Laboratory Medicine Online eissn: Laboratory Medicine Online 진단검사의학온라인 Vol. 1 No. 2 April 2011

Laboratory Medicine Online eissn: 2093-6338 www.labmedonline.org Laboratory Medicine Online 진단검사의학온라인 Vol. 1 No. 2 April 2011

Laboratory Medicine Online 진단검사의학온라인 Vol. 1 No. 2 April 2011 번역 >>> 67 예기치못한 Hemoglobin A 1c 결과 Unexpected Hemoglobin A1c Results Alina-Gabriela Sofronescu, Laurie M. Williams, Dorinda M. Andrews, Yusheng Zhu 원저 >>> 72 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 Effects of Long Distance Transportation of Specimens on Test Results 임환섭, 이유경, 민원기 Hwan Sub Lim, You Kyung Lee, Won Ki Min 81 한국인비호지킨림프종의백혈병성골수침습에대한임상혈액학적소견 Clinico-hematologic Findings of Leukemic Bone Marrow Involvement in Korean Patients with Non-Hodgkin Lymphoma 김지명, 박찬정, 장성수, 지현숙, 허주령, 강윤구, 서종진 Ji-Myung Kim, Chan-Jeoung Park, Sung-Soo Jang, Hyun-Sook Chi, Joo-Ryung Huh, Yoon-Koo Kang, Jong-Jin Seo 88 빈혈환자에서철결핍의예측인자로서혈중 Pro-hepcidin Seum Pro-hepcidin As an Predictor of Iron Deficiency in Anemic Patients 김지명, 손용학, 임춘화 Jimyung Kim, Yonghak Son, Chunhwa Ihm 94 Coapresta 2000 을이용한혈액응고검사의평가 Evaluation of An Automated Coagulation Analyzer Coapresta 2000 최종현, 송성욱, 박용정, 최종락, 송재우 Jonghyeon Choi, Sungwook Song, Yongjung Park, Jong Rak Choi, Jaewoo Song 100 LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR 의말라리아진단유용성 Evaluation of the LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR for the Diagnosis of Malaria 이혜진, 김하늬, 유병준, 김장수, 김명한, 임채승, 이갑노 Hye Jin Lee, Ha Nui Kim, Byong Joon Yoo, Jang Su Kim, Myong Han Kim, Chae Seung Lim, Kap No Lee 105 체액및요검체접종을위한자동접종장비 PREVI Isola 의유용성평가 Evaluation of an Automated Instrument, PREVI Isola for Inoculation of Body Fluids and Urine Samples onto Agar Plates 김윤정, 윤서영, 손영숙, 이양순, 정혜선, 이운형, 용동은, 정석훈, 이경원, 정윤섭 Yoonjung Kim, Seoyoung Yoon, Young Sook Sohn, Yangsoon Lee, Hae-Sun Chung, Woonhyoung Lee, Dongeun Yong, Seok Hoon Jeong, Kyungwon Lee, Yunsop Chong 증례 >>> 110 클론성염색체이상을보인혈구포식림프조직구증 1 예 A Case of Hemophagocytic Lymphohistiocytosis with Clonal Karyotype Abnormalities 최계령, 김하늬, 조치현, 유병준, 김명한, 김장수, 임채승, 이갑노 Gae-Ryung Choi, Ha-Nui Kim, Chi-Hyun Cho, Byoung-Joon Yoo, Myung-Han Kim, Jang-Su Kim, Chae-Seung Lim, Kap No Lee 115 MCCC2 유전자의새로운변이에의한 3-Methylcrotonyl-CoA Carboxylase 결핍증 Identification of a Novel Mutation in the MCCC2 Gene of a Korean Patient with 3-methylcrotonyl-CoA Carboxylase Deficiency 김병철, 이동환, 기창석, 박형두, 최태윤, 신정원, 이용화 Byung Chul Kim, Dong Hwan Lee, Chang-Seok Ki, Hyung-Doo Park, Tae-Youn Choi, Jeong Won Shin, Yong-Wha Lee eissn 2093-6338 www.labmedonilne.org

번역 Lab Med Online Vol. 1, No. 2: 67-71, April 2011 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.1 임상화학 예기치못한 Hemoglobin A 1c 결과 Unexpected Hemoglobin A1c Results Alina-Gabriela Sofronescu, Laurie M. Williams, Dorinda M. Andrews, Yusheng Zhu Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, Charleston, SC, USA 증례 B 형간염, 고지혈증, 고혈압, 빈혈, 우울증의병력을갖고있는 52 세여성이일상적인진료를위해내과클리닉에방문했다. 3 개월 전의혈당검사는 5.9 mmol/l (106 mg/dl) ( 참고치 3.9 5.6 mmol/ L [70 100 mg/dl]) 로공복혈당장애 (impaired fasting glucose) 에 해당하는농도를나타내었다. 따라서, hemoglobin (Hb) A 1c 검사 를시행하게되었다. 양이온교환고성능액체크로마토그래피 (CE- HPLC) (Hb A 1c Program on the VARIANT II TURBO Link System; Bio-Rad Laboratories) 로실시한 Hb A 1c 검사결과는 115.8% ( 참고 치 4.0 6.0%) 였다 (Fig. 1). 비정상적인 Hb A 1c 결과가헤모글로빈병증으로부터기인했는지 를알기위해서 Bio-Rad VARIANT CE-HPLC β-thalassemia Short Program 으로 Hb 변이형분석을시행하였다. 분석결과에서 Hb A 2 (3.2%) 와 Hb F (<1.0%) 는정상이었고, Hb A 는없었으며 sickle cell Hb (Hb S) (37.4%) 이나타났다 (Fig. 2). 그리고 Hb A 에앞서분리되 는다른커다란 peak (53.0%) 가나타나서 P2 라하였다. 이결과는 번역 : 이선민부산대학교의학전문대학원진단검사의학교실 E-mail: yaong97@paran.com Received: March 11, 2011 Revision received: March 11, 2011 Accepted: March 14, 2011 * 본원고는양잡지의발행인사이의협약에의하여 Clinical Chemistry 에실린영문논문을번역하여게재하는것으로, 본논문을인용하고자할때는다음과같이원논문을인용하여야함. 원논문의저자사사표기및기타원고의내용과관련이없는부분은번역과정에서생략하였음. 원문인용 : Sofronescu AG, Williams LM, Andrews DM, Zhu Y. Unexpected Hemoglobin A1c Results. Clin Chem. 2011 Feb;57(2):153-6. Little RR. Commentary. Clin Chem. 2011 Feb;57(2):156. Fisher SJ. Commentary. Clin Chem. 2011 Feb;57(2):157. This article is available from http://www.labmedonline.org 2011, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Hb S의존재와함께, Hb A 1c 와거의동일한크로마토그라피정체시간 (retention time) 을보이는 Hb 변이형이있음을암시하였다 (Figs. 1, 2). 다음으로 ph 6.0에서 Hb 전기영동분석 (QuickGel Acid; Helena Laboratories) 을실시한결과 Hb S의존재와함께 Hb F 위치와유사한이동성을보이는또다른비정상적띠가확인되었다. 환자경과관찰 Hb 변이형을확인하기위해환자의 β globin 유전자의 DNA 염기서열을조사하였다. 분석결과한대립유전자는 codon 6에서 Hb S에상응하는 (GAG 에서 GTG으로 [Glu to Val]) 치환이발견되었고, 다른대립유전자는 Hb Raleigh에상응하는 codon 1 (GTG 에서 GCG으로 [Val to Ala]) 치환이발견되었다. 생각해야할점 1. Hb A 1c 측정하기위한다양한방법에는어떤것이있는가? 2. Hb 변이형은이런 Hb A 1c 측정방법각각에어떤영향을미치는가? 3. 잘못된 Hb A 1c 결과가나왔을때어떻게해야하는가? 이환자에서 Hb A 1c 를 CE-HPLC법으로검사한결과가잘못나온이유는 Hb A 1c 와정체시간이유사한 Hb Raleigh의존재때문인것을암시한다. 그리고혼탁억제면역측정법 (turbidimetric inhibition immunoassay) (Dimension Clinical Chemistry System; Siemens) 으로실시한 Hb A 1c 검사에서는공복혈당장애 (5.9 mmol/ L[106 mg/dl]) 에합당하지않은값인 4.1% 가나왔다. 고찰 Hb A 1c 는 Hb A의 β chain의 N말단의발린잔기 (valine residue) 에당분자가비효소적으로결합하여만들어진다. N말단잔기의이와같은당화반응은 Hb A의구조를바꾸고양전하를감소시킨다. 미국당뇨병협회는당뇨병의선별과진단그리고당뇨병환자에서장기적혈당조절의지표로 Hb A 1c 를측정할것을권고하면 eissn 2093-6338 www.labmedonilne.org 67

