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서규 표
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1 - Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 2, April 2012, 땅콩나물뿌리추출물의세포보호효과 조나래 박찬일 * 박채원 * 신동한 * 황윤찬 * 김용현 * 박수남 서울과학기술대학교정밀화학과, 화장품종합기술연구소, * 서울과학고등학교 (2011 년 11 월 28 일접수, 2011 년 12 월 26 일수정, 2012 년 1 월 9 일채택 ) Cellular Protective Effects of Peanut Sprout Root Extracts Na Rae Jo, Chan Il Park*, Chae won Park*, Dong Han Shin*, Yoon Chan Hwang*, Yong Hyun Kim*, and Soo Nam Park Department of Fine Chemistry, Cosmetic R&D Center, Seoul National University of Science and Technology, Seoul , Korea *Seoul Science High School, Seoul , Korea (Received November 28, 2011; Revised December 26, 2011; Accepted January 9, 2012) 본연구에서는땅콩나물뿌리추출물의세포보호작용및항산화능에관한연구를수행하였다. Rose-bengal 로증감된사람적혈구의광용혈에대한땅콩나물뿌리추출물의세포보호효과를측정하였다. 에틸아세테이트분획 (5 50 µg/ ml) 은농도 - 의존적으로세포보호효과를나타냈으며, 특히아글리콘 (aglycone) 분획은 5 50 µg/ml 의농도범위에서현저한세포보호활성을나타내었다. 그리고땅콩나물뿌리의모든분획은지질과산화연쇄반응의차단제인 (+)-αtocopherol 보다도효과적이었다. Luminol 화학발광법을이용한 Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계에서생성된활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 에대한땅콩나물뿌리추출물의활성산소소거활성을측정하였다. 추출물중에틸아세테이트분획 (OSC 50; 1.59 µg/ml) 은강력한항산화제로알려진 L-ascorbic acid (1.50 µg/ml) 와비교할때유사한활성산소소거활성을보여주었다. 반면에, free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성 (FSC 50) 의크기는 (+)-α-tocopherol > 80% MeOH 추출물 > 아글리콘분획 > 에틸아세테이트분획순으로나타났다. 이상의결과들은땅콩나물뿌리추출물이 1 O 2 및다른활성산소종을소거하고활성산소종에대항하여세포막을보호함으로써생체계, 특히태양자외선에노출된피부에서항산화제로써작용할수있음을시사한다. In this study, the cellular protective effect and antioxidative property of peanut sprout root extracts were investigated. Cellular protective effects of peanut sprout root extracts on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The ethyl acetate fraction of extracts exhibited a cellular protective effect in a concentration dependent manner. Particularly, the aglycone fraction of extracts showed prominent cellular protective effects in a concentration range (5 50 µg/ml). They are more effective than that of (+)-α-tocopherol, known as a lipid peroxidation chain blocker. