Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 4, pp. 391-397 pissn 0440-2413 DOI https://doi.org/10.7845/kjm.2016.6057 eissn 2383-9902 Copyright c 2016, The Microbiological Society of Korea Review Clostridium 속미생물대사공학을통한 butanol 생산 우지은 1 김민지 1 노현지 1 황누리 1 김진효 1 이상엽 2 장유신 1 * 1 경상대학교농업생명과학원, 2 한국과학기술원생명화학공학과 Metabolic engineering of the genus Clostridium for butanol production Ji Eun Woo 1, Minji Kim 1, Hyeon Ji Noh 1, NuRi Hwang 1, Jin-Hyo Kim 1, Sang Yup Lee 2, and Yu-Sin Jang 1 * 1 Institute of Agriculture & Life Science (IALS), Department of Agricultural Chemistry and Food Science Technology, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Republic of Korea 2 Metabolic and Biomolecular Engineering National Research Laboratory, Department of Chemical and Biomolecular Engineering (BK21 plus program), Bioinformatics Research Center, BioProcess Engineering Research Center, Center for Systems and Synthetic Biotechnology, KAIST, Daejeon 34141, Republic of Korea (Received September 23, 2016; Revised October 11, 2016; Accepted October 12, 2016) ABSTRACT: Clostridium is a genus of Gram-positive, rod shape, spore-forming obligate anaerobe. Recently, Clostridium has been attracted as a host for bio-based chemical production, due to its diversity of substrate utilization and the production ability for metabolites which can be used as a building block for chemical production. Especially, butanol produced from Clostridium has been considered as an alternative fuel. As a transportation fuel, butanol has a higher energy density and lower hygroscopicity compared to ethanol, the first generation biofuel. Recently, metabolic engineering of Clostridium has been massively conducted for butanol production. In this study, the metabolic engineering strategy of Clostridium for butanol production has been reviewed with a brief perspective. Key words: Clostridium, acetogen, butanol, metabolic engineering 최근화석연료의과다사용으로인하여지구온난화와같은기후변화가발생하고있으며, 화석연료또한가까운시일내에고갈될것으로예상되고있다. 전세계적으로기후변화및화석연료의고갈을대비하기위하여많은노력을기울이고있다. 바이오화학및바이오에너지분야가대두되는것또한앞서언급한노력의결과이다. 이러한관점에서 butanol은바이오화학산업및차세대수송용연료산업에서중요하게고려되고있다. Butanol 은에너지밀도가높아연료로서특성이 gasoline과거의유사하기때문에차세대수송용연료로도입지를확고히하고있다. 그리고화학용매및주요화합물합성의전구체로사용되고있다. 현재대부분 butanol은석유화학공정으로부터만들어지고있으며, 아주소량만이생물공정을통하여생산되고있다. 생물공정에서는 butanol 생합성대사회로를가지는 Clostridium 속미생물들을이용하고있다 (Jones and Woods, 1986). 산생 *For correspondence. E-mail: jangys@gnu.ac.kr; Tel.: +82-55-772-1964; Fax: +82-55-772-1969 성기 (acidogenic phase) 및용매생성기 (solventogenic phase) 와같은 biphasic 특성을나타내는 Clostridium 속미생물들은산생성기때에는 acetic acid와 butyric acid를생합성하고용매생성기동안은 butanol을포함하여 acetone 및 ethanol을생합성하는것으로잘알려져있다 (Jang et al., 2014a, 2014b). Biphasic 특징을가지는 Clostridium 속미생물에는 Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum 등이있다. 