, pp. 738-742 고효율바이오물질분리및농축을위한나노필터소자제작 허윤석 * 최봉길 홍원희 한국과학기술원생명화학공학과 305-701 대전광역시유성구과학로 335 * 한국기초과학지원연구원물성과학연구부 305-333 대전광역시유성구과학로 113 (2012 년 2 월 9 일접수, 2012 년 3 월 28 일채택 ) Fabrication of Nano-filter Device for High Efficient Separation and Concentration of Biomolecules Yun Suk Huh*, Bong Gill Choi and Won Hi Hong Department of Chemical & Biomolecular Engineering (BK21 program), KAIST, 335 Gwahangno, Yuseong-gu, Daejeon 305-701, Korea *Division of Material Science, Korea Basic Science Institute, 113 Gwahangno, Yuseong-gu, Daejeon 305-333, Korea (Received 9 February 2012; accepted 28 March 2012) 요 약 본연구에서는알루미나나노템플레이트 (anodic alumina oxide; AAO) 를이용하여신속하면서도효과적으로나노입자및바이오물질을분리, 농축할수있는나노필터소자를개발하였다. 본연구에서사용한나노필터소자는유체의주입및흐름이가능한미세유체채널 (microfluidic channel) 을 PDMS 에패터닝하였다. 위아래로형성된 PDMS 미세유체채널사이로, 다양한크기의나노다공을형성하고있는 AAO 막을삽입하여크기에따른나노입자및바이오물질을분리할수있었다. 위아래로 PDMS 유체채널과 AAO 분리막을집적하고, 최종적으로아크릴레이트플락스틱 (acrylic plastic) 으로전체소자를고정하여나노필터유체소자를제작하였다. 완성된나노필터소자를이용하여나노입자의농축효율및은나노입자가뭉쳐져있는필터존 (filtration zone) 으로부터뎅기바이러스 (dengue virus) 를표면증강라만 (surface enhanced Raman scattering) 분석법에의해검출할수있었다. Abstract Here, we develop a new nanofilter device for the rapid and efficient separation of nanoparticles and biomolecules, exploiting the use of AAO mebrane with ordered nanopores in the range from 20 nm to 200 nm. Briefly, the chip comprises of a series of the upper and lower PDMS channels containing embedded inlet and outlet ports, and 50 µm width microfluidic channel, and AAO membrane to be made the filtering zone. After assembling these components, the acrylate plastic plates were used to fix the device on the top and bottom side. When introducing the samples into the inlet ports of the upper PDMS channel, we were able to separate and concentrate the nanoparticles and target molecules at the filtering zone, and to elute the solutions containing the unwanted materials toward the lower PDMS channels normal to the direction of AAO membrane. To demonstrate the usefulness of the device we apply it to the SERS detection of nucleic acid sequences associated with Dengue virus serotype 2. We report a limit of detection for Dengue sequences of 300 nm and show excellent enhancement of Raman signals from the filter zone of the nanofilter device. Key words: Nanofilter Device, AAO, Concentration, SERS, Dengue Virus 1. 서론 물질을크기에따라분리및농축하는공정은오랜역사를통해발전되어왔으며, 현재까지도이러한기술은화학적공정에서부터생체물질에이르기까지다양하게응용개발되어연구되어지고있다. 보편적으로알려져있는물리적필터링방법은 1900년대초반부터 To whom correspondence should be addressed. E-mail: whhong@kaist.ac.kr 이논문은 KAIST 홍원희교수님의정년을기념하여투고되었습니다. 화학공학자들에의해활발히연구되기시작하여 1970년대에들어이론적체계가준비되기시작했다 [1]. 이러한필터링방법은필터의크기가입자보다크면입자는머무름없이필터를빠져나가게되고, 필터의크기가작으면입자는모두걸러지게되는원리를이용하는것이다. 1990년대들어서나노기술의발전과더불어나노수준의기공을갖는고분자젤이나 track etch 법으로제작된막 (membrane) 이개발되었고, 이를상용화하면서바이오물질및화학물질들을분리, 정제하는과정에널리사용되기시작했다 [1-5]. 최근에는나노기술과 MEMS 기술의발전으로이를단일의유체 738
