구들이있다. 또한금전초의주요성분들로는 myricetin, kaempferol 및 quercetin의배당체들이보고되어있다 [15,22,24]. 하지만화장품에서금전초추출물이나특정분획을대상으로다양한 ROS가생성되는 Fe 3+ -EDTA/H 2 O 2 계에서의총항산화능측정에관한연구나세포보호효과에관한연구는아직미흡한실정이다. 따라서본연구에서는금전초추출물과분획물을이용하여항산화및세포보호효과를확인하고성분분석을통해활성성분을밝힘으로써기능성화장품의항산화소재로서의가능성이있는지를알아보고자하였다. Figure 1. Fractionation scheme of L. christinae Hance 50% EtOH extract and fractions. glet oxygen ( 1 O 2 ) 을비롯한 superoxide anion radical (O - 2 ) 과같은활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 을생성시킨다. O - 2 는 superoxide dismutase (SOD) 에의해과산화수소 (H 2 O 2 ) 로전환되며, H 2 O 2 는펜톤 (Fenton) 반응을거처히드록실라디칼 ( OH) 로전환된다. 이러한다양한종류의 ROS가자외선에의한생체내반응으로생성될수있다 [3-7]. ROS는자외선외에도흡연, 공해및약물대사과정에서도생성된다. 과잉으로생성된 ROS는단백질산화, DNA 손상및지질과산화반응을개시시키며진피층의기질성분인콜라젠, 엘라스틴섬유질을분해시키는효소인 matrix metalloproteinases (MMPs) 의발현을촉진시킬수있다 [8,9]. 결합조직분자와기저막단백질을표적으로하는 MMPs의작용으로피부탄력감소나주름생성등의피부노화가가속화된다. 이러한산화적스트레스로부터피부를보호하기위하여피부에는 superoxide dismutase (SOD), catalase 및 glutathione peroxidase와같은항산화효소 [10] 와비타민 C, E 및글루타치온등의비효소적항산화제 [11] 로구성된항산화방어망이구축되어있다. 그러나지속적인자외선노출에의하여생성된과잉의 ROS는이러한항산화방어망을붕괴시킴으로써피부노화를더욱가속화시킨다 [9]. 따라서피부에서생성되는과잉의 ROS의생성을억제하거나생성된 ROS를효율적으로제거할수있는피부항산화방어망구축과이를통한산화적손상으로부터세포를보호할수있는항산화제개발은매우중요하며여전히관심의대상이되고있다 [12,13]. 화장품에사용되는천연항산화제는주로식물추출물의플라보노이드와같은페놀성화합물들이주성분이다 [14]. 이러한플라보노이드는대부분배당체형태로존재하며중간극성을갖는용매인에탄올이나에틸아세테이트에의해추출이잘된다. 따라서본논문에서는금전초추출물로부터에틸아세테이트분획과아글리콘분획물을제조하고이들의항산화활성을평가하고성분분석을수행하였다. 금전초는긴병꽃풀이라불리는꿀풀과의 Glechoma longituba Kupr 와과로황이라불리는앵초과의 L. christinae Hance 두가지종이있다. 앵초과금전초의생약명은 Lysimachiae Herba이며중국약전에는 Jinqiancao 로기록되어있다. 전세계적으로온대기후에서분포하며중국남서부와 Yangzi강유역에주로분포되어있다 [15]. 금전초는일반적으로담석증, 요로결석제거, 담낭염, 황달등의한방치료제로사용된다고알려져있다 [16,17]. 현재까지금전초로부터분리한 6-tridecyl resorcylic acid, grevillol의 Na + -K + -ATPase 활성억제작용이보고되고있으며 [18], 메탄올추출물과분획물의간독성해독작용 [19], 콜레스테롤담석증감소 [17], 항염증제 [20], 담즙배출촉진작용 [21], 이뇨제 (diuretics)[22], 산화방지제 [23], 진통제 (analgesic)[20] 등의다 2. 실험 2.1. 기기및시약 DPPH 실험에서 UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia) 사의 Cary 50을사용하였으며, 화학발광기는 Berthold (Germany) 사의 6-channel LB9505 LT를사용하였다. 적혈구광용혈실험에사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품이며, ph 미터는 Mettler-Toledo Ltd. (Korea) 제품을사용하였다. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), luminol, heparin, H 2 O 2, 증감제로사용된 rose-bengal, 표준물질로사용한항산화제 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g) 과 L-ascorbic acid는 Sigma Chemical Co. (USA) 에서구입하였다. 기타 FeCl 3 6H 2 O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을사용하였다. 완충용액제조에사용된 Na 2 HPO 4 12H 2 O, NaH 2 PO 4 2H 2 O, NaCl, H 2 SO 4 그리고에탄올 (EtOH), 에틸아세테이트 (EtOAc) 등각종용매는시판특급시약을사용하였다. 성분분리를위한 thin layer chromatography (TLC, aluminum sheet silica gel 60 F254) 는 Merck (USA) 에서구입하였고 HPLC는 Shimadzu (Japan) 제품을사용하였다. LC/ESI-MS (Applied Biosystems, USA) 는서울대학교농생명과학공동기기원에분석의뢰하였다. MTT 실험에서사용되는 ELISA reader는 Tecan (Austria) 사의제품을사용하였다. 본연구에사용한금전초는앵초과에속하며 2017년 5월경경동시장에서구입하였다. 2.2. 금전초의추출및분획건조된금전초 600 g에 50% 에탄올 9 L를이용하여 24 h 동안침적시킨후여과하였다. 