대한임상병리학회지 : 제 21 권제 4 호 2001 Korean J Clin Pathol 2001; 21: 304-9 진단면역학 말라리아감염의신속진단을위한 Parasite Lactate Dehydrogenasebased Immunochromatographic Antigen Assay (DiaMed OptiMAL ) 의유용성 김자영 임지향 김명신 이승옥 김용구 한경자 강창석 가톨릭대학교의과대학임상병리학교실 Evaluation of Parasite Lactate Dehydrogenase-based Immunochromatographic Antigen Assay (DiaMed OptiMAL ) for Rapid Diagnosis of Malaria Jayoung Kim, M.D., Jihyang Lim, M.D., Myungshin Kim, M.D., Seungok Lee, M.D., Yonggoo Kim, M.D., Kyungja Han, M.D., and Chang Suk Kang, M.D. Department of Clinical Pathology, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea Background : Microscopic examination of peripheral blood smears has been a standard diagnostic test for malarial infection for a long time, but it is labor-intensive and time-consuming. Recently, a rapid diagnostic test for malarial infection containing a dipstick bearing monoclonal antibodies against the intracellular metabolic enzyme, parasite lactate dehydrogenase (pldh), was introduced (DiaMed OptiMAL ). We evaluated the usefulness of the OptiMAL test in malaria diagnosis by comparing with a microscopic examination of peripheral blood smears. Methods : Fifty-eight (initial 44 and follow-up 14) whole blood samples were obtained from 44 patients who were suspected of having malarial infection. After 1 drop of whole blood reacted with the dipstick, band numbers and positions on the dipsticks determined the results. All results were compared to those of microscopic examination findings. Results : The OptiMAL test revealed 100% sensitivity and specificity by comparing with the microscopic examination. The intensity of stained bands showed positively correlated with the severity of parasitemia. The OptiMAL test revealed a more rapid negative conversion than the microscopic examination after treatment. Conclusions : The OptiMAL test is a simple, rapid and accurate test for diagnosis of malarial infection; moreover, it is good tool for monitoring after treatment. (Korean J Clin Pathol 2001; 21: 304-9) Key words : Malaria, Plasmodium, Parasite lactate dehydrogenase, OptiMAL 서 론 접 수 : 2001년 6월 16일 접수번호 : KJCP1504 수정본접수 : 2001년 8월 1일 교신저자 : 임지향 우 150-713 서울시영등포구여의도동 62 가톨릭대학교성모병원임상병리과의국 전화 : 02-3779-2158, 2262, Fax: 02-783-6648 E-mail : ljh117@cmc.cuk.ac.kr Plasmodium vivax로알려진한국토착형말라리아는 1970년대후반에소실되었다가 1993년 1예가재발생된이후 1999년전국적으로 3,628 건에이를만큼급격히증가하고있으며또한해외여행, 취업의증가에따라유입형말라리아도꾸준히증가하고있다 [1]. 최근전세계적으로도말라리아환자가다시증가되는추세이며, 이는살충제에내성을갖는말라리아모기의출현, 304
