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종문 봉
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1 J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 44(8), 1172~1179(2015) 추출조건에따른유근피추출물의항산화활성 김재민 1 조명래 1 서규은 1 김예슬 1 정태동 1 김영현 1 김단비 1 신기해 1 오지원 1 이종석 2 이진하 1 김종예 1 이대원 3 이옥환 1 1 강원대학교식품생명공학과 2 국립생물자원관 3 정선약초백화점 Effect of Extraction Conditions on in vitro Antioxidant Activities of Root Bark Extract from Ulmus pumila L. Jae-Min Kim 1, Myoung-Lae Cho 1, Kyu-Eun Seo 1, Ye-Seul Kim 1, Tae-Dong Jung 1, Young-Hyun Kim 1, Dan-Bi Kim 1, Gi-Hae Shin 1, Ji-Won Oh 1, Jong Seok Lee 2, Jin-Ha Lee 1, Jong-Yae Kim 1, Dae-Won Lee 3, and Ok-Hwan Lee 1 1 Department of Food science and Biotechnology, Kangwon National University 2 National Institute of Biological Resources 3 Department of Jeongseon Yaccho ABSTRACT This study investigated optimal extraction conditions for application of Ulmus pumila L. as a natural antioxidant. U. pumila L. was extracted using ethanol (EtOH) at various concentrations (0, 40, and 80%) and extraction times (1, 2, and 3 h) at 70 C and then evaluated for extraction yield, total phenolic contents, total flavonoid contents, as well as antioxidant activities [2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging activity, reducing power, and oxygen radical absorbing capacity (ORAC)]. Antioxidant activities were correlated with total phenolic and flavonoid contents. Of the solvent conditions, 80% EtOH extracts for 3 h at 70 C showed the highest total phenolic and flavonoid contents with strong antioxidant activities, although there were no significant time effects on DPPH and ABTS radical scavenging activities and reducing power. However, ORAC values of all EtOH extracts remarkably increased in a time-dependent manner. In addition, 80% EtOH extract for 3 h exhibited strong antioxidant effects on HDF and 3T3-L1 cells. Therefore, the antioxidant capacity of U. pumila L., may due to phenolic and flavonoid contents, and extraction conditions were 80% EtOH for 3 h at 70 C. This extract could be a good source for natural antioxidants. Key words: Ulmus pumila L., DPPH, ABTS, ORAC, total phenolic content 서 인체의산화적스트레스로발생되는활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 은생체내의세포막, 단백질, DNA 손상등을유발시켜암, 당뇨, 고혈압, 비만등각종질병의원인이되는것으로알려져있다 (1-3). 