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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): (2016) ISSN / eissn 총설 Butanol 생합성 Clostridium 속미생물대사공학용게놈편집도구개발 우지은 1, 김민지 1, 이지원 1, 서효주 1, 이상엽 2, 장유신 1 * Development of Genome Engineering Tools for Metabolic Engineering of Butanol-producing Clostridium Species Ji Eun Woo 1, Minji Kim 1, Ji Won Lee 1, Hyo Joo Seo 1, Sang Yup Lee 2, and Yu-Sin Jang 1 * Received: 22 November 2016 / Revised: 2 December 2016 / Accepted: 5 December The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Global warming caused from the heavy consumption of fossil fuel is one of the biggest problems to be solved. Biofuel has been gained more attention as an alternative to reduce the consumption of fossil fuel. Recently, butanol produced from the genus Clostridium has been considered as one of the promising alternatives for gasoline, fossil based fuel. Nevertheless, the lack of the genome-engineering tools for the genus Clostridium is the major hurdle for the economic production of butanol. More recently, genome engineering tools have been developed for metabolic engineering of butanolproducing Clostridium species, which includes genome scale network model and genome editing tools on the basis of mobile group II introns and CRISPR/Cas system. In this study, the genome engineering tools for butanol-producing Clostridium species have been reviewed with a brief future perspective. Keywords: Clostridium, Genome engineering, Butanol, Mobile intron, CRISPR 1 경상대학교농업생명과학연구원 1 Institute of Agriculture & Life Science (IALS), Department of Agricultural Chemistry and Food Science Technology, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea Tel , Fax jangys@gnu.ac.kr 2 한국과학기술원생명화학공학과 2 Metabolic and Biomolecular Engineering National Research Laboratory, Department of Chemical and Biomolecular Engineering (BK21 plus program), Bioinformatics Research Center, BioProcess Engineering Research Center, Center for Systems and Synthetic Biotechnology, KAIST, Daejeon 34141, Korea 1. INTRODUCTION 과다한석유의사용으로대기중온실가스가급증함으로써기후변화와같은환경문제가크게대두되고있다. 이러한환경문제를야기하는화석연료의사용을자제하고차세대대체연료를사용하고자하는노력이최근큰관심을받고있다. 차세대바이오연료에대한관심의증가에따라 bio-butanol 에대한관심이커지면서 Clostridium 을이용하여 butanol 을생산하고자하는노력도커지고있다 [1]. 자연에서분리한야생형 Clostridium 균주들은 butanol 을생합성할수있는대사회로를가지고있으나, acetate, butyrate, acetone, ethanol 과같은부산물들을동시에생산하는것으로잘알려져있다 [2]. 