고효율바이오물질분리및농축을위한나노필터소자제작 739 소자내에나노구조물로패터닝하여적은양의시료만으로도필요로하는물질을신속히분리및정제할수있게되었으며, 이러한기술들을생명공학및의료공학분야에적용하고자하는노력들이활발히이루어지고있다. 또한, 발전된 MEMS/NEMS 기술은보다정밀하게나노구조물을원하는위치에수나노의오차한계로패터닝할수있게되었으며, 이러한기술은미세유체채널과결합되어미세종합분석시스템 (micro total analysis system; µ-tas) 또는랩온어칩 (Lab-on-a-chip) 으로활발히연구되어지고있다 [6,7]. µ-tas는시료채취영역, 미세유체회로, 검출기및이들을제어할수있는제어부 (controller) 로구성된다. 따라서 µ-tas를구현하기위해서는플라스틱이나유리, 실리콘등의표면에용액이흐를수있는미세채널로회로를만들어시료의전처리, 분리, 혼합, 생화학반응, 검출등을하나의칩에소형화, 집적화시킬수있어야한다. 현재까지이러한모든기능이통합된 µ-tas 개발보다는몇가지기능을수행할수있는랩온어칩, 정확한의미로는특정기능을수행하는바이오유체소자 (bio-fluidic device) 분야의개발이활발한실정이다. 특히, 많은연구가특정질병의 DNA 또는단백질표지물질을전기화학, 분광학적인방법들을적용하여검출하는연구에집중되어수행되어졌다. 그러나, 궁극적인 µ-tas 또는랩온어칩의구현을위해서는미세소자내에서시료의전처리단계를신속하면서도효율적으로수행할수있는방법이개발되어져야한다 [8-10]. 본연구에서는시료전처리의중요성이더해지는바이오센서, 바이오칩분야에널리적용될수있는나노필터시스템을개발하는연구를수행하였다. 시료의전처리단계로개발되었던기존의전기영동 (electrophoresis), 유전영동 (dielectrophoresis), 나노구조물을활용한나노필터방법들은미세소자로의구현에있어복잡한공정과고가의공정비용을요구한다. 따라서, 본연구에서는나노수준의다공이형성된상용 AAO 막과미세패턴이형성된 PDMS 유체채널을결합하여나노필터시스템을손쉽게구현할수있었다. 또한, 본연구에서구현된소자를활용하여나노입자의농축및표면증강라만 (surface enhanced Raman scattering; SERS) 분석법을적용하여뎅게열바이러스를검출할수있었다. 2. 실험재료와방법 2-1. 나노필터소자제작나노필터소자는 Fig. 1에서보는바와같이아크릴레이트기판 Poly(methyl methacrylate; PMMA), PDMS (polydimethylsiloxane) 유체채널, 나노크기의기공 (20, 100, 200 nm) 을갖는 AAO 막으로구성되어있다. PDMS 미세유체채널의제작을위하여일반적으로미세패턴을위한소프트리쏘그리피 (soft-lithography) 공정을적용하였다. 구체적으로, SU-8 감광성고분자를이용하여채널의높이를 50 µm로실리콘웨이퍼위에제작후에, PDMS로유체채널을전사하였다. 위아래로유체채널이패터닝되어있는 PDMS를사이에두고, 20 nm 크기의기공을갖고있는 AAO 막을삽입하였다. 최종적으로, 안정적인유체의흐름조절및소자의구동을위하여아크릴레이트기판을이용하여전체소자시스템을고정하였다. 2-2. 나노입자농축실험제작된나노필터소자의농축특성을분석하기위하여, 44 nm 크기의 FITC 형광물질이코팅되어있는 polystyrene beads를이용하였다. 위 Fig. 1. (a) Photo images of nanofilter device by assembling between PDMS fluidic channels and AAO membrane with 20 nm pore size. (Left image: front side view, right image: back side view), (b) Overview of chip fabrication process. 쪽의 PDMS 유체채널주입구를통하여 5 µl/s 유속으로주입하였고, 아래의 PDMS 유체채널출구를통해서는 10 µl/s의유속으로실린지펌프 (syringe pump) 를이용하여용출하였다. AAO 막의기공크기는 20, 100, 200 nm로선정하여농축및분리효율을분석하였다. PS beads의농축및분리효율은시간변화에따라형광이변화되는정도를분석하였다. 2-3. 뎅기열바이러스검출을위한표면증강라만분석뎅기열바이러스의검출을위하여 50 nm 금나노입자 (Nanocs Co., New York, NY) 를이용하여 target DNA를금입자표면에고정화된 capture DNA와 hybridization 반응을통하여분석하였다. 구체적으로, 금나노입자는 10 mm PBS 완충용액 (0.6 M NaCl, ph 7.4) 에최종농도가 0.3 nm이되도록준비하였다. 준비된금나노입자에 thiol 작용기가결합된뎅기열바이러스 serotype 2의 capture DNA (Operon Biotechnologies, Huntsville, AL) 를결합시킨다. 금나노입자의표면에비특이적 (non-specific bining) 결합을방지하기위하여 300 M 6-mercapto-1-hexanol (MCH) 를이용하여금나노입자의표면처리를하였다. 최종적으로, SERS-active dye인 TAMRA가결합된 target DNA ((TAMRA) 5'-TCT AGT CCT TCC AGT GAG ACT ACA GCT TCA TCT CAC CTT G-3') 를금나노입자표면에고정되어있는 capture DNA와 hybridization을통해결합하였다. 이렇게준비된금나노입자를나노필터소자에주입하여필터링존 (filtering zone) 에농 축된 TAMRA 신호를 Raman 분광기를이용하여분석하였다. 라만분석 (NT-MDT spectra, Russia) 은 633 nm 레이져를 1 mw power로분석하였다.