활성산소종에는 superoxide anion(o 2- ), hydrogen peroxide(h 2O 2), hydroxyl 라디칼 (OH) 등이있는데, 기능성식품및의약품산업에서는활성산소종들을제거하기위하여합성항산화제인 butylated hydroxytoluene(bht), butylated hydroxyanisole(bha), propyl gallate(pg) 등을사용하여왔다. Received 27 March 2015; Accepted 30 April 2015 Corresponding author: Ok-Hwan Lee, Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon, Gangwon 24341, Korea loh99@kangwon.ac.kr, Phone: 론 그러나많은연구결과들에서이들합성항산화제가암을유발하거나세포내독성을나타낸다고보고하였다 (4). 따라서보다안전하고효과적인천연항산화제를찾고자하는연구가꾸준히수행되고있으며, 최근에는민간요법이나한방에서효능이입증된육상식물을활용한기능성식품, 화장품및의약품소재에관한연구가많이수행되고있다 (5,6). 느릅나무 (Ulmus davidiana var. japonica Nakai) 는전국각지에자생하고일본, 중국등지에도분포하는것으로알려져있으며, 느릅나무의껍질은유백피 (bark of Ulmus pumila L.) 이고, 뿌리껍질은유근피 (root bark of U. pumila L.) 이다. 유근피는예부터염증, 항부종, 항균작용등의생리활성으로민간요법에서많이사용하여왔으며 (7), 최근연구결과에의하면유근피의수용성추출물에서분리된단백다당체는 mouse의생체내면역력을증강시켜항암활성을유도한다고보고되었다 (8). 한편유근피를 100% 메탄올로

2 유근피추출물의항산화활성 1173 추출하여분리한 flavonoid 성분의화합물은 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl(DPPH), OH 라디칼소거능과높은환원력을보였으며 (9), 80% 메탄올로추출후분리된 phenolic 화합물들은글루탐산에의한신경세포독성으로부터뇌신경보호효과를갖는다고보고되었다 (10). 또한 80% 에탄올로추출된유근피추출물은다른농도의에탄올추출물보다높은항산화, 항고혈압, 항염증효과를보였다 (8). 이러한연구결과들에서보듯이유근피는추출용매및추출조건에따라다양한기능성을갖는성분들을분리할수있다. 하지만유근피를기능성항산화소재로활용하기위한최적추출조건확립에관한연구는거의수행되지않았으며, 유근피의추출용매및추출시간에따른항산화활성에대한체계적인연구는수행되지않았다. 따라서본연구에서는유근피추출물을기능성식품및의약품산업의소재로활용할기초자료를제공하고자유근피를추출용매 (0, 40, 80% 에탄올 ) 와추출시간 (1, 2, 3시간 ) 을달리하여추출조건에따른폴리페놀, 플라보노이드함량을연구하였고다양한방법을이용하여항산화활성을측정하였으며, 폴리페놀, 플라보노이드함량과항산화활성과의연관성을분석하였다. 또한 in vitro 항산화활성에서가장우수한유근피추출물을이용하여피부섬유아세포에서 hydrogen peroxide에의하여발생하는산화적스트레스에대한세포보호효과를관찰하였고, 3T3- L1 전지방세포에서 ROS 생성저감활성을연구하였다. 재료및방법유근피추출물제조본연구에사용한유근피 (Ulmus pumila L.) 는정선약초백화점에서구입하여 20 mesh 이하로분쇄후 4 C에보관하였다. 유근피추출물은 1 g의시료에 200 ml의용액 (0, 40, 80% 에탄올 ) 을첨가하였으며, 70 C에서 1, 2, 3시간동안환류냉각추출하였다. 각각의추출물은 filter paper (Whatman No. 3, Whatman, Maidstone, UK) 로여과한후, 회전진공농축기 (Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Shanghai, China) 를사용하여 60 C에서농축하였고, 동결건조 (Ilshinbiobase Co., Ltd., Yangju, Korea) 하였다. 각추출물의수율은건조중량을기준으로환산하여계산하였다. 실험시약 Folin-Ciocalteu's phenol reagent, gallic acid, sodium carbonate, aluminium nitrate, potassium acetate, sodium hydroxide, DPPH, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(trolox), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)(abts), acetic acid, 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(aaph), potassium persulfate, potassium ferricyanide, trichloroacetic acid, 2,4,6-tri(2-pyridyl)-striazine(TPTZ), N-acetyl-L-cysteine(NAC) 등은 Sigma- Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 로부터구입하였고, fluorescein sodium salt는 Junsei Co.