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities (OSC 50) of peanut sprout root extracts on ROS generated in Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 system were investigated using the luminol-dependent chemiluminescence assay. The ethyl acetate fraction of extracts (OSC 50; 1.59 µg/ml) showed a similar ROS scavenging activity compare with that of L-ascorbic acid (1.50 µg/ml), known as a strong antioxidant. On the other hand, the order of free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydraxyl, DPPH) scavenging activity (FSC 50) was (+)-α-tocopherol > 80% MeOH extract > aglycone fraction > ethyl acetate fraction. These results indicate that peanut sprout root extracts can function as an antioxidant in biological systems, particularly skin exposed to solar UV radiation by scavenging 1 O 2 and other ROS, and to protect cellular membranes against ROS. Keywords: peanut sprout root extracts, cellular protective effect, photohemolysis, antioxidative activity 1) 1. 서론 인간이나이가들어감에따라겪게되는노화란신체내의평형이깨져내적, 외적환경에대한적응을어렵게만드는신체구조와기능의점진적인저하를말한다 [1]. 이러한노화의원인으로여러가지학설이제시되고있지만크게두가지로나눌수있다. 첫번째는 교신저자 ( snpark@seoultech.ac.kr) 시간의흐름에따른자연적노화 (intrinsic aging) 로피부의구조적변화와생리적기능이감소하여나타나는노화이고, 두번째원인은자외선, 외부자극등산화적스트레스에의한광노화 (photoaging) 이다 [2]. 피부광노화의주원인은태양자외선으로자외선은파장에따라 UVC ( nm), UVB ( nm), UVA ( nm) 의 3가지로나누어진다. UVC는자외선영역중에서생물학적인손상을가장많이유발하지만, 대부분이지구대기의오존층에서흡수된다. 따라서사람의병인으로써는작은역할을차지하며 183

2 184 조나래 박찬일 박채원 신동한 황윤찬 김용현 박수남 UVB와 UVA는피부암을포함하는다양한피부병을유발한다 [3,4]. 더구나피부는인체의최외각에존재하기때문에이러한자외선에노출이쉽고, 따라서활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 에의한피부의광산화적손상위험이항상존재한다. 활성산소종이란반응성이매우큰 1 O 2 및 OH를비롯하여 O 2, H 2O 2, ROO, RO, ROOH 및 HOCl 등을포함하는것으로, 이들은고에너지복사선, 광증감반응및몇가지효소반응을포함하는다양한과정을거쳐서세포및조직중에서생성될수있다. 피부는복잡한항산화방어망이발달되어있기때문에 ROS에대항하여보호작용을나타내지만활성산소가다량으로발생되거나만성적으로활성산소발생이지속될경우항산화방어계의균형이깨지게되면서 ROS 유래의각종질환을야기시키게된다. 활성산소종중에서, 특히 1 O 2 은수명이짧고해로운분자로, 주로광증감반응으로생성된다. 이활성산소종은사람의백혈구인호중구및호산구에서생성됨이확인되었고, 다양한염증질환상태에서정상조직을손상시킬수있다고알려져있다 [5,6]. 또한사람피부섬유아세포에서 1 O 2 이 collagenase의발현을유발시키며 UVA로유도된 MMP-1 (matrix metalloproteinase-1) 의합성을 1 O 2 이매개할수있는것으로알려져있다 [7-9]. 콜라겐은피부진피층의매트릭스를이루는가장많은성분이기때문에콜라겐의생합성과분해의조절은주름생성이수반되는피부노화과정중에서핵심이되고있다 [10-12]. 따라서 1 O 2 과같은 ROS는피부세포및조직의손상과항산화효소와비효소적항산화제들로구성된산화제와항산화제균형을파괴를유발하며, 지질과산화반응의개시, 단백질의산화, 콜라겐과엘라스틴의사슬절단및멜라닌생성반응의촉진, DNA의산화와같은생체구성성분들의손상을야기하기때문에피부노화를가속화시킨다 [13-19]. 따라서광노화를지연시키고억제하기위해서는피부에서의활성산소종을억제하고또한활성산소를효율적으로제거할수있는적절한항산화물질을사용할필요가있다. 그러나합성항산화제의경우열안전성및발암성등의안전성문제가제기되고있어최근에는효능이우수하고안전성면에서입증된천연항산화제를개발하기위한연구들이활발히이루어지고있다 [20-22]. 특히, 식물의경우광합성과정에서활성산소가많이생성되기때문에활성산소로부터보호할수있는효소와이차대사산물의방어체계가발달되어있어식물의항산화물질에관한관심이증대되고있다 [23-27]. 식물종자에서싹을발아시키는새싹채소는싹이발아될때곰팡이나박테리아와같은외부의유해요인으로부터보호하기위해생리활성물질을생산한다고알려져있다 [28]. 특히땅콩은콩과에속하는일년생의초본식물로우리나라, 인도, 중국, 미국등세계 50여국가에서재배되고있으며풍부한영양성분및생리활성물질들과천연폴리페놀화합물인레즈베라트롤이함유되어있는대표적인식물로알려져있다. 