pldh-based OptiMAL test 305 교통의발달에따른비면역자의말라리아유행지역으로의이동및효과적인말라리아백신개발실패등에기인한다 [2]. 말라리아를가장효과적으로관리하는방법은조기진단에의한적절한치료이다 [3]. 이를위해말라리아조기진단을위한여러가지방법들이개발되어왔다 [4-9]. 이에저자들은말라리아원충내에존재하는효소인 parasite lactate dehydrogenase (pldh) 항원에특이적인단클론항체를부착한 dipstick을이용한면역크로마토그라피 (immunochromatography) 검사법을말초혈액도말법과비교하여말라리아의진단과치료효과판정에있어그유용성을평가하고자본연구를시행하였다. 2) pldh를이용한면역크로마토그라피검사법 (DiaMed OptiMAL ) 발색표지자가포함되어있는 conjugate well에완충액한방울을넣고 1분간반응시킨후, 환자의 EDTA 전혈한방울 (10 L) 을떨어뜨려잘섞은다음, pldh에대한단클론항체가도포된 dipstick을꽂아 10-15분간반응시킨후 wash well에 4방울의완충액을넣고 1분간둔후다시 dipstick을꽂아 5-10분을반응시킨다. 결과판정은 dipstick에나타난 band의발색반응유무와 band 의위치로결정하였다. 먼저첫번째 band인대조선의발색으로검사가적절히수행되었음을확인한후, 삼일열말라리아 (P. vivax), 난원형말라리아 (P. ovale), 사일열말라리아 (P. malariae), 열대열말라리아 (P. falciparum) 에있는공통항원과반응하는단클론항체가도포되어있는두번째 band가나타나면국내말라리아감염이대부분토착형말라리아인삼일열말라리아에의한것을감안하여삼일열말라리아로진단하였고, 열대열말라리아에만특이적인단클론성항체로구성되어있는세번째 band까지나타난경우는열대열말라리아로진단하였다. 또한 band의염색강도에따라 1-4등급으로나누어말초혈액도말상관찰되는원충수와비교하였다. 검체저장시간과보관온도가검사결과에미치는영향을알아보기위하여양성 band가확인되었던검체중 4개를 6일동안각각냉장보관과실온보관한뒤 OptiMAL 검사를실시하여채혈당일신선검체로실시한결과와비교하였다. 대상및방법 1. 대상 2000년 6월부터 11월까지말라리아감염이의심되어본원에내원한환자 44명 ( 남자 28명, 여자 16명, 나이 2세-78세 ) 의총 58개의혈액검체 ( 진단당시 44검체, 치료후추적검사 14검체 ) 를대상으로말초혈액도말법과 pldh 면역크로마토그라피검사법 (DiaMed OptiMAL, Flow Inc., Portland, Oreg., USA) 을이용한검사를동시에시행하였다. 2. 방법 3) 치료효과판정말라리아감염으로진단된환자는 hydroxyquinolone과 primaquine의병합요법으로치료를받았으며, 추적검사가가능했던 6명의환자에대해서는치료후 4일간은매일, 그후는 14일째되는날에말초혈액도말상의원충수변화와 OptiMAL 검사결과를비교하였다. 3. 통계및결과분석결과통계분석에서는 SPSS 프로그램을사용하였고각지표간의비교는 Pearson 상관분석을이용하였으며유의성판정은 P<0.05로하였다. 1) 말초혈액도말법검사대상자의 EDTA혈액으로박층도말후 Giemsa 염색을실시한다음, 고배율 ( 1,000) 상에서 300시야이상을관찰하였다. Parasitemia 정도는박층도말에서적혈구 1,000개당관찰되는원충수를계수하여말초혈액단위용적당 ( L) 관찰되는원충수로환산하였고, 또한구분이가능한경우는관찰되는각원충의성장단계를조사하였다. 결과 1. 최초진단당시말초혈액도말법과 OptiMAL 검사법의비교검사대상자 44명중말초혈액도말법상말라리아양성으로판독된환자는 24명 ( 남자 14명, 여자 10명, 나이 2-78세, 평균 29.9 세 ) 로양성률은 55% 였다. 이중삼일열말라리아로진단된 21명의말초혈액도말법상관찰된평균원충수는 2,981/ L였으며, 관찰된원충의성장단계는생식모세포 (gametocyte) 가가장흔하였고다음이고리형을포함한영양형 (trophozoite), 분열형 (schizont) 순이었다. 열대열말라리아로진단된 1명은동남아여행의과거력이있었으며진단당시말라리아원충수는 55,780/ L였고, 한적혈구내다수의고리형원충이들어있는형태가관찰되었다. 나머지 2명은전슬라이드상한개의고리형원충만관찰되거나변성이되어불분명한원충형태만관찰되어종간구분이불가능하였다. OptiMAL 검사에서는말초혈액도말법에서삼일열말라리아로판독된 21명은삼일열말라리아에해당하는 band 상을, 말초혈액도말법에서열대열말라리아로판독된 1명은그에해당하는
