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1 J Korean Soc Food Sci Nutr 35(8), 961~966(2006) 한국식품영양과학회지 머루과피용매추출물의항산화성및아질산염소거작용 최선영 조현소 성낙주 경상대학교식품영양학과 농업생명과학연구원 The Antioxidative and Nitrite Scavenging Ability of Solvent from Wild Grape (Vitis Coignetiea) Skin Sun Young Choi, Hyun So Cho and Nak Ju Sung Dept. of Food Science and Nutrition, Institute of Agriculture and Life Sciences, Gyeongsang National University, Jinju , Korea Abstract This study was worked out to investigate antioxidant activity of solvent extracts from wild grape skin by measuring electron donating ability (EDA), reducing power, superoxide dismutase (SOD) like activity, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and nitrite scavenging ability. Total phenolic compound and flavonoids contents were the highest in ethyl acetate extract, 54.4±1.18 mg/100 g and 645.1±5.05 mg/100 g, respectively. The EDA and reducing power of solvent extracts from wild grape skin were proportionally increased with concentration and ethyl acetate extract (79.2±0.06%) showed the stronger than (74.1±0.15%) at concentration of 100 μg/ml, especially. SOD like ability of ethyl acetate (25.1±0.41%) and butanol (20.2±0.13%) extracts were stronger than other extracts at concentration of 100 μg/ml. TBARS of ethyl acetate extract was higher than ascorbic acid. Nitrite scavenging ability of solvent extracts from wild grape skin (ph 2.5, 1,000 μg/ml) were in order of ethyl acetate (90.5±0.75%)>butanol (65.9±2.16%)>hexane (58.1±1.74%)>chloroform (55.4±1.02%)>water (40.9±0.35%). Antioxidant activity of solvent extracts from wild grape skin was the highest in ethyl acetate extract from the results of our experiments. Key words: wild grape skin, electron donating ability, nitrite scavenging ability 서론최근건강과대체의학에대한관심의고조, 합성의약품에대한부작용우려, 각종천연식품의가공기술발달과더불어천연식품원료에대한다양한연구가진행되고있다. 이러한측면에서주목받고있는것이천연식물류로서, 오랫동안복용하여도독성이낮으며미량으로도현저한활성을나타내는것은이차대사물질인 phytochemicals를함유하고있기때문이다 (1). 식물체에함유되어있는 vitamin, carotenoids, cellulose, flavonoids와 phenolic 화합물들은항돌연변이원성, 콜레스테롤저하작용, 정장작용, 항산화작용및항암작용등다양한생리활성기능을가지고있다 (2). 이중특히, 페놀화합물들은다양한구조와분자량을가지는데분자내 phenolic hydroxyl기는효소단백질과같은거대분자들과결합하는성질이있어이러한생리활성기능을나타내는주체로인정되고있다 (3,4). 페놀화합물들을다량함유하고있는대표적인식품인포도과에속하는머루 (Vitis Coignetiea) 는일명산포도로불 리는낙엽성넝쿨식물로세계적으로광범위하게재배되는포도와형상이비슷하나산록및계곡에자생하며내한성이강하고지리적으로한국, 일본, 중국에주로많이분포하고있다. 또한양질의알칼리성식품으로포도보다 10배이상의칼륨, 칼슘, 철분과인을함유하고있으며, 유기산과수용성비타민등필수영양소가골고루들어있어성장기어린이두뇌발달과식욕및소화촉진의기능을한다 (5). 예로부터민간요법으로열매, 줄기및뿌리는빈혈, 구토, 설사와두통등의치료제로, 열매즙은피부암예방과괴혈병의치료제및이뇨제로널리이용되고있다 (6). 그중뿌리는대부분의 resveratrol을중심구조로하고있는 viniferin, amurensin, heyneanol 등의물질을함유하고있으므로뛰어난염증치료제로알려져있는데 (7), resveratrol 은포도의주요한천연페놀화합물의구성성분으로더잘알려져있으며 LDL-콜레스테롤의산화억제, 항산화와항염증효과및암예방효능을가진물질이라고보고된바있다 (8,9). 포도의조상으로포도와성분이비슷하지만그성분이약 10배정도농축되어있어더우수한효능을가진것으로보고 Corresponding author. snakju@gsnu.ac.kr Phone: , Fax:

2 962 최선영 조현소 성낙주 되고있는머루 (10) 는이화학적성분과머루를이용한머루주, 머루쥬스및발효제품개발 (11,12) 에관한연구만이진행되었을뿐기능성에관한체계적인연구는미비한실정이다. 따라서본연구에서는머루과피를용매별로추출하여항산화효과를검색하여천연항산화제로서의효능과이용가능성에대한기초자료를제공하고자한다. 재료및방법재료및용매추출물조제머루는경북봉화군에서 10월경에수확한것으로흐르는물에씻은후자연건조해물기를제거한다음 cheese cloth 를이용하여가볍게압착해과육부와분리하여씨를제거한다음동결건조하였다. 건조분말 100 g에약 10배의 80% ethanol을가하여실온에서 12시간동안정치시켜 3회반복추출한후회전식증발기에서완전건고하여 ethanol 조추출물을얻었다. 여기에 3차증류수와 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol을순차적으로계통분획하여여과한여액을감압 농축한후시료의무게로부터수율을측정한다음 3차증류수를가하여 1,000 μg/ml의농도가되도록하여냉동보관하면서실험에사용하였다. 총페놀화합물측정 Folin-Denis 방법 (13) 에따라추출물 0.2 ml에증류수 5 ml와 Folin-Ciocalteau 시약 0.5 ml를차례로가하고 3분간정치시킨다음 2% Na 2CO 3 용액 1 ml를가하여혼합한후 1시간동안반응시켜 725 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로는 tannic acid(sigma Co., USA) 를사용하였고, 동일한방법으로작성된표준검량곡선으로부터총페놀화합물함량을정량하였다. 총플라보노이드측정 Moreno 등 (14) 의방법에따라추출물 0.5 ml에 10% aluminum nitrate 0.1 ml, 1 M potassium acetate 0.1 ml 및 ethanol 4.3 ml를차례로가하여혼합하고실온에서 40분간방치한다음 415 nm에서흡광도를측정하였다. Quercetin (Sigma Co., USA) 을표준물질로하여총플라보노이드함량을계산하였다. 전자공여작용측정 Kang 등 (15) 의방법을변형하여 100, 250, 500 및 1,000 μg/ml로농도를조정한추출물 1 ml에 M 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 용액 5 ml를가하여혼합한다음 30분간반응시켜 528 nm에서흡광도를측정하였다. 전자공여능은시료첨가군와무첨가군의흡광도를비로나타내었으며동일한방법으로실험한 butylatedhydroxytoluene() 과 ascorbic acid를 positive control로하였다. 환원력측정 Oyaizu(16) 의방법에따라추출물에 ph 6.6 sodium phosphate buffer 2.5 ml와 potassium ferricyanide 2.5 ml 를혼합하여 50 o C에서 20분간반응시킨후 10% trichloroacetic acid 2.5 ml를첨가하고 10분동안 5,000 rpm에서원심분리시켰다. 상층액, 증류수및 1% ferric chloride를각각 1 ml씩가하여혼합한다음 700 nm에서흡광도를측정하고환원력은흡광도의값으로나타내었다. Superoxide dismutase(sod) 유사활성측정알칼리상태에서 pyrogallol의자동산화에의한발색원리를이용한 Marklund 와 Marklund(17) 의방법에따라측정하였다. 추출물 0.2 ml에 tris-hcl buffer 3 ml와 7.2 mm pyrogallol 0.2 ml를가하고 25 o C에서 10분간방치하였다. 1 N HCl 1 ml로반응을정지시키고산화된 pyrogallol의흡광도를 420 nm에서측정하였다. SOD 유사활성은시료첨가군과무첨가군의흡광도비로나타내었다. Thiobarbituric acid reactive substances(tbars) 측정 Buege와 Aust(18) 의방법에따라 maleic acid buffer(ph 6.5) 와 Tween-20 및 0.1 N HCl로만든 oil emulsion 0.5 ml, 산소종 (FeCl 2, CuSO 4) 0.1 ml 및추출물 0.1 ml를첨가하고 3차증류수를이용하여최종반응물을 1 ml로만들어 37 o C 에서 1시간동안산화반응시켰다. 이어 7.2% 50 μl와 TCA/TBA 용액을 2 ml 가하고 15분간가열 냉각한다음 2,000 rpm에서 15분간원심분리한상층액을취하여 531 nm 에서흡광도를측정하였다. TBARS 값은반응혼합물 L당 mg malondialdehyde(mda) 로표시하였다. 