(Tokyo, Japan) 에서구입하여사용하였다. 피부섬유아세포 (human dermal fibroblast) 는강원대학교생물공학과 Bioprocess Engineering 실험실로부터분양받아본연구실에서계대배양하여사용하였고 (11), 마우스유래지방세포 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA) 으로부터분양받아사용하였다. 세포배양에사용된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum(fbs), penicillin-streptomycin(p/s), phosphate-buffered saline(pbs) 및 trypsinethylenediaminetetraacetic acid(edta) 는 Gibco(Gaithersburg, MD, USA) 로부터구입하여사용하였다. 유근피의일반성분분석유근피의일반성분은 AOAC법 (12) 에따라수분함량은상압건조법, 조지방함량은 soxhlet 추출법, 조단백질함량은 semi micro-kjeldahl법, 회분함량은회화법으로분석하였고, 탄수화물함량은유근피시료 100 g 중에서수분, 회분, 조지방및조단백을합한값을 100에서뺀값으로하였다. 총폴리페놀함량측정총폴리페놀함량은 Folin-Ciocalteu의방법을변형하여측정하였다 (13). 각시료 1 ml에 2% sodium carbonate 용액 1 ml와 10% Folin-Ciocalteu's reagent 1 ml를혼합하여암소에서 1시간방치후 microplate reader(molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로 750 nm에서흡광도를측정하였다. 총폴리페놀함량은 gallic acid를이용하여표준물질의표준곡선 (y=16.47x+0.014, R 2 =0.993) 으로부터총폴리페놀함량 (mg GAE/g sample) 을계산하였다. 총플라보노이드측정총플라보노이드함량은 Moreno 등 (14) 의방법에따라각시료 0.5 ml에 95% EtOH 1.5 ml, 10% aluminum nitrate 0.1 ml 및 1.0 M potassium acetate 0.1 ml, 증류수 2.8 ml를첨가하여 30분간반응시킨후 microplate reader (Molecular Devices) 의 415 nm에서흡광도를측정하였다. 총플라보노이드함량은 catechin를이용하여표준물질의표준곡선 (y=1.879x+0.035, R 2 =0.995) 으로부터총플라보노이드함량 (mg CE/g sample) 을계산하였다. DPPH 라디칼소거능 DPPH 라디칼소거능은시료내의항산화물질과자유라디칼인 DPPH 시약이반응하여자유라디칼이소거되어자색에서노란색으로탈색되는원리를이용한다. DPPH 라디칼소거능은 Stagos 등 (15) 의방법을변형하여측정하였다. Ethanol을사용하여용해시킨 0.4 mm DPPH 용액 0.8 ml

3 1174 김재민 조명래 서규은 김예슬 정태동 김영현 김단비 신기해 오지원 이종석 이진하 김종예 이대원 이옥환 와시료 0.2 ml를혼합한뒤 10분동안암소에서반응시킨후 microplate reader의 517 nm에서흡광도값을측정하였다. DPPH 라디칼소거능은다음의식을이용하여계산하였다. DPPH 라디칼 =(1- AExperiment-ABlank 소거능 (%) ) 100 A Control A Experiment: 시료군흡광도, A Blank: 공시료흡광도 A Control: 대조군흡광도 ABTS 라디칼소거능 ABTS 라디칼소거능은 ABTS 시약과 potassium persulfate의반응에의해생성된 ABTS 자유라디칼이시료의항산화성분에의해청록색으로탈색되는현상을이용한방법이다. ABTS 라디칼소거능은 Re 등 (16) 의방법으로측정하였다. 7 mm ABTS 용액과 2.45 mm potassium persulfate를혼합하여빛을차단한상태로 16시간동안상온에서반응시켜 ABTS 양이온을형성시킨후흡광도값이 0.70± 0.02가되도록무수에탄올을이용하여조절하였다. 시료 10 μl와 900 μl의희석된 ABTS 용액을첨가하고 6분동안반응시켜 microplate reader의 750 nm에서흡광도를측정하였다. ABTS 라디칼소거능은아래의식을이용하여계산하였다. ABTS 라디칼소거능 =(1- ASample ) 100 A Control A Sample: 시료군흡광도, A Control: 대조군흡광도 환원력 환원력은 ferric-ferricyanide(fe 3+ ) 가항산화활성물질에의하여 ferrous(fe 2+ ) 로환원되는능력을측정한방법으로 Oyaizu(17) 의방법을변형하여측정하였다. 시료 0.1 ml, 0.2 M sodium phosphate buffer 0.5 ml, 1% potassium ferricyanide 0.5 ml를혼합하여 50 C에서 20분간반응시켰다. 