740 허윤석 최봉길 홍원희 3. 결과및고찰 화학적, 생물학적입자의분리및분석을위해미세유체시스템을적용하는것은적은시료만으로도빠른시간안에분석및측정이가능하다는장점을갖는다. 향후이러한마이크로플릭이딕 (microfluidics) 을기반으로한전처리기술들은기존의많은연구가진행되어온분석기술들과결합되어통합분석시스템및랩온어칩의구현에실질적인도움을줄수있을것이다 [9,10]. 이러한필요에따라본연구에서는통합분석시스템의적용을위한나노수준의분리및농축이가능한나노필터소자를구현하였다. 그림 1a에서는최종적으로집적된나노필터소자 (assembled nanofilter device) 의앞면과뒷면의사진을보여주고있다. 본소자는크게위, 아래로유체의흐름이가능한미세유체채널이패터닝된 PDMS와 20 nm 크기의다공을갖는 AAO 막으로구성되어있다. Fig. 1(b) 에서보는바와같이 AAO 막을사이에두고, 시료의주입이가능한위쪽의 PDMS 유체채널이패터닝되어있으며, 아래쪽의 PDMS 채널로는 AAO 막을통해나노입자및표지물질이분리되어용액의용출이가능한미세채널로제작되었다. 최종적으로, 위와아래로아크릴레이트기판을집적하여나노필터소자가안정적으로구동될수있도록지지체역할을할수있도록고정하여나노필터소자를완성하였다. Fig. 3. Time-lapse captured concentration images of 44 nm fluorescent PS particles in the filtration zone bulk. 효율을관찰하였다 (Fig. 3). Fig. 3은시간변화 (0~330 s) 에따라필터존에서 PS beads가농축되는현상을실시간으로분석하였다. 예상한바와같이 20 nm 크기의기공이있는 AAO 막을 44 nm크기의 PS beads는통과하지못하고위쪽의 PDMS 필터존에분리및농축되는현상이관찰되었다. 본연구결과를통해수십나노크기의나노입자및물질을수분내에효과적으로분리및농축이가능한나노필터소자임을확인할수있었다. 3-1. 나노필터소자를이용한농축특성분석결과본연구에서개발된나노필터소자는 Fig. 2(a) 에서보는바와같이미세유체의유속을조절할수있는실린지펌프, 나노입자의형광및라만분석이가능한분광시스템이결합되어있는현미경위에나노필터소자를올려놓고분석하였다. 구체적인나노필터소자의구동은위쪽의 PDMS 유체채널의주입구로 5 µl/s의유속으로 FITC 형광물질이코팅되어있는 44 nm PS beads를주입하였다. 이와동시에 AAO 막의아래쪽에결합되어있는 PDMS 유체채널로는 10 µl/s의유속으로유체를용출하여시료가 AAO 막을통하여나노입자와유체가분리되어농축될수있도록시스템을구동하였다. 위쪽의 PDMS 유체채널과아래쪽의 PDMS 유체채널이겹치는구간인필터존 (filter zone) 에서는 20 nm 크기의 AAO 기공을통하여유체와나노입자가분리및농축되는현상이관찰되었다. Fig. 2(b) 에서보는바와같이국부적인필터존에서나노입자또는표지물질을선택적으로분리및농축할수있다. 본실험에서는 FITC 형광물질이코팅되어있는 44 nm PS beads를주입하여시간변화에따른분리및농축 Fig. 2. (a) Photo-image of experimental setup used the nanofilter device, (b) Schematic illustration of nanofiltration process for the separation and concentration of nanoparticles and biomolecules at the filter zone. 3-2. 표면증강라만분석기술을이용한뎅기열바이러스검출연구위의 PS beads 분리및농축효율실험을통해나노필터소자의성능이검증된바와같이수십나노수준의나노입자및표지물질을신속하면서도선택적으로분리및농축할수있음을확인할수있었다. 이러한소자의특성을이용하여, 뎅기열바이러스의표면증강라만검출연구를수행하였다. 본실험에서표지물질로선정한뎅기바이러스는네가지혈청형 (serotype) 이존재한다. 뎅기열은뎅기열바이러스에감염된사람을물었던모기가다른사람을무는과정에서옮겨져생기는병으로고열을동반하는급성열성질환이다. 또한, 뎅기출혈열은몸에서의출혈현상뿐만아니라혈압이떨어지고다른장기들의기능이저하되는현상이생겨환자가사망에이를수도있는바이러스성질환이다. 본연구에서는뎅기열바이러스의두번째혈청형 (serotype II) 을선정하여표면증강라만검출연구에적용하였다 [11,12]. 표면증강라만산란은금속나노구조에분자가접촉하고있는경우에그분자의라만신호가금속의영향을받아서크게증폭되는현상을이용한것으로기존의라만분광법에비해 10 5 ~10 6 정도의신호증폭효과를얻을수있어 2000년대들어생체물질검출에활발히응용되어지고있다. 금속표면에부탁된분자의라만신호를효과적으로증폭하기위해서는나노입자의크기및거칠기등의조절이중요한인자로작용하게된다 [13-15]. 본연구에서는 50 nm 크기의금나노입자를선정하였고, 입자의표면거칠기를조절하기위하여나노입자들이필터존에서모이는과정에서서로뭉침효과 (aggregation effect) 를이용하였다. 나노입자들이필터존에선택적으로모이게되면서, 입자들은서로근접하게접촉하게되면서날카로운접촉면을형성하게되는데이러한부분을 hot-spot이라부르며라만신호가효과적으로증폭되는지점이다. 보편적으로용액상에분산된나노입자를이용하여라만신호의증폭연구를함에있어서는나노입자들의뭉침효과를얻기위하여여러가지염 (NaCl or KCl) 들을도입하여나노입자들이서로뭉치는효과를활용한다 [16,17]. 본연구에서는추가