Sofronescu A-G et al.: 예기치못한 Hemoglobin A 1c 결과 Peak name Calibrated area (%) Area (%) Retention time (min) Peak area A1a - 0.4 0.106 6,826 A1b - 4.6 0.213 76,457 A1c 115.8* - 0.405 816,032 P3-1.3 0.770 21,144 Variant window - 4.2 0.860 70,124 S window - 40.2 0.920 665,722 *Value outside of expected range Total area: 1,656,306 20.0 A1b A1c S Analyte ID Percent Time (min) Area P1 1.2 0.75 33,627 F 0.5 0.94 16,262 P2 53.0 1.30 1,542,147 Ao 2.7 2.28 79,887 Unknown 1 1.6 2.50 47,682 A2 3.2 3.68 108,007 S window 37.4 4.45 1,088,414 53.0% 37.4% 30 P2 S 17.5 Hb A1c (%) 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 A1a 0.11 0.21 서, Hb A 1c 의기준치 (cutoff) 로 6.5% 가제안하였다 [1]. 0.40 Hb A 1c 분석방법은분자전하와구조에근거를둔방법으로크 게 2 종류로나뉘어진다. 분자전하에근거를둔방법에는양이온 교환고성능액체크로마토그래피와전기영동법이있고, 구조에근 거를둔방법에는면역측정법, 붕산친화성크로마토그래피법 (boronate affinity chromatography), 질량분석법 (mass spectrometry) 이있다 [2]. 양이온교환고성능액체크로마토그래피와전기영동을 이용한분석법에서는, N 말단의발린의당화반응이양전하를감소 시킴으로해서 Hb A 1c 가 Hb A 로부터분리되는원리를이용한것 이다. 따라서분자전하에근거한분석방법은단백질번역후변형 (posttranslational modification) ( 예를들어, carbamylation 과 acetylation) 또는전하의변화를초래하는 Hb 돌연변이에의해영향 을받을수있다 [2, 3]. 그러나 Hb AS, Hb AC 와같은흔한 Hb trait 들은이번분석 (Bio-Rad VARIANT II TURBO) 과같이양이온교환 고성능액체크로마토그래피를이용한 Hb A 1c 검사에영향을주지 않는다 [4]. 면역측정법은 Hb A 1c 을정량측정하기위해 β chain 위 의 N 말단당화아미노산을표적으로하는항체를사용하고, Hb 0.77 0.86 0.92 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 Time (min) Fig. 1. CE-HPLC chromatogram for Hb A1c analysis. Hb S and an aberrant Hb A1c value of 115.8% represented the predominant Hb peaks in the chromatogram. Percentage of Hb (%) 20 10 0 F 3.2% 0 1 2 3 4 5 6 Time (min) Fig. 2. Chromatogram of Hb variants analysis with the CE-HPLC β- Thalassemia Short Program. Hb S (37.4%), wild-type Hb A2 (3.2%), and Hb F (<1.0%) were identified, but Hb A was not detected. A large peak, which we designated P2, was detected at 53.0%. A 1c 백분율은 Hb A 1c 와 Hb 농도로부터계산하여얻는다 [2]. 따라 서, N 말단아미노산의항원결정인자 (epitope) 의당화를방해하는 요소나또는그 epitope 의돌연변이가항체의항원인식에영향을 미쳐잘못된결과를가져올수있다. 또한 Hb F (>10%) 가증가된 환자에서는면역측정법에의해잘못된낮은 Hb A 1c 값을보일수 있는이유는 Hb F 의 γ chain 이 Hb A 의 β chain 과처음 10 개의아 미노산중에 4 개만을공유하고있어서 Hb A 1c 분석에서이용되는 대부분의항체가 Hb F 와는거의반응하지않기때문이다 [2]. 붕산 친화적크로마토그라피분석법에서는붕산이당화반응에의해형 성된시스디올그룹 (cis diol group) 과반응하기때문에 Hb A 1c 와 같은당화혈색소가 Hb A 와구분될수있는것이다 [2]. 한편으로는 Hb Himeji 와같이과량의당화가일어난 Hb 변이형은붕산친화 성크로마토그라피에영향을줄수있다 [5]. IFCC 참고방법인질량 분석법은 Hb A β chain 의당화 N 말단발린을특이적으로측정한 다 [6]. 그러나질량분석기기가매우고가이고그것의설치와작동 이복잡한특성때문에대부분의임상검사실에서가까운장래에 A2 68 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.1

Sofronescu A-G et al.: 예기치못한 Hemoglobin A 1c 결과 사용하기는불가능하다 [2]. 이환자의 Hb A 1c 를분석하기위하여처음에사용된방법은양이온교환고성능액체크로마토그래피방법이었다. 양이온교환고성능액체크로마토그래피 Hb 변이형분석 (Fig. 2), 산성젤 Hb 전기영동법및 β-globin 유전자의 DNA 염기서열분석을통해거짓으로증가된 Hb A 1c 값이 Hb A 1c 와유사한곳에서용출된 Hb Raleigh에기인한것으로밝혀졌다 (Fig. 1). Hb Raleigh는 β chain의첫번째아미노산인 N말단발린을부호화하는코돈 (codon) 의 2번째염기가 T에서 C로바뀌는돌연변이가일어나발린이알라닌으로바뀐것이다. 이치환은 N말단알라닌이 translation 직후에아세틸화되어아세틸알라닌으로바뀌는경우를제외하면 Hb A 전하에는영향을미치지않는다 [7, 8]. 그러나아세틸화가일어나면 Hb A 1c 와유사하게양전하가감소되어, Hb A 1c 와 Hb Raleigh의정체시간이비슷하게된다. 결과적으로이두종류의 Hb는크로마토그램에서같은위치에용출 peak가형성되는것이다 (Fig. 1). 따라서이환자에서 Hb Raleigh의존재는양이온교환고성능액체크로마토그래피방법으로측정시 Hb A 1c 가거짓으로높게나타난원인이된다. Chen 등 [9] 은 Bio-Rad VARIANT CE-HPLC Hb A 1c 측정에서 Hb Raleigh로인하여거짓으로증가된 Hb A 1c 에대한증례를보고하였다. 그증례의환자는 Hb A와 Hb Raleigh의이형접합체를가진환자였고검사결과나타난 46% 의 Hb A 1c 에는진짜 Hb A 1c 은소량만포함되어있었다. 이환자의경우 Hb S와 Hb Raleigh 의이형접합체였는데 Hb S는 β chain의 N말단발린이당화되어 Hb S 1c 가되고, Hb Raleigh의 N말단아세틸알라닌은당화되지않는다. 그래서이환자에서 Hb A 1c 는존재하지않는다. 증가된것처럼보이는 Hb A 1c 값 (115.8%) 은 1차적으로 Hb Raleigh 때문이었다. 이와유사한간섭을일으키는다른 Hb 변이형은 Hb Graz, Hb Sherwood Forest, Hb South Florida, Hb Niigata, carbamylated Hb A 등이있다 [2]. 혼탁억제면역측정법에서 4.1% 의 Hb A 1c 값을보였던것은, Hb A 1c 백분율에해당하는 Hb S 1c 를나타낸것이었고, 이환자가 Hb Raleigh와이형접합체였기때문에 Hb S 1c 는낮게측정되었다. Hb S 는 codon 6에서의치환 (GAG to GTG) 에의해 β chain글루타민산잔기가발린으로치환된것이다. 이치환이여섯번째아미노산잔기에서이루어진것이지만, 면역측정법에서쓰이는항체는여전히 Hb S 1c 를인식하여 Hb A1로측정된다. 그러나 Hb Raleigh의 β chain N말단의아세틸화된알라닌은당화될수없고그래서면역측정법에서항체가결합될수없다. Hb A 1c 의백분율을계산할때는분자는 Hb A 1c 로측정된 Hb S 1c 만포함하고, 분모는 Hb Raleigh 를포함한환자가가진모든 Hb를포함한다. 그러므로이환자에서면역측정법으로측정된 Hb A 1c 농도는대략 50% 정도낮게측정되었다. Hb A 1c 면역측정법에서의이와같은문제는 Chen 등 [9] 과 Jain 등 [10] 에의해제기되었다. 이와유사하게, 붕산친화성크로마토그라피분석은 Hb Raleigh β chain에있는 N말단아세틸알라닌이당화를방해하기때문에컬럼 (column) 에서붕산친화력이떨어져서 Hb Raleigh를갖고있는환자에서 Hb A 1c 가낮게측정된다 [9]. Chen 등과 Jain 등은이러한환자들에서 fructosamine 의이용, 하루에수차례의모세혈관혈당측정, 지속적인혈당모니터링등의방법을사용하기를권고했다. 이환자에서는검체가부족하여이러한검사를실시하지못했다. Hb Raleigh를갖고있는환자에게는 Hb A와 Hb A 1c 만특이적으로측정하는 IFCC 탠덤질량분석법이최선의검사법일수있지만, 본환자에서는 Hb A 또는 Hb A 1c 는없기때문에질량분석법이 Hb S와 Hb S 1c 를측정할수있다고해도소용이없을것이다. 기억해두어야할요점 Hb A 1c 검사방법은분자전하를이용하는방법 ( 양이온교환고성능액체크로마토그래피와전기영동 ) 과분자구조를이용하는방법 ( 면역측정법, 붕산친화성크로마토그래피법, 질량분석법 ) 으로구분될수있다. Hb 변이형은양이온교환고성능액체크로마토그래피법이나전기영동법으로검사했을때 Hb A, Hb A 1c 와같이용출되거나이동할경우검사결과에영향을미칠수있다. Hb 변이형의아미노산치환이 anti-hb A 1c 항체인식부위인 β chain N말단 epitope 에서일어나거나또는환자의 Hb F가현저히높으면 Hb A 1c 면역측정법이영향을받을수있다. 당화반응이적게혹은많이일어난변이형은붕산친화성크로마토그래피법에영향을미칠수있다. 질량분석법은 IFCC 참고법으로, 일반적으로 Hb A 분자에유전적또는화학적변화에영향을받지않는것으로알려져있다. 비정상적인 Hb A 1c 결과가나올때에는 Hb 변이형의가능성을고려해야하고, Hb A 1c 의결과는환자의병력및다른검사결과를참조하여해석하여야한다. 더불어, Hb 변이형을확인하기위해노력해야하고, 영향을받지않는다른 Hb A 1c 검사방법을사용해야한다. 만약특정 Hb 변이형을구분할수있는적절한방법이없다면 fructosamine 측정의이용과하루에수차례의모세혈관혈당측정, 또는지속적인혈당모니터링등의방법을사용해혈당조절을감시할수있다. 이러한대체검사법은적혈구의수명이나당화반응의정도가변화된환자에서도사용할수있다. Hb A 1c 검사는이런환자에서는사용될수없다. 본증례는 Hb 변이형이 Hb A 1c 분석방법에어떤영향을줄수 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.1 www.labmedonilne.org 69