아질산염소거작용측정 Kato 등 (19) 의방법에따라 1 mm NaNO 2 용액 1 ml에추출물을 1 ml씩첨가하고, 0.1 N HCl 및 0.2 M citrate buffer로 ph 2.5 및 4.2로보정한다음반응용액의최종부피를 10 ml로하였다. 이용액을 37 o C에서 1시간반응시킨다음반응액을 1 ml씩취하여 2% acetic acid 3 ml, Griess시약 0.4 ml를차례로가하고잘혼합한다음실온에서 15분간반응시킨후 520 nm에서흡광도를측정하였다. 아질산염소거능은 100-[( 시료첨가군의흡광도 / 무첨가군의흡광도 ) 100] 으로나타내었다. 통계처리실험결과는 3회반복측정후평균 ± 표준편차로나타내었으며, SPSS 12.0을이용하여각시료군간의유의성을검증한후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test에따라분석하였다. 결과및고찰추출수율, 총페놀화합물및플라보노이드함량머루과피용매추출물의추출수율은 (Table 1) water 추출

3 머루과피용매추출물의항산화성및아질산염소거작용 963 Table 1. Extraction yield, total phenolic compounds and flavonoids contents of solvent extracts from wild grape skin Extraction yield (%) Phenolic compounds (mg/100 g) 4.4±0.99 a1) 9.0±0.29 c 54.4±1.18 e 28.4±0.83 d 7.3±0.97 b Flavonoids (mg/100 g) 6.3±0.47 a 11.3±0.31 b 645.1±5.05 e 77.6±0.84 d 13.9±0.34 c 1) Each value with different superscripts within a column in the different solvent 물에서 61.9% 로가장높았으며다음으로 butanol 추출물이 18.3% 였으며다른추출물의수율은 10% 미만이었다. 1,000 μg/ml로농도를조정한머루과피추출물의총페놀화합물과플라보노이드함량을측정한결과는 Table 1과같다. 총페놀화합물은 4.4±0.99~54.4±1.18 mg/100 g의범위로 ethyl acetate(54.4±1.18 mg/100 g) 와 butanol(28.4±0.83 mg/100 g) 추출물을제외한여타추출물에서는 10 mg/100 g이하로정량되어추출용매에따른함량차이가매우컸다. 플라보노이드의함량도이와동일한경향으로 ethyl acetate 추출물의경우 645.1±5.05 mg/100 g으로다른용매추출물에비하여월등히높은함량이었고가장함량이낮은 hexane 추출물 (6.3±0.47 mg/100 g) 보다약 100배이상, butanol 추출물 (77.6±0.84 mg/100 g) 에비해서도약 8배더높은함량으로정량되었다. 포도씨용매별추출물의페놀화합물은 ethyl acetate 추출물에서유의적으로높게함유하고있다는보고 (20) 와본실험결과는동일한경향이었다. 포도류의총페놀화합물은과피나과육보다는씨에주로함유되어있는것으로알려져있는데포도의총페놀화합물함량을측정한결과건물 100 g 당과육에는 4.19±0.04 g, 씨는 8.58±0.03 g, 과피에는 3.33±0.03 g이함유되어있다는보고 (21) 가있으며포도에서추출할수있는총페놀화합물의함량은과육에 10%, 종자에 60~70% 및종피에는 28~35% 가함유되어있다는보고 (22) 도있다. 전자공여작용 머루과피용매추출물의농도별전자공여작용을측정한결과 (Fig. 1) 가장활성이높은 ethyl acetate 추출물의경우 100 μg/ml에서전자공여능은 79.2±0.06% 로 (74.1 ±0.15%) 보다유의적으로높았으며, 1,000 μg/ml 첨가시에는 90.9±1.23% 로항산화활성이증가하였다. 모든용매추출물에서농도가증가함에따라전자공여작용이유의적으로증가하는경향을나타내었으며 1,000 μg/ml 첨가시모든시료의전자공여작용은 50% 이상이었다. 머루와포도용매별추출물의전자공여능측정한결과머루보다포도에서더전자공여능이높았는데, butanol과 ethyl acetate 추출물의경우포도에서약 84.6%, 머루에서는 Electron donating ability (%). 120 cg 100 af bg cg df bf cf ae ce ce 80 be ad cd dd bd dc 60 cc ac bc db ac cb ab ca da 40 ba aa hexane chloroform 20 ethyl acetate butanol water Concentration (µg/ml) Fig. 1. Electron donating ability of solvent extracts from wild grape skin. a-d Each value with different superscripts within a same solvent A-G Each value with different superscripts within a same concentration 약 83.4% 로시료및용매별차이는적었으나, water 추출물은포도 (40.6%) 와머루 (11.8%) 에서전자공여능이큰차이를보인다는보고 (5) 가있다. Park 과 Oh(23) 는거봉포도의경우종자 ethanol 추출물이과피 ethanol 추출물보다더높은라디칼소거능을보였으나용매별추출물경우종자와과피모두에서 ethyl acetate와 butanol 추출물에서항산화활성이가장높다고하였다. 