고효율바이오물질분리및농축을위한나노필터소자제작 741 에대한신속하면서도고감도로분석할수있는바이오센서칩으로도적극활용될수있을것으로기대된다. 감 사 본논문은한국기초과학지원연구원의지원을받아수행된신진우수연구사업이며이에감사드립니다 (K2009B, 허윤석 ). 참고문헌 Fig. 4. SERS spectra of TAMRA-labelled dengue virus serotype 2 with increasing the concentration times. (a) 0 s, (b) 150 s, (c) 300 s. The concentration of target DNA was 300 nm. 적인염 (salts) 들의도입없이, 나노입자가예측할수있는필터존에국부적으로뭉쳐지는효과를활용하여표면증강라만신호를검출할수있었다. 실험부분에서언급한바와같이 TAMRA가결합된 target DNA를 hybridization을통해형성된, 금나노입자를미세유체의주입구로넣어준다. 0.3 nm의금나노입자를시간변화에따라필터존에서라만분광신호를분석하였다. Fig. 4에서보는바와같이시료가도입되기전인초기의필터존으로부터는라만신호가관측되지않았다. 150초가지난후, 필터존으로부터라만신호를측정한결과 Fig. 4(b) 에서보는바와같이 TAMRA에해당하는라만신호가관측되었다. 300초가흐른후, 다시필터존에뭉쳐져있는금나노입자로부터표면증강라만신호를검출한결과 Fig. 4(c) 와같이약 2배이상의라만신호의강도가증가함을확인할수있었다. 이러한결과로부터본연구에서개발한나노필터소자를이용하여저농도로존재하는나노입자를선택적으로분리및농축을수행할수있었으며, 필터존에서나노입자의국부적인뭉침효과를이용하여표면증강라만신호를효과적으로검출할수있었다. 4. 결론 랩온어칩을구현함에있어, 미세유체흐름을기반으로하는시료전처리기술개발의중요성이더해지는바이오센서, 바이오칩분야에널리적용가능한나노필터소자를본연구에서는구현하였다. 나노수준의기공을갖는 AAO 막을이용하여미세유체흐름이가능한 PDMS 채널을위, 아래로집적하여나노필터소자를제작하였다. 이렇게개발된나노필터소자를이용하여 44 nm PS beads를시간변화에따라분리및농축효율을분석하였다. 또한, 저농도뎅기열바이러스의신속한검출을위하여나노필터소자에주입된시료용액으로부터 50 nm 금입자만을선택적으로분리하고, 필터존에국부적으로뭉쳐져있는금나노입자로부터증폭된표면증강라만신호를성공적으로얻을수있었다. 따라서, 본연구를통해개발된나노필터소자는향후, 나노입자및물질을선택적으로분리, 농축할수있는랩온어칩의시료전처리기술로활용될수있을것이다. 또한, 신속한표면증강라만신호검출결과를통해, 본소자가특정질병및표지물질 1. Deen, W. M., Hindered Transport of Large Molecules in Liquid-filled Pores, AIChE J., 33, 1409-1425(1987). 2. Nishizawa, M., Menon, V. P. and Martin, C. R., Metal Nanotubule Membranes with Electrochemically Switchable Ion-Transport Selectivity, Science, 268, 700-702(1995). 3. Jirage, K. B., Hulteen, J. C. and Martin, C. R., Nanotubule- Based Molecular-Filtration Membranes, Science, 278, 655-658 (1997). 4. Che, G., Lakshmi, B. B., Fisher, E. R. and Martin, C. R., Carbon Nanotubule Membranes for Electrochemical Energy Storage and Production, Nature, 393, 346-349(1998). 5. Lee, S. B., Mitchell, D. T., Trofin, L., Nevanen, T. K., Soderlund, H. and Martin, C. R., Antibody-Based Bio-Nanotube Membranes for Enantiomeric Drug Separations, Science, 296, 2198-2200(2002). 6. Fu, J., Mao, P. and Han, J., Nanofilter Array Chip for Fast Gelfree Biomolecule Separation, Appl. Phys. Lett., 87, 263902-263902-3(2005). 