Sofronescu A-G et al.: 예기치못한 Hemoglobin A 1c 결과 있는지를잘보여주고있다. 비정상적인 Hb A 1c 값이측정될때또는측정된값이임상적인소견과맞지않을때 Hb 변이형에의한간섭의가능성을검토해야하고, Hb A 1c 결과는환자의병력과기타검사결과와함께해석해야한다. 또한 Hb 변이형을찾아내야하고환자의 Hb 변이형이 Hb A 1c 측정에영향을주지않는방법을선택해서환자의혈당의조절상태를모니터링해야한다. 참고문헌 1. American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes - 2010. Diabetes Care 2010;33(S):S11-61. 2. Bry L, Chen PC, Sacks DB. Effects of hemoglobin variants and chemically modified derivatives on assays for glycohemoglobin. Clin Chem 2001;47:153-63. 3. Weykamp CW, Penders TJ, Siebelder CW, Muskiet FA, van der Slik W. Interference of carbamylated and acetylated hemoglobins in assays of glycohemoglobin by HPLC, electrophoresis, affinity chromatography, and enzyme immunoassay. Clin Chem 1993;39:138-42. 4. Mongia SK, Little RR, Rohlfing CL, Hanson S, Roberts RF, Owen WE, et al. Effects of hemoglobin C and S traits on fourteen commercial glycated hemoglobin assays. Am J Clin Pathol 2008;130:136-40. 5. Ohba Y, Miyaji T, Murakami M, Kadowaki S, Fujita T, Oimomi M, et al. Hb Himeji or β 140 (H18) Ala-Asp. A slightly unstable hemoglobin with increased β N-terminal glycation. Hemoglobin 1986;10:109-25. 6. Jeppsson JO, Kobold U, Barr J, Finke A, Hoelzel W, Hoshino T, et al. Approved IFCC reference method for the measurement of HbA 1c in human blood. Clin Chem Lab Med 2002;40:78-89. 7. Marchis-Mouren G, Lipmann F. On the mechanism of acetylation of fetal and chicken hemoglobins. Proc Natl Acad Sci U S A 1965;53:1147-54. 8. Moo-Penn WF, Bechtel KC, Schmidt RM, Johnson MH, Jue DL, Schmidt DE Jr, et al. Hemoglobin Raleigh (beta1 valine replaced by acetylalanine). Structural and functional characterization. Biochemistry 1977;16:4872-9. 9. Chen D, Crimmins DL, Hsu FF, Lindberg FP, Scott MG. Hemoglobin Raleigh as the cause of a falsely increased hemoglobin A 1c in an automated ion-exchange HPLC method. Clin Chem 1998;44(Pt 1):1296-301. 10. Jain N, Kesimer M, Hoyer JD, Calikoglu AS. Hemoglobin Raleigh results in factitiously low hemoglobin A 1c when evaluated via immunoassay analyzer. J Diabetes Complications 2011;25:14-8. 70 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.1

Sofronescu A-G et al.: 예기치못한 Hemoglobin A 1c 결과 논평 논평 Randie R. Little Departments of Pathology & Anatomical Sciences, and Child Health, University of Missouri School of Medicine, Columbia, MO, USA 전세계적으로또한미국에가장흔한네가지 Hb 변이형은 Hb S, Hb E, Hb C, Hb D 이다. 그외에도많은변이형들이있다. 이런 변이형들은이형접합형 ( 예, Hb S trait) 에서와같이대개임상증상 을나타내지않으므로인식하지못하고지나가는수가많다. 그렇 지만이런 Hb 변이형들은종종검사결과의오류를보일수있기 때문에여전히임상적으로중요하다. 많은당뇨병환자들은임상 적증상은없지만 Hb A 1c 측정에영향을미칠수있는 Hb 변이형 을갖고있다. 일반적으로쓰이는 Hb A 1c 검사방법은대부분 4 개 의가장흔한 Hb 변이형 traits 에대해평가를했고 (http://www. NGSP.org), 이런변이형중하나이상이어떤방법에대해서는영 향을미치더라도나머지는그렇지않다. Hb 변이형이적혈구의수 명을변화시키거나실제로 Hb 당화반응에영향을주면, Hb A 1c 측 정은임상적으로의미가있는결과를얻기어렵다. Sofronescu 등 이보고한환자의경우는실제로 Hb S 와 Hb Raleigh 2 종류의 Hb 변이형이있었다. 이환자에서는 Hb A 가없기때문에직접 Hb A 1c 를측정할수없다. 대신이환자에서는붕산친화법으로당화 Hb S 와당화 Hb Raleigh 를포함하는총당화 Hb 을측정하는것을고 려할수있겠다. 다만 Hb Raleigh 에서특정아미노산의치환으로 인해서 (Hb A 와비교할때 ) 훨씬적게당화된다는사실을고려해 야한다. 드물게는 Hb A 1c 측정대신에 fructosamine 나계속적인혈 당모니터링과같은다른방법으로혈당조절을측정해야하는경 우가있다. 하지만압도적인대부분의당뇨병환자에서 Hb A 1c 측 정은적절한방법을사용하기만하면장기혈당조절을평가하는 가장좋은방법이다. 모든장비제조사는자기회사방법의한계를 명확하게제시해야할책임이있으며, 또한검사실은자신이측정 하는방법의이러한한계를분명히인식하고적절한때임상의에 게도알려줄책임이있다. Simon J. Fisher Department of Internal Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism and Lipid Research, Washington University, St. Louis, MO, USA Hb A 1c 는직전 3 개월기간 ( 적혈구의수명 ) 동안의혈당조절을 평가하는표준검사법이다. 미국당뇨병협회는최근 Hb A 1c 의증 가 ( 예, 6.5%) 를당뇨병진단기준으로승인하였다. 본증례의환자 에서는당뇨병전상태의공복혈당장애와현성당뇨병을구분하기 위해 Hb A 1c 검사를실시하였다. 통상사용되는양이온교환고성 능액체크로마토그래피법 Hb A 1c 검사법은거짓으로엄청나게높 은 Hb A 1c 값 (115.8%) 을보고했고, 의료진에게경고하여조사를할 수있었다. 이증례보고에서환자의잘못된 Hb A 1c 검사결과는 Hb A 1c 가나오는크로마토그램띠를증가시키는 Hb 변이형, Hb Raleigh 의존재때문인것으로밝혀졌다. 이상혈색소증을가진사람 에서는 Hb A 1c 검사결과가잘못높게 ( 혹은낮게 ) 나와당뇨병에대 해과도한혹은부족한치료가이루어질수있다 ( 국립당화혈색소 표준화프로그램웹사이트 http://www.ngsp.org/interf.asp). 이색 혈색소증외에도적혈구수명에영향을주는질환에서도역시 Hb A 1c 의결과가기존의방법으로정확하게측정됨에도당조절을잘 못반영할수있다. 용혈또는급성실혈과같이적혈구회전율이 높은경우혹은신장질환처럼적혈구수명이길어진경우에는당 화될수있는시간이달라져서이런과정으로인해 Hb A 1c 결과값 이혈당조절상태를각각과소혹은과대평가할수있다. 그래서 의료진은 (a) Hb A 1c 값이환자의혈당치나임상증상과일치하지 않을때, (b) Hb A 1c 결과가 15% 이상일때, (c) Hb A 1c 검사결과가 검사방법간에차이가많이날때에는이상혈색소증혹은적혈구 수명과관련된질환을의심해야한다. Hb A 1c 값을신뢰하지못할 경우, 당뇨병환자의혈당조절상태를좀더정확하게평가하기위 해 fructosamine 측정, 잦은매일혈당검사혹은지속적인혈당모 니터링등의검사를사용해야한다. DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.1 www.labmedonilne.org 71

원저 Lab Med Online Vol. 1, No. 2: 72-80, April 2011 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.2 임상화학 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 Effects of Long Distance Transportation of Specimens on Test Results 임환섭 1 이유경 2 민원기 3 Hwan Sub Lim 1, You Kyung Lee 2, Won Ki Min 3 관동의대진단검사의학교실 1, 순천향의대진단검사의학교실 2, 울산의대진단검사의학교실 3 Department of Laboratory Medicine 1, Kwandong University College of Medicine, Goyang; Laboratory Medicine and Genetics 2, Soonchunhyang University Bucheon Hospital and Soonchunhyang University College of Medicine, Bucheon; Department of Laboratory Medicine 3, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, Seoul, Korea Background: Accuracy of laboratory test results is an important issue. New guidelines for specimen delivery systems are needed for appropriate pretreatment of specimens and accuracy of results. Methods: We evaluated various laboratory profiles, comparing the effects of specimen rack holders and coolants within transport containers. The hematology profiles (complete blood cell count [CBC], erythrocyte sedimentation rate [ ESR]), chemistry profiles (aspartate aminotransaminase [ AST], alanine aminotransaminase [ ALT], gamma-glutamyl transferase [ γ-gt], electrolytes [ Na, K, Cl], glucose, lactate dehydrogenase [ LD], creatinine kinase [CK]), and coagulation profiles (prothrombin time [PT], activated partial thromboplastin time [aptt], fibrinogen level). We also investigated the effects of transportation time including the presence or absence of hemolyzation. We received from 9 different university hospital laboratories using conventional transporation methods. Results: Hemolytic features were seen in short drawn specimens. Fewer result variations were observed in specimens transported with coolants. Average specimen transportation time was 11.3 hours, and average temperatures of container was 10.9 with coolant and 25.0 without coolants. Non-centrifuged specimens transported with coolants showed increased serum K levels than centrifuged specimens. Coagulation tests showed less than a 10% differences. Centrifuged specimen prior to transportation showed no hemolyzation and no differences in results. Conclusions: Appropriate temperatures for each analyte should be defined to ensure the accuracy of results. To reduce hemolyzation, appropriate temperature and rack holder should be used. Temperature of the transport container should be monitored in objectively. Coagulation tests should be added as referral tests, if appropriate specimen transport monitoring system for time and temperature could be adopted. Key Words: Specimen delivery, Container, Hemolysis 서론 Corresponding author: Hwan Sub Lim Depatment of Laboratory Medicine, Myongji Hospital, Kwandong University College of Medicine, 697-24 Hwajeong-dong, Deogyang-gu, Goyang 412-270, Korea TEL: +82-31-810-7081, FAX: +82-31-962-1352 E-mail : capt95@kd.ac.kr/capt95@hitel.net Received: July 10, 2010 Revision received: October 14, 2010 Accepted: November 2, 2010 * 본연구는 2008 년도대한진단검사의학회검사실신임위원회학술연구비에의한연구임. This article is available from http://www.labmedonline.org 2011, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 의료기술의발전으로인하여환자진료부문에서의검사실의존도는점차증가하는추세에있다. 이로인하여자체검사실운영이어려운개원의사들도검사를많이이용하고있고뿐만아니라, 대형병원에서도다양한희귀질환들을진단하기위한특수검사를편리성및효용성면에서자체검사실이아닌외부수탁전문의료기관에의뢰하게된다. 따라서수탁전문의료기관의검사건수는빠르게증가하고있다. 대한진단검사의학회검사실신임위원회에 2007년각기관에서보고한자료에따르면수탁전문의료기관의수는중 소형기관을포함하여현재총 26개기관이신고되어있으며, 2007년한해동안약 106,949,934 건의검사를처리한것으로보고되었다. 각의료기관에서의뢰되는검체들은다양한검사전인자들에의하여영향을받을수있다. 최근검체운송은차량을이용한방법이주로사용되지만우편을이용한검체운송방법을사용한경 72 www.labmedonilne.org eissn 2093-6338