306 김자영 임지향 김명신외 4 인 N P.v P.f A B C Fig. 1. (A) P. vivax, gametocytes in enlarged RBC. Giemsa stain ( 1,000). (B) P. falciparum, numerous ringform trophozoits in RBCs. Giemsa stain ( 1,000). (C) OptiMAL test: N, negative (control band only); P.v, P.vivax (control+2nd bands); P.f, P.falciparum (control+2nd+3rd bands). Table 1. The results of OptiMAL test comparing with microscopic examination in 44 patients who were suspected malarial infection OptiMAL test (n=44) positive (n=24) P. vivax P. falciparum negative (n=20) positive 21 1 0 Microscopic negative 0 0 20 Examination UnID* 1 1 0 Total 22 2 20 *The species can not be identified. Abbreviation: UnID, unidentified. band 상을나타내었다. 종간구분이힘들었던 2명중변성된원충체가있던 1명은삼일열말라리아에해당하는 band 상을나타내었으며, 하나의고리형원충만있었던 1명은열대열말라리아에해당하는 band 상을나타내었는데이환자는 2년간동남아에거주한과거력이있었다. 말초혈액도말법상음성이었던 20명은 Opti- MAL 검사에서도모두음성으로판독되었다 (Table 1, Fig. 1). 삼일열말라리아의경우말초혈액도말법과비교하여말라리아원충수가증가할수록 OptiMAL 검사상 band의염색강도가유의하게증가하였으나 (r=0.826, P<0.005)(Fig. 2), 말초혈액도말법에서고리형만관찰되었던열대열말라리아경우에는그와비슷한원충수를보이는삼일열말라리아예와비교할때 band의 염색강도가훨씬희미하게나타났다. 6일동안각각냉장보관과실온보관한 4개검체로실시한 OptiMAL 검사에서는채혈직후신선검체로시행한검사결과와비교하였을때 band 염색강도의차이는없었다. 2. 치료효과의판정 Hydroxyquinolone과 primaquine를투여받은다음날부터환자의말초혈액에서관찰되는원충수가감소하였고 OptiMAL 검사에서도 band 염색강도가약화되는결과를보였다. 치료 3일째에말초혈액도말법에서는변성된말라리아원충이전슬라이드영역에서 1개정도관찰되었으나 ( 평균원충수, 90/ L) Opti- MAL 검사는음성소견을보였으며치료 4일째이후에는말초혈액도말법에서도말라리아원충을관찰할수없었다. 치료 14일째시행한말초혈액도말법과 OptiMAL 검사에서모두음성으로판독되었다 (Table 2). 고찰말라리아진단에있어현재가장보편적으로사용되는방법은 Giemsa 염색을이용한말초혈액도말법으로가장신뢰성있는검
pldh-based OptiMAL test 307 Table 2. Comparison between microscopic examination and OptiMAL test after treatment in six malaria parasites No. case Diagnosis Test Initial Posttreatment days 1 2 3 4 1 P. vivax Micro* 645 NA 151 74 0 0 OptiMAL P (1) NA P (1) N N N 2 P. vivax Micro 2,375 NA 451 103 0 0 OptiMAL P (2) NA P (1) N N N 3 P. vivax Micro 128 NA NA NA NA 0 OptiMAL P (1) NA NA NA NA N 4 P. vivax Micro 7,660 6,660 NA NA NA NA OptiMAL P (4) P (3) NA NA NA NA 5 P. vivax Micro 2,325 NA NA NA 0 NA OptiMAL P (2) NA NA NA N NA 6 P. falciparum Micro 55,300 NA 2,450 98 0 NA OptiMAL P (4) NA P (1) N N NA *malarial count (/ L) of microscopic examination; Positive OptiMAL test that graded 1-4 by band intensity expressed in the parenthesis. Abbreviations: Micro, microscopic examination; OptiMAL, DiaMed OptiMAL test; P, positive; N, negative; NA, not available. 