7. Fu, J., Yoo, J. and Han, J., Molecular Sieving in Periodic Free- Energy Landscapes Created by Patterned Nanofilter Arrays, Phys. Rev. Lett., 97, 018103-018106(2006). 8. Park, S., Huh, Y. S., Craighead, H. G. and Erickson, D., A Method for Nanofluidic Device Prototyping Using Elastomeric Collapse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 15549-15554(2009). 9. Huh, Y. S., Choi, J. H., Park, T. J., Hong, Y. K., Hong, W. H. and Lee, S. Y., Microfluidic Cell Disruption System Employing a Magnetically Actuated Diaphragm, Electrophoresis, 28, 4748-4757(2007). 10. Lee, E. Z., Huh, Y. S., Jun, Y. S., Won, H. J., Hong, Y. K., Park, T. J., Lee, S. Y. and Hong, W. H., Removal of Bovine Serum Albumin Using Solid-phase Extraction with In-situ Polymerized Stationary Phase in a Microfluidic Device, J. Chromato. A., 1187, 11-17(2008). 11. Zaytseva, N. V., Montagna, R. A., Lee, E. M. and Baeumner, A. J., Multi-analyte Single-membrane Biosensor for the Serotypespecific Detection of Dengue Virus, Anal. Bioanal. Chem., 380, 46-53(2004). 12. Franz, A. W. E., Sanchez-Vargas, I., Adelman, Z. N., Blair, C. D., Beaty, B. J., James, A. A. and Olson, K. E., Engineering RNA Interference-based Resistance to Dengue Virus type 2 in Genetically Modified Aedes Aegypti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4198-4203(2006). 13. Lowe, A. J., Huh, Y. S., Strickland, A. D., Erickson, D. and Batt, C. A., Multiplex Single Nucleotide Polymorphism Genotyping Utilizing Ligase Detection Reaction Coupled Surface Enhanced Raman Spectroscopy, Anal. Chem., 82, 5810-5814(2010). 14. Brown, R., Smith, W. E. and Graham, D., Synthesis of a Ben-
742 허윤석 최봉길 홍원희 zotriazole Phosphoramidite for Attachment of Oligonucleotides to Metal Surfaces, Terahedron Lett., 42, 2197-2200(2001). 15. Cao, Y. C., Jin, R. and Mirkin, C. A., Nanoparticles with Raman Spectroscopic Fingerprints for DNA and RNA Detection, Science, 297, 1536-1540(2002). 16. Huh, Y. S., Chung, A. J., Cordovez, B. and Erickson, D., Enhanced on-chip SERS Based Biomolecular Detection Using Electrokinetically Active Microwells, Lab Chip, 9, 433-439(2009). 17. Abu-Hatab, N. A., John, J. F., Oran, J. M. and Sepaniak, M. J., Multiplexed Microfluidic Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, Appl. Spectrosc., 61, 1116-1122(2007).