임환섭외 : 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 우, 혈청내검사항목 8가지중빌리루빈만이불안정한결과를보이는것으로보고된바있다 [1]. 시험관내의젤의유무, 미원심분리검체혹은원심분리후검체운송등의검사전인자들이검사결과에영향을미친다는보고도있다 [2]. 또한운송되는검체들은계절적요인에따른가성고칼륨혈증등의현상이나타나는것으로보고되었다 [3]. 현재검사실신임위원회에서실시하는검사실인증사업에수탁전문의료기관과관련되어검체운반에대하여평가를실시하고있다. 그러나운송상자의온도기록이실시간으로이루어지지않고있으며검체별보관조건등에대한정확한지침이없어수탁전문의료기관들이자체적으로설정한방법을사용하고있으며대부분간단한냉매만을운송상자내에넣어사용하고있는실정이다. 대부분의위탁검사용검체들은의뢰한의료기관으로부터검사실시전까지상당히많은시간이소요되고있으나이에대한정확한시간소요상황이나검체에미치는영향등에검체위탁과관련되어정확하게조사된바없다. 신뢰성있는결과보고를위하여효과적인검체의운송방법등에대한지침이절대적으로필요하다. 이에저자들은검체의운반조건및운송환경에대한연구를실시하여검사결과에미치는영향에대하여조사하고이를토대로검사의질향상을위한검체의운반조건및환경에대한지침을제시하고자한다. 4개씩을채취하였다. 검체의공여자의수는검사결과의변이를줄이기위하여최소화를원칙으로하여각기관당 5명의지원자만을선발하여동의를얻어검사에참여하도록하였다. 3) 대상검사종목대상검사종목은일반적으로많은검사가이루어지는일반혈액학적검사인전혈구계산, 적혈구침강속도, 임상화학검사인 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), gamma-glutamyl transferase (γ-gt), 전해질 ( 나트륨, 칼륨, 염소 ), 혈당, lactate dehydrogenase (LD), creatine kinase (CK) 와검체운반의제한을받으나일반적으로필요한혈액응고검사인프로트롬빈시간, 부분트롬보플라스틴시간, 섬유소원등으로제한하였다. 운송전검사는 8개기관에서실시한후, 검체를운송하였으며운송전실시한혈청검체도제공받아본원에서재검하여검사결과의차이를분석하였다. 임상화학검사는본원에서사용중인 TBA-200FR Neo (Toshiba Medical System Corp., Tochigi-ken, Japan), 혈액학검사는 LH-860 (Beckman-Coulter Inc., Fullerton, CA, USA), 혈액응고장비는 ACL Advance (Instrumentation Laboratory Corp., Bedford, MA, USA), 적혈구침강속도는 Test 1 automatic ESR analyzer (SIRE analytical system, Polverara, Italy) 을사용하였다. 재료및방법 1. 참여기관및검체 1) 참여기관 1 본원에서는채혈량의차이와검체운송시간경과에따른검사결과의상관성을대상으로연구를실시하였다. 2 장거리운송에소요되는시간및시간경과에따른변화를보고자서울지역 1기관, 강원지역 1기관, 충청지역 2기관, 호남지역 2 기관, 영남지역 1기관, 제주지역 1기관총 8기관을대상으로하였다. 2) 검체채취 1 본원에서실시한채혈량과운송시간경과에따른결과비교를위하여 3명의건강인으로부터는 EDTA 검체 7개, plain 시험관검체 7개, sodium citrate 시험관검체 7개를각검체별로각각 4 ml, 8 ml, 1.5 ml 채취하였다. 또다른 3명으로부터는 sodium citrate 시험관검체를제외한나머지검체를시험관용량의 1/2만채취하였다. 2 장거리운송에사용된검체는 8기관에서별도로검체를채취하였다. 각기관당건강인 1인당 EDTA 시험관검체 4개, SST 시험관검체 4개, plain 시험관검체 4개, sodium citrate 시험관검체 2. 채혈량, 검체운송조건및시간에따른결과변화 1) 채혈량검체운송시차량진동에따른용혈정도를비교하기위하여진공시험관으로채혈을할때, 혈액을가득채운시험관과 1/2만채운시험관으로채혈량을달리하여운송하였다. 2) 검체의운송조건채혈한검체를실온상태와냉매가들어간운송상자에검체 rack holder 를설치하고운송상자안에넣어운송후용혈정도를비교하였다. 동일한사람으로부터채혈한검체로냉매유무및운송상자내의온도변화에대하여평가하였으며, 운송시작전해당검사종목에대한검사를실시하여기본값으로설정하여, 운송시간별검사결과의변화를관찰하였다. 각운송상자내에는 rack holder 에각시험관별및검체용량별총 36개의시험관을장착하였다. 운송조건은기존의검체운송과동일한조건을주기위하여아침에채혈된검체를차량내에싣고 12시간동안운행하여검체에가해지는충격및차량내온도변화와운송상자내의온도를매시간관찰하였다. 운송중인검체의시간별변화를측정하기위하여매 2시간마다검체를검사실로전달하여대상항목에대한검사업무를실시하도록하였다. DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.2 www.labmedonilne.org 73

임환섭외 : 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 3. 기관간검체운송조건및운송방법 1) 운송조건각종류별검체중 1개씩은 rack holder에꽂아서고정을시키고나머지 1개는운송상자내에고정하지않은상태로운송을하되, 냉매가들어간운송상자와실온상태인운송상자를동시에운송하였다. SST시험관검체는원심분리후, plain 시험관검체는원심분리하지않은상태로온도가다른 2가지운송상자에넣어운송하였다. 각단계별운송시간은지역기관에서검체를접수한시각, 검체가지역수탁전문의료기관의각지역사무실도착시각, 각지역에서서울에위치한수탁전문의료기관으로의발송시각, 검체도착시각등을비롯하여운송상자내의온도를기록하여실질적인검체운반소요시간및운송상자내의온도를측정하였다. 운송상자내의온도는수탁검사의료기관들이통상적으로사용하는일반온도계를사용하였다. 2) 운송방법및운송시간기록각병원검사실에서검체배송직원에게검체가전달되는시점에서의검체운송상자내의온도를측정하여기록하도록하였으며, 각단계별운송수단및운송상자의출발시간과도착시간을기록하여각단계별소요시간을산출하였다. 4. 혈청및혈장헤모글로빈측정본연구에사용한모든검체들을대상으로각각의혈청과혈장을분리하여혈청및혈장내의헤모글로빈농도를측정하였다 [4]. 채혈즉시분리한혈청및혈장을 blank 값으로사용하였다. 검체의용혈정도는육안평가는객관적인기준이되지않아혈청및혈장내헤모글로빈농도를측정하여평가하였다. 5. 통계처리본연구에서는냉매유무및 rack holder 사용여부에따른검사결과의차이를보고자하였기에이들사항에대한검사결과값을 Excel 프로그램 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) 의 T-test 를사용하여통계학적의의를평가하였다. 결과 1. 검체운송시간대별검사결과변화전혈구계산검사결과는채혈후 12시간동안매 2시간마다측정한결과와채혈직후측정한결과의차이가 10% 이내로비교적안정적인것으로나타났다. 혈장내헤모글로빈의농도는 1.5 ml만을채운 EDTA 시험관검체에서높게관찰되었다 (Table 1). 임상화학검사의결과에서는검체용혈로인하여 LD, CK 변화가 Table 1. Complete blood cell count results according to transportation time (hours) Test Item Coolant Sample Volume(mL) 0 2 4 6 8 10 12 WBC (10 3 /μl) RBC (10 6 /μl) Hb (g/dl) Hct (%) PLT (10 3 /μl) Plasma Hb (%) With Without With Without With Without With Without With Without With Without 3 1.5 3 1.5 3 1.5 3 1.5 3 1.5 3 1.5 3 1.5 3 1.5 3 1.5 3 1.5 3 1.5 3 1.5 7.1 9.7 10.3 7.3 5.1 5.4 5.4 5.1 15.6 15.9 16.0 15.1 45.5 46.4 46.9 45.5 228 287 297 228 8.9 27.3 4.6 20.9 7.2 10.1 10.6 7.8 5.1 5.3 5.4 5.1 15.4 15.6 15.7 15.6 46.1 46.5 46.8 47.0 239 294 300 238 10.0 21.6 2.3 6.4 7.0 10.0 10.3 7.6 5.1 5.4 5.4 5.2 15.3 15.6 15.7 15.6 45.9 46.5 47.4 46.8 239 277 293 235 3.5 20.6 2.3 11.3 7.1 10.6 10.3 7.8 5.0 5.4 5.4 5.1 15.3 15.9 15.6 15.6 46.1 46.5 47.3 47.0 226 297 295 240 4.8 16.2 2.3 9.0 7.0 10.6 10.3 7.6 5.0 5.4 5.4 5.1 15.3. 15.9 15.7 15.7 45.8 46.5 47.4 47.4 237 297 299 239 6.7 23.5 1.7 9.0 7.0 10.5 10.2 7.3 5.0 5.4 5.4 5.1 15.1 15.8 15.6 15.6 44.9 46.3 47.2 47.5 228 292 289 235 1.0 23.8 1.1 7.1 7.7 10.4 10.2 7.5 5.1 5.4 5.4 5.1 15.4 15.8 15.7 15.4 46.5 46.9 47.8 47.1 240 298 297 244 6.9 43.2 1.4 8.2 Abbreviations: WBC, white blood cell Count; Hb, hemoglobin; Hct, hematocrit; PLT, platelet. 74 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.2