반응후 10% trichloroacetic acid 0.5 ml를넣어준다음 12,000 rpm에서 10분동안원심분리하고, 상층액 0.5 ml와증류수 0.5 ml 그리고 0.1% iron(Ⅲ) chloride 0.1 ml를첨가하여상온에서 10분간반응후 mircoplate reader 655 nm에서흡광도를측정하였다. ORAC assay Oxygen radical absorbing capacity(orac) 는항산화활성물질이자유라디칼의 chain을절단하여항산력을나타내는것을측정하는것으로 (18), 유근피추출물의 ORAC assay는 Ou 등 (19) 의방법을변형하여실험하였다. 75 mm phosphate buffer에유근피추출물을용해시키고, 53 mm 의 fluorescein 150 μl를첨가후, 37 C에서 15분간가열한다음 144 mm AAPH 25 μl를첨가하였다. 형광분광광도계 는 37 C로조정후, excitation 파장 485 nm와 emission 파장 530 nm에서 90분간측정하였다. 표준물질로는 Trolox 를사용하였으며, 표준시약과유근피추출물의 under the curve(auc) 를측정하고 μm TE/mg으로표기하였다. 세포배양피부섬유아세포는실험목적에따라 96-well plate 및 6-well plate에각각 cells/well 농도로 seeding 한후, FBS(10%) 및 P/S(1%) 를함유한저농도포도당 DMEM (89%) 에서배양하였다. 이때유근피 80% 에탄올 3시간추출물의효과를관찰하기위하여음성대조군에는아무것도처리하지않았으며, 양성대조군으로는 NAC를처리하였다. 3T3-L1 지방세포분화과정중유근피추출물에의해세포내 ROS 생성량의변화를관찰하였다. 3T3-L1 세포주는 ATCC로부터분양받아사용하였다. 3T3-L1 전지방세포는 24-well plate에각각 seeding 한후 BS(10%) 및 P/S(1%) 를함유한고농도포도당 DMEM(89%) 에서 100% confluence 될때까지 CO 2 incubator에서배양하였다. 2일후지방세포분화유도물질 (10 μg/ml insulin, 1 μm DEX, 0.5 mm IBMX) 과 FBS(10%) 및 P/S(1%) 를함유한 DMEM으로전지방세포를지방세포로분화유도하였다. 지방세포분화 (day 0) 시 DMEM에유근피 80% 에탄올 3시간추출물을 100, 200 μg/ml의농도로처리하였고, 이때유근피추출물의효과를비교하기위하여음성대조군에는아무것도처리하지않았으며, 양성대조군에는항산화제인 NAC(5 mm) 를처리하여비교하였다. 지방세포의분화는분화유도물질을처리한후 2일마다지속적으로 10 μg/ml insulin, 1% P/S, 10% FBS가함유된배지에각각의시료를처리한다음, 8일동안분화시키며지방축적량및 ROS의생성량을관찰하였다. XTT assay 를이용한세포독성평가피부섬유아세포와 3T3-L1 전지방세포에대한유근피추출물의세포독성평가는 XTT[2,3-bis (2-methoxy-4- nitro-5-sulfophenyl)-2h-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt] assay kit을이용하여측정하였다. 세포는실험전날 cells 농도로 96-well plate에 seeding 하고 100, 200 μg/ml의유근피 80% 에탄올 3시간추출물을처리하여 24시간동안배양하였다. XTT reagent 1 ml와 PMS reagent 20 μl를혼합하여 working solution을조제하고, CO 2 incubator에서 4시간동안배양한후 microplate reader를이용하여 450 nm 흡광도값에서 690 nm의흡광도값을뺀결과값으로세포독성을계산하였다 (20,21). 산화적스트레스에의한세포손상보호효과측정산화적스트레스요인에의한세포손상보호효과는 XTT assay를변형하여측정하였다. 먼저피부섬유아세포를 96-well plate에 seeding 하고유근피 80% 에탄올 3시

4 유근피추출물의항산화활성 1175 간추출물을 100, 200 μg/ml 농도로처리하고 24시간동안배양후, 산화적스트레스를유발하기위하여 1 mm hydrogen peroxide를 3시간동안세포에처리하였다. 배양이끝난후배지를제거하고각 well에 XTT working solution이 20% 포함된배지를 200 μl씩첨가하였다. XTT가첨가된 96-well plate는 CO 2 incubator에서 4시간동안반응한후, microplate reader를이용하여 450 nm 흡광도값에서 690 nm의흡광도값을뺀결과값으로세포손상보호효과를계산하였다. Table 1. Proximate composition of U. pumila L. (%) Proximate composition Ulmus pumila L. Moisture Ash Protein Lipid Carbohydrate 1) 12.7±0.1 2) 9.0± ± ± ) 100-sum of moisture, crude ash, crude protein, and crude fat contents. 