대사생화학 (1)- Week6 Chapter 17: 시트르산회로 (TCA cycle, Krebs cycle, Citric acid cycle, 구연산회로 ) * 호기적호흡으로에너지를얻는생물들에서연료분자 ( 포도당등 ) 들로부터추출되는대부분 의 ATP (90% 이상 ) 는해당과정이아닌 TCA cycle 로부터다 시트르산회로는고에너지전자들을수확한다 *TCA cycle 자체는산소를반응물로포함하지도않고많은양의 ATP도직접발생하지도않으며다만연료분자들에들어있는 ( 직접적으로는 acetyl기에들어있는 ) 전자들을빼낸다. 이를위하여이회로에는 NAD + 나 FAD를조효소로사용하는여러 dehydrogenase들 ( 탈수소효소들 ) 이참여한다. 그리하여 NADH나 FADH 2 의형태에들어있는전자들을고에너지전자들이라하는이유는이들전자들은전자전달사슬의다음전자받게들에게이동할려는포텐셜이강하기때문이다 (ATP 속의바깥인산기와동일한성질 ). 그러니호기성호흡에서의전자들의흐름을보면연료분자 ( 직접적으로는 acetyl 기 ) NADH or FADH 2 전자전달사슬 (complex I, II, III, IV) O 2 이다. 전자가전자전달사슬을통하여전달되는동안미토콘드리아막의안팎에양성자농도기울기 (proton gradient) 가생성되고이것이 proton-motive force (PMF) 라는 universal energy 형태인데이에너지를이용하여 ADP의인산화반응이촉매되어 (by ATP synthase) ATP가생성. 이 ATP 생성과정을 산화적인산화 (oxidative phosphorylation) 라하고연료분자들의산화와 ATP의생성을이처럼 proton gradient라는연결고리로설명한가설을 화학삼투가설 (chemiosmotic hypothesis ) 라한다 17.1 피루브산탈수소효소는해당을시트르산회로에연결시킨다 *Pyruvate (from glycolysis) + CoA + NAD + acetyl CoA + CO 2 + NADH + H + (by pyruvate dehydrogenase complex, PDH) * 이반응은해당과정과 TCA cycle 을연결시킨다 * 이반응을촉매하는 PDH 는 3 개의효소 (E 1, E 2, E 3 ) 와 5 개의조효소 (thiamine pyrophosphate=tpp, lipoamide, FAD, CoA, NAD + ) 로이루어진효소복합체이다. 효소작용메커니즘 : 피루브산으로부터 acetyl CoA 를합성하는데세가지효소와다섯가지조효 소가필요하다 * 반응의단계들및기작 : 1. 탈카르복실화 (decarboxylation) 피루브산 + E 1 -TPP (Vit-B1 의조효소형태 ) 의탄소음이온 (carbanion) 히드록시메틸 -TPP-E 1
2. 산화 ( 및 E 1 의재생 ) 히드록시메틸 -TPP-E 1 + lipoamide-e 2 E 1 -TPP + acetyllipoamide-e 2 3. Acetyl CoA 의형성 Acetyllipoamide + Coenzyme A (CoA) Acetyl CoA + dihydrolipoamide-e 2 4. 산화형 lipoamide (E 2 ) 의재생 Dihydrolipoamide +FAD-E 3 lipoamide-e 2 + FADH 2 -E 3 5. FAD-E 3 의재생 FADH 2 -E 3 + NAD + FAD-E 3 + NADH 유연한연결들때문에 lipoamide 는여러활성부위들사이를오갈수있다 *3 종류의효소들이구조적으로통합하여하나의 complex를만든후길고융통성있는 lipoamide의 arm을이용하여복잡한반응들을협동적으로촉매할수있다. 이처럼두가지이상의효소들이하나의 complex를이루어 ( 일반적으로비공유결합들에의해이루어짐 ) 근접해있으면전체반응의속도도높일수있고부반응들 (side reactions) 을최소화할수있다 17.2 시트르산회로는이 - 탄소단위 (two carbon unit, 즉 acetyl unit) 를산화한다 시트르산생성효소는옥살아세트산 (OAA) 과아세틸 CoA 로부터시트르산 ( 구연산 ) 을형성한다 *OAA + acetyl CoA (citryl CoA: 중간체 =intermediate) citrate (by citrate synthase) * 효소작용기작 : 순차적이고질서있는반응속도론적 (sequential, ordered bi-bi kinetics) 반응이다. 즉, OAA가먼저효소의 active site에결합하면효소단백질의 structural change가생기고그결과두번째기질인 acetyl CoA가결합할결합부위가생긴다 (induced fit의한예 ). 