특히, butanol 과동시에생산되는 acetone 및 ethanol 과같은유기용매들의영문첫글자만따서 ABE fermentation 으로이름지어지기도했으나, 이들은 butanol 생산에있어서부산물일뿐이다. 차세대연료로사용가능한 butanol 을생산하기위한숙주로서 Clostridium 은큰매력을가지고있었지만, 오랜기간동안이들의대사회로를조절하기위한효율적인게놈편집도구들은없었다 [1]. 최근수년동안 Clostridium 에대한게놈정보들이많이발표되고있으며, 게놈정보를활용한 in silico 모델또한빠른속도로개발되어보고되고있다 [3]. 이러한게놈정보와이를기반하여구축된 in silico 모델은목적하는바이오화합물의최적생산을위한유전자증폭또는 knockout 대상을효율적으로제안해줄수있다. Clostridium 을사용하여목적바이오화합물생산을위한대사공학에서사용하는게놈편집은 mobile group II intron 과 CRISPR/Cas 시스템을이용하는기술들이최근개발되어활용되고있다. 따라서, 본논문에서는바이오화합물생산을위한 Clostridium 의대사공학도구로써

2 194 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): (2016) 게놈정보기반의 in silico 모델, mobile group II intron 과 CRI- SPR/Cas 시스템을이용한게놈편집기술에대해서리뷰하고향후관련분야의발전방향을전망하였다. 2. Butanol 생산용 Clostridium 속미생물게놈정보및 in silico 모델의개발 전체게놈정보는 butanol 생합성을위한최적대사회로를구성하기위한대사회로를제공하기때문에대사공학에있어서매우중요한정보를제공한다. 지금까지 butanol 을생합성할수있는 Clostridium 속미생물중, C. acetobutylicum (4.1 Mbp) 의전체게놈정보가가장먼저보고되었다 [2, 4-6]. 이후, C. beijerinckii (6.0 Mbp) 및 C. carboxidivorans (5.7 Mbp) 의전체게놈정보가분석되어보고되었다 [7, 8]. 뿐만아니라, butanol 생합성능력은없지만, 대사공학을통하여 butanol 생산을위한 host 로사용되고있는 C. ljungdahlii (4.6 Mbp) 및 C. tyrobutyricum (3.1 Mbp) 에대한전체게놈정보가보고되었다 [9, 10]. 이와같은전체게놈정보는대사네트워크의구성을통한직관적인대사공학을위한전략을제공할뿐만아니라시스템차원에서최적 butanol 생합성대사회로를최적설계하기위한 in silico 대사네트워크구축을위한토대를제공하기도한다. C. acetobutylicum 의대사흐름에대한화학량론모델 (stoichiometric model) 은전체게놈정보가밝혀지기전인 1984 년에최초로만들어졌으며 [11], 이후다양한연구들에서 C. acetobutylicum 의세포내의대사흐름을분석하기위한도구로활발히활용되고있다 [1, 12-15]. 이후, C. acetobutylicum 의전체게놈정보에기반한게놈수준대사네트워크모델들이개발되어보고되었다 [16-19]. Senger 등 (2008) 은 flux-balance analysis (FBA) 와세포막을통한세포내부로의총 proton 흐름으로정의되는 specific proton flux (SPF) 개념을이용하였다. 해당연구에서는 SPF 가산생성기일때는음의값이고, 용매생성기일때는양의값인점에착안하여두개의 phase 를구분하였다 [17, 18]. 같은해에 Lee 등 (2008) 또한산생성기와용매생성기를구분하는모델을제안하였다. 산생성기에는 flux distribution 을결정하기위하여 FBA 를적용하여세포형성을최대화하는방법을적용하였고, 용매생성기에는 acetic acid 와 butyric acid 의흐름에대해서만예외로하고나머지흐름의변화에대해서는최소화하는방법 (minimization of metabolic adjustment, MOMA) 을적용하였다 [16]. Gallardo 등 (2016) 은 Senger 등 (2008) 의 SPF 개념을이용하여 C. acetobutylicum 의게놈수준대사네크워크모델을보고하였다. C. beijerinckii 의대사네트워크모델또한 SPF 개념을이용하여만들어져보고되어있다 [20]. Butanol 을생산하는 Clostridium 중, kinetic 모델은처음으로 C. saccharoperbutylacetonicum 에대한대사네트워크모델로제안되었다 [21]. 이후다른그룹에서효소활성이동적으로반영된 C. acetobutylicum 에대한 kinetic 모델을제안하였다 [22]. 이러한효소의활성 은 ph 같은외부환경으로부터영향을받기때문에, 또다른그룹에서는 ph 변화에따른 C. acetobutylicum 의 kinetic 모델을제안하였다. 이와같은모델에서는 chemostat 에서 ph 4.5 부근에서는용매생성기로이들용매생산에관여하는효소들을코딩하는 sol 오페론이활성화되고, 환경의 ph 가상승하게되면이들효소들의활성이감소하는경향을대사네트워크모델에반영하였다 [23-26]. 