임환섭외 : 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 관찰되었다. 특히 4 ml만을채운 plain 시험관검체에서의변화는 12시간동안매 2시간마다측정한결과와채혈직후측정한결과의차이가 10% 이내로비교적안정적인것으로나타났다. 특히혈청내칼륨결과는냉매가없는운송상자에서는비교적처음검사결과와유사한것으로나타났으나냉매가포함된운송상자로운반된검체에서는시간이경과함에따라점차증가하는것으로나타났다 (Table 2, Fig. 1). 혈액응고관련검사는시간경과에따른결과변화는없이비교적안정적인검사결과를보이는것으로나타났다 (Table 3). 혈청및혈장헤모글로빈은혈액응고검사를제외한전혈구검사 용검체와임상화학검체중냉매가있는운송상자로운반된검체에서만관찰되었다 (Tables 1, 2). 12시간동안관찰한운송상자내온도의변화는냉매가없는운송상자내의온도가 22 로처음측정되었으나차량외부온도및시간에따라 28 까지증가하는것으로나타났으며, 평균온도는 27.2 인반면냉매가들어있는운송상자내의온도는평균 18.0 로안정적으로유지되는것으로나타났다. 외부온도에따라냉매가없는운송상자내의온도가변화하는것을관찰할수있었다 (Table 4). Table 2. Chemistry test results according to transportation time (hour) Test Item Coolant Sample Volume (ml) 0 2 4 6 8 10 12 AST (IU/L) ALT (IU/L) γ-gt (IU/L) Na (mmol/l) K (mmol/l) Cl (mmol/l) Glucose (mg/dl) LD (IU/L) CK (IU/L) Plasma Hb (%) With Without With Without With Without With Without With Without With Without With Without With Without With Without With Without 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 8 4 22 19 16 19 17 20 15 20 38 20 23 20 142 142 141 142 4.2 4.4 3.9 4.4 102 105 100 105 104 96 85 96 367 338 310 338 66 86 102 86 4.4 5.4 3.1 0.0 20 20 16 21 17 19 15 19 38 23 23 23 143 141 141 142 4.5 5.0 3.9 4.6 100 103 100 104 100 92 85 87 364 383 310 422 64 90 102 90 2.2 28.3 2.6 10.2 21 19 15 18 15 19 15 19 37 23 23 24 142 141 141 142 4.6 5.1 3.4 4.5 101 103 100 104 96 88 79 81 362 364 315 371 63 88 100 86 2.2 8.6 1.5 0.9 21 21 16 20 16 19 16 19 37 23 23 24 141 141 143 142 4.9 5.6 3.5 4.3 101 104 100 103 94 84 66 69 406 442 319 393 62 94 100 91 1.3 20.0 1.7 6.1 20 20 16 19 15 18 14 18 38 24 25 25 143 142 153 143 5.2 5.9 3.3 4.0 101 104 100 103 91 82 62 60 361 446 343 414 65 92 100 90 2.2 20.0 1.1 7.8 20 20 15 19 15 17 14 18 37 23 24 25 143 142 143 144 5.8 6.2 3.4 3.9 101 104 99 102 88 78 50 55 405 480 343 404 65 93 96 90 4.8 23.5 2.0 5.4 21 26 15 18 14 19 14 18 37 24 24 25 142 140 143 144 6.5 6.5 3.5 3.8 101 103 99 102 86 76 45 47 415 653 349 405 64 95 95 88 1.1 48.4 NT* 4.1 *NT= Not tested. Abbreviations: AST, aspartate aminotransaminase; ALT, alanine aminotransaminase; γ-gt, gamma-glutamyl transaminase; Na, sodium; K, potassium; Cl, chloride; LD, lactate dehydrogenase; CK, creatine kinase. DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.2 www.labmedonilne.org 75

임환섭외 : 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 Table 3. Coagulation test results according to transportation time (hours) Test Item Coolant Sample volume (ml) 0 2 4 6 8 10 12 PT (sec) INR aptt (sec) Fibrinogen (mg/dl) Plasma Hb (%) With Without With Without With Without With Without With Without 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 11.20 11.20 0.99 0.99 24.63 24.63 216.32 216.32 0.00 0.00 11.05 11.15 0.97 0.98 23.63 24.16 230.29 234.5 0.00 0.00 10.70 11.30 0.93 1.00 23.03 26.23 221.57 224.78 0.00 0.00 11.30 11.10 1.00 0.98 25.70 25.43 219.87 227.93 0.31 0.00 11.55 10.85 1.03 0.95 24.63 23.16 219.27 209.81 0.00 0.00 11.30 10.65 1.00 0.92 25.83 23.63 223.87 224.90 0.00 0.00 11.30 10.70 1.00 0.93 25.76 24.63 203.27 221.27 0.00 0.00 Abbreviations: PT, prothrombin time; INR, international normalized ratio; aptt, activated partial thromboplastin time. K (mmol/l) 7 6 5 4 3 2 1 0 Transportation time elapsed K (8 ml, with coolant) K (4 ml, with coolant) K (8 ml, without coolant) K (4 ml, without coolant) 0 2 4 6 8 10 12 Fig. 1. Serum K Levels (mmol/l) changed according to transportation time elapsed Table 4. Temperature changes ( ) observed according to transportation time and external temperature of the transport vehicle Time elapsed (hr) Trip meter (km) External Temperature of Vehicle ( ) Temperature of specimen container With coolant Without coolant 0 0 25 20 22 1 6 28 15 23 2 12 28 16 26 3 0 29 15 26 4 28 32 15 27 5 16 35 20 32 6 14 34 19 28 7 16 32 16 28 8 10 32 21 28 9 6 32 18 28 10 10 31 18 28 11 5 30 19 28 12 5 30 22 29 2. 기관간검체운송조건에따른검사결과변화 1) 운송소요시간각의료기관에서검체를채혈하여수탁전문의료기관에도착하기까지소요된시간은평균 27.5 시간으로나타났다 (Table 5). 1개의료기관에서송부된검체의운송과정에서지연운송됨으로써전체적인운송시간에영향을미친것으로나타나이기관을제외하면 18.5 시간의시간이소요된것으로나타났다. 전체운송시간을각단계별로구분하여보면각의료기간에서채혈하여검체운반직원에게전달되기까지소요된평균시간은 3.5 시간이소요되었다. 검체를전달받은직원이이를해당수탁전문의료기관으로발송하기전단계인지역사무실까지운반한시간은평균 3.3시간이소요되었다. 각지역사무실로운송된검체가수탁전문의료기관까지운송에소요된시간은 20.7시간이었다. 이중검체운송과정에서잘못분류되어늦게운송된검체를제외하면통상적으로 11.3 시간이검체운송에소요된것으로나타났다. Table 5. Average transport time (hours) between participating laboratories and the central laboratory of reference laboratory Participants Sample Collected* Sample Send Sample Received Total 1 5.2 3.7 17.0 25.8 2 1.3 1.5 96.0 98.8 3 7.3 3.7 16.0 27.0 4 2.1 2.1 8.8 13.0 5 2.2 4.0 14.0 20.2 6 3.5 5.5 15.5 24.2 7 4.7 3.8 13.7 22.3 8 3.0 0.6 4.2 7.8 9 2.0 4.5 1.3 7.8 Average 3.5 3.3 20.7 27.5 *Time elapsed between collection of blood sample from patient and transfer to the transporter; Time elapsed between hospital laboratory and regional office of reference laboratory; Time elapsed between regional office and central laboratory of reference laboratory. 76 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.2