특히, C. acetobutylicum은 1910년대에 butanol 및 acetone의산업적생산을위한발효공정에사용된미생물이다 (Moon et al., 2016). 하지만, 자연에서분리한야생형 Clostridium 속미생물은경제성있는 butanol 생산성을담보하지않는다. Butanol 생산성을향상시키기위하여발효및분리정제에대한수많은연구들이오랜기간동안수행되었다 (Friedl, 2016; Li et al., 2016). 대사공학을통한연구에있어서는대사공학을위한도구들의미비와함께 biphasic 특성을가지는복잡한대사흐름으로인하여우수한균주들을개발하기에많은어려움
392 Woo et al. 이있었다 (Jang and Lee, 2015; Chen and Liao, 2016). 최근, 대사공학을위한다양한도구의개발과대사회로의재해석등을통하여 butanol의대량생산을위한 solventogenic Clostridium 의대사공학이활발히진행되고있다 (Cho et al., 2015; Liao et al., 2016). 또한, Clostridium tyrobutyricum과같은 acidogenic Clostridium을대사공학적으로개량하여 butanol을생합성하는연구와더불어이산화탄소, 일산화탄소, 수소와같은합성가스 (syngas) 로부터 butanol을생합성하기위한대사공학전략도개발되어보고되었다 (Yu et al., 2011, 2012). 본총설에서는 Clostridium 속미생물을 (1) solventogenic, (2) acidogenic, 그리고 (3) acetogen으로구분하고, 이들이가진대사회로및 butanol 증산을위한대사공학전략을리뷰하였다. 또한, 향후 butanol 생합성향상을위한대사회로최적화전략을전망하였다. Butanol 생산을위한대사회로 Clostridium 속미생물은지난 100년동안 butanol 및 acetone 생산을위하여사용되었다. 1900년대초의연구에서는 Clostridium 속미생물의 butanol 생합성경로를알수는없었으나유기산이생산된이후에 butanol 및 acetone과같은용매가생산된다는것은잘알려져있었다. 유기산생합성및용매생합성에관 여하는유전자들에대해서일부밝혀진후, 전체 genome 정보들이밝혀져정확한 butanol 생합성대사회로에대해서정의되었다 (Fig. 1). Glucose를대사하여최종산소호흡을통하여 ATP를확보하는호기성미생물의대사와달리, Clostridium 속의혐기성미생물들은 acetic acid 및 butyric acid를생합성함으로써 ATP를확보하는것으로알려져있다 (Jones and Woods, 1986). 이미잘알려진것과같이, Clostridium은해당과정을거쳐 1몰의 glucose로부터 2몰 ATP, 2몰 pyruvate, 2몰 NADH 를생산한다. 호기성호흡대비부족한 ATP는산생성기동안 acetic acid와 butyric acid 생합성과정에서보충하는것으로알려져있다 (Fig. 1). Acetic acid 생합성대사회로를이용하게된다면, acetyl CoA 분자당 1몰의 ATP 생합성이가능하지만, butyric acid 생합성대사회로를이용하는경우는 0.5몰의 ATP 만을생합성한다 (Fig. 1). ATP 생산측면에서만본다면, butyric acid 생합성경로보다 acetic acid 생합성경로를이용하는것이더유리하다고판단할수있다. 하지만, 산생성기동안 NAD + 재생및산화 / 환원균형을맞추기위해서는 butyric acid 생합성경로의활용도필요한것으로알려져있다. Butyric acid 생합성경로는 2몰의 acetyl CoA로부터 2몰의 NADH를소비하여 2몰의 NAD + 를재생가능하기때문이다. Solventogenic Clostridium의중심대사회로를살펴보면, 1몰의 glucose로부터 4몰의 NADH가생합성된다. Glycolysis를통하여만들어진 2몰의 NADH를제외하고, 추가적으로 pyruvate-ferredoxin Fig. 1. Representative metabolic pathway of the solventogenic clostridia for butanol production. Enzymes encoded by the genes are as follows: ack, acetate kinase; thl, acetyl-coa acetyltransferase (thiolase); pta, phosphotransacetylase; adhe1, aldehyde/alcohol dehydrogenase 1; adhe2, alcohol dehydrogenase 2; hbd, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase; crt, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase (crotonase); bcd, butyryl-coa dehydrogenase; buk, butyrate kinase; ptb, phosphotransbutyrylse; ctfab, CoA transferase. 미생물학회지제 52 권제 4 호