이렇게됨으로써쓸데없이미리 acetyl CoA가먼저붙음으로써야기될수있는 acetyl CoA의가수분해부반응을방지할수있다. Acetyl CoA의결합후곧바로중간체인 citryl CoA가생성되고이중간체의생성후에효소의추가적인구조변화가일어나면서 citryl CoA의가수분해반응에적합한구조가됨으로써 acetyl CoA의가수분해반응이방지되기도한다. 생성물인시트르산이먼저효소를떠난후 CoA가뒤이어효소를떠난다 (ordered bi-bi). 이가수분해반응의촉매에결정적인역할을하는아미노산잔기들은 citryl CoA가생기기전까지는촉매에적합한위치에놓이지않음으로써 ( 즉, 구조변화가일어나지않음으로써 ) 잠시동안이더라도구조가비슷한기질인 acetyl CoA의가수분해부반응을억제한다. 결국유도적합 (induced fit) 이원하지않는부반응이일어나는것을막아주는셈이다. 이효소의촉매기작을전체적으로보면효소는기질들을서로가깝게가져오고 (proximity),
그들의배향을알맞게하며 (orientation), 기질들의결합들을분극 ( 편극, polarizing) 시켜친핵공격 을용이하게하고또한효소의활성부위아미노산들이일반산및염기로써작용해줌으로써 (general acid-base catalysis) 이축합반응을촉매하는것을볼수있다. 시트르산은이소시트르산으로이성질화된다 *Citrate (cis-aconitate: 중간체 ) Isocitrate (thru dehydration & rehydration steps catalyzed by aconitase) *Aconitase 는 4 개의철원자가 heme 이아닌무기황 (inorganic sulfide) 과효소의 cysteine 의 S 에연결되어있는 iron-sulfur protein ( 철 - 황단백질또는비헴성철단백질 =non-heme iron protein) 의일종이다 *Aconitase 는 stereospecificity 가있어시트르산의 dehydration 반응시 pror arm, pros arm 중 의어느한쪽 arm 에있는 pror, pros hydrogen 중에서 어느한쪽의 hydrogen 을정확히구별하여 뽑아내고다시 H 와 OH 를집어넣는 rehydration 시에도 re, si face 를정확하게구별하여 trans 로집 어넣음으로써반드시 (2R,3S)-isocitrate 만을생성한다. 이소시트르산은산화되고탈카르복실화되어서 α- 케토글루타르산 (α-ketoglutarate) 이된다 *Isocitrate + NAD + (Oxalosuccinate=OAA) α-kg + CO 2 + NADH (by isocitrate dehydrogenase) Succinyl CoA 는 α-kg 의산화적탈카르복실화반응으로생성된다 *α-kg + NAD + + CoA Succinyl CoA + CO 2 + NADH (by α-ketoglutarate dehydrogenase complex) * 이반응을촉매하는효소는 pyruvate dehydrogenase complex 와같이 3 개의효소와 5 개의 조효소로이루어져있다 (3 개의효소이름은기질이다르므로다르지만 5 개의조효소는동일하다 ). Succinyl CoA 로부터높은인산기이동포텐셜을가진화합물이생성된다 *succinyl CoA + Pi + GDP Succinate ( 숙신산 ) + CoA + GTP (by succinyl CoA synthetase. 효 소의이름은역반응에서왔음을알수있다 ) *TCA cycle 에서유일하게기질수준의인산화 (substrate-level phosphorylation) 에의해 ATP (GTP) 가생성되는반응이다. GTP 는 nucleoside diphosphate kinase 에의해촉매되는다음반응에 의해쉽게 ATP 로전환가능 GTP + ADP GDP + ATP * 효소의촉매작용기작 : Succinyl CoA 에존재하는고에너지결합의일종인 thioester 에들어있
는에너지는인산기이동포텐셜로전환된다. 우선무기인산이 succinyl CoA 를친핵공격하여고에 너지인산화합물인숙신산인산이생긴후인산기는뒤이어효소의 active site 에있는 histidine 잔기 에붙었다가 GDP (ADP) 로이전되어 GTP (ATP) 가생성되고숙신산이생성된다 - 기질수준의인산화 * 대장균숙시닐 CoA 합성효소는두개의 αβ heterodimer ( 이형이합체 ) 두개가연결된 α 2 β 2, 즉 이형 4 합체 (heterodimeric tetramer) 의 4 차구조를가진다 옥살아세트산 (OAA) 은숙신산의산화로재생된다 * 숙신산으로부터 OAA 의재생은다음의연속된반응들에의해이루어진다 : 1. Succinate + FAD Fumarate + FADH 2 (by succinate dehydrogenase): 숙신산탈수소효소는철-황단백질이며 FAD를조효소 ( 보결그룹 ) 로사용한다. 