임환섭외 : 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 Table 6. Average temperature ( ) of sample transport container Participants Without Coolant* With Coolant* 1 23.8 13.1 2 22.0 3.2 3 28.2 18.0 4 25.3 9.0 5 21.7 6.7 6 23.8 6.3 7 27.2 15.9 8 28.2 17.3 9 27.2 14.4 Average 25.0 10.9 *Average temperature measured from sample drawn through whole transportation process. Table 7. Average CBC & ESR result differences (%) of between participants and reference laboratories Test Item 2) 운송상자내의온도 검체운송과함께측정된검체운송상자내의냉매유무에따른 평균온도는각각 10.9 와 25.0 인것으로조사되었다 (Table 6). 국내의료기관들이검체를수탁검사의료기관에의뢰하는경우, 국내검체운반기준이수립되어있지않아각자의기준을적용하 고있었다. 각수탁검사의료기관들은일부에서는드라이아이스 와같은냉매를사용하여운반상자내의온도를 10 미만으로유 지하였으나대부분의기관들은일반냉매를사용하고있는것으 로나타났다. With Coolant 3) 운송조건에따른각검사항목별결과비교 (1) 검체량과 rack holder 및냉매사용에따른결과변화 Without Coolant Using Rack No Rack Using Rack No Rack CBC-WBC -3.02 0.15 0.10-0.15 RBC -0.94-0.89-1.12-1.23 Hb -1.17-1.08-1.24-0.59 Hct 3.12 3.04 4.06 3.88 PLT -1.92-2.52-2.15-1.89 ESR -9.09-16.33-18.26-15.80 Abbreviations: WBC white blood cell count; Hb, hemoglobin; Hct, hematocrit; PLT, platelet; ESR, erythrocyte sedimentation rate. 각검사의뢰기관에서본원검사실로운송된검체들은검체 rack holder 를사용한검체중운송상자내에냉매를넣은것과넣 지않은검체를비교한결과, 전혈구계산검사의결과에서는헤마 토크리트치와적혈구침강계수종목이최초검사와차이가있는 것으로나타났다 (Table 7). 헤마토크리트치는운송방법이나조건 에관계없이평균 3% 정도증가하는것으로나타난반면, 적혈구 침강계수종목은냉매가들어간운송상자내에검체전용 rack 을 Table 8. Average blood chemistry (SST) test result differences (%) between participants and reference laboratories Test Item With Coolant 사용하여야다른운송방법에비하여 9% 로비교적낮은검사결과 차이를보이는것으로나타났다 (Table 7). SST 시험관을사용한검 체중 GGT, LD 종목과 plain 시험관을사용한검체중칼륨, LD 종 목에서각각 27.14-43.45%, 15.21-16.95%, 21.17-80.17%, 28.53-43.87% 로많은차이를보이고있었다 (Tables 8, 9). 혈청내칼륨의 경우, 냉매가있는운송상자내검체의결과가 rack 의사용여부와 관계없이냉매가없는운송상자내검체에비하여 4% 이상의증가 된결과값차이를보이고있었다 (Table 8). 검체전용 rack 를사용하지않은검체들은냉매유무에따라서 전혈구계산검사종목중혈색소, 헤마토크리트, 적혈구용적이, SST 시험관검체중에서는 AST, ALT, 나토륨, 칼륨검사항목과 plain 시 험관검체중에서는 γ-gt 종목, 혈액응고검사에서는프로트롬빈 시간, 부분트롬보플라스틴시간및섬유소원종목에서통계학적으 로유의한차이 (p<0.05) 를보여주고있었다. Without Coolant Using Rack No Rack Using Rack No Rack AST 1.88 1.71 1.09 0.51 ALT -5.53-5.67-5.92-6.03 GGT 28.74 27.14 43.45 28.29 Na 0.39 0.38 0.43 0.49 K 4.40 4.84-0.55-0.24 Cl -2.30-0.09-0.16-0.11 Glucose 17.21-2.48-2.69-5.92 LD 15.21 15.23 16.95 15.84 CK -1.27-1.24 0.29-0.77 Abbreviations: AST, aspartate aminotransaminase; ALT, alanine aminotransaminase; γ-gt, gamma-glutamyl transaminase; Na, sodium; K, potassium; Cl, chloride; LD, lactate dehydrogenase; CK, creatine kinase. Table 9. Average blood chemistry (plain tube) test result differences (%) between participants and reference laboratories Test Item With Coolant Without Coolant Using Rack No Rack Using Rack No Rack AST 3.80 3.26 0.12 0.11 ALT -9.82-9.44-9.79-9.02 γ-gt 9.85 9.26 11.70 12.56 Na -1.86-2.02-2.71-0.84 K 80.17 63.12 21.17 72.50 Cl -2.90 20.16-4.50-5.46 Glucose -18.40-17.20-34.13-34.67 LD 43.87 32.07 28.53 34.22 CK -5.47-4.95-7.47-8.16 Abbreviations: AST, aspartate aminotransaminase; ALT, alanine aminotransaminase; γ-gt, gamma-glutamyl transaminase; Na, sodium; K, potassium; Cl, chloride; LD, lactate dehydrogenase; CK, creatine kinase. 혈액응고검사의경우, 냉매사용여부및 rack 사용여부에관계 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.2 www.labmedonilne.org 77

임환섭외 : 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 Table 10. Average coagulation test result differences (%) between participants and reference laboratories Test Items 없이유사한결과값의차이가있는것으로나타났다 (Table 10). (2) 검체운송전원심분리여부에따른결과변화 Plain 시험관을사용한검체는운송전원심분리를하지않은관 계로검체의용혈로인하여 K, LD 의결과값은 80% 까지증가한반 면, ALT, 혈당, 염소, CK 의결과값은 34% 까지감소한결과를보여 주었다 (Table 9). 고찰 검사실에서의오류는검사전, 검사중및검사후단계로나누 어구분할수있다. 지난 20 년간검사장비의자동화및검사실내 전산화비율이높아짐에따라검사중장비등에인한검사결과의 질저하는거의나타나지않음에따라검사전및검사후오류요 인들에대하여관심을가지기시작하였다 [5, 6]. 의학기술의발전으로인하여환자진료에있어서검사실의역할 및의존도는점차적으로증가되고있다. 검사의주요목적은정확 한검사결과를보고함으로서임상의사가환자를보다정확하게 진단하고치료할수있도록도와주는역할을하는것이다. 그러나 진료의현장에검사실이없어검체를외부수탁전문의료기관으 로보내고있는경우에서는검체의전처리및처리과정이검사결 과에많은영향을미치는사실에대하여정확히아는것이중요할 것으로생각된다 [7]. With Coolant Without Coolant Using Rack No Rack Using Rack No Rack PT -3.17-3.27-3.20-2.04 INR 8.24 8.03 8.72 10.68 aptt 5.62 4.38 2.69 2.15 Fibrinogen 8.92 8.22 8.45 10.91 Abbreviations: PT, prothrombin time; INR, international normalized ratio; aptt, activated partial thromboplastin time. 여러연구자들은검체의안정성에미치는검사전인자들에대 하여보고하고있다 [7]. 검사전영향을주는인자들에대하여개 별적으로검토되었으나, 검사중질관리목표와달리검사전질 관리목표들은표준화가안되어있고정확하게규명하기에많은 어려움이있는것으로알려져있다 [7]. 특히검체운반과관련되어 혈중칼륨수치는상당히많은영향을받는것으로알려져있다. 정확한혈중칼륨측정을위하여채혈즉시검체를원심분리하거 나원심분리가불가능한경우에는 lithium-heparin 혈장보다 SST 시험관에넣어운반하는것은온도변화나원심분리지연에따른 결과변화를최소화할수있다는보고도있다 [8]. 검체운송에따 른검사전영향을최소화하기위한방안으로서검체인식을정확히하고, 검체보관및운반온도는 20-25 를유지하며, 채혈현장에서의원심분리필요성을없애기위하여하루 2차례검체를수거하며, 원심분리전검체보관시간은 6시간을제한하는방안이제시되기도하였다 [2]. 본연구에서검토된사항으로서검체가채혈에서수거까지소요된시간은평균 3.5시간으로나타났으며, 검체가수탁기관의지역사무실에서원심분리되기까지총 6.7시간이소요되어 Jensen 등의기준인 6시간을초과하는것으로나타났다. 일부기관에서송부한검체는검체전달과정의오류로인하여상당한검사지연이이루어진것으로보아통상적인검체운송과정에서간혹관찰될수있으므로수탁전문의료기관들은이에대한대응책및검체의뢰기관에이를알려주어야할것으로생각된다. 통상적으로검체가운반되는과정에서 10 이하의냉장상태가철저하게유지되는것으로생각되었으나이번연구를통하여실질적인운송상자내의온도는일부에서는냉장상태에미치지못하는 10 이상으로온도가상승되어유지되고있었다. 현재운송상자내의온도는검체와함께냉매를넣은후, 검사실도착시점에온도를기록하도록하고있으나이에대한객관적인평가방법이나관리체계가없다. 이는궁극적으로검사결과의오류를초래할수있어안전한검체운송을위하여객관적인온도관리체계구축이필요하며이에대한객관적인평가방법이모색되어야할것으로생각된다. 원심분리가안된검체를냉장과실온으로나누어운반한결과, 혈중내칼륨수치에많은영향을준것으로나타났는데, 냉장에서의변화가실온에비하여더높은것으로나타났다. 이는적혈구막에존재하는나트륨 -칼륨펌프에의한결과로서실온상태에서는이펌프의작동이정상적으로일어나혈중내칼륨결과에차이가없었으나냉장상태에서는이펌프의작동이정지되어혈중내칼륨결과가높게나타났다고할수있다. 또한 plain 시험관에채혈한검체를원심분리하지않은상태로검체를운반하게되면혈액내에포함된적혈구, 백혈구, 혈소판과같은세포들에의하여당이이용되므로시간당 7 mg/dl의혈당이감소하는것으로알려져있다 [10]. 현실적으로다양한검사항목을의뢰하는경우, 혈당전용검사로사용되는 sodium fluoride (NaF) 시험관을사용하지않고있으며, 일부개인의원에서는 plaint 시험관혹은 syringe-tube 와같은용기에검체를채혈하여검사를의뢰하고있다. 검사의뢰자가정확한채혈용기선택을못하는경우가많아통상적으로사용하는시험관을이용하여검사결과에미치는영향을조사하였다. 즉모든혈액검체는검사종목에따라정확하게채혈되고용혈을방지하기위하여채혈현장에서즉시원심분리되어검사에필요한검체만을선택적으로운송함으로서검사결과의안정성을확보할수있을것으로사료된다. 78 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.2