이여액을감압농축하여 50% 에탄올추출물을얻었으며, 일부를에틸아세테이트로 3회반복처리한분획을감압농축하여건조된에틸아세테이트분획물을얻었다. 에틸아세테이트분획중일부를산가수분해반응을이용해당을제거시킨후아글리콘분획물을얻었다. 아글리콘제조는에틸아세테이트분획파우더 0.1 g에 H 2 SO 4 와아세톤을혼합한용액 (10 ml) 을첨가한후 4 h 동안중탕가열하면서환류 냉각시켰다. 환류시킨용액을 5% KOH- MeOH 용액으로중화적정한후산, 염기및당등을모두제거하기위해증류수로세척하였다. 이용액을다시에틸아세테이트로분획하고이를감압 농축하여제조된아글리콘분획물을실험에사용하였다 (Figure 1). 2.3. 금전초추출물의항산화효과측정 2.3.1. DPPH법을이용한 free radical 소거활성금전초추출물및분획물의 free radical 소거활성을평가하기위해비교적안정한라디칼인 DPPH에대한시료의환원력을측정하였다. 먼저, 메탄올에용해시킨 0.2 mm의 DPPH 용액 0.3 ml에에탄올 0.3 Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 2, 2018

178 김아랑 정민철 정혜인 송동기 서영빈 전영희 박소현 신혁수 이상래 박수남 ml를첨가한후금전초추출물 0.3 ml를농도별로첨가하여섞는다. 실온에서 10 min 동안방치한후 spectrophotometer로 517 nm에서흡광도를측정하였다. 대조군 (control) 은시료가포함되지않은용매를첨가한것으로, DPPH의최대흡광도를나타낸다. 실험군 (experiment) 은시료를첨가한것으로, 시료에의해 DPPH 라디칼소거활성이나타날경우 517 nm에서의흡광도가감소하게된다. 시료바탕실험군 (sample blank) 은 DPPH를첨가하지않고시료만을첨가한것으로, 시료자체의흡광도를나타낸다. 이들각각의흡광도 (A) 로부터아래식에의거해서 DPPH 라디칼소거율 (%) 을나타내었다. 자유라디칼소거활성은 DPPH의농도가 50% 감소되는데필요한시료의농도 (free radical scavenging activity, FSC 50, µg/ml) 로표기하였다. exp 2.3.2. Luminol 발광법을이용한 Fe 3+ -EDTA/H 2 O 2 계에있어서활성산소소거활성 ( 총항산화능 ) Fe 3+ -EDTA/H 2 O 2 계는 Fenton 반응을주반응으로다양한종류의 ROS (O - 2, OH 및 H 2 O 2 ) 를생성시킨다. 이들 ROS와 luminol이반응하면들뜬상태의 luminol이되고이어화학발광 (chemiluminescence) 이나타난다. 이러한화학발광은시료의항산화능이나 ROS 생성을억제하는킬레이트능력에의해감소된다. 이를총항산화능이라고말한다. 실험방법은먼저, 화학발광측정용튜브에증류수 1.78 ml를넣고여러농도의금전초추출물과 2.5 mm EDTA 40 µl, 5 mm FeCl 3 6H 2 O 10 µl, 35 mm luminol 80 µl를첨가하여섞은후화학발광기의 cell holder에튜브를넣고, 5 min 동안 37 에서항온시켰다. 그후 150 mm H 2 O 2 40 µl를넣고 25 min 동안화학발광을측정하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의각채널은실험전에보정하여채널간의차이가거의없도록하였다. 공시험 (blank) 은실험군 (experiment) 과조건이동일하나 H 2 O 2 와 FeCl 3 6H 2 O를첨가하지않은것으로하였으며, 대조군 (control) 은시료용액대신증류수를첨가한것으로하여, 다음식에의해활성산소소거율 (%) 을구하였다. 활성산소소거활성의크기는화학발광의세기 (counts per minute, cpm) 가 50% 감소하는데필요한시료의농도 (reactive oxygen species scavenging activity, OSC 50, µg/ml) 로표기하였다. exp 2.4. Photohemolysis법을이용한세포보호효과측정 2.4.1. 적혈구분산액제조적혈구는건강한성인으로부터얻었고, 채혈즉시혈액을 heparin이첨가된시험관에넣었다. 혈액 1.2 ml를취해튜브에넣고 3,000 rpm 으로 5 min 동안원심분리하여적혈구와혈장을분리하였다. 분리한적혈구는 0.9% saline phosphate buffer (ph 7.4, Na 2 HPO 4 12H 2 O 9.6 mm, NaH 2 PO 4 2H 2 O 1.6 mm) 로 3회세척하여실험에사용하였으며, 모든실험은채혈후 12 h 이내에행하였다. 실험에사용된적혈구현탁액은 700 nm에서광학밀도 (optical density, O. D.) 값이 0.6이었으며이때적혈구수는약 1.5 10 7 cells/ml이었다. 2.4.2. 금전초추출물및분획의광용혈억제효과 1.5 10 7 cells/ml 적혈구현탁액 3.5 ml를파이렉스시험관 (No. 9820) 에넣고, 금전초추출물및분획을농도별로각각 50 µl씩첨가하였다. 암소에서 30 min 동안 pre-incubation시킨후, 광증감제인 rose bengal (15 µm) 0.5 ml를첨가하고파라필름으로시험관의입구를봉한뒤 15 min 동안광조사하였다. 광용혈에필요한광조사는내부를검게칠한 50 cm 20 cm 25 cm 크기의상자안에 20 W 형광등을장치하고, 적혈구현탁액이담긴파이렉스시험관을형광등과 5 cm 거리에평행이되도록배열한후 15 min 동안수행하였다. 광조사가끝난후암반응 (post-incubation) 시간에따른적혈구의파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서투광도 (transmittance, %) 를측정하여구하였다. 이파장에서적혈구현탁액의투광도증가는적혈구의용혈정도에비례한다. 모든실험은 20 항온실에서수행하였다. 