이러한땅콩을새싹채소로발아시킬경우레즈베라트롤함량이발아전보다증가하는것으로보고되고있다 [29,30]. 이전연구들에서땅콩나물의레즈베라트롤함량및영양성분분석이이루어져있고 [30], 땅콩나물추출물의항산화효과에대한연구등이이루어져있다 [31]. 그러나땅콩나물뿌리추출물에대한광노화과정에깊이관여하는활성산소의소거활성및세포보호효과에대한구체적인연구는미미한실정이다. 따라서본연구에서는땅콩나물의뿌리부위를구입하여땅콩나물뿌리의추출물과분획을제조하고이들추출물 ( 혹은분획 ) 의활성산소및 free radical 소거활성, 특히사람적혈구세포에있어서 1 O 2 으로유도된세포손상 ( 광용혈실험 ) 에대한실질적인세포보호효과를측정하여 ROS에의 한피부노화를방지를위한항산화화장품소재로서의가능성을검토하였다. 2. 실험 2.1. 기기및시약 UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia) 의 Cary 50, 적혈구광용혈에사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold (Germany) 의 6-channel LB9505 LT를, ph meter는 Istek (Korea) 제품을사용하였다. EDTA, luminol, 증감제로사용된 rose-bengal, free radical 소거활성에사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma Chemical Co. (USA) 에서구입하여사용하였다. 기타 FeCl 3 6H 2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H 2O 2 는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea) 제품을사용하였다. 완충용액제조에사용된 Na 2HPO 4 12H 2O, NaH 2PO 4 2H 2O, NaCl, trizma base, HCl 그리고에탄올, 메탄올 (MeOH), 에틸아세테이트등각종용매는시판특급시약을사용하였다. 비교물질로사용한 (+)-α-tocopherol, L-ascorbic acid는 Sigma (USA) 에서구입하였다 2.2. 땅콩나물뿌리의분획및추출건조된땅콩나물뿌리 100 g을잘게자른후 80% 메탄올 2 L를이용하여일주일동안침적시킨후여과하고이여액을감압건조하여파우더를얻어서이를실험에사용하였다. 또한 80% 메탄올추출물은감압농축한후물과헥산을이용하여엽록소, 지질등의비극성성분을제거하였으며, 이후에틸아세테이트로 3회반복처리한분획을감압농축하여파우더를얻었다. 에틸아세테이트분획으로부터아글리콘제조 : 에틸아세테이트분획의파우더일정량에 5% H 2SO 4 및아세톤용액을넣고, 4 h 동안중탕가열하면서환류냉각시킨다. 환류시킨용액을 5% KOH- MeOH 용액으로중화적정후다시에틸아세테이트층을분획하고이를감압농축하여얻은당이제거된아글리콘파우더 ( 탈글리코실화된분획 ) 를실험에사용하였다 땅콩나물뿌리추출물의항산화효과측정 DPPH법을이용한 free radical 소거활성 Free radical은홀전자를갖는원자단으로이는짝을짓지않은활성전자를가지고있기때문에불안정하고, 매우큰반응성을갖는다. Free radical의이러한큰반응성으로피부뿐만아니라, 신체구성성분들에손상을주며결과적으로노화를가속화시킨다. DPPH 실험법은이러한 free radical의소거능을확인하는대표적인실험으로, 비교적간편한방법으로짧은시간에결과를알수있어, 천연물의항산화능을측정하기에적합하다. 땅콩나물뿌리추출물에대한 free radical 소거활성을 DPPH법을통하여확인하였다. 실험방법은메탄올에용해시킨 0.2 mm DPPH 용액 1 ml에에탄올 1 ml를첨가하고여러농도의추출물 1 ml을첨가하여섞은다음실온에서 10 min 동안방치후 spectrophotometer로 517 nm에서흡광도를측정하였다. 그활성의크기는시료를넣지않은경우를대조군 (control) 으로하고시료를넣은것을실험군 (experiment) 으로하여다음식에의해 DPPH의소거활성저해율을나타내었다. Free radical 소거활성은 DPPH의농도가 50% 감소되는데필요한시료의농도 (free radical scavenging activity, FSC 50, µg/ml) 로서표기하였다. 공업화학, 제 23 권제 2 호, 2012