2) All values are mean±sd of triple determinations. NBT assay 를이용한 ROS 함량측정분화과정에따른지방세포의 ROS 생성량을측정하기위하여먼저 24-well plate에배양및분화된 3T3-L1 세포의배양액을제거한후멸균된 PBS(pH 7.4) 를이용하여 2회세척하고, 0.2% NBT reagent 0.2 ml를첨가하여 CO 2 incubator 안에서 90분간반응시킨뒤 100% acetic acid를이용하여 dark blue formazan을모두용출시켰다. 그후 microplate reader를이용하여 550 nm에서흡광도를측정하였다. 통계분석모든실험은 3반복으로측정한값을평균 ± 표준편차로나타내었다. 실험결과의통계적유의성은 one-way ANOVA 분석을하였으며, 최소유의차검정 (LSD) 에의해평균간의유의차를 P<0.05 유의수준에서 Tukey's test로유의성을검정하였다. 실험의통계분석은 SAS 9.3(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을이용하였다. 결과및고찰유근피의일반성분분석유근피의일반성분을분석한결과는 Table 1에나타내었다. 유근피 100 g(dry weight basis) 중에는수분 12.7%, 조회분 9.0%, 조단백질 5.2%, 조지방 0.6%, 탄수화물 72.5 % 가함유되어있었다. 이러한결과는평창지역유근피의일반성분 ( 수분 5.7%, 조회분 15.7%, 조단백질 5.7%, 조지방 0.5%, 탄수화물 72.4%) 및홍천지역유근피의일반성분 ( 수분 6.2%, 조회분 10.9%, 조단백질 6.7%, 조지방 0.7%, 탄수화물 75.5%)(22) 함량과비교하였을때수분및조회분의함량은약간차이를보였으나조단백질, 조지방, 탄수화물의함량은유사하였다. 이와같은결과는유근피의일반성분들은느릅나무의자생환경 ( 토양환경, 기후조건, 채취시기등 ) 에따라다르게함유되어있는것으로보인다. 유근피의추출조건에따른추출수율, 총폴리페놀및플라보노이드함량유근피를다양한용매조건과시간으로추출하여획득된수율은 Table 2에나타내었다. 유근피의수율은전체적으로 19.4~27.3% 로나타났으며, 80% 에탄올로 1시간추출하였을때 19.4% 로가장낮았고, 0% 에탄올 3시간추출에서 27.3% 로가장높게나타났다. 이러한결과는 100% 메탄올로상온에서추출한유근피의추출물 (15.2%)(9), 70% 에탄올 60 C에서 3시간추출한추출물 (12.0%) 및 0% 에탄올 80 C에서 3시간추출한유근피추출물 (12.7%) 수율보다높게나타났다 (23). 이상의결과에서보듯이유근피추출물의수율은추출용매, 추출온도및추출시간에따라다르게나타나는것을알수있다. 유근피추출물의총폴리페놀함량은 215.7~363.5 mg/g sample로나타났으며, 0% 에탄올추출물에서가장낮은총폴리페놀함량 (215.7~218.4 mg/g sample) 을보였고, 80% 에탄올추출물에서가장높은총폴리페놀함량 (312.3~363.5 mg/g sample) 을보였다 (Table 2). 이러한결과는 Kim 등 Table 2. Extraction yield, total phenolic, and flavonoid contents of U. pumila L. extracts EtOH Con. (%) Time (h) Extraction yield (%) Total phenolic content (mg GAE 1) /g) 218.4±11.1 d3) 215.7±9.1 d 217.6±18.8 d 259.5±5.9 c 272.6±19.1 c 270.4±17.7 c 312.3±10.6 b 326.7±6.2 b 363.5±6.9 a Total flavonoids content (mg CE 2) /g) 174.3±13.8 d 179.0±5.0 d 184.3±12.6 d 254.0±8.4 c 265.8±7.2 c 268.8±5.1 c 306.6±6.3 b 318.4±12.1 b 363.3±27.6 a 1) GAE: gallic acid equivalent. 2) CE: catechin equivalent. 3) Value are mean±sd (n=3). a-d Significant differences among various samples.

1176 김재민 조명래 서규은 김예슬 정태동 김영현 김단비 신기해 오지원 이종석 이진하 김종예 이대원 이옥환 (24) 이보고한농도별에탄올추출물중 70% 에탄올추출물에서최대의총폴리페놀함량을나타낸것과유사하였다. 그러나 Jeong과 Kim(23) 및 Kim 등 (7) 이보고한유근피 70% 에탄올추출물의총폴리페놀함량 ( 각각 17.9, 7.

3~184.3 mg/g sample을보였다. 그러나 40%, 80% 에탄올추출물의총플라보노이드함량 ( 각각 254.0~ 268.8, 306.6~363.3 mg/g sample) 은총폴리페놀함량과유사하게나타났다. 유근피추출물의총플라보노이드함량은 Kim 등 (25) 이보고한오가피, 칡, 인삼의총플라보노이드함량 (44.0, 15.2, 5.