금전초추출물및분획이광용혈에미치는효과는암반응시간과용혈정도로구성된그래프로부터적혈구의 50% 가용혈되는시간 (τ 50 ) 을구하여비교평가하였다. 2.5. 금전초추출물및분획물의 HaCaT 세포독성평가 금전초 50% 에탄올추출물과분획물이세포생존율에미치는영향을 MTT 방법으로확인하여실험에사용될시료의농도범위를결정하였다. 실험방법은 HaCaT 각질형성세포를 96-well plate에접종한후 37 세포배양기에서 70-80% confluency 수준으로배양하였다. 금전초 50% 에탄올추출물과분획물을농도별로세포에 24 h 처리한후, 0.5 mg/ml 농도의 MTT 용액을첨가하여 1 h 동안반응시켜 formazan 결정을생성시켰다. MTT 용액을제거하고생성된 formazan 결정을 DMSO에용해하여 570 nm 파장에서 ELISA reader로흡광도를측정하였다. 비처리군 (untreated group) 에의한흡광도를음성대조군 (100%) 으로하여식 (3) 에따라처리군 (treated group) 에대한상대적인세포생존율을구하였다. (3) 2.6. UVB 로유도된 HaCaT 세포손상에대한세포보호효과측정 세포배양기에서 70-80% confluency 수준으로배양된 HaCaT 세포를 PBS 상태에서 250 mj/cm 2 UVB를조사하여세포손상을유도하였다. PBS로 2번세척한후, 농도별로금전초 50% 에탄올추출물과분획물을처리한다음 37 배양기에서배양하였다. 24 h 후 MTT assay 를통해세포생존율을확인하여 UVB로유도된세포손상에대한금전초 50% 에탄올추출물과분획물들의세포보호효과를확인하였다. 2.7. 과산화수소로유도된세포손상에대한세포보호효과측정 HaCaT 세포를 1 10 4 cells/well로 96-well plate에분주하고 24 h 동안 37, 5% CO 2 조건으로 incubator에서배양하였다. 24 h incubation 후, 배지를모두제거하고 PBS 100 µl로 1회세척하였다. PBS를모두제거후, 과산화수소 1 mm 농도 (in PBS) 로 30 min 처리하였다. 과산화수소를모두제거후, PBS 100 µl로 2회세척하였다. 세척후, 1% P/S (penicillin/streptomycin) 를함유한 DMEM 배지에금전초 50% 에탄올추출물과분획물을농도별로희석하여처리한후, 37, 5% CO 2 조건으로 incubator에서 24 h 배양하였다. 24 h 항온배양후, MTT assay로세포생존율을확인하여과산화수소로유도된세포손상에대한금전초 50% 에탄올추출물과분획물들의세포보호효과를확인하였다. 공업화학, 제 29 권제 2 호, 2018

179 Table 1. TLC Mobile Phase for Separation of Ethyl Acetate Fraction and Aglycone Fraction from L. christinae Hance Ethyl acetate fraction Aglycone fraction Eluent system ethyl acetate : chloroform : formic acid : water = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v) hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v) Table 2. HPLC Condition for Separation of Ethyl Acetate Fraction and Aglycone Fraction from L. christinae Hance Condition of HPLC analysis Column Shim-pack VP-ODS C18 column Detector UVD 170s DIONEX Mobile phase A : 2% acetic acid in water, B : 0.5% acetic acid in 50% acetonitrile Flow rate 1.0 ml/min Injection volume 20 µl Gradient elution 0-10.0 min, 0% (v/v) of B; 10.0-140.0 min, 0-50% (v/v) of B; 140.0-180.0 min, 50-70% (v/v) of B; 180.0-190.0 min, 70% (v/v) of B; and 190.0-195.0 min, 70-0% (v/v) of B Table 3. Yields of L. christinae Hance Extract and Fractions 50% EtOH extract EtOAc fraction Aglycone fraction Yields (% g/g) 13.6 0.3 0.1 2.8. TLC 및 HPLC를이용한금전초분획물의플라보노이드분석금전초추출물중에틸아세테이트분획과아글리콘분획을 100% 에탄올에녹인후, syringe filter (Milopore 0.45 µm) 를이용하여여과한후여과된추출물용액을이용하여극성 TLC 및비극성 HPLC 분석에이용하였다. TLC 분석시사용한전개용매는 Table 1에나타내었다. 성분확인은이미보고된분광학적자료와플라보노이드표준물질의 R f 값과자외선및발색법을이용한띠의색상등을통해확인하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 수용액과 0.5% acetic acid를함유한 50% acetonitrile 수용액을이용해기울기용리법으로분석하였고 HPLC 분리조건은 Table 2에나타내었다. 2.9. LC/ESI-MS 를이용한금전초분획물의성분분석 LC 분석은 autosampler와 PDA-UV detector가장착된 Thermo- Finnigan Surveyor instrument (Thermo Scientific, USA) 를사용하였다. 컬럼은 U-VDSpher Pur C18-E (2.0 50 mm, 1.8 µm) 을사용하였다. 