임환섭외 : 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 각검사항목별검사방법이나장비에따른차이는검토되지않았다. 검사항목별로본원검사실에서재검한결과, 해당기관에서보고한결과값과오차범위인 10% 이내에있었기에이를검사방법혹은검사장비별로재검토할필요가없어이에대한검토는배제하였다. 검체운반은흔들림을최소화하는것이원칙으로서 rack에넣어운반한검사결과의차이가더적은것으로나타났다. 혈액응고검사는냉매의유무와 Rack 사용여부에따른결과차이는보이지않았다. 이는 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) 에서제작한가이드라인에서는프로트롬빈시간에사용되는검체는채혈후 24시간이내에검사되어야하며검체보관은 18-24 를유지하도록권장하고있다 [9]. 만약 2-4 에보관된검체라면 VII 응고인자의활성화로 PT 결과에영향을미친다고알려져있다. 본연구에서실시한프로트롬빈시간결과도허용범위오차내에있음을확인하였는데이는검체보관상자내의온도가 18 로유지되었기에이러한결과가나온것으로추정된다. 반면부분트롬보플라스틴시간이나혈액응고인자검사용검체는 2-4 혹은 18-24 를유지를하도록권장하고있으며검체의장거리이동이필요한경우에는채혈후 1시간이내에원심분리하여혈장만을운송하도록권장하고있다 [9]. 검사결과의영향을미치는여러가지요인중검체보관온도및운송방법의상세한부분을다음과같이결론을얻었다. 1. 검체는반드시 rack holder에꽂아서운반한다. 2. 검체의운송상자내온도는검사항목에따라냉장인 2-4 혹은 18-24 를유지하되채혈현장에서원심분리함을원칙으로하며검사에필요한검체만을운반한다. 현장에서원심분리를할수없는경우, 채혈후 2시간이내원심분리를실시하여야한다. 3. 혈액응고용검체는프로트롬빈시간검사의경우 18-24 를, 부분트롬보플라스틴시간검사의경우 2-4 혹은 18-24 를유지하되각각 24시간과 4시간이내검사가이루어져야한다. 4. 객관적인운송상자내온도관리체계구축을위하여전자온도장치가달린운송상자의사용이중요하다. 5. 검체의각단계별시간과온도가모두기록되어야한다. 요약 배경 : 검사결과의정확성은질병의진단과치료에있어중요한이슈가되고있다. 검체운송방법등에대한지침을수립하고검사결과의정확성과검체전처리등의필요성에대하여조사하였다. 방법 : 검체운반에있어서검체 rack holder 사용여부와운송상자내의냉매유무에따른검사결과의차이여부를혈액학검사 ( 한글로 CBC, ESR), 임상화학검사 (AST, ALT, GGT, 전해질 [ 나트륨, 칼 륨, 염소 ], Glucose, LD, CK), 혈액응고검사 ( 프로트롬빈시간, 부분트롬보플라스틴시간, 섬유소원 ) 등을대상으로조사하였다. 또한검사운송단계별소요시간을조사하고이에따른검사결과및용혈여부를분석하였다. 검체는서로다른지역에위치한 9개대학병원검사실로부터기존의검체운송방법을이용하였다. 결과 : 채혈량이부족한시험관에서용혈이더많이관찰되었으며, 냉매가들어있는운송상자내검체들의결과변이가더적은것으로나타났다. 평균검체운송에소요된시간은 11.3 시간인것으로나타났다. 운송상자내평균온도는냉매유무에따라각각 10.9 와 25.0 인것으로나타났다. 원심분리가안된냉장운송검체의혈중칼륨농도가더높은것으로나타났으므로검체는운송전반드시원심분리하여야한다. 혈액응고검사는결과차이가 10% 이내인것으로나타났다. 운송전원심분리된검체에서는용혈이관찰되지않았으며운송전결과와큰차이를보이지않았다. 결론 : 검사결과의신뢰성을높이기위하여검체운송은검사종목에적합한온도를유지하도록구성되어야한다. 검체의용혈을줄이기위하여적정한온도유지와 rack holder를이용하여검체의흔들림을줄여야하며, 운송상자내온도관리는객관적인관점에서관리될수있도록하여야한다. 검체운송시간및온도관리에대한객관적인감시체계가있다면혈액응고검사도수탁검사항목으로허락될수있을것으로생각된다. 감사의글 이번연구에검체를제공해주시고적극적으로참여해주신건국의대이창훈교수님, 울산의대전사일교수님, 전남의대신명근교수님, 전북의대김달식교수님, 제주의대김영리교수님, 충남의대권계철교수님, 한림의대신동훈교수님과여러검사실직원분들께감사드립니다. 참고문헌 1. Berg B, Estborn B, Tryding N. Stability of serum and blood constituents during mail transport. Scand J Clin Lab Invest 1981;41:425-30. 2. Jensen EA, Stahl M, Brandslund I, Grinsted P. Stability of heparin blood samples during transport based on defined pre-analytical quality goals. Clin Chem Lab Med 2008;46:225-34. 3. Sinclair D, Briston P, Young R, Pepin N. Seasonal pseudohyperkalaemia. J Clin Pathol 2003;56:385-8. 4. Lewis SM, Bain BJ, eds. Practical haematology. 9th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2001. 5. Plebani M. Errors in clinical laboratories or errors in laboratory medi- DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.2 www.labmedonilne.org 79

임환섭외 : 장거리검체운송이검사결과에미치는영향 cine? Clin Chem Lab Med 2006;44:750-9. 6. Stroobants AK, Goldschmidt HM, Plebani M. Error budget calculations in laboratory medicine: linking the concepts of biological variations and allowable medical errors. Clin Chim Acta 2003;333:169-76. 7. Lippi G, Guidi GC, Mattituzzi C, Plebani M. Preanalytical variability: the dark side of the moon in laboratory testing. Clin Chem Lab Med 2006; 44:358-65. 8. Seamark D, Backhouse S, Barber P, Hichens J, Salzmann M, Powell R. Transport and temperature effects on measurement of serum and plasma potassium. J R Soc Med 1999;92:339-41. 9. Clinical and Laboratory Standards Institute. Collection, transport, and processing of blood specimens for testing plasma-based coagulation assays; approved guideline, 4th ed. CLSI document H21-A4. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2003. 10. Weissman M and Klein B. Evaluation of glucose determinations in untreated serum samples. Clin Chem 1958;4:420-2. 80 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.2

원저 Lab Med Online Vol. 1, No. 2: 81-87, April 2011 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.3 진단혈액학 한국인비호지킨림프종의백혈병성골수침습에대한임상혈액학적소견 Clinico-hematologic Findings of Leukemic Bone Marrow Involvement in Korean Patients with Non-Hodgkin Lymphoma 김지명 1 박찬정 2 장성수 2 지현숙 2 허주령 3 강윤구 4 서종진 5 Ji-Myung Kim 1, Chan-Jeoung Park 2, Sung-Soo Jang 2, Hyun-Sook Chi 2, Joo-Ryung Huh 3, Yoon-Koo Kang 4, Jong-Jin Seo 5 충남대학병원진단검사의학과 1, 서울아산병원진단검사의학과 2 병리과 3 혈액종양내과 4 소아과 5 Department of Laboratory Medicine 1, Chungnam National University Hospital, Daejeon; Departments of Laboratory Medicine 2, Pathology 3, Oncology 4, and Pediatrics 5, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, Seoul, Korea Background: The purpose of the present study was to investigate the clinico-hematological findings of bone marrow (BM) involvement and leukemic phase in Korean patients with non-hodgkin lymphoma (NHL). Methods: We included 791 patients with NHL that were classified with the WHO (2008) criteria. Laboratory data, bone marrow histomorphologic features and medical records were reviewed. Leukemic phase was defined as when the proportion of neoplastic lymphoid cells comprised more than 10% of leukocytes in the peripheral blood or more than 25% of nucleated cells in the BM. Results: We found that 21.7% (172/791) of the patients had BM involvement, and 6.2% (49/791) developed leukemic phase of the disease. NHL subtypes showing high frequencies of leukemic phase development were mantle cell lymphoma (40%), angioimmunoblastic T cell lymphoma (40%), lymphoblastic lymphoma (36.4%), and Burkitt lymphoma (26.1%). Compared to B-cell type, T-cell type of NHL showed significantly higher frequencies of BM involvement (18.6% vs 30.9%; P =0.0004) and leukemic phase development (4.8% vs 10.3%, P =0.008). Complete remission rate was significantly lower in leukemic (55.6%) than in non-leukemic (85.9%) group of patients (P =0.0002), whereas relapse rate was not different between the two groups. Death rate was higher in leukemic (46.9%) than in non-leukemic (30.1%) group of patients, and the 5-yr overall survival probability was significantly lower in leukemic group (P =0.02). Conclusions: The incidence of leukemic phase development in NHL was lower in Korean patients than that reported for Western populations and higher in T-cell lymphoma. We confirmed that the presence of leukemic phase in NHL patients is associated with a poor prognosis. Key Words: Leukemic phase, Non-Hodgkin lymphoma, Korean, WHO classification 서론 비호지킨림프종의골수침습은조직학적아형에따라매우다양 하며 8-73% 의빈도로보고되어있다 [1, 2]. 광범위한골수침습을보 Corresponding author: Chan-Jeoung Park Department of Laboratory Medicine, Asan Medical Center, College of Medicine, 86 Asanbyeongwon-gil, Songpa-gu, Seoul 138-736, Korea Tel: +82-2-3010-4508, Fax: +82-2-478-0884 E-mail: cjpark@amc.seoul.kr Received: September 1, 2010 Revision received: February 9, 2011 Accepted: February 11, 2011 This article is available from http://www.labmedonline.org 2011, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 이는경우는악성림프구가말초혈액에서관찰되거나백혈병처럼발현되기도하며, 이러한백혈병성골수침습혹은백혈병기 (leukemic phase) 발현은비호지킨림프종의진단시뿐만아니라질병의진행과정에서나타나기도한다 [3]. 그러나, 그빈도에관한보고는매우적어한연구에서는전체비호지킨림프종의백혈병기발현의빈도를 14% 로보고하였으며 [4] 골수침습을나타낸비호지킨림프종환자의 29% 에서말초에서비정상림프구가관찰되었다는보고도있다 [5]. 골수침습과유사하게백혈병기발현의빈도도비호지킨림프종의아형마다다르다. 백혈병기발현은버킷림프종 (Burkitt lymphoma) 과림프모구림프종 (lymphoblastic lymphoma) 을제외하면 high grade 림프종보다 low grade 림프종에서더흔하다. 또한 high grade 림프종에서백혈병기발현은예후가극히불량하다 [3]. 현재까지비호지킨림프종의골수침습이나백혈병기발현을각아형별로분류하여다룬연구 [1-6] 는많지않으며대부분은과거의비호지킨림프종의분류를이용한것이었다. 국내에서림프구성 eissn 2093-6338 www.labmedonilne.org 81