하지만, 유전자발현등의조절에관여하는 ph 와같은환경적요인이어떻게대사산물생산에연결되어있는지를정확히알수없기때문에, 이들모델들은다른조건에서의결과들에대한시뮬레이션에있어서는제한적일수밖에없다 [27]. 최근에는대사반응 (metabolic reactions), 유전자조절 (gene regulation), 환경신호 (environmental cues) 를모두반영한 C. acetobutylicum 의모델개발이시도되었다 [28]. 해당모델을이용한연구에서는대사산물의생산, 포자형성, 세포독성등의상호관계들을모사할수있었다 [28]. 3. Mobile group Ⅱ intron 을이용한 butanol 생합성 Clostridium 속미생물게놈편집 3.1. Mobile group intron 발현및형질전환방법 Mobile group intron 을이용하여 Clostridium 속미생물게놈편집을위해서는숙주내에서복제가가능한 plasmid 가존재하여야한다. 대표적 butanol 생합성 Clostridium 인 C. acetobutylicum 과 C. beijerinckii 세포에서복제및유전이가능한 plasmid 는 1990 년대에다수개발되어보고된바있다. 이들 Clostridium 에서복제가능한대표적인 replicon 은 Enterococcus faeculis 유래 pamb1, Clostridium butyricum 유래 pcb102, Bacillus subtilis 유래 pim13 인것으로알려져있다 [29-31]. pamβ1 replicon 으로부터 pmtl21e 가만들어졌으며 [29], pim13 replicon 으로부터 pfnk1 이제작되었다 [30]. 현재널리사용되고있는대부분의 Escherichia coli - C. acetobutylicum shuttle vector 에는상기 replicon 들이이용되고있다. 하지만, C. acetobutylicum 은상기 shuttle vector 를이용한대사공학에제한이있었는데, 그것은 E. coli 에서분리한 plasmid 를형질전환하면효율이매우낮기때문이다. C. acetobutylicum 은 5 -GCNGC- 3 서열을인식하는매우강력한 restriction system (Cac824I 유전자가암호화 ) 이있기때문이다. 이문제는 B. subtilis phage Φ 3T I methyltransferase 를이용하여 E. coli 로부터분리한 plasmid 를메틸화한후형질전환하는방법이개발되면서해결되었다 [32]. 이러한 plasmid 및형질전환기법을기반으로 mobile group II intron 을이용가능하게되었다 Mobile group intron 을이용한 solventogenic Clostridium 속미생물유전자결실모델미생물로서연구가잘되어있는 E. coli 와 Saccharomyces cerevisiae 와는달리, solventogenic Clostridium 유전자결실및게놈편집은최근까지쉬운일이아니었다 년이

3 Clostridium 대사공학용게놈편집도구개발 195 전에는상동성재조합기법을이용하여목적하는유전자에 plasmid 를 single-crossover 시켜목적유전자의기능을파괴하는기법이활용되었으나, 그성공확률이매우낮았다. 성공한예는 C. acetobutylicum buk 유전자를목적하여 mutation 을일으켜만든 PJC4BK 균주가대표적인것이다 [33]. 이후, solventogenic Clostridium 유전자결실에대한괄목할만한연구결과는보고된바없었다. 비로소 2007 년에 mobile group II intron 을이용한유전자결실기법이 solventogenic Clostridium 에성공적으로적용됨으로써유전자결실및게놈편집연구가활발히진행되었다 [34, 35]. 일명 TargeTron (Clostridium 에응용한경우는 ClosTron 으로명명되기도함 ) 으로불리는 mobile group II intron 기술은 mobility 를가지는 intron 을게놈상의목적유전자에삽입할수있는기술이다 (Fig. 1). Mobile group II intron 은 bacteria 뿐만아니라 fungi, protozoa, algae, archaea 등다양한종에서고르게발견되는것으로보고되어있다 [36]. 중온균인 solventogenic Clostridium 유전자결실및게놈편집에는 Lactococcus lactis 유래 Ll.LtrB intron 이사용되고있다 [1]. Ll.LtrB intron 은 intron RNA 도메인과 open reading frame (ORF) 도메인으로크게구분할수있다. Intron RNA 도메인은 exon binding sites (EBS)1, EBS2, δ 로구성되어있는 splicing 자리를포함한다 [37]. ORF 도메인은역전사효소 (RTase), maturase, endonuclease 를암호화하는유전자를포함한다 [36]. 