이동상은 0.1% formic acid in D. W. (solvent A) : 0.1% formic acid in acetonitrile (solvent B) 로하였으며, 유속은 200 µl/min이며, injection volume은 5 µl로하였다. MS/MS 분석은 Thermo-Finnigan LCQ Deca XP plus ion trap mass spectrometer, with ESI interface를사용하였다. Negative ion model로 capillary voltage는 3500 V, nebulizer gas (N 2 ) 10 (arbitraryunits), collisiongas (N 2 ) 그리고 ion source temperature는 400 에서행하였다. 2.10. 통계처리본연구의모든실험결과는 3회반복하였고통계자료의값은 mean ± SD로표시하였다. 통계분석은 Graphpad Prism 5.0 (San Diego, CA) 프로그램을이용하였으며, one-way ANOVA 검정을적용하여 p < 0.05 유의수준에서유의성검정을실시하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 금전초추출물및분획물의수율건조된금전초를 50% 에탄올로추출하여여과및건조시켜얻은 50% 에탄올추출물의수율은금전초건조중량의 13.6% 이었다. 50% 에탄올추출물로부터얻어진에틸아세테이트분획의수율은추출에이용한금전초의건조중량대비 0.3% 이었으며, 에틸아세테이트분획으로부터산가수분해반응을통해얻어진아글리콘분획의수율은금전초의건조중량대비 0.1% 로얻어졌다 (Table 3). 3.2. 금전초추출물및분획의항산화활성 3.2.1. DPPH법을이용한자유라디칼소거활성자외선노출과같은외부스트레스에의해피부에서생성되는과잉의 ROS는세포막에서지질과산화반응을개시하고라디칼연쇄반응을통해세포및조직을손상시킴으로써노화를가속화시킨다. 대표적인항산화제인 (+)-α-tocopherol은생성된지질라디칼에전자를제공하여연쇄반응을종결시키고세포막를보호하게된다. 따라서시료의전자주게능력을측정하여항산화능을평가할수있다. 금전초추출물및분획물, 대조군인 (+)-α-tocopherol의자유라디칼소거활성 (FSC 50 ) 측정결과는 Figure 2에나타내었다. 실험결과, 50% 에탄올추출물의 FSC 50 은 146.8 µg/ml, 아글리콘분획 27.2 µg/ml, 에틸아세테이트분획 22.2 µg/ml 순으로자유라디칼소거활성이증가하였다. 그중에틸아세테이트분획과아글리콘분획의자유라디칼소거활성은대표적인지용성항산화제인 (+)-α-tocopherol (FSC 50 = 9.0 µg/ml) 보다는약간작았지만상당한수준의라디칼소거활성이있음을나타내었다. 3.2.2. 루미놀화학발광법을이용한 Fe 3+ -EDTA/H 2 O 2 계에있어서활성산소소거활성 ( 총항산화능 ) Fe 3+ -EDTA/H 2 O 2 계에서는 H 2 O 2 와 Fe 2+ 에의해 OH을포함한다양한 ROS가생성된다. 루미놀은생성된 ROS에의해산화되어들뜬 Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 2, 2018

180 김아랑 정민철 정혜인 송동기 서영빈 전영희 박소현 신혁수 이상래 박수남 Table 4. Cellular Protective Effects of Extract and Fractions from L. christinae Hance on Rose-bengal Sensitized Photohemolysis of Human Erythrocytes τ 50 (half time of hemolysis)* Concentration (µg/ml) 0.5 1 5 10 25 50 50% EtOH extract - - 26.9 ± 0.9 34.4 ± 0.5 37.7 ± 0.1 37.5 ± 1.4 EtOAc fraction 50.2 ± 1.3 53.5 ± 0.8 57.5 ± 0.8 43.3 ± 2.6 39.4 ± 1.7 - Aglycone fraction 62.3 ± 1.1 69.3 ± 0.8 103.9 ± 1.5 76.2 ± 2.5 - - *Control, τ 50 = 34.1 ± 1.9 min Figure 2. Free radical scavenging activities of extract and fractions from L. christinae Hance and reference. Data are presented as mean ± SD. Figure 4. Cellular protective effects of extract and fractions from L. christinae Hance and (+)-α-tocopherol at 5 µg/ml on rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes. *p < 0.05 compared with (+)-α-tocopherol in 50% ethanol extract and fractions dosetreated group. Figure 3. Reactive oxygen species scavenging activities of extract and fractions from L. christinae Hance and reference in Fe 3+ -EDTA/H 2 O 2 system by luminol-dependent chemiluminescence assay. Data are presented as mean ± SD. 상태의아미노프탈산으로전환되며, 다시바닥상태로떨어지면서발광 (420-450 nm) 을한다. 이때, 항산화제에의해 ROS가소거되면루미놀이아미노프탈산으로전환되는양이감소하여화학발광이감소하게된다. 따라서루미놀화학발광법을이용하여금전초추출물및분획물의활성산소소거활성 ( 총항산화능 ) 을비교하였다 (Figure 3). 