3 땅콩나물뿌리추출물의세포보호효과 185 Inhibition (%) = {1 - [ (AExperiment - ABlank) ] } 100 A Control Luminol 발광법을이용한 Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계에있어서활성 산소소거활성 ( 총항산화능 ) Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계의 Fenton 반응과그후의연쇄반응에의해각 종활성산소종 (O 2, OH, 그리고 H 2O 2) 가생성되며, 철은이반응 을촉매한다. 따라서이계를이용하면각종활성산소종에대한총 항산화능을측정할수있다. 총항산화능은 luminol 이활성산소종에 의해산화되어나타나는빛을화학발광기로검출하여측정하였다. 화학발광측정용튜브에증류수 1.78 ml 를넣고다양한농도의 땅콩나물뿌리추출물을넣었다. 여기에 2.5 mm EDTA 40 µl 및 5 mm FeCl 3 6H 2O 10 µl 를가한후 35 mm luminol 80 µl 를넣고 흔들어섞어주었다. 이어서화학발광기의 cell holder 에튜브를넣고 5 min 동안항온시킨후 150 mm H 2O 2 40 µl 를넣고화학발광을 25 min 동안측정하였다. 대조군 (control) 은시료용액대신에증류수 를넣고, 공시험 (blank) 은시료군과조건이동일하나 H 2O 2 와 FeCl 3 6H 2O 를첨가하지않은것으로하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT 의각채널은실험전에보정하여채널간의차이가거의없도록 하였다. 화학발광으로측정한저해율을다음식과같이나타내었고, 활성산소소거활성의크기는화학발광의세기가 50% 감소되는데 필요한시료의농도 (reactive oxygen species scavenging activity, OSC 50, µg/ml) 로서표기하였다. Inhibition (%) = (Control 의 cpm - Sample 의 cpm) 100 (Control 의 cpm - Blank 의 cpm) 2.4. 광용혈법을이용한세포보호효과측정 사람적혈구를대상으로한활성산소에의한세포손상및파괴실 험은활성산소에의한세포손상모델로적합한점이많다. 활성산소 에의한지질과산화반응, 단백질산화, 그리고항산화제의파괴및 세포의파괴등을이실험법을이용하여알아볼수있다. 무엇보다 자외선에의한피부노화를방어할수있는피부보호물질을검색하 는데있어서사람적혈구세포를이용한다는점이실질적이다. 따라 서이실험법을이용하여활성산소에대한천연물추출물의세포보 호효과를측정할수있다 적혈구현탁액제조 적혈구는건강한성인남녀로부터얻었다. 채혈즉시 heparin 이첨 가된시험관에넣은후, 3000 rpm 으로 5 min 동안원심분리하여적 혈구와혈장을분리하고, 분리한적혈구는 0.9% saline phosphate buffer (ph 7.4, Na 2HPO 4 12H 2O 9.6 mm, NaH 2PO 4 2H 2O 1.6 mm) 로세척하여원심분리하고흰색의백혈구층은제거하였다. 3 회반 복하여세척, 분리한적혈구는 4 의냉장고에보관하면서사용하 였고, 모든실험은채혈후 12 h 이내에행하였다. 광용혈실험은이 미확립된방법에따라수행하였다. 실험에사용된적혈구현탁액은 700 nm 에서 O.D. 가 0.6 이었으며이때적혈구수는 cells/ ml 이었다 땅콩나물뿌리추출물의광용혈억제효과 적혈구현탁액 3.5 ml 를파이렉스시험관 (No. 9820) 에넣은후, Table 1. Free Radical Scavenging Activities of Peanut Sprout Root Extracts and Reference Compounds Scavenging activity (FSC 50 µg/ml) 80% MeOH peanut sprout root extracts ± 3.9 Ethyl acetate fraction of peanut sprout root extracts ± 3.8 Aglycone fraction of peanut sprout root extracts ± 3.5 (+)-α-tocopherol 8.98 ± 2.93 시료용액을첨가하였다. 추출물을농도별로각각 50 µl씩첨가하고암소에서 30 min 동안 pre-incubation시킨후, 광증감제인 rose-bengal (12 µm) 0.5 ml를가하고파라필름 (Whatman laboratory sealing film, UK) 으로입구를막은후 15 min 동안광조사하였다. 광용혈에필요한광조사는내부를검게칠한 cm 크기의상자안에 20 W 형광등을장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에적혈구현탁액이담긴파이렉스시험관을형광등과평행이되도록배열한후 15 min 동안광조사하였다. 광조사가끝난후암반응 (post-incubation) 시간에따른적혈구의파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서투광도 (transmittance, %) 로부터구하였다. 이파장에서적혈구현탁액의투광도의증가는적혈구의용혈정도에비례한다. 모든실험은 20 항온실에서행하였다. 땅콩나물뿌리추출물의광용혈에미치는효과는 post-incubation 시간과용혈정도로구성된그래프로부터적혈구의 50% 가용혈되는시간인 τ 50 을구하여비교하였다. 대조군은 τ 50 이 31 min으로오차범위 ± 1 min 이내로모든경우의실험에서재현성이양호하게나타났다. Rose-bengal을첨가하고광조사를안했을경우와 rose-bengal을첨가하지않고광조사만했을경우는모두암반응 120 min까지는용혈이거의일어나지않았다. 