5 1176 김재민 조명래 서규은 김예슬 정태동 김영현 김단비 신기해 오지원 이종석 이진하 김종예 이대원 이옥환 (24) 이보고한농도별에탄올추출물중 70% 에탄올추출물에서최대의총폴리페놀함량을나타낸것과유사하였다. 그러나 Jeong과 Kim(23) 및 Kim 등 (7) 이보고한유근피 70% 에탄올추출물의총폴리페놀함량 ( 각각 17.9, 7.1 mg/ g sample) 보다높게나타났다. 다른식물과비교를하면유근피추출물의총폴리페놀함량은 Seo 등 (24) 이보고한더위지기의총폴리페놀함량 (548.0 mg/g sample) 보다는낮은값을보였다. 한편유근피추출물의총플라보노이드함량은 174.3~363.3 mg/g sample로나타났으며, 0% 에탄올추출물의총플라보노이드함량은총폴리페놀함량보다낮은 174.3~184.3 mg/g sample을보였다. 그러나 40%, 80% 에탄올추출물의총플라보노이드함량 ( 각각 254.0~ 268.8, 306.6~363.3 mg/g sample) 은총폴리페놀함량과유사하게나타났다. 유근피추출물의총플라보노이드함량은 Kim 등 (25) 이보고한오가피, 칡, 인삼의총플라보노이드함량 (44.0, 15.2, 5.9 mg/g sample) 보다높게나타났다. 따라서본연구결과유근피추출물에함유되어있는총폴리페놀및플라보노이드함량은유근피의추출방법및느릅나무의자생환경 ( 일조량, 강수량, 토양영양분등 ) 에큰영향을받는것으로예상되며, 총폴리페놀및플라보노이드함량과직접적인연관성을갖는항산화활성에관하여연구하였다. 유근피추출물의항산화활성유근피추출물의항산화활성은 DPPH 라디칼소거능, ABTS 라디칼소거능, 환원력, ORAC assay를수행하였다. Fig. 1에서보듯이유근피추출물의 DPPH 라디칼소거능은 0% 에탄올추출물이 34.7% 로가장낮게나타났으며, 80% 에탄올추출물이 55.7% 로가장높은 DPPH 라디칼소거능을보였다. 하지만각농도의에탄올추출물을 1, 2, 3시간비교하였을때 DPPH 라디칼소거능은큰차이를보이지않았다. 다른연구에의하면 Kim 등 (26) 은감초를이용하여용매추출조건과추출시간에따른항산화활성을연구하였는데, 본연구결과와유사하게에탄올농도가증가함에따라항산화활성이증가하였고추출시간은항산화활성에크게영향을미치지않았다. 한편유근피추출물의 ABTS 라디칼소거능은 0% 에탄올추출물에서 27.8% 의낮은라디칼소거능을보였으나 80% 에탄올추출물에서는 76.3% 의높은 ABTS 라디칼소거능을보였다. 또한 ABTS 라디칼소거능역시 DPPH 라디칼소거능과유사하게추출시간에따른라디칼소거능의변화는보이지않았다. 추출조건에따른유근피추출물의환원력은 0% 에탄올추출물에서가장낮은환원력 ( 흡광도 0.49) 을보였으며, 80% 에탄올추출물에서가장높은환원력 ( 흡광도 0.71) 을보였다. 또한추출시간에따른항산화활성의차이는크게나타나지않았다. 이러한항산화활성은 DPPH 및 ABTS 라디칼소거능과비슷한양상을보였다. 유근피추출물의 ORAC는 0% 에탄올 1시간추출물에서 1,331 μm TE/mg을보이다가 0% 에탄올 3시간추출물에서는 2,557 μm TE/mg으로증가하였다. 또한 80 % 에탄올 1시간추출물은 0% 에탄올 3시간추출물및 40% A B C D Fig. 1. Antioxidant activities of various extracts from U. pumila L. DPPH radical scavenging activity (A), ABTS radical scavenging activity (B), reducing power (C), and oxygen radical absorbing capacity (ORAC) (D). Each samples used at a concentration of 100 μg/ml. a-e Significant differences among different EtOH concentration and extraction times.

유근피추출물의항산화활성 1177 에탄올 1시간추출물과유사한 2,242 μm TE/mg의 ORAC 를보였으며, 80% 에탄올 3시간추출물은 3,158 μm TE/mg으로 ORAC가증가하였다. 본연구에서수행된유근피 80% 에탄올 3시간추출물의 ORAC는 Feeney(27) 의논문에서보고된성인하루 ORAC 권장량인 3,000~5,000 ORAC를충족하였다.