총항산화능은 OSC 50 으로나타내었고, 비교물질로는수용성항산화제인 L-ascorbic acid를사용하였다. 실험결과, 금전초 50% 에탄올추출물의 OSC 50 은 29.3 µg/ml, 에틸아세테이트분획 2.9 µg/ml, 아글리콘분획은 4.5 µg/ml로나타났다. 에틸아세테이트분획의총항산화능은추출물및분획물중가장크게나타났으며, 이는수용성항산화제인 L-ascorbic acid (4.9 µg/ml) 보다도더큰항산화능을나타내었다. 3.2.3. 1 O 2 으로유도된적혈구의파괴에대한세포보호효과피부에자외선이조사되면피부에존재하는광증감제 (porphyrin 또는 riboflavin) 에의해다양한 ROS가생성된다. 그중 singlet oxygen ( 1 O 2 ) 은반응성이매우큰활성산소종으로광증감반응의주생성물이다. 1 O 2 를포함한 ROS는피부항산화방어막을붕괴시키고세포막구성성분인인지질을산화시켜지질과산화반응을개시한다. 이러한자동산화반응에의해세포막이손상되고세포는파괴된다. 따라서적혈구세포를이용한광용혈실험을통해 1 O 2 에의한세포손상을방어하는항산화제의세포보호효과를측정할수있다. 본실험에서는 rose-bengal로유도된 1 O 2 에의한세포손상에대하여금전초추출물의세포보호효과를측정하였다. 적혈구파괴에대한금전초추출물의세포보호효과를추출물또는분획의농도별로비교하여표로나타내었다 (Table 4). 세포보호효과는적혈구가 50% 용혈되는데걸리는시간인 τ 50 으로나타내었다. 금전초추출물및분획을 5, 10, 25, 50 µg/ml의농도로측정한결과금전초 50% 에탄올추출물은 5, 10, 25, 50 µg/ml의농도에서각각 τ 50 이 26.9, 34.4, 37.7, 37.5 min으로 50 µg/ml을제외하고는농도의존적인경향을보였고, 에틸아세테이트분획은 0.5, 1, 5 µg/ml 농도에서각각 τ 50 이 50.2, 53.5, 57.5 min이었고, 10 µg/ml 이상의농도에서는시료의독성에의해세포보호효과가감소하는경향을보였다. 아글리콘분획은 0.5, 1, 5 µg/ml에서각각 62.3, 69.3, 103.9 min으로농도의존적으로세포보호효과가증가하는경향을보이다가 10 µg/ml 이상의농도에서는에틸아세테이트분획과마찬가지로세포보호효과가감소하는경향을보였다. 따라서세포독성이나타나지않고최대세포보호효과를갖는 5 µg/ml 농도에서의세포보 공업화학, 제 29 권제 2 호, 2018

181 Figure 5. Effects of fractions from L. christinae Hance on HaCaT cells viability. HaCaT cells were treated with different concentration of samples, and cytotoxicity was then determined by the MTT assay. Data are presented as mean ± SD. * p < 0.05 compared with untreated control in 50% ethanol extract dose-treated group. # p < 0.05 compared with untreated control in ethyl acetate fraction dose-treated group. p < 0.05 compared with untreated control in aglycone fraction dosetreated group (N. C. : negative control). Figure 7. Cell protective effects of 50% ethanol extract/fractions from L. christinae Hance on H 2 O 2 -induced HaCaT cell. HaCaT cells were treated with different concentration of sample for 24 h before being exposed to oxidative stress. * p < 0.05 compared with untreated control in 50% ethanol extract and fractions dose-treated groups. 실험에사용될농도범위를확인하였다. 금전초추출물및분획물을 HaCaT 세포에 24 h 동안처리하고세포생존율을확인한결과, 50% EtOH 추출물은 100 µg/ml, 에틸아세테이트분획은 25.0 µg/ml, 아글리콘분획은 12.5 µg/ml까지세포독성이나타나지않았다 (Figure 5). 따라서세포보호효과를측정하기위한최고농도를 12.5 µg/ml로설정하였다. Figure 6. Cell protective effects of 50% ethanol extract/fractions from L. christinae Hance on UVB-induced HaCaT cell. HaCaT cells were treated with different concentration of 50% ethanol extract and its fractions from L. christinae Hance for 24 h after being exposed to oxidative stress. Data are presented as mean ± SD. * p < 0.05 compared with untreated control in 50% ethanol extract dose-treated group. # p < 0.05 compared with untreated control in ethyl acetate fraction dose-treated group (NC : negative control, PC : positive control). 