모든실험은 3회반복하여평균하였다 통계처리모든실험은 3회반복하였고통계분석은 5% 유의수준에서 Student s t-test를행하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 땅콩나물뿌리추출물의항산화활성 DPPH법을이용한 Free Radical 소거활성생체막에서활성산소종또는지질라디칼에의해개시된지질과산화연쇄반응에서 (+)-α-tocopherol, flavonoids 등의항산화제는지질과산화라디칼에수소주개로작용하여연쇄반응을종결시킨다. 이처럼생체막에서수소주개로써작용하는항산화제의활성은 DPPH를이용한 free radical 소거활성을통해확인할수있다. 땅콩나물뿌리추출물의 free radical 소거활성 (FSC 50) 측정결과는 Table 1 및 Figure 1과같다. 땅콩나물뿌리 80% 메탄올추출물의경우 µg/ml, 에틸아세테이트분획의경우 µg/ml, 아글리콘분획은 µg/ml으로나타났으며, 비교물질로사용한 (+)-αtocopherol의 FSC 50 는 8.98 µg/ml로나타났다. 지용성항산화제인 (+)-α-tocopherol과비교하여볼때, 땅콩나물뿌리추출물의각분 Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 2, 2012

4 186 조나래 박찬일 박채원 신동한 황윤찬 김용현 박수남 Figure 1. Free radical scavenging activity of extracts and fraction from peanut sprout root and references. Figure 3. Reactive oxygen species scavenging activity of peanut sprout root extracts and reference in Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 system by luminoldependent chemiluminescence assay. Figure 2. Reactive oxygen species scavenging activity of peanut sprout root extracts (ethyl Acetate fraction) in Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 system by luminol-dependent chemiluminescence assay. [FeCl 3 6H 2O] = 25 µm, [EDTA] = 50 µm, [H 2O 2] = 3 mm, [luminol] = 1.4 mm, concentration of ethyl acetate fraction from peanut sprout root extracts; 1: control, 2: 1 µg/ml, 3: 2 µg/ml, 4: 5 µg/ml, 5: 7 µg/ml, 6: blank. 획은 (+)-α-tocopherol 보다낮은 free radical 활성을나타냈다. Figure 4. Cellular protective effects of peanut sprout root extracts against 1 O 2-induced photohemolysis of human erythrocytes (Control = 30 ± 1 min) Luminol 발광법을이용한 Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계에있어서활성산소소거활성 ( 총항산화능 ) Luminol은 Fe 3+ -EDTA/H 2O 2 계에서생성된활성산소종에의해산화되어들뜬상태의아미노프탈산이된후 nm에서발광하는것으로알려져있다. Fe 이온과 H 2O 2 의 Fenton 반응에의해활성산소종이생성되어 luminol과반응한다. 땅콩나물추출물의 80% 메탄올추출물의활성산소소거활성 ( 총항산화능, OSC 50) 은 3.88 µg/ ml, 에틸아세테이트분획의총항산화능은 1.59 µg/ml으로나타났 으며 (Figure 2) 아글리콘분획의총항산화능은 5.80 µg/ml로나타났다. 비교물질은대표적인수용성항산화제인 L-ascorbic acid를사용하였으며 L-ascorbic acid의총항산화능은 1.50 µg/ml로나타났다. 땅콩나물뿌리추출물의에틸아세테이트분획의경우, 비교물질로사용된 L-ascorbic acid와유사한활성산소소거활성을나타내었다. (Figure 3). 공업화학, 제 23 권제 2 호, 2012

땅콩나물뿌리추출물의세포보호효과 187 뿌리추출물들의세포보호효과는 10 µg/ml에서에틸아세테이트분획 (49.7 min) < 80% 메탄올추출물 (92.9 min) < 아글리콘분획 (112.1 min) 순으로증가하였다. 비교물질로사용한 (+)-α-tocopherol 은지용성이높은항산화제로지질과산화반응이일어나는세포막또는세포소기관의막에분포한다.