Clostridium 속미생물대사공학을통한 butanol 생산 393 oxidoreductase의활성을통하여 2몰의 pyruvate가 2몰의 CO 2 와 2몰의 acetyl CoA로전환되는과정에서 2몰의 NAD(P)H가만들어지는것으로알려져있다. 따라서, 산생성기동안은세포내에서적절한 NADH/NAD + 비율을유지하기위해서 ATP 생산측면에서는수율이낮지만 butyric acid 생합성경로를활용하여산화 / 환원균형을맞추는것으로알려져있다. 산화 / 환원조절을위한또다른경로는 hydrogenase를이용하는것이있다. Hydrogenase를이용하여 NAD(P)H를산화시켜수소생산과동시에 NAD(P) + 로재생시킬수있지만, 이대사회로를이용할경우는 ATP 생산에전혀이득은없다 (Fig. 1). 한편, C4 화합물인 butanol 생합성은 acetyl CoA 두분자의축합반응으로부터시작된다고할수있다 (Fig. 1). 이반응은 thiolase에의해서매개되는반응이며, 최근연구에따르면 thiolase가산생성기에서용매생성기로의전환에관여하는것으로알려져있다 (Kim et al., 2015). Acetyl CoA 두분자의축합반응으로만들어진 acetoacetyl CoA는두가지의대사경로를통하여대사될수있다. 한경로에서는 acetoacetyl CoA가환원되어 3-hydroxybutyryl CoA로전환될수있으며, 이반응은 hydroxybutyryl CoA dehydrogenase에의해서매개된다. 나머지경로는 acetic acid 및 butyric acid를세포내부로재흡수후, acetyl CoA 및 butyryl CoA를생합성하는과정에서 CoA 공여체로서역할을하는것이다. 이경로로계속대사되면최종적으로 acetone이생합성된다. 또한, 3-hydroxybutyryl CoA는 crotonyl CoA를거쳐최종 butyryl CoA로환원되어 aldehyde/alcohol dehydrogenase를통하여 butanol로전환된다. Butanol 증산을위한 solventogenic clostridia 대사공학전략 Butanol 증산을위한대사공학연구에가장많이활용된균주는 C. acetobutylicum과 C. beijerinckii 이다. C. acetobutylicum 은 butanol 생합성대사회로를가지는가장대표적인미생물이며, genome 서열또한 solventogenic Clostridium 중가장먼저밝혀졌다 (Hou et al., 2013). 이를기반으로유기산생합성대사에관여하는유전자들 (pta 및 buk) 을상동성재조합 (homologous recombination) 기법으로 knockout 시키는대사공학전략을수립하였다 (Ventura et al., 2013). Acetic acid 생합성경로에관여하는 phosphotransacetylase를암호화하는 pta 유전자를 knockout 시킨균주는 butanol 생합성능력이향상되지않았으나, butyrate kinase를암호화하는 buk 유전자를 knockout한경우는 butanol 생합성능력 (10.8 g/l, ph 5.5 발효조건 ) 이야 생형 (9.7 g/l, ph 5.5 발효조건 ) 대비증가하는결과를나타내었다 (Green et al., 1996). 다른연구에서는 butanol 생합성을위한최적조건 (ph 5.0) 에서 batch 발효를수행하여 16.7 g/l butanol을생산하였다 (Harris et al., 2000). Butyric acid 생합성에관여하는주요유전자 (buk) 가 knockout 되었음에도불구하고여전히 butyric acid의생합성은계속되는것으로보고되었다 (Harris et al., 2000; Ventura et al., 2013). 그이유는아직까지정확히밝혀져있지않으나, 잘알려지지않은 isozyme 또는 acyl CoA를기질로이용가능한잘알려지지않은효소들의영향으로추정된다. 상기보고이후 2010년대초까지, butanol 생산을향상시킨 solventogenic Clostridium 대사공학전략은보고된바없다. 최근 mobile group II intron을이용한유전자 knockout 기법이 Clostridium 속미생물에성공적으로도입됨에따라 pta 및 buk 유전자 knockout의재연뿐만아니라, 유기산생합성경로에있는또다른유전자인 ack 및 ptb 유전자 ( 각각 acetate kinase 및 phosphotransbutyrylase 암호화 ) 의 knockout도시도되었다. Mobile group II intron을이용하여만들어진 pta 또는 buk 유전자가각각 knockout된돌연변이들의경우도모두 acetic acid와 butyric acid의생합성을막지는못하는것으로보고되었다 (Cooksley et al., 2012; Jang et al., 2012; Kuit et al., 2012). 