호효과를지용성항산화제인 (+)-α-tocopherol과비교한결과, 50% 에탄올추출물 (26.9 min), (+)-α-tocopherol (37.7 min), 에틸아세테이트분획 (57.5 min), 아글리콘분획 (103.9 min) 순으로세포보호효과가증가하였으며에틸아세테이트분획과아글리콘분획은대조군인 (+)-α-tocopherol보다큰세포보호효과를나타내었다 (Figure 4). DPPH와총항산화능결과에서는에틸아세테이트분획의항산화활성이가장컸고적혈구를대상으로하는광용혈실험에서는세포독성이없는저농도일때아글리콘분획에서세포보호효과가가장크게나타났다. 하지만높은농도의에틸아세테이트분획과아글리콘분획에서는세포효과를나타내지않았고오히려세포막이파괴되는현상을나타냈다. 3.3. 금전초분획물의세포보호효과 3.3.1. 금전초추출물및분획물의세포독성평가 MTT 방법으로금전초추출물및분획물의세포독성을확인하여 3.3.2. UVB로유도된세포손상에대한세포보호효과본연구에서는금전초의 50% 에탄올추출물, 에틸아세테이트및아글리콘분획을이용하여 UVB로유도된 HaCaT 세포의산화적손상에대한세포보호효과가있는지를확인하였다. 실험결과, UVB를조사한실험군은조사하지않은군에비하여 67.1% 의세포생존율을나타내었다. UVB를조사한후, 0.4-12.5 µg/ml 농도의 50% 에탄올추출물을처리했을때, 세포생존율은모든농도에서증가되지않았다. 하지만에틸아세테이트분획을 HaCaT 세포에 24 h 처리하였을때, 세포생존율은최대 90.1% 까지현저하게증가하였다 ( 각각 76.4, 80.0, 86.1, 90.1, 89.4, 88.5%). 0.4-12.5 µg/ml 농도의아글리콘분획을 HaCaT 세포에 24 h 처리하였을때, 세포생존율은최대 73.8% 까지증가하였다 ( 각각 70.2, 71.9, 72.3, 73.6, 73.8, 67.4%). 즉금전초추출물의에틸아세테이트분획및아글리콘분획은 UVB 조사로유도된세포손상에대해보호효과를나타냈다 (Figure 6). 3.3.3. 과산화수소로유도된세포손상에대한세포보호효과금전초 50% 에탄올추출물및분획의과산화수소로유도된 HaCaT 세포의세포보호효과를 Figure 7에나타내었다. 실험결과, 과산화수소를처리한실험군은처리하지않은군에비하여약 65% 의세포생존율을나타내었다. 50% 에탄올추출물은세포보호효과가나타나지않았으나, 에틸아세테이트분획과아글리콘분획을처리했을때세포생존율이증가하는것을확인하였다. 에틸아세테이트분획 5-25 µg/ml 농도에서세포생존율은각각 74.0, 76.3 및 76.6% 로증가하였고, 아글리콘분획은 2.5-12.5 µg/ml 농도에서각각 67.1, 71.1 및 73.0% 로증가하였다. 따라서금전초에틸아세테이트분획및아글리콘분획은과산화수소로유도된세포손상에대한보호효과를나타내었다. Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 2, 2018

182 김아랑 정민철 정혜인 송동기 서영빈 전영희 박소현 신혁수 이상래 박수남 Table 5. TLC, HPLC, and LC-MS Data of Ethyl Acetate Fraction from L. christinae Hance Extract TLC band HPLC peak No. LCE-1 2 LCE-2 3 LCE-3 4 LCE-4 4 Identified compound kaempferol 3-O -neohesperidoside (C 27H 30O 15) kaempferol 3-O-β-rutinoside (nicotiflorin, C 27H 30O 15) kaempferol 3-O-glucoside (astragalin, C 21H 20O 11) quercetin 3-rhamnoside (quercitrin, C 21H 20O 11) Retention time (min) λ max (nm) Measurement Positive ions (m/z) [M-H] + Negative ions (m/z) [M-H] - MW (g/mol) 98.178 265, 345 595.2 593.8 594.52 [25] 106.323 265, 345 595.2 593.9 594.52 [26] 109.033 264, 344 449.2 447.7 448.37 [27] 109.033 253, 344 449.0 447.5 448.38 [25,27] LCE-5 5 kaempferol 3-rhamnoside (afzelin, C 21H 20O 10) 122.906 264, 341 433.1 431.6 432.38 [28] LCE-6 1 p-coumaric acid (C 9H 8O 3) 66.437 310 163.0 164.16 [29,30] LCE-7 6 quercetin (C 15H 10O 7) 136.137 256, 372 303.2 301.2 302.24 [30] LCE-8 7 kaempferol (C 15H 10O 6) 158.075 266, 366 287.3 285.4 286.23 [30] Ref. Figure 9. HPLC chromatogram of ethyl acetate fraction of L. christinae Hance (3,000 µg/ml) at λ = 254-400 nm, 1 : LCE-6, 2 : LCE-1, 3 : LCE-2, 4 : LCE-3,4, 5 : LCE-5, 6: LCE-7, 7 : LCE-8. (a) Figure 8. TLC chromatograms of ethyl acetate fraction (a) and aglycone fraction (b) from L. christinae Hance extract. (a) Eluent system : ethyl acetate : formic acid : chloroform : D. W. = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v), (b) Eluent system : hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v). 