6 유근피추출물의항산화활성 1177 에탄올 1시간추출물과유사한 2,242 μm TE/mg의 ORAC 를보였으며, 80% 에탄올 3시간추출물은 3,158 μm TE/mg으로 ORAC가증가하였다. 본연구에서수행된유근피 80% 에탄올 3시간추출물의 ORAC는 Feeney(27) 의논문에서보고된성인하루 ORAC 권장량인 3,000~5,000 ORAC를충족하였다. 따라서이상의결과는유근피추출물의항산화활성은 80% 에탄올로추출하였을때가장높은 DPPH, ABTS 라디칼소거능과환원력을보였으며, 추출시간은라디칼소거능및환원력에크게영향을미치지않는것을보여준다. 그러나 ORAC assay에서는유근피를 80% 로 3시간추출하였을때가장높은활성을보였다. Jung 등 (9) 은유근피를 70% 메탄올로추출하였을때 flavonoid 성분인 (-)-catechin과 (-)-catechin-7-o-β-d-apiofuranoside가높은 DPPH 및 OH 라디칼소거능을보인다고보고하였으며, Bong과 Park(28) 은유근피에서추출한 phenolic 성분인 hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl (1 3)-α-L-rhamnopyranosyl(1 2)-α-L-arabinopyranoside(HDL) 가 ROS 생성과관련된산화효소및항산화효소에대한저해효과를보인다고보고하였다. 따라서유근피의주요항산화활성은 flavonoid 및 phenolic 성분때문인것으로예상된다. 따라서본연구에서는이러한항산화활성의주요성분인 flavonoid 및 phenolic의함량과항산화활성과의연관성을분석하였다. 상관관계분석유근피추출물의총폴리페놀및플라보노이드함량과 DPPH 라디칼소거능, ABTS 라디칼소거능, 환원력및 ORAC와의연관성분석은 Table 3에나타내었다. 유근피추출물의총폴리페놀함량과항산화활성과의연관성은전체적으로 R 2 =0.813~0.976으로높은상관관계를보였다. 특히유근피추출물의총폴리페놀함량과 DPPH 라디칼소거능과의연관성은 R 2 =0.976을보이면서가장높은연관성을보였다. 그러나 ORAC는총폴리페놀함량과의연관성이 R 2 =0.813으로 DPPH 및 ABTS 라디칼소거능과환원력 Table 3. Correlation analysis (R 2 ) between the content of antioxidant compounds and antioxidant activities (DPPH, ABTS, FRAP, reducing power, and ORAC) of U. pumila L. Antioxidant compounds 1) DPPH ABTS Reducing power ORAC TP TF **2) ** ** ** ** ** ** ** 1) TP, total phenol content; TF, total flavonoid content. 2) Significantly different at ** P<0.01. 에비해서는약간낮은연관성을보였다. 한편유근피추출물의총플라보노이드함량과항산화활성과의연관성분석은총폴리페놀함량과유사하게 DPPH 및 ABTS 라디칼소거능, 환원력에서높은연관성을보였으며 (R 2 =0.967~ 0.988), ORAC에서조금낮은연관성 (R 2 =0.826) 을보였다. ORAC가다른항산화활성에비해약간낮은연관성을보이는이유는 DPPH 및 ABTS 라디칼소거능과환원력은 phenolic 화합물에특이적으로반응하는데반해, ORAC 분석법은 phenolic 화합물뿐만아니라 non-phenolic 화합물에도반응하기때문인것으로예상된다 (29,30). 산화적스트레스에의한 HDF 세포에대한세포보호효과유근피추출물이피부섬유아세포와 3T3-L1 전지방세포의세포독성에미치는영향을알아보기위하여유근피 80% 에탄올 3시간추출물을농도별로처리하고 XTT assay 방법으로세포의생존율을측정한결과 (Fig. 2), 100, 200 μg/ml 농도에서독성을나타내지않았다. 따라서본연구에서는유근피추출물의피부섬유아세포에대한세포보호효과및항산화활성을측정하기위하여 100, 200 μg/ ml 농도를이용하여실험을진행하였다. 유근피추출물이 hydrogen peroxide로유도한산화적스트레스상태에서피부섬유아세포의생존율에미치는영향을 XTT assay로측정한결과는 Fig. 2와같다. 피부섬유아세포는 1 mm hydrogen peroxide를처리함으로써처리하지않은군보다유의적으로 40% 정도로생존율이감소한 A B Fig. 2. Effect of U. pumila L. extracts on cell viability (A) and protective effects against oxidative stress-induced damage on human dermal fibroblast (B). a-c Significant differences among different concentration of 80% EtOH extracts.