그이유에대해서는아직까지정확히밝혀진바없어서, 향후연구가더욱진행되어야할분야이다. Mobile group II intron 을이용하여 pta 유전자를 knockout한균주는상동성재조합을통하여만들어진균주와달리 butanol 생산성이 17.2 g/l까지향상되는것으로보고되었다 (Jang et al., 2012). Acetic acid 및 butyric acid 생합성경로를형성하는효소들을암호화하는 pta, ack, ptb, buk 유전자의 single knockout 전략을통하여만들어진균주들은 batch 발효에서농도및수율은 17.2 g/l 및 0.21 g/g glucose를상회하지는못하는것으로보고되었다 (Cooksley et al., 2012; Jang et al., 2012; Kuit et al., 2012). 획기적인 butanol 생산농도및수율향상은 butanol 생합성경로를간접경로와직접경로로나누어분석하여직접경로를강화시킴으로써달성할수있었다. 유기산생합성경로를거치지않고, acetyl CoA로부터 butyryl CoA로 cascade 반응을거친후, butanol이합성되는경로를직접경로, 유기산생합성경로를돌아서 butanol이만들어지는경로를간접경로로구분하였다. 이러한 butanol 생합성경로모델은 metabolic flux 분석및 mass balance 분석을통하여확립하였으며, 이를기반으로직접경로가강화되는방향으로대사흐름을조절하여 butanol 농도와수율을향상시킨것으로보고되었다 (Jang et al., 2012). 해당보고에서는 pta 및 buk 유전자를동시에 knockout한후, point Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 4
394 Woo et al. mutation 으로만들어진돌연변이 aldehyde/alcohol dehydrogenase 를암호화하는 adhe1 D485G 유전자를증폭시키는대사공학전략을보고하였고, 이균주는 batch 발효에서 butanol 농도 18.9 g/l 및 0.29 g/g glucose 수율을나타낸바있다 (Jang et al., 2012). Butanol을흡착할수있는모듈을이용한연속발효공정에서는 130 g/l butanol 농도와 0.31 g/g의수율을나타내었다 (Jang et al., 2012). 또한, 최근 acetyl CoA로부터 butyryl CoA로전환을위한 4개의효소 thiolase, 3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase, crotonase, butyryl CoA dehydrogenase를암호화하는유전자인 thl, hbd, crt, bcd와 adhe1, ctfab 유전자를모두과발현하고, acetone 생합성에관여하는 adc 유전자를 knockout하는대신 glutathione 생합성을위한대장균의 gshab 유전자를도입하는대사공학전략이보고되었다 (Hou et al., 2013). 해당연구에서는 batch 발효결과, butanol 14.9 g/l를생산하였으며 0.34 g/g glucose 수율을보고하였다 (Hou et al., 2013). 상기두연구모두유기산생합성경로를이용한 butanol 생합성을최소화하기위한전략을공통으로적용하였으며, NADH와같은세포내의 redox 공급을원활히하기위한전략을사용하였다. Jang 등 (2012) 의경우는, aldehyde/alcohol dehydrogenase 의 NADH-조효소특이성을 NADH뿐만아니라 NADPH까지조효소로사용가능하도록효소공학적기법으로효소를개량하였으며, Hou 등 (2013) 의경우는, 세포내의 redox 조절에기여하는 glutathione을생합성할수있는유전자를도입하여더욱원활한산화 / 환원반응을유도한것으로설명할수있다. 따라서, C. acetobutylicum을이용한 butanol 증산목적의대사공학을위해서는 butanol 생산을위한직접경로의강화와함께원활한산화 / 환원이가능하도록해야할것으로보인다. Butanol 생합성직접경로의강화가아닌 butanol 증산을위한대사공학전략은 6-phosphofructokinase를암호화하는 pfka 와 pyruvate kinase를암호화하는 pyka 유전자를동시에과발현시키는방법이보고되었다 (Ventura et al., 2013). 이들 pfka 및 pyka의과발현은세포내의 ATP 및 NADH 농도를증가시키고 butanol 독성에대한저항성을높여주는것으로보고되었다 (Ventura et al., 2013). 해당보고에서는, C. acetobutylicum 을이용한 batch 발효에서최고농도인 19.1 g/l butanol이생산되었으나, 수율은 0.21 g/g glucose로비교적낮은값을보고하였다 (Ventura et al., 2013). C. beijerinckii 또한가장활발히연구된 solventogenic clostridia 중하나로알려져있으며, C. acetobutylicum과동일한 CoA의존적대사회로로부터 1-butanol을생합성하는것으로알려져있다. 또한, 유기산생합성경로도거의동일한경로를나타내고있다. 다만, C. acetobutylicum과비교하여 C. beijerinckii의 genome 크기가약 2 Mbp 정도크고, isozyme 들이더많이존재하는특징을가지는것으로알려져있다 (Little et al., 2015). 이러한이유등으로비교적 C. acetobutylicum 보다 C. beijerinckii 를이용한대사공학결과가조금더늦게도출되고있으며, 대사공학을이용한 butanol 생산성또한 C. acetobutylicum을넘어서지못하고있다 (Kim et al., 2015). 