14 malarial count/ L 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 1 2 3 4 band intensity Fig. 2. Comparison between band intensity of OptiMAL test and malarial count (/ L) of microscopic examination in 22 patients with P. vivax (r=0.826, P<0.005). 사법이지만많은시간과노력이소요되며동시에숙련된검사자를필요로한다 [10]. 이를보완하기위해 acridine orange 같은형광염색을이용한현미경적검경법 [4] 과원심분리시킨말초혈액검체를이용한검경법 (QBC, technique )[5] 등이소개되었지만, 이방법도역시숙련된검사자가필요하며말라리아의성장단계를잘구별할수없는등의단점이제기되었다. 그외에혈청에서항체를검출하는효소면역법 [6], 간접면역형광항체법 [7], 중합효소연쇄반응법 [8], RNA나 DNA 탐침자 (probe) 를이용한 교잡법 (hybridization)[9] 등이개발되어말라리아의진단과치료효과판정에사용되었으나대부분특수한인력과시설, 장비가필요하고검사과정이복잡하다 [6-9]. 또한, 혈청에서항체를검출하는방법의경우는대량의검체를단시간에검사할수있지만양성결과가반드시현재감염상태를의미하는것은아니며혈중에존재하는다른항체와의교차반응가능성도배제할수없는등의단점이지적되었다 [6]. 이에세계보건기구 (WHO) 의주도로특별한기술이나장비없이손쉽게현장에서말라리아를검출할목적으로 dipstick을이용하여혈액에서직접말라리아항원을검출하는신속검사법 (rapid diagnostic test, RDT) 이개발되었다. 신속검사법에주로이용되는말라리아항원은 histidine rich protein II (HRP-II)[11], parasite lactate dehydrogenase (pldh)[12-14], pan malaria [15] 등으로초기에는열대열말라리아를빠르고간단하게진단할목적으로개발되었지만현재는비열대열말라리아의진단에도이용하고있다. 이중 pldh는생식모세포 (gametocyte) 시기에생성되며젖산 (lactate) 에서피르부산 (pyruvate) 으로전환시 nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 대신 3-acetylpyridine adenine dinucleotide (APAD) 를이용하는대사성효소로서말라리아종간에각기다른 pldh 동위형을가지고있어종별로다른항원성을나타낸다 [12-14]. 체내에서 pldh를측정하는방법에는현재두가지가소개되었는데, 첫번째방법은감염된사람혈청내에존재하는말라리아 NAD analogue인 APAD를이용하여 650nm에서흡광도를측정하는방법으로정량적분석이가능하며초기진단과치료효과추적시혈액내원충수를잘반영하지만과정이매우복잡하며시간이오래걸리는단점이있다 [12]. 이를보완하여 immunochromatographic capture 원리에근거하여 pldh에특이적인단클론성항체를부착시킨 dipstick을사용한 DiaMed OptiMAL 검사법이개발되었으며, dipstick에발색된 band의위치로열대열말라리아와비열대열말라리아를쉽게구별할수있고소량의검체만을이용하
308 김자영 임지향 김명신외 4 인 여 10분이내에말라리아진단이가능하여그유용성이부각되고있다 [14]. 본연구에서 OptiMAL 검사법은민감도및특이도가 100% 로말초혈액도말법과정확히일치하는결과를보였는데임등 [16] 도국내말라리아감염검사자를대상으로동일한민감도와특이도를보고하였다. 삼일열말라리아경우원충수가 3,000/ L 이상에서는 conjugate well에반응하는단계에서이미해당 band가나타나 10분이내에결과판독이가능하였고원충수가증가할수록 band 염색강도가증가하는양상을보였다. 고리형만관찰된열대열말라리아 1명은동일한원충수를가진삼일열말라리아경우보다훨씬희미한 band 염색강도를보였는데이는 pldh가원충성장단계중생식모세포에서만생성되기때문이다 [12]. 