7 1178 김재민 조명래 서규은 김예슬 정태동 김영현 김단비 신기해 오지원 이종석 이진하 김종예 이대원 이옥환 B A Fig. 3. Effect of U. pumila L. extracts on cell viability (A) and relative reactive oxygen species (ROS) production (B) in 3T3-L1 cells. a-c Significant differences among different concentration of 80% EtOH extracts. 반면, 유근피추출물전처리군에서는산화적스트레스영향에반하여세포생존율이다시증가함을확인하였다. NBT assay 를이용한 ROS 함량 NBT assay는 NBT 용액이지방세포내에축적된 ROS와반응하여 dark blue formazan을생성하게되며, 이를용출하여세포내 ROS의생성량을알수있다. 이러한산화적스트레스는지방세포의분화및지방의축적과밀접한관계를갖는것으로알려져있다 (20,31). 3T3-L1 전지방세포에분화유도물질을처리하여지방세포로분화시킨뒤생성된 ROS 생성량을측정하기위하여 NBT assay를이용하여측정한결과는 Fig. 3과같다. 시료를처리하지않은대조군과유근피추출물의흡광도를비교한결과유근피 80% 에탄올 3시간추출물을 100 μg/ml 농도로처리하였을때 ROS 생성량은약 80% 였으나 200 μg/ml 처리군에서는 27% 로양성대조군인 NAC와유사한수치를나타냈다. 따라서유근피 80% 에탄올 3시간추출물은지방세포에서분비되는 ROS를효과적으로감소시키는것을확인하였다. 요약본연구는유근피를항산화소재로사용하기위한기초자료를제공하고자에탄올의농도 (0, 40, 80% 에탄올 ) 및추출시간 (1, 2, 3시간 ) 이다른조건에서추출하였으며, 이들추출물의총폴리페놀및플라보노이드함량을측정하였다. 또한다양한추출물의 DPPH 라디칼소거능, ABTS 라디칼소거능, 환원력, ORAC value 등의항산화활성을측정하였으며, 총폴리페놀및플라보노이드함량과항산화활성과의연관성을분석하였다. 그결과유근피추출물은 80% 에탄올로 3시간추출하였을때가장높은총폴리페놀및플라보노이드함량과항산화활성을보였다. 또한 DPPH 및 ABTS 라디칼소거능, 환원력은에탄올함량에따른활성차이는보였으나추출시간에따른항산화활성차이는보이지않았다. 하지만 ORAC는유근피추출물의추출시간이증가함에따라함께증가하였다. 이상의결과로볼때유근피추출물은 80% 에탄올을이용하여 70 C에서 3시간추출을할때항산화활성을갖는 phenolic 및 flavonoid 계열의유효성분이가장많이추출되었다. 또한유근피 80% 에탄올 3시간추출물은피부섬유아세포와 3T3-L1 지방세포에서세포독성을나타내지않았고피부섬유아세포에서산화적스트레스에대한세포보호효과를가졌으며, 3T3-L1 지방세포에서활성산소종생성량을감소하였다. 따라서높은항산화력을가진유근피추출물은천연항산화제로충분히사용가능할것으로사료된다. 감사의글 본연구는한국식품연구원식품기능성평가지원사업위탁연구개발과제 ( 과제번호 : C ) 로수행한연구의일부로이에감사드립니다. REFERENCES 1. Dröge W Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 82: Willcox JK, Ash SL, Catignani GL Antioxidants and prevention of chronic disease. Crit Rev Food Sci Nutr 44: Gardner PR, Fridovich I Superoxide sensitivity of the Escherichia coli aconitase. J Biol Chem 266: Cho ML, Lee DJ, Lee HS, Lee YJ, You SG LPS-induced NO inhibition and antioxidant activities of ethanol extracts and their solvent partitioned fractions from four brown seaweeds. Ocean Sci J 48:

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,