유기산생합성에관여하는유전자원들의결실결과도 C. acetobutylicum의결과와일치하는경향을보이고있다. 하지만, 최근다양한 C. beijerinckii 의대사공학을위한도구들이개발되어발표됨으로써향후전망을밝게하고있다. Butanol 생산을위한 acidogenic clostridia 대사공학전략 과거에 acidogenic clostridia는 butanol 생산에있어서 solventogenic clostridia에비하여상대적으로주목을크게받지못했다. 대표적 acidogenic clostridia인 C. tyrobutyricum이 butanol에대하여내성이높다고보고된후, 이를이용한 butanol 생산연구가활발히진행되었다. C. tyrobutyricum은 solventogenic clostridia와달리 butanol을생합성못하고 butyric acid만을생합성하는것으로알려져있다. 최근까지 C. tyrobutyricum의 butyric acid 생합성은 solventogenic clostridia와같이 phosphotransbutyrylase와 butyrate kinase의작용으로생합성이가능한것으로추정되었다. 하지만, 최근 C. tyrobutyricum의전체 genome 분석결과 (Lee et al., 2016), 상기두효소를사용하지않고 cat1 유전자가암호화하는 CoA transferase에의해서 butyryl CoA 와 acetate가 CoA를맞교환하여 butyric acid를생합성하는것으로밝혀졌다 (Fig. 2). C. tyrobutyricum 대사공학은 acetic acid 생합성경로에관여하는효소를암호화하는 ack 유전자를결실하여 butyric acid을증산시키는것이초기연구들의목적이었고, 이를통하여 butyric acid의증산이확인된바있다 (Liu et al., 2006). 이후연구에서는목적화합물을 butyric acid에서 butanol로전환하였으며, 목적을달성하기위하여 C. acetobutylicum의 adhe2 유전자를도입하는전략을취하였다 (Yu et al., 2011). 그결과, mannitol을탄소원으로사용하여 16.4 g/l의 butanol을 0.30 g/g의수율로생산하는것에성공하였다 (Yu et al., 2011). 동일한균주의 glucose를이용한발효결과는 10 g/l 및 0.27 g/g의 butanol 농도및수율을보였다 (Yu et al., 2011). 후속연구에서는 adhe2 유전자발현용 plasmid의 origin을 pim13 기반에서 pbp1으로변경하여 mannitol을탄소원으로사용하여 20.5 g/l 미생물학회지제 52 권제 4 호
Clostridium 속미생물대사공학을통한 butanol 생산 395 Fig. 2. Central metabolic pathway of C. tyrobutyricum. Enzymes encoded by the genes are as follows: thl, acetyl-coa acetyltransferase (thiolase); hbd, β -hydroxybutyryl-coa dehydrogenase; crt, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase (crotonase); bcd, butyryl-coa dehydrogenase; pta, phosphotransacetylase; ak, acetate kinase; cat1, CoA transferase. Table 1. Fermentation performance of the metabolically engineered Clostridium strains Type of clostridia Solventogenic clostridia Acidogenic clostridia Acetogen Strain Clostridium acetobutylicum Clostridium tyrobutyricum Clostridium ljungdalhlii Genotype Titer (g/l) Butanol Yield (g/g) Fermentation and carbon source Reference buk 10.8 - Batch fermentation (ph 5.5), Glucose Green et al. (1996) 16.7 - Batch fermentation (ph 5.0), Glucose Harris et al. (2000) pta 17.2 - Batch fermentation, Glucose Jang et al. (2012) buk, pta, adhe1 D485G+ 18.9 0.29 Batch fermentation, Glucose Jang et al. (2012) 130 0.31 Fed-Batch fermentation, Glucose Jang et al. (2012) gshab +, thl +, hbd +, crt +, bcd +, adhe1 + +, ctfab 14.9 0.34 Batch fermentation, Glucose Hou et al. (2013) pfka +, pyka + 19.1 0.21 Batch fermentation, Glucose Ventura et al. (2013) adhe2 + (pim13 origin) 16.4 0.30 Batch fermentation, Mannitol Yu et al. (2011) 10 0.27 Batch fermentation, Glucose Yu et al. (2011) adhe2 + (pbp1 origin) 20.5 0.33 Batch fermentation, Mannitol Yu et al. (2012) thla +, hbd +, crt +, bcd +, adhe +, bdha + 0.15 - Batch fermentation, Glucose Kopke et al. (2010) 의 butanol 농도와 0.33 g/g의수율을달성하였다 (Yu et al., 2012). 