3.4. 금전초분획물의 TLC 및 HPLC 성분분석 3.4.1. 금전초분획물의 TLC 성분분석 금전초에틸아세테이트분획의성분을확인하기위해, TLC 크로마토그램에서 ethyl acetate : formic acid : chloroform : D. W. = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v) 의용매조건을이용하여분리한후, 자외선과 2-aminoethyl diphenylbroinate-polyethylene glycol (NP-PEG) 발색으로확인하였다 (Figure 8a). 또한에틸아세테이트분획물의 TLC 분석띠 8개를추출 (b) 하여 LC/ESI-MS로분석하였다 (Table 5). TLC, UV-vis spectrum, LC/ESI-MS를이용해분석한결과 TLC R f 0.17인 LCE-1은 [M-H] - 이 m/z 593.8에서나타났고, kaempferol 3-O-neohesperidoside임을확인하였다. R f 0.21인 LCE-2는 [M-H] - 이 m/z 593.9으로나타나 kaempferol 3-O-β-rutinoside (nicotiflorin) 로, R f 0.50인 LCE-3는 [M-H] - 이 m/z 447.7, UV λ max 가 264, 348 nm로나타나 astragalin으로, R f 0.61인 LCE-4는 [M-H] - 이 m/z 447.5, UV λ max 는 256, 348 nm로 quercitrin으로확인되었다. R f 0.72인 LCE-5는 [M-H] - 이 m/z 431.6로 kaempferol 3-rhamnoside (afzelin), R f 0.88인 LCE-6은 [M-H] - 이 m/z 163.0인 coumaric acid로확인되었으며, R f 0.93인 LCE-7은 [M-H] - 이 m/z 301.2인 quercetin, R f 0.96인 LCE-8은 [M-H] - 이 m/z 285.4인 kaempferol로확인되었다 (Table 5). 아글리콘분획의성분을확인하기위해서는 TLC 크로마토그램에서 hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v) 의용매조건을이용하였고, TLC, HPLC를이용해분석한결과 quercetin 및 kaempferol을확인하였다 (Figure 8B). 3.4.2. 금전초분획물의 HPLC 성분분석금전초에틸아세테이트분획의 HPLC 크로그마토그램은 Figure 9 와같고확인된성분들은주로 quercetin과 kaempferol에당이결합된 공업화학, 제 29 권제 2 호, 2018

183 LCE-7은 quercetin, 0.96인 LCE-8은 kaempferol로확인되었다. 이결과로금전초추출물및분획물은대부분 quercetin 및 kaempferol과그배당체성분으로이루어져있는것이확인되었고, 이러한플라보노이드성분들이현저한항산화활성및세포보호효과를나타낸것으로판단된다. 결론적으로금전초에틸아세테이트분획및아글리콘분획은우수한항산화효능및세포보호효과가있어화장품의항산화소재로서응용가능성이있음을시사하였다. Figure 10. HPLC chromatogram of aglycone fraction of L. christinae Hance (3,000 µg/ml) at λ = 254-400 nm. 배당체나 acid 종류였다. 각 peak에해당되는성분은 Table 5에나타내었다. 이처럼금전초에틸아세테이트분획에뛰어난항산화활성으로알려져있는 quercetin과 kaempferol 배당체성분들이존재하기때문에 free radical 소거활성, 총항산화능및세포보호효과실험에서현저한항산화활성및세포보호효과가나타난것으로사료된다. 당을제거한금전초아글리콘분획의 HPLC 크로마토그램은 Figure 10에나타내었다. 아글리콘분획은 λ = 254-400 nm에서 2개의피크를나타내었고, 이는에틸아세테이트분획에존재하던 quercetin과 kaempferol 배당체들의당이제거되어생긴 quercetin과 kaempferol로확인되었다. 4. 결론 1. 금전초추출물및분획의자유라디칼소거능력 (FSC 50 ) 은 50% 에탄올추출물에서 146.8 µg/ml, 에틸아세테이트분획에서 22.2 µg/ml, 아글리콘분획에서 27.2 µg/ml였다. 금전초에틸아세테이트분획및아글리콘분획은비교물질로사용한 (+)-α-tocopherol (9.0 µg/ml) 보다는조금떨어지지만상당한라디칼소거활성이있음을확인하였다. 2. 금전초추출물및분획의활성산소소거활성 (OSC 50 ) 은 50% 에탄올추출물, 에틸아세테이트분획, 아글리콘분획이각각 29.2 µg/ml, 2.9, 4.5 µg/ml으로나타났다. 에틸아세테이트분획의총항산화능은추출물및분획물중가장높게나타났으며, 대조군인 L-ascorbic acid (4.9 µg/ml) 와비교하였을때, 높은항산화능을나타내었다. 3. 1 O 2 으로유도된적혈구의광용혈실험에서금전초 50% 에탄올추출물은 25 µg/ml까지, 에틸아세테이트분획, 아글리콘분획은각각 5 µg/ml까지농도의존적인세포보호효과를나타내었으나, 그이상의농도에서는세포보호효과가감소하였다. 특히아글리콘분획은 5 µg/ml일때, 비교물질인 (+)-α-tocopherol에비해매우큰세포보호활성을나타내었다. 4. UVB로유도된 HaCaT세포의산화적손상에대한세포보호효과를확인한실험에서금전초에틸아세테이트분획및아글리콘분획은 UVB 조사로유도된세포손상에대해보호효과를나타내었고, 과산화수소로유도된 HaCaT 세포의세포보호효과를확인한실험에서도마찬가지로금전초에틸아세테이트분획및아글리콘분획이과산화수소로유도된세포손상에대해보호효과를나타내었다. 5. 