또한말초혈액도말법상으로는종별구분이불가능했던두명이 Opti- MAL 검사에서는각각삼일열말라리아와열대열말라리아로판독가능하였는데이와같이말초혈액도말상고리형이나파괴된분열체만이존재하거나, 부적절한검체보관에의해변성된원충만관찰되거나, 염색과정의오류에의한적혈구변형과인공산물로인해말라리아진단이어려운경우는 OptiMAL 검사가말초혈액도말법보다훨씬유용한진단법으로생각되었다. Iqbal 등 [17] 에의하면 OptiMAL 검사는말라리아원충수가 100/ L 이상이면민감도 97% 를보이나 100/ L 이하에서는민감도가 59% 로떨어지며 50/ L 이하에서는 39% 로급감한다고하였으며, Palmer 등 [18] 도말라리아원충수가 50/ L 이하에서는민감도와특이도가각각 53%, 50% 라보고한것으로보아원충수가 100/ L 이하에서는 OptiMAL 검사의민감도가유의하게감소함을알수있다. 또한고려해야할점은, 매우드물지만열대열말라리아와삼일열말라리아가동시에감염되었을경우에 OptiMAL 검사의 band 상만으로는동시감염을알수없으므로주의해야하며 [19], 열대열말라리아는치료후약제내성없이도생식모세포가혈중내에 2주까지존재할수있으며따라서이시기에는 OptiMAL 검사상위양성을보일수도있다 [20]. 치료효과판정시말초혈액도말법보다 OptiMAL 검사법에서먼저음성으로전환되었는데, 이는 pldh가살아있는말라리아에서만생성되는효소이기때문이며, 따라서치료후말초혈액도말상원충이관찰되더라도 OptiMAL 검사상음성이면이는치료에의해죽거나변성된원충으로생각할수있으며이러한결과를볼때말초혈액도말법보다조기에치료효과를판단할수있고임상적결과를더잘반영할수있는검사법으로생각되었다. 약제내성이있는경우는말초혈액도말상에서는치료시작후수일내에는일시적으로원충이사라졌다가 1-2주후에다시원충이관찰되는경향을보인다고하나 [21] 본연구에서는약제내성을보였던예가없어약제내성인경우에 OptiMAL 검사법의효용은알수없었다. 결론적으로 OptiMAL 검사법은말초혈액도말법에상응하는민감도를가지면서검체저장상태에구애를받지않고전혈로 간편하고신속하게말라리아를검사할수있는우수한검사법으로치료효과추적검사에도유용하며, 특히임상적으로말라리아가의심되는경우이지만원충수가적거나변성되어말초혈액도말법으로는말라리아진단이어려운경우에매우유용한검사법으로생각되었다. 요약배경 : 말초혈액도말법은현재까지말라리아감염의진단에있어표준검사법으로이용되고있지만정확한판독에는많은시간과노력이필요하다. 최근말라리아원충에특이적으로존재하는대사효소인 parasite lactate dehydrogenase (pldh) 에대한단클론항체를이용하여빠른시간내에말라리아감염을진단할수있는면역크로마토그라피법 (DiaMed OptiMAL test) 이국내에소개되었다. 따라서이검사법을말초혈액도말법과비교하여말라리아의신속진단에있어그유용성을평가해보고자하였다. 재료및방법 : 임상적으로말라리아가의심되어말초혈액도말검사가의뢰된 44명환자의총 58검체 ( 진단당시 44검체, 치료후추적관찰 14검체 ) 를대상으로본연구를시행하였다. 환자의 EDTA 전혈한방울을 pldh에특이한단클론항체가도포된 dipstick과반응시킨후발색된 band의유무와위치로결과를판정하였으며모든결과는말초혈액도말법의결과와비교하였다. 결과 : OptiMAL 검사는 100% 인민감도와특이도를나타내었으며말초혈액도말법과정확히일치하였다. 원충수가증가할수록 band의염색강도는증가하였다. 치료후추적검사시치료에따라 band 염색강도가약해졌으며말초혈액도말법에서보다먼저음성소견을나타내었다. 결론 : OptiMAL 검사법은말라리아진단에있어간단하고신속하며정확한검사법으로, 말라리아의초기진단뿐만아니라치료효과판정및추적검사에도유용한것으로생각되었다. 참고문헌 1. 박재원, 손정일, 허준평, 정현순, 황보영, 이상원등. 한국에서의 1999 년도삼일열말라리아발생현황. 감염 2000; 4: 335-9. 2. Krogstad DJ. Malaria as a reemerging disease. Epidemiol Rev 1996; 18: 77-89. 3. World Health Organization. WHO expert committee on malaria. World Health Organization, Technical reports series No.892. 2000; 1-25. 4. Kawamoto F. Rapid diagnosis of malaria by fluorescence microscopy with light microscope and interference filters. Lancet 1991; 337: 200-2. 5. Baird JK, Purnomo, Jones TR. Diagnosis of malaria in the field by fluorescence microscopy QBC capillary tubes. Trans R Soc Trop Med Hyg 1992; 86: 3-5.
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