대사공학을통하여만들어진 C. tyrobutyricum이 glucose 를탄소원으로한경우보다환원된당인 mannitol을이용할때, butanol 생합성을더욱효율적으로하는것을보여준다. 이는야생형 C. tyrobutyricum의산화 / 환원전위가 butyric acid 생합성에최적화되어있기때문인것으로보이며, butanol 생합성을위해서는더많은환원력의공급이필요한것으로보인다. 따라서, 향후 butanol 생합성을위한 C. tyrobutyricum의대사공학에서는이들산화 / 환원전위균형을조절하기위한전략이필요할것으로생각된다. Butanol 생산을위한 acetogen 대사공학전략 Acetogen은혐기성조건에서생존하는미생물로, Wood- Ljungdahl 대사회로를통해서합성가스 (syngas; CO 2, CO, H 2) 로부터 acetyl CoA를생합성하고, 이로부터 acetic acid을생합성하는균주들로대표되고있다. 최근다양한바이오매스를이용하여고효율바이오연료및바이오화합물생합성을위한노력이활발히진행되고있지만, 바이오매스 feedstock의전처리는기술및비용적측면에서상당한제약이된다. 이들모든바이오매스를가스화한합성가스를이용하는기술은 feedstock Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 4
396 Woo et al. 활용성및경제성에있어서장점이큰유망기술로평가받고있다. 이와같이가스자원의활용측면에서 acetogen은최근큰관심을받고있다. Acetogen은특정 genus에속하지않고다양한 genus에포함되어있다. Clostridium 속에도이와같은유용한 acetogen들이일부있어서, 이들을이용한 butanol 생합성을위한연구가비교적최근에시작되었다. 예를들어, Clostridium ljungdalhlii를이용한 butanol 생산을위한대사공학연구가대표적이다. C. acetobutylicum의주요 butanol 생합성대사회로, 즉 thiolase로부터 aldehyde/alcohol dehydrogenase를암호화하는유전자들을 C. ljungdalhlii에도입하여발현시켰다 (Kopke et al., 2010). 그결과, 발효과정에서합성가스 (CO, CO 2 H 2) 로부터 0.15 g/l의 butanol을생합성하였다 (Kopke et al., 2010). 하지만, 발효종료후에는 0.015 g/l 이하의 butanol 만이생산된것으로보고된바있다 (Kopke et al., 2010). 이와같이 Wood-Ljungdahl 대사회로를이용하여 butanol을생산할경우, 다양한 feedstock을활용할수있을뿐만아니라이용효율을크게증가시킬것으로기대되지만, 합성가스로부터 butanol 생합성을위한대사회로최적화연구가필요한실정이다. 적요 Clostridium은그람양성, 장간균으로포자를형성하는절대혐기성균이다. Clostridium은다양한기질을이용할수있고, 유용화합물합성을위한 building block으로사용가능한대사산물을생산할수있어, 최근많은관심을끌고있다. 특히, Clostridium을이용하여생산된 butanol은차세대연료로써고려되고있다. 수송용연료로써 butanol은 1세대바이오연료인 ethanol과비교하여더높은에너지밀도와낮은흡습성을보이는것으로알려져있다. 최근, butanol 생산을위한 Clostridium 대사공학이활발히진행되어상당한진보를보이고있다. 본연구에서는 butanol 생산을위한 Clostridium의대사공학전략을리뷰하고, 관련분야에대해서간략히전망하였다. 감사의말 본연구는한국연구재단의 C1가스리파이너리사업단 (NRF- 2015M3D3A1A01064918) 과 2016년도경상대학교신임교원연구기반조성사업 (2016-0199) 지원으로수행하였습니다. 전망 Clostridium 속미생물을이용한 butanol 생산은 100년이넘는오랜역사를가지고있으며, 최근인류가해결해야할문제들에대한해법을제공해줄수있는방법중하나로손꼽히고있다. 또한, 최근대사공학및시스템대사공학기술의발달과더불어난공불락으로여겨졌던 Clostridium 속미생물의대사공학전략들이활발하게개발되어보고되고있다. 이러한흐름은더욱경제적으로효율성이높은균주의제공가능성을예상할수있게해주고있다. 특히, genome 정보에기반하여시스템수준에서 Clostridium 속미생물의대사흐름을분석하고예측할수있는기술들의발전은더욱우수한균주의개발전망을밝게하고있다. 지나간최근 10년동안, 과거로부터축적한정보들을기반으로대사공학및시스템대사공학연구가활발히수행되어국내의경우 butanol의상업적생산을눈앞에두고있다. 