고온균인 Clostridium thermocellum 유전자결실에는고온에서 melting 이가능한 Thermosynechococcus elongates 유래 TeI3c/4c intron 을이용하는것으로알려져있다 [38]. Mobile group II intron 이목적유전자에삽입되는 mechanism 을 retrohoming 이라칭하며, splicing 된 intron RNA 와역전사효소가 RNA- 단백질복합체를형성한후목적유전자에 intron RNA 를역전사하는것으로알려져있다 [37]. 이기법을응용하여 C. acetobutylicum, C. beijerinckii 와같은주요 butanol 생산 Clostridium 의 spo0a, pta, ack, ptb, buk, hbd, hyda, arga 와같은단일유전자결실돌연변이들이제작되어보고된바있다 [1, 34, 35]. Mobile group II intron 을이용한유전자결실은숙주에서복제가능한 plasmid 를바탕으로하기때문에, 두번째유전자결실을위해서는먼저첫번째유전자결실에사용하였던 plasmid 의제거가필요하다. 이와같은과정을거쳐이중돌연변이를제작하는것은매우까다로운일이었다. 이러한이유로 mobile group II intron 을 solventogenic Clostridium 유전자조작에적용하기시작한 2007 년으로부터 3 년뒤인 2010 년에처음으로 agra/spo0a 이중돌연변이체가개발되어보고된바있다 [39] 년에는첫번째유전자결실에사용한 plasmid 의제거없이다음순서의유전자를결실할수있는새로운방법이개발되어 pta/buk, pta/ctfb, ptb/buk 와같은다수의이중돌연변이체를포함하여 pta/buk/ctfb 와같은삼중돌연변이 C. acetobutylicum 제작에 Fig. 1. Schematic presentation of the genome engineering by using the L. lactis Ll.LtrB mobile group II intron targeting the pta gene in a butanol producing-clostridium. Abbreviations: Em R, the gene encoding enzyme responsible for erythromycin resistant; ori, replication origin; RTase, reverse transcriptase; primer-f and primer-r, primers to confirm the integration of intron into the pta gene; pta, the gene encoding phosphotransacetylase; acka, the gene encoding acetate kinase.

4 196 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): (2016) 대한보고가있었다 [1]. 해당연구에서는돌연변이선발마커로 erythromycin 과 chloramphenicol 항생제내성에관여하는단백질을암호화하는유전자 2 개를사용하였으며, 한세포내에서동일한 replicon 을가진서로다른 plasmid 가존재할수없는 plasmid incompatibility 특징을활용하였다. 첫번째목적하는유전자결실을위하여 erythromycin 내성마커를사용한다면, 두번째목적하는유전자결실을위하여첫번째와동일한 replicon 을가지는 chloramphenicol 항생제내성유전자를가진 plasmid 를사용한것으로보고되었다 [1]. 같은연구그룹의 2014 년보고에따르면, 사중, 오중돌연변이제작을위한네번째, 다섯번째유전자결실과정에서는앞서사용한방법이적용되지않음을보고하고있다 [40]. 그이유에대해서는아직정확하게밝혀져있지않지만, 공존하던동일한 replicon 에자연돌연변이가유발되었을가능성을제시하고있다 [40]. 사중, 오중돌연변이 C. acetobutylicum 제작을위하여두개의 plasmid 중한개는반드시 curing 이필요한것으로알려져있다 [40]. 항생제마커만다르고동일한 replicon 을가지는두 plasmid 중하나를 curing 하기위하여두항생제중하나만을선택하여 (chloramphenicol 을함유하는배지에서 ) 계대배양함으로써나머지항생제 (erythromycin) 내성에관여하는 plasmid 를제거한것으로보고하고있다 [40]. 결국이를숙주로이용하여네번째, 다섯번째유전자의결실에성공하여 pta/buk/ctfb/adhe1, pta/buk/ctfb/adhe1/ hyda 돌연변이를제작한것으로보고하고있다 [40]. 비교적짧은시간 (1 주일이하 ) 의계대를통하여나머지 plasmid 의제거가가능했던것으로보고되고있기때문에 replicon 의돌연변이는심각하지않았을것으로추정된다. 즉, 한쪽 plasmid replicon 에발생했을돌연변이가두 plasmid 의상호공존을가능하게는할정도의능력을부여한것으로예측되지만, 특정하나의 plasmid 를선택하기위한조건에서는분리가능한정도인것으로추정된다. 