5 땅콩나물뿌리추출물의세포보호효과 187 뿌리추출물들의세포보호효과는 10 µg/ml에서에틸아세테이트분획 (49.7 min) < 80% 메탄올추출물 (92.9 min) < 아글리콘분획 (112.1 min) 순으로증가하였다. 비교물질로사용한 (+)-α-tocopherol 은지용성이높은항산화제로지질과산화반응이일어나는세포막또는세포소기관의막에분포한다. 막에분포한 (+)-α-tocopherol 은활성산소에의해발생되는지질과산화반응의연쇄반응을효율적으로차단하며, 특히광증감반응에의해생성된 1 O 2 을효율적으로제거할수있다. 이러한 (+)-α-tocopherol은 10 µg/ml에서혈구세포가 50% 파괴되는데걸리는시간 (τ 50) 이 min으로, 땅콩나물뿌리추출물들은모두 (+)-α-tocopherol보다우수한세포보호효과를나타냈다. 특히땅콩나물뿌리추출물중 80% 메탄올추출물과아글리콘분획의경우지용성항산화제인 (+)-α-tocopherol와비교하여볼때동일농도에서 2배이상우수한세포보호활성을나타내었다. 4. 논의 Figure 5. The relative cellular protective effects of extracts and fractions obtained from peanut sprout root extracts and standards on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes at 10 µg/ml O 2 으로유도된사람적혈구의파괴에대한세포보호효과땅콩나물뿌리의 80% 메탄올추출물, 에틸아세테이트분획과아글리콘분획의활성산소로유도된세포손상에대한보호효과를적혈구광용혈법으로측정하였으며에틸아세테이트분획의농도에따른세포보호효과는 Figures 4, 5 및 Table 2에나타내었다. 적혈구세포가 50% 파괴되는데걸리는시간 (τ 50) 은세포보호활성이클수록크게나타난다. 땅콩나물뿌리추출물의에틸아세테이트분획의경우혈구세포가 50% 파괴되는데걸리는시간 (τ 50) 이농도범위 5, 10, 25, 50 µg/ ml에서각각 36.9, 49.7, 95.9, min 으로농도의존적인세포보호효과를나타내었다. 한편 80% 메탄올추출물과아글리콘분획의경우혈구세포가 50% 파괴되는데걸리는시간 (τ 50) 이 5, 10, 25 µg/ml 농도범위에서각각 67.3, 112.1, min과 80.8, 95.9, min로농도의존적인세포보호효과를나타내었으나 50 µg/ml 로농도가증가함에따라 80% 메탄올추출물은 56.8 min, 아글리콘분획은 min으로감소하는경향을나타내었다. 이는아마도추출용매에따른추출물의세포막에대한교란작용 ( 계면활성제로서의작용등 ) 에기인된영향으로생각되며이메커니즘은더연구해볼필요가있다고사료된다. 땅콩나물 광노화는특히태양광선에노출된신체부위에서자외선에의해야기될수있다. 많은양의자외선에노출되면피부에서높은농도의활성산소종이생성되며이로인한광노화는진피결합조직의심각한손상과관련되어있다. 피부에서활성산소종의생성은주로광증감제에의해이루어진다. 광증감반응은 Type Ⅰ 또는 Type Ⅱ 형태로일어나며, Type I 반응의산물은라디칼혹은라디칼이온이고, 반면에 Type Ⅱ 반응은 O 2, OH, 그리고 1 O 2 을포함하는활성산소종을생성시킨다. O 2 는 superoxide dismutase (SOD) 가 H 2O 2 로전환시킨다. O 2 와 H 2O 2 는어느것도 DNA와직접반응할수없으나 OH같은보다위험한라디칼종의생성에참여한다. O 2 는 Fe (Ⅲ) 및 Cu(Ⅱ) 를환원시키거나, 철-황무리로된효소또는 ferritin으로부터 Fe(Ⅱ) 을방출시키고, 방출된 Fe(Ⅱ) 은 H 2O 2 를환원시켜 OH 을생성시킬수있다. 1 O 2 는수명이짧은특히해로운분자이며주로광증감반응으로피부에서생성되어광노화에있어서핵심적인역할을한다. 사람피부세포에있어서지질과산화물의생성, 단백질산화및 DNA 손상, 그리고 UV-A 의존성세포사멸등에 1 O 2 이포함된다. 또한 1 O 2 은 UVA로유도된 MMPs의합성을매개하기때문에광노화를방어하고자외선으로부터의피부를보호하기위하여 1 O 2 의역할은매우중요하다. 실제로 UVA와 UVB를조사하는동안자외선차단제를도포하면효율적으로결합조직손상을막아주고자연적으로일어나는피부의회복능력을촉진시킨다. 