앞으로는우리가알고있는정보에기반한대사공학을수행하기에는정보들이많이부족할것으로예상된다. Clostridium 속미생물의대사공학을이용한 butanol 증산을위해서는더욱효율적인대사공학전략의개발이필요할것으로생각된다. 예를들자면, 이미개발된 in silico 대사네트워크모델의개선및활용과더불어주요효소의기능을정확히밝히는연구들이필요할것으로전망된다. References Chen, C.T. and Liao, J.C. 2016. Frontiers in microbial 1-butanol and isobutanol production. FEMS Microbiol. Lett. 363, fnw020. Cho, C., Jang, Y.S., Moon, H.G., Lee, J., and Lee, S.Y. 2015. Metabolic engineering of clostridia for the production of chemicals. Biofuels Bioprod. Bioref. 9, 211 225. Cooksley, C.M., Zhang, Y., Wang, H., Redl, S., Winzer, K., and Minton, N.P. 2012. Targeted mutagenesis of the Clostridium acetobutylicum acetone-butanol-ethanol fermentation pathway. Metab. Eng. 14, 630 641. Friedl, A. 2016. Downstream process options for the ABE fermentation. FEMS Microbiol. Lett. 363, fnw073. Green, E.M., Boynton, Z.L., Harris, L.M., Rudolph, F.B., Papoutsakis, E.T., and Bennett, G.N. 1996. Genetic manipulation of acid formation pathways by gene inactivation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Microbiology 142, 2079 2086. Harris, L.M., Desai, R.P., Welker, N.E., and Papoutsakis, E.T. 2000. Characterization of recombinant strains of the Clostridium acetobutylicum butyrate kinase inactivation mutant: need for new phenomenological models for solventogenesis and butanol inhibition? Biotechnol. Bioeng. 67, 1 11. Hou, X., Peng, W., Xiong, L., Huang, C., Chen, X., Chen, X., and Zhang, W. 2013. Engineering Clostridium acetobutylicum for alcohol production. J. Biotechnol. 166, 25 33. 미생물학회지제 52 권제 4 호
Clostridium 속미생물대사공학을통한 butanol 생산 397 Jang, Y.S., Han, M.J., Lee, J., Im, J.A., Lee, Y.H., Papoutsakis, E.T., Bennett, G., and Lee, S.Y. 2014a. Proteomic analyses of the phase transition from acidogenesis to solventogenesis using solventogenic and non-solventogenic Clostridium acetobutylicum strains. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 5105 5115. Jang, Y.S., Im, J.A., Choi, S.Y., Lee, J.I., and Lee, S.Y. 2014b. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for butyric acid production with high butyric acid selectivity. Metab. Eng. 23, 165 174. Jang, Y.S. and Lee, S.Y. 2015. Recent advances in biobutanol production. Ind. Biotechnol. 11, 316 321. Jang, Y.S., Lee, J.Y., Lee, J., Park, J.H., Im, J.A., Eom, M.H., Lee, J., Lee, S.H., Song, H., Cho, J.H., et al. 2012. Enhanced butanol production obtained by reinforcing the direct butanol-forming route in Clostridium acetobutylicum. mbio 3, e00314-12. Jones, D.T. and Woods, D.R. 1986. Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiol. Rev. 50, 484 524. Kim, S., Jang, Y.S., Ha, S.C., Ahn, J.W., Kim, E.J., Lim, J.H., Cho, C., Ryu, Y.S., Lee, S.K., Lee, S.Y., et al. 2015. Redox-switch regulatory mechanism of thiolase from Clostridium acetobutylicum. Nat. Commun. 6, 8410. Kopke, M., Held, C., Hujer, S., Liesegang, H., Wiezer, A., Wollherr, A., Ehrenreich, A., Liebl, W., Gottschalk, G., and Durre, P. 2010. Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 13087 13092. Kuit, W., Minton, N.P., Lopez-Contreras, A.M., and Eggink, G. 2012. Disruption of the acetate kinase (ack) gene of Clostridium acetobutylicum results in delayed acetate production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 94, 729 741. Lee, J., Jang, Y.S., Han, M.J., Kim, J.Y., and Lee, S.Y. 2016. Deciphering Clostridium tyrobutyricum metabolism based on the whole-genome sequence and proteome analyses. mbio 7, e00743-16. Li, S.Y., Chiang, C.J., Tseng, I.T., He, C.R., and Chao, Y.P. 2016. Bioreactors and in situ product recovery techniques for acetonebutanol-ethanol fermentation. FEMS Microbiol. Lett. 363, fnw107. Liao, C., Seo, S.O., and Lu, T. 2016. System-level modeling of acetone-butanol-ethanol fermentation. FEMS Microbiol. Lett. 363, fnw074. Little, G.T., Winzer, K., and Minton, N.P. 2015. Genome sequence of the solvent-producing Clostridium beijerinckii strain 59B, isolated from staffordshire garden soil. Genome Announc. 3, e00108-15. Liu, X., Zhu, Y., and Yang, S.T. 2006. Construction and characterization of ack deleted mutant of Clostridium tyrobutyricum for enhanced butyric acid and hydrogen production. Biotechnol. Prog. 22, 1265 1275. Moon, H.G., Jang, Y.S., Cho, C., Lee, J., Binkley, R., and Lee, S.Y. 2016. One hundred years of clostridial butanol fermentation. FEMS Microbiol. Lett. 363, fnw001. Ventura, J.R.S., Hu, H., and Jahng, D. 2013. Enhanced butanol production in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 by double overexpression of 6-phosphofructokinase and pyruvate kinase genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 7505 7516. Yu, M.R., Du, Y.M., Jiang, W.Y., Chang, W.L., Yang, S.T., and Tang, I.C. 2012. Effects of different replicons in conjugative plasmids on transformation efficiency, plasmid stability, gene expression and n-butanol biosynthesis in Clostridium tyrobutyricum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 881 889. Yu, M.R., Zhang, Y.L., Tang, I.C., and Yang, S.T. 2011. Metabolic engineering of Clostridium tyrobutyricum for n-butanol production. Metab. Eng. 13, 373 382. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 4