이효소는미토콘드리아의내막에박혀있으며전자전달복합체 II의일부이기도하다. 다른 TCA cycle 효소들은모두미토콘드리아의내부공간인기질 (matrix) 에존재한다. 2. Fumarate + H 2 O Malate (by fumarase): 푸마르산수화효소 (fumarase) 는대칭구조인기질 fumarate의 re face와 si face를정확히인식하여 H와 OH를정확하게 trans로부가함으로써항상 L-malate가생성되도록 stereospecific하게촉매한다. 탄소원자에결합한 4개의원자 ( 단 ) 중 2 개가동일하여 ( 예를들면 2개의수소원자가결합 ) 현재상태로는 achiral이나그중하나의원자를다른원자 ( 단 ) 으로치환할경우 chiral center가되는탄소혹은 center를 prochiral carbon 혹은 prochiral center라한다. 그런데효소와같은 chiral compound는이동일한두수소원자를구별하여그중의하나와만반응할수있다. 이런경우효소는 stereospecificity ( 입체특이성 ) 를가진다고한다. 이때효소가다르게구별하는두개의수소원자를각각 pro-r, pro-s라고명명하는데그것은특정수소원자를중수소원자 (deuterium, D) 로치환한후에 R, S configuration을보았을때 R이되면치환전의그수소는 pro-r이라하고 S가되면 pro-s 수소원자라한다. 또한종류의 prochiral compound는이중결합을갖는탄소화합물들이다. 이경우에도현재로는각탄소에결합한원자 ( 단 ) 가 3개씩이므로 achiral이지만이중결합에똑같지않은원자 ( 단 ) 이각각의탄소에부가되고나면 chiral이되기때문에이런경우도 prochiral이된다. 이경우에는이중결합을갖는평면적구조인 prochiral compound의평면의위쪽이나아랫쪽에서원자 ( 단 ) 이부가될수있는데이를 위쪽, 아래쪽 으로표현하지않고 re face, si face라칭한다. re face라함은이중결합을가지는탄소원자에결합된 3개의원자 ( 단 ) 들의원자량이감소하는순서가시계방향이되도록바라보는면을 re face라하며시계반대방향으로돌아가도록바라보는면을 si face라한다. 푸마르산은이중결합을가지는 prochiral compound이고푸마르산수화효소인 fumarase는물의 H와 OH를푸마르산에부가할때두원자 ( 단 ) 를각기다른 face ( 하나의탄소에서는 re face, 다른하나에서는 si face) 에서부가시킴으로써 (trans addition) 생성물도반드시 L(S)-malate가되도록 stereospecific한 hydration 반응을촉매한다
3. Malate + NAD OAA + NADH + H + (by malate dehydrogenase) 시트르산회로는높은이동포텐셜을갖는전자들, GTP, 그리고 CO 2 를생산한다 * 시트르사회로의알짜반응은 : Acetyl CoA + NAD + + FAD +ADP + Pi + 2 H 2 O 2 CO 2 + 3 NADH + FADH + ATP + 2H + + CoA * 방사능원소표지법연구에의하면 TCA cycle 로들어오는 acetyl 기의두탄소원자들은바로 그회로에서는이산화탄소로나가지않고그다음번의회로들에서빠져나가는것으로밝혀졌다. * 시트르산회로효소들은서로물리적으로결합되어있다 ( 여기서 결합 이라함은주로비공유결합등을통한느슨한묶음형태- 영어로는 associate되었다 로표현 ) 는증거들이많아지고있다. 이처럼하나의대사경로효소들이필요할경우잠시물리적으로묶여하나의일시적인다효소복합체를이룰때이를 metabolon ( 대사단위체 ) 라부르는데이는공통으로전사되는유전자들의묶음체인 operon 에서패러디하여만들어진말이다. 효소들이 metabolon을형성하면효소들의활성부위들사이의통로로기질들이이동하여순차적으로이용되기때문에 ( 기질통로, substrate channeling) 반응속도가빨라지고, 부반응이나생성물들의가수분해등의부작용을최소화할수있는장점이있다 * 후에전자전달사슬을통하여 NADH 와 FADH 2 속의전자들이산소분자에까지전달되면 NADH 한분자당 2.5 ATP, FADH 2 한분자당 1.5 ATP 가생성된다 * 시트르산회로에서분자상의산소 (O 2 ) 가직접회로에참여하지는않지만이회로는호기성조건에서만일어나는데그이유는이회로의효소들에조효소로사용되는 NAD +, FAD들이 NADH 와 FADH 2 로부터산소분자에게로전자전달이일어날때만재생되기때문이다. 반면에해당은호기성조건과혐기성조건모두에서일어날수있다.