또한활성산소종소거활성이큰 α-tocopherol과 L-ascrobic acid를도포하거나특정한철킬레이트제를국소도포하면실질적으로주름생성이지연 Table 2. Effects of Peanut Sprout Root Extracts and Reference Compounds on the Rose-bengal Sensitized Photohemolysis of Human Erythrocytes τ 50 (Half time of hemolysis 1) ) Concentration (µg/ml) % MeOH peanut sprout root extracts 80.8 ± ± ± ± 2.47 Ethyl acetate fraction of peanut sprout root extracts 36.9 ± ± ± ± 4.20 Aglycone fraction of peanut sprout root extracts 67.3 ± ± ± ± 7.10 (+)-α-tocopherol ± ± ) Control, τ 50 = ± 1.00 min Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 2, 2012

6 188 조나래 박찬일 박채원 신동한 황윤찬 김용현 박수남 된다. 비타민류의천연항산화제외에식물계에널리분포하는폴리페놀화합물은항산화제로서최근에큰관심을모으고있다. 천연폴리페놀류는그종류가다양하여소수성에서친수성까지다양한구조적특성을가질수있다. 따라서이들을적절히조합하면기존에알려진항산화제들의복합기능을대신할수있을것이다. 이러한폴리페놀류화합물들은활성산소종과의반응, 전이금속킬레이트작용, 지질과산화반응의종결, 그리고생체내산화효소의작용저해등의여러단계를통하여항산화작용을나타낸다. 본논문에서는다량의폴리페놀을함유한땅콩나물뿌리의항산화활성과세포보호능력에대하여검토하였다. 1 O 2 으로유도된적혈구의광용혈에있어서땅콩나물뿌리 80% MeOH 추출물, 에틸아세테이트분획, 그리고아글리콘분획모두 5 25 µg/ml의농도범위에서농도의존적으로적혈구세포의파괴를억제하였고특히아글리콘분획은지용성항산화제인 (+)-α-tocopherol보다약 3배더우수한세포보호활성을나타내었다. 또한땅콩나물뿌리추출물의아글리콘분획은 5 25 µg/ml의농도범위에서같은농도의 80% MeOH 추출물및에틸아세테이트분획보다훨씬큰세포보호활성을보여주었다. 이는 80% MeOH 추출물및에틸아세테이트분획의성분들은플라보노이드배당체로이들주위에생성된물껍질로인하여세포막으로의접근및침투가어려운반면에아글리콘분획은당이제거된플라보노이드성분들로인하여세포막으로의침투가용이하고세포막불포화지질의자동산화반응을효율적으로억제함으로써적혈구세포막을보호하는효과를나타낸것이라사료된다. 땅콩나물뿌리추출물들의세포막보호작용은 1 O 2 의소광, 그리고이차적으로암반응에서생성된 O 2, H 2O 2, OH 등의활성산소소거작용, 철이온과의킬레이팅에의한활성산소의생성억제, 항산화성분의세포막으로의침투및지질과산화반응차단등다양한요인들이복합적으로일어난결과라고사료된다. 생명체에대한 O 2 와 H 2O 2 의독성작용은철이온의존성 OH 의생성에기인된다. 생체계에있어서 OH을생성시키는중반응은다음과같은 Fenton 반응으로알려져있다. Fe 2+ + H 2O 2 Fe 3+ + OH + OH - 추가적으로 Fe 3+ 염과과산화수소의반응으로도 OH이생성될수있다고보고되고있다. Fe H 2O 2 Fe 2+ + OH + H + + H 2O + O 2 1 O 2 을포함한활성산소종은피부의광노화및기타피부질환을일으킨다고보고되고있다. 피부에있어서적절한항산화제를사용하여활성산소종의생성을감소시키는일은피부광노화를예방하고최소화시키기위하여필수적이라판단된다. 본연구에서사용한땅콩나물뿌리추출물들은 1 O 2 으로유도된적혈구광용혈에서의현저한세포보호활성, 활성산소종의소거활성및철이온킬레이팅효과등이우수함을보여주었다. 따라서땅콩나물뿌리추출물은피부의광노화를예방하기위한항산화및항노화기능성화장품소재로서의응용이가능하다고사료된다. 5. 결론 1) 땅콩나물뿌리추출물의 free radical 소거능력 (FSC 50) 은 80% MeOH 추출물의경우 µg/ml, 에틸아세테이트분획의경우 µg/ml, 에틸아세테이트분획에서당을제거시킨아글리콘분획의경우 µg/ml으로 (+)-α-tocopherol (8.98 µg/ml) 에비해낮은 free radical 소거능을나타냈다. 2) 땅콩나물뿌리추출물의활성산소소거활성 (OSC 50) 은 80% MeOH 추출물이 3.88 µg/ml, 에틸아세테이트분획이 1.59 µg/ml, 아글리콘분획이 5.80 µg/ml로나타났으며에틸아세테이트분획의경우 L-ascorbic acid (1.50 µg/ml) 와유사한활성을나타내었다. 