금전초에틸아세테이트분획의 TLC, HPLC, UV-vis spectrum, LC/ESI-MS를이용한분석결과 R f 값이 0.17인 LCE-1은 kaempferol 3-O-neohesperidoside, 0.21인 LCE-2는 nicotiflorin, 0.50인 LCE-3는 astragalin, 0.61인 LCE-4는 quercitrin, 0.72인 LCE-5는 kaempferol 3-rhamnoside (afzelin), 0.88인 LCE-6은 coumaric acid, 그리고 0.93인 References 1. A. Kammeyer and R. M. Luiten, Oxidation events and skin aging, Ageing Res. Rev., 21, 16-29 (2015). 2. M. Wlaschek, I. Tantcheva-Poor, L. Naderi, W. J. Ma, A. Schneider, Z. Razi-Wolf, J. Schuller, and K. Scharffetter- Kochanek, Solar UV irradiation and dermal photoaging, J. Photochem. Photobiol. B., 63, 41-51 (2001). 3. R. Aquino, S. Morelli, A. Tomaino, M. Pellegrino, A. Saija, L. Grumetto, C. Puglia, D. Ventura, and F. Bonina, Antioxidant and photoprotective activity of a crude extract of Culcitium reflexum H.B.K. leaves and their major flavonoids, J. Ethnopharmacol., 79, 183-191 (2002). 4. S. E. Fridovich and N. A. Porter, Oxidation of arachidonic acid in micelles by superoxide and hydrogen peroxide, J. Biol. Chem., 256, 260-265 (1981). 5. S. Passi, M. Picardo, C. D. Luca, A. S. Breathnach, and M. Nazzaro-Porro, Scavenging activity of azelaic acid on hydroxyl radicals in vitro, Free Radic. Res. Commun., 11, 329-338 (1991). 6. F. R. Gruijl, H. J. van Kranen, and L. H. Mullenders, UV-induced DNA damage, repair mutations and oncogenic pathways in skin cancer, J. Photochem. Photobiol., 63, 19-27 (2001). 7. J. E. Cleaver and E. Crowley, UV damage, DNA repair and skin carcinogenesis, Front. Biosci., 7, 1024-1043 (2002). 8. M. Wlaschek, I. Tantcheva-Poor, L. Naderi, W. Ma, L. A. Schneider, Z. Razi-Wolf, J. Schuller, and K. Scharffertter- Kochanek, Solar UV irradiation and dermal photoaging, J. Photochem. Photobiol. B, 63, 41-51 (2001) 9. A. Kammeyer and R. M. Luiten, Oxidation events and skin aging, Ageing Res. Rev., 21, 16-29 (2015). 10. M. Jose, Mates, C. Perez-gomez, and I. N. De Castro, Antioxidant enzymes and human diseases, Clin. Biochem., 32(8), 595-603 (1999). 11. A. Bendich, L. J. Machlin, and O. Scandurra, The antioxidant role of vitamin C, Adv. Free Radic. Biol. Med., 2, 419-444 (1986). 12. S. N. Park, S. Y. Kim, G. N. Lim, N. R. Jo, and M. H. Lee, In vitro skin permeation and cellular protective effects of flavonoids isolated from Suaeda asparagoides extracts, J. Ind. Eng. Chem., 18, 680-683 (2012). 13. J. S. Seong, K. M. Kim, J. Y. suh, J. H. Ha, and S. N. Park, Antioxidative activities of whole plant extracts of Solanum nigrum L, J. Korean Oil Chem. Soc., 32, 781-788 (2015). 14. Y. N. Kim, B. Jennifer, Keogh, and P. M. Clifton, Polyphenols and glycemic control, Nutrients, 8(1), 17-43 (2016). 15. F. Gao, D. Zhao, and J. Deng, New flavonoids from Lysimachia christinae Hance, Helv. Chim. Acta, 96, 985-989 (2013). 16. China Pharmacopoeia Committee, Pharmacopoeia of the People s Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 2, 2018

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