4. CRISPR/Cas9 을이용한 butanol 생합성 Clostridium 속미생물의게놈편집 최근세균면역계에서발견되는 clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) 을이용하는게놈편집기술은생물종을가리지않고활발하게연구되어보고되고있다. 세균면역계에서는 CRISPR 로부터 pre-crrna 가전사되고이들은다시 crrna 로가공되어, Cas9 단백질과복합체를형성하여외부에서침입한 phage DNA 를인식하여제한하는것으로알려져있다 [41]. 후속연구에서, crrna, Cas9 단백질, 이들둘을연결해주는 trans-activating crrna (tracrrna) 조합으로목적하는 phage DNA 의제한이 in vitro 상에서가능하다는것이증명되었다 [42]. 이를기반으로목적 DNA 에상보적인 guide RNA (grna) 를설계하여 crrna 및 tracrrna 대신넣게되면목적유전자의이중가닥을 Cas9 이자르게되어게놈편집도구로활용가능하다는것이보고되었다 [42]. CRISPR/Cas9 시스템을 butanol 생합성용 Clostridium 게놈편집에이용하려는연구도활발히진행되고있다. 지금까지 CRISPR/Cas9 시스템을이용하여게놈편집에성공한예는 C. ljungdahlii, C. beijerinckii, C. acetobutylicum, C. pasteurianum를이용한연구에서보고된바있다 [43-46]. 이들 4종의 Clostridium 게놈편집에서는모두 Streptococcus pyogenes 유래의 type II CRISPR/Cas9 시스템을도입하였다 (Fig. 2). C. ljungdahlii 게놈편집에서는 cas9 유전자발현을위하여 C. acetobutylicum의 thiolase 프로모터가이용되었으며, grna 발현을위하여 C. acetobutylicum의 arae 프로모터가사용되었다 [43]. 외래로부터도입한 CRISPR/Cas9 시스템을이용하여 C. ljungdahlii의 pta, adhe1, ctf, pyre 유전자를목적하였으며, 모두계획한게놈편집이가능했던것으로보고하고있다 [43]. C. beijerinckii를이용한연구에서는 cas9 발현을위한 spoiie 프로모터와 grna 발현을위한 srna 프로모터 (scbei _5830) 를이용한것으로보고되었다 (Fig. 2). 상기연구에서는포자형성과관련있는 spo0a 유전자편집을시도하였으며, 이돌연변이는포자를형성하지않는표현형을나타내는것으로보고한바있다 [44]. 또다른연구에서는 C. acetobutylicum과 C. pasteurianum에서동시에호환가능한 CRISPR/ Cas9 시스템을구축하여보고한바있다 [45]. 상기연구에서는 C. acetobutylicum과 C. pasteurianum 두균주모두에서복제가능한 pim13 복제기구를가지는 plasmid를이용하였으며, cas9 발현을위한 C. pasteurianum의 thiolase 프로모터와 grna 발현을위한 C. beijerinckii srna 프로모터 (scbei_58 30) 를사용한것으로알려져있다 [45]. 상기연구에서는 Cac 824I 제한효소를암호화하는 C. acetobutylicum의 cac1502 유전자를편집할수있음을보고하였으며, 동일한시스템을이용하여 CpaAIR Type II 제한효소를암호화하는 C. pasteurianum의 cpaair 자리에혐기조건에서녹색형광단백질을암호화하는 afp 유전자를치환하는것을시연한바있다 [45]. 또한, Clostridium 속의경우, 약 74% 가 CRISPR-Cas 자리를가지는것으로알려져있어, Clostridium 자체에내재되어있는 CRISPR/Cas 시스템을이용할수있을것이라는기대가큰편이었다 (Fig. 3). 실제 2016년에 C. pasteurianum에내재된 CRISPR/Cas 시스템을이용하여해당균주의게놈편집을시연하는보고가있었다 [46]. C. pasteurianum에는 type I-B CRISPR/Cas 시스템이존재하는것으로알려져있으며, 외래 cas9 유전자의도입없이 cpaair를목적하도록설계한 crrna 만으로목적유전자의편집이가능한것으로보고하였다 [46]. 실제로는내재된 CRISPR/Cas 시스템을이용하여게놈의목적유전자를편집했다고하기보다상동성재조합 (homologous recombination) 을일으켜서게놈을편집하고, CRISPR/Cas 시스템을 counter partner로이용했다고볼수있다 (Fig. 3). 상동성재조합으로편집된게놈의목적유전자에는 crrna 결합자리가사라져 Cas3에의해서절단이일어나지않기때문에오히려생존하는것을볼수있다. 반면, 상동성재조합이일어나지않은경우는 crrna와 Cas3에의해서절단되어생존이불가한특징을이용한게놈편집의예이다 (Fig. 3). Bu-