3) 1 O 2 으로유도된적혈구의광용혈현상에있어서, 땅콩나물뿌리추출물중에틸아세테이트분획은농도범위 (1 50 µg/ml) 에서농도-의존적으로 1 O 2 에의해유도된용혈억제하였으며, 80% MeOH 추출물과아글리콘분획또한 1 25 µg/ml 농도범위에서는우수한세포보호효과를나타내었다. 비교물질로사용한 (+)-α-tocopherol 과비교하였을때동일한 10 µg/ml 농도에서땅콩나물뿌리추출물들은더욱우수한효과를나타내었으며, 특히땅콩나물뿌리의 80% MeOH 추출물과아글리콘분획은 1 25 µg/ml 농도범위에서에틸아세테이트분획보다 1 O 2 으로유도된용혈을크게억제하였다. 이상의결과들을통해땅콩나물뿌리부위추출물들은 1 O 2 으로유도된적혈구의광용혈에서의우수한세포보호작용을나타내었으며, 이는땅콩나물뿌리추출물의항산화화장품과같은기능성화장품으로의응용가능성을시사한다. 참고문헌 1. Korean Geriatrics Society, Textbook of geriatric medicine 2nd ed, 28, Medical Publishing, Seoul (2005). 2. W. Meinhard, T. B. Iiana, N. Lale, M. Wenjian, A. S. Lars, R. W. Ziba, S. Jutta, and S. K. Karin, J. Photochem. Photobiol., B, 63, 41 (2001). 3. F. Afaq, V. M. Adhami, and H. Mukhtar, Mutat. Res., 571, 153 (2005). 4. M. A. Bachelor and G. T. Bowden, Cancer Biol., 14, 131 (2004). 5. J. Pinc , In Analysis of Free radicals in Biology Systems, ed. A. E. Favier, J. Cadet, B. Kalyanaraman, M. Fontecave, and J.-L. Pierre, 83, Birkhauser Verlag Basel, Switzerland (1995). 6. J. R. Kanofsky, H. Hoogland, R. Wever, and S. J. Weiss, J. Biol. Chem., 263, 9692 (1988). 7. A. Oikarinen, J. Karvonen, J. Uitto, and M. Hannuksela, Photodermatology, 2, 15 (1985). 8. A. Oikarinen and M. Kallioinen, Photodermatology, 6, 24 (1989). 9. L. H. Kilgman, Biological responses to Ultraviolet A Radiation, ed. F. Urbach, 209 Valdemar, Overland Park (1992). 10. K. Scharffetter-Kochanek, Advances in Pharmacology. ed. H. Sies, 38, 639 (1997). 11. K. Scharffetter-Kochanek, M. Wlaschek, K. Briviba, and H. Sies, FEBS Lett., 331, 304 (1993). 12. M. Wlaschek, K. Briviba, G. P. Stricklin, H. Sies, and K. Scharffetter-Kochanek, J. Invest. Dermatol., 104, 194 (1995). 13. J. H. Kim, S. J. Yoon, K. H. Lee, H. J. Kwon, S. S. Chun, T. W. Kim, and Y. J. Cho, J. Korean Soc. Appl. Biol., Chem., 48, 173 (2005). 14. J. C. Fantone and P. A. Ward, Ann. J. Path., 107, 397 (1982). 15. K. J. A. Davies, J. Biol. Chem., 262, 9895 (1987). 16. C. S. Foote, Free Radical in Biology, ed. W. A. Pryor, 2, 85, Acdemic press, New Yok (1976). 공업화학, 제 23 권제 2 호, 2012

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,