포도나머루에있어서전자공여작용은실험에사용된부위에따라서다소상이하지만추출용매에따른차이를보면 ethyl acetate 추출물에서높은활성을보였으며이는본실험의결과와유사한경향이었다. 환원력 머루과피용매추출물을농도별로첨가하여 FeCl 3 와의반응정도를 700 nm의흡광도로표시하였는데발색정도가높을수록환원력이높음을의미한다. 모든시료의농도가증가함에따라시료의환원력 (Table 2) 은유의적으로증가하는경향이었으나, ascorbic acid나 보다낮은환원력을나타내었다. 100 μg/ml에서시료추출물의환원력은 0.13~0.25의범위였으며, 250 μg/ml 첨가시 ethyl acetate 추출물이 0.45±0.06으로환원력이증가하였으나다른추출물은 0.25 미만이었다. 1,000 μg/ml에서환원력은 ethyl acetate 추출물 (0.67)>water 추출물 (0.55)>butanol chloroform 추출물 (0.45~0.48)>hexane 추출물 (0.25) 의순이었다. SOD 유사활성 Pyrogallol의자동산화반응을이용하여머루과피용매추출물의 SOD 유사활성측정결과 (Fig. 2) 농도가증가함에따라 ascorbic acid, hexane, butanol 및 water 추출물을제외한다른추출물들은유의적차이가적었다. 100 μg/ml에서 ethyl acetate 추출물은 ascorbic acid보다높은 SOD 유사활성을나타내었으며다음으로 butanol 추출물이 20.2±0.13%

4 964 최선영 조현소 성낙주 Table 2. Reducing power of solvent extracts from wild grape skin (Absorbance at 700 nm) , ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.03 a-d Each value with different superscripts within a same solvent A-F Each value with different superscripts within a same concentration SOD-like ability (%) af ae 20 ad ac 10 ab aa chloroform butanol be ad bc ba dc hexane ethyl acetate water cf ae cd bc ca Fig. 2. Pyrogallol autoxidation activity of solvent extracts from wild grape skin. a-d Each value with different superscripts within a same solvent A-F Each value with different superscripts within a same concentration 로높은항산화활성을보였고다른추출물에서는 15% 미만의낮은활성을보였다. 500 μg/ml 첨가시 ethyl acetate, butanol 및 water 추출물은 20.6±0.52~25.5±0.43% 의활성 df be dd cc da 을보이다가 1,000 μg/ml에서는 ethyl acetate 추출물이 32.5±0.45% 로 SOD 유사활성이더증가하였으나 chloroform 및 hexane 추출물의경우는 24.1±0.25% 미만의낮은활성을나타내었다. 반면, hexane 추출물은농도증가에따른유의적차이는있었으나, 낮은 SOD 유사활성을보였다. 이상의결과로보아머루과피추출물이 100 μg/ml 농도를제외하고는 ascorbic acid보다 SOD 유사활성이낮았는데, 이는 chain-breaking 항산화제로작용하기때문인것으로추정된다. Chung 등 (24) 은 60여종의약용작물에대한항산화활성결과평균 34.8% 의활성을나타낸다는보고에비해머루과피용매추출물은전반적으로낮은 SOD 유사활성을보였다. TBARS의함량 Oil emulsion을기질로하여활성산소종 (FeCl 2, CuSO 4) 과머루과피용매추출물을농도별로첨가한후생성된 MDA의양을 positive control(, ascorbic acid) 과비교실험한결과는 Table 3에나타내었다. FeCl 2 가지질산화에미치는정도는추출물과 Fe 2+ 가결합하는능력이우수할수록항산화활성이뛰어나며, 특히 Fe 2+ 와 Fe 3+ 의비가 1:1일 Table 3. Effect of solvent extracts from wild grape skin on lipid oxidation of oil emulsion containing FeCl 2 and CuSO 4 (mg MDA/L) Active oxygens FeCl 2 CuSO , ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.02 a-d Each value with different superscripts within a same solvent A-G Each value with different superscripts within a same concentration