5 Clostridium 대사공학용게놈편집도구개발 197 Fig. 2. Schematic presentation of the genome engineering by using the S. pyogenes CRISPR/Cas9 system in C. ljungdahlii, C. beijerinckii, C. acetobutylicum, and C. pasteurianum [43-46]. (A) The C. acetobutylicum thl and arae promoters (P thl and P arae ) were used for the transcription of the Cas9 and grna in C. ljungdahlii, respectively. (B) The C. beijerinckii spoiie and scbei_5830 promoters (P spoiie and P scbei_5830 ) were used for the transcription of the Cas9 and grna in C. beijerinckii, respectively. (C) The C. pasteurianum thl promoter (P thl ) and C. beijerinckii scbei_5830 promoter (P scbei_5830 ) were used for the transcription of the Cas9 and grna, respectively, in both C. acetobutylicum and C. pasteurianum. Fig. 3. Schematic presentation of genome engineering by using the inherent CRISPR/Cas system in C. pasteurianum [46]. In this case, the inherent CRISPR/Cas system was used as a counter partner for screening a gene deletion mutant generated by homologous recombination. tanol 생합성용 Clostridium 은비교적형질전환효율이매우낮은것으로알려져있기때문에내재되어있는 CRISPR/Cas 시스템을확인하고, 이들을개발하여이용하면더욱높은효율의게놈편집시스템으로개발가능할것으로전망하고있다. 5. CONCLUSION 당해는 Clostridium 속미생물을이용하여 butanol 을산업적으로생산하기시작한지 100 년이되는기념비적인해이다. 100 년의기간동안 butanol 의산업적생산은석유의생산량및생산단가에반대방향으로의존하는경향을보였다. 최근에는석유의과다사용으로유발된지구온난화를늦추기위하여바이오연료로사용가능한 butanol 에대한관심도가다시매우커지고있다. 지난 100 년동안 Clostridium 발효를통한 butanol 생산기술의꾸준한발전과더불어, 최근에는 butanol 을생산하는 Clostridium 속미생물게놈편집을위한기술들이활발히개발되어보고되고있다. Mobile group II intron 을이용한게놈편집기술은 Clostridium 을연구하는그룹들에서는이미대중화되어있고, 최근 2 년동안에는 CRISPR/

6 198 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): (2016) Cas 시스템을이용한게놈편집이시연되고있다. 또한상당수 Clostridium 속미생물에 CRISPR/Cas 시스템이내재되어있음이밝혀지고있고, 내재된 CRISPR/Cas 시스템을이용한게놈편집이성공한바있어서앞으로이들을이용하기위한노력이활발히진행될것으로보인다. 내재된 CRISPR/Cas 시스템을이용할경우형질전환등에서많은장점을가지기때문에다양한돌연변이라이브러리를제작할수있을것으로기대한다. 이러한대규모라이브러리를이용할경우, 지금까지큰발전이없었던 butanol 에대한내성이향상된 Clostridium 속미생물의선발도가능할것으로전망된다. 또한, 이와같은게놈편집도구의발전에따라대사흐름이변경된 Clostridium 을쉽게만들수있기때문에이들을배양하여얻은결과로게놈수준대사네트워크모델의향상을위한기초자료를제공하여우수한 butanol 생산대사회로의예측이가능할것으로전망된다. Acknowledgements 본연구는한국연구재단의이공분야기초연구사업 ( 과제번호 : NRF-2016R1D1A3B ) 지원으로수행되었습니다. REFERENCES 1. Jang, Y. S., J. Y. Lee, J. Lee, J. H. Park, J. A. Im, M. H. Eom, J. Lee, S. H. Lee, H. Song, J. H. Cho, D. Y. Seung, and S. Y. Lee (2012) Enhanced butanol production obtained by reinforcing the direct butanol-forming route in Clostridium acetobutylicum. mbio 3: e Nolling, J., G. Breton, M. V. Omelchenko, K. S. Makarova, Q. Zeng, R. Gibson, H. M. Lee, J. Dubois, D. Qiu, J. Hitti, Y. I. Wolf, R. L. 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