5 머루과피용매추출물의항산화성및아질산염소거작용 965 Table 4. Nitrite scavenging ability of solvent extracts from wild grape skin in different ph reaction system (%) ph condition , ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.75 a-d Each value with different superscripts within a same solvent A-E Each value with different superscripts within a same concentration 때최고의활성을나타낸다고보고되어있다 (25). 추출물의농도가증가할수록 TBARS 값이낮아져항산화활성이유의적으로증가함을알수있었다. 100 μg/ml 농도에서 ethyl acetate와 chloroform 추출물이각각 1.7±0.04 mg MDA/L 와 1.9±0.05 mg MDA/L 로 (1.5±0.04 mg MDA/L) 에가장근접한활성을보였고다른추출물은 3.4±0.04 mg MDA/L 이상으로항산화활성이낮았다. 비교적높은항산화활성을보인 ethyl acetate와 chloroform 추출물의경우 1,000 μg/ml에서 0.7±0.02 mg MDA/L 와 0.8±0.02 mg MDA/L 로 및 ascorbic acid와유사한범위였으나 hexane, butanol 및 water 추출물은 1.6±0.03~2.2±0.04 mg MDA/L 로항산화활성이낮았다. CuSO 4 에대한항산화활성은 FeCl 2 첨가시보다전체적으로항산화활성이낮았으며용매추출물및첨가농도에따른활성의차이가적어다소상이한경향을보였다. 100 μg/ml에서 가 1.9±0.02 mg MDA/L 에반해모든추출물들은 4.2±0.02~5.0±0.02 mg MDA/L 의범위였고 1,000 μg/ml 농도에서는 ethyl acetate 추출물이 2.9±0.01 mg MDA/L 로추출물중가장활성이높기는하였으나 (1.3±0.02 mg MDA/L) 보다는활성이월등히낮았다. 아질산염소거작용 ph 2.5와 4.2의반응용액에서머루과피용매추출물의아질산염소거작용을측정한결과 Table 4에서나타낸바와같이반응계의 ph가낮을수록, 시료농도가증가할수록소거능은유의적으로높아졌다. ph 2.5의반응용액에서는 ethyl acetate 추출물 (50.5±0.31~90.5±0.75%) 의아질산염소거능이가장높아 100 μg/ml의농도에서도 50% 이상, 1,000 μg/ml에서는 90% 이상으로활성이높았다. 여타추출물은 ethyl acetate 추출물보다아질산염소거작용이낮아 chloroform 추출물이 500 μg/ml 농도에서 52.6±0.95% 로 50% 이상의활성을보였으며 water 추출물은 1,000 μg/ml 의농도에서도 40.9±0.35% 로시료중아질산염소거작용이가장낮았다. 이러한경향은 ph 4.2에서도유사하여 ethyl acetate 추출물의경우 33.2±0.12~62.3±0.31% 로유의적으로높은소거능을보였고다음으로는 butanol 추출물에서 30.7±0.23~57.8±0.52% 였으며그외에추출물은 40% 미만의소거작용을보였다. Lee 등 (26) 이보고한올리브잎의 6가지용매분획물이 500 μg/ml에서 13~18% 의아질산염소거작용을나타낸결과에비해머루과피용매추출물의아질산염소거작용은상당히우수한것으로나타났다. 이상의결과를종합해보면총페놀화합물의함량이높을수록, ph 가낮을수록아질산염소거작용이뛰어나다는 Lee 등 (27) 과 Kim 등 (28) 의보고와일치하였다. 따라서머루과피용매추출물은아질산염과아민이존재할수있는생체식품및가공식품과함께섭취하면생체내에서 nitrosamine 에의한암발생을예방하는데도움을줄것으로생각된다. 요약머루과피용매추출물의전자공여작용, 환원력, SOD 유사활성, TBARS 및아질산염소거작용을측정하여항산화기능을규명하고자하였다. 총페놀과플라보노이드함량이가장높은 ethyl acetate 추출물의경우전자공여작용도 100 μg/ml 농도에서 79.2±0.06% 로 (74.1±0.15%) 보다더활성이높았고, 추출물의농도에비례하여전자공여작용과환원력은유의적으로증가하였다. SOD 유사활성은 100 μg/ ml 농도에서 ethyl acetate와 butanol 추출물에서각각 25.1±0.41% 와 20.2±0.13% 로다른추출물에비해높은활성을보였다. FeCl 2 와 CuSO 4 에대한항산화활성도추출물의농도가높아짐에따라그활성이증가하는경향이었는데, ethyl acetate 추출물은 ascorbic acid보다항산화활성이높았다. 머루과피용매추출물의아질산염소거작용은 ph 2.5 에서 ethyl acetate(90.5±0.75%)>butanol(65.9±2.16%)>hexane(58.1±1.74%)>chloroform(55.4±1.02%)>water(40.9± 0.35%) 추출물의순으로소거작용이높았다. 이상의결과를종합하여볼때머루과피의항산화활성은 ethyl acetate 추출물에서가장우수하였다.

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