김지명외 : Marrow Involvement of Non-Hodgkin Lymphoma 종양의세계보건기구 (World Health Organization, WHO) 분류 [7] 에따른비호지킨림프종의각아형에서골수침습을조사한보고는매우적어 473예의비호지킨림프종에서 WHO 분류의각아형별골수침습및말초에서림프종세포의관찰빈도를보고 [8] 한것외에는전무하다. 이에저자들은한국인비호지킨림프종환자에대해 WHO 분류에근거하여아형을나누고각아형별로골수침습과백혈병기발현의빈도를조사하고백혈병기발현을가진환자들의임상혈액학적특성을관찰하고자하였다. 대상및방법 1997년 1월부터 2000년 12월까지비호지킨림프종으로진단된 791예의환자를대상으로하였다. 남자 495예, 여자 296예이었으며평균연령은 49.2±19.8 세이었고 18개월부터 84세까지의연령분포를보였다. 이전에림프종에대한치료력은없었으며비호지킨림프종아형은림프절이나다른조직에대한검사를기준으로 WHO (2008) 분류체계에의거하여결정하였다. 모든환자들은진단시일반혈액검사, 말초혈액도말, 골수천자와생검을통해병기를평가하였으며이후에는매방문시점마다일반혈액검사와말초혈액도말을검사하였다. 항암치료를받은환자중골수침습이있었던경우는항암치료후치료효과의판정을위해골수천자와생검을다시시행하였고최초내원시골수침습이없었더라도경과중림프종의악화가의심되는경우는골수검사를재시행하여골수침습여부를재평가하였다. 악성림프구의세포형을확진하기위해모든비호지킨림프종은림프절, 기타조직, 골수에서얻어진천자세포나생검조직을이용하여유세포분석이나면역조직염색으로세포형을 B 혹은 T 세포형으로분류하였다. 악성림프구의세포형태를바탕으로 HLA-DR, TdT, CD10, CD79α, CD19, CD20, FMC7, cyclin D1, surface immunoglobulin G, M, A, D, lambda light chain, kappa light chain, CD3, CD5, CD7, CD43, CD45RO, CD4와 CD8의표지자중에서선택하여검사를시행하였다. 골수침습은골수의응괴절편이나생검조직에서미만형 (diffuse type), 간질형 (interstitial type), 결절형 (nodular type), 방소주형 (paratrabecular type) 의침습형태를보이거나골수천자에서악성림프구가관찰되는것으로규정하였고두명의전문의가독립적으로판독하여일치하는경우로하였다. 골수침습중악성림프구가말초혈액에서 10% 이상 [4] 혹은골수에서유핵세포의 25% 이상 [9] 을차지하는경우는백혈병기로정의하였다. 침습여부의진찰시간비대나비장비대의유무를조사하였고중추신경계전이를보기위해뇌척수액의세포검사도시행하였다. 진단후최소 1년이상추적관찰하였으며 1년이내사망한경우는 사망시점까지를추적관찰기간으로하였고평균추적기간은 18.5 개월 ( 범위 0.5-56.6 개월 ) 이었다. 골수침습을보인환자에대해서는복합항암요법후치료반응을평가하기위하여의무기록검토를통해항암요법을시행한경우완전관해의유무와재발여부를조사하였다. 완전관해는항암요법을완료한후시행한추적검사에서말초혈액과골수에서이전의침습의증거가사라진것으로규정하였고 [4] 재발은말초혈액과골수에서악성림프구가다시출현하는것으로정하였다. 또한사망여부와총생존기간도조사하였으며총생존기간은최초진단부터사망이나마지막추적관찰이이루어진시점으로정하였다. 통계분석은 MedCalc Statistical Software 11.5.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium) 를사용하였다. 각비교군간의측정값의비교는 Mann-Whitney U test, 빈도의비교는카이제곱검정을이용하였다. 단, 주요아형에서비교군간빈도의비교는 Fisher exact test를이용하였다. 생존율은 Kaplan-Meier method를이용해생존곡선을그리고 log-rank test로비교하였다. P <0.05를통계학적으로유의한것으로정하였다. 결과 1. 비호지킨림프종아형의분포 791예의비호지킨림프종환자중 B세포림프종은 587예 (74.2%) 이었고 T세포림프종은 204예 (25.8%) 이었으며면역표현형검사상조직과골수의악성림프구의세포계열은모두일치하였다. WHO 분류에따른분포에서광범위대형 B세포림프종 (diffuse large B cell lymphoma) 이 333예 (42.1%) 으로가장흔한아형이었으며다음으로 MALT림프종 (extranodal marginal zone B cell lymphoma of mucosa associated lymphoid tissue) 144예 (18.2%), 말초성T 세포림프종 (peripheral T cell lymphoma) 65예 (8.2%), 비형림프절외 NK/ T세포림프종 (extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type) 59예 (7.5%), 전구세포 T 혹은 B 림프모구림프종 (precursor T or B lymphoblastic lymphoma) 44예 (5.6%), 역형성큰세포림프종 (anaplastic large cell lymphoma) 37예 (4.7%), 소포림프종 (follicular lymphoma) 27예 (3.4%), 외투층세포림프종 (mantle cell lymphoma) 25 예 (3.2%), 버킷림프종 23예 (2.9%) 의순이었다. 2. 비호지킨림프종아형에따른골수침습과백혈병기발현의빈도각세포계열별로골수침습의빈도는 B세포림프종 18.6% (109/ 587), T세포계열림프종 30.9% (63/204) 로 T세포림프종에서골수침습의빈도가통계학적으로유의하게높았다 (P = 0.0004). 백혈병기발현의빈도는 B세포림프종 4.8% (28/587), T세포림프종 10.3% 82 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.3

김지명외 : Marrow Involvement of Non-Hodgkin Lymphoma (21/204) 로 T 세포림프종에서의미있게빈도가높았다 (P = 0.008). 각아형별골수침습률을분석시 50% 이상의골수침습률을보 인아형은혈관면역모세포 T 림프종 (angioimmunoblastic T cell lymphoma) 80.0%, 소림프구림프종 (small lymphocytic lymphoma) 66.7%, 외투층세포림프종 64.0%, 전구세포 T 및 B 림프모구림프종 61.7%, 60.0% 이었다. 말초성 T 세포림프종 (38.5%) 과버킷림프종 (39.1%) 은 30-50% 미만의중등도의골수침습의빈도를보였으며 역형성큰세포림프종 (16.2%), 소포림프종 (14.8%), MALT 림프종 (14.6%), 광범위대형 B 세포림프종 (13.5%), 비형림프절외 NK/T 세포 림프종 (10.2%) 은상대적으로낮은골수침습의빈도를나타냈다. 골수침습을나타낸 172 예중백혈병기발현은 49 예 (28.5%) 에서 관찰되었으며각아형별백혈병기발현의빈도는골수침습의빈 도가높았던전구세포 T 림프모구림프종 (41.2%), 외투층세포림프 종 (40%), 혈관면역모세포 T 림프종 (40.0%) 에서가장높았으며버킷 림프종 (26.1%) 과전구세포 B 림프모구림프종 (20.0%) 는 20% 이상 이었고역형성큰세포림프종 (5.4%), 소포림프종 (3.7%), 말초성 T 세 포림프종 (3.1%), 광범위대형 B 세포림프종 (1.8%), MALT 림프종 (1.4%) 은낮은빈도를보였다 (Table 1). Table 1. Incidence of bone marrow involvement and leukemic phase in 791 patients with WHO (2008) classified non-hodgkin lymphoma WHO classification N N of cases N of cases with with leukemic marrow involvement (%) phase (%) Total 791 172 (21.7) 49 (6.2) B-cell lineage DLBCL MALT lymphoma Follicular lymphoma Mantle cell lymphoma Burkitt lymphoma B-lymphoblastic lymphoma Plasmacytoma SLL NMZL Lymphoplasmacytic lymphoma T-cell lineage PTL, unspecified NK/T-cell lymphoma, nasal ALCL T-lymphoblastic lymphoma AILT Enteropathic T-cell lymphoma Mycosis fungoides/sezary S 587 333 144 27 23 25 10 9 7 7 2 204 65 59 37 34 5 3 1 109 (18.6) 45 (13.5) 21 (14.6) 4 (14.8) 16 (64.0) 9 (39.1) 6 (60.0) 6 (66.7) 1 (14.3) 1 (14.3) 0 (0.0) 63 (30.9) 25 (38.5) 6 (10.2) 6 (16.2) 21 (61.7) 4 (80.0) 0 (0.0) 1 (100.0) 28 (4.8) 6 (1.8) 2 (1.4) 1 (3.7) 10 (40.0) 6 (26.1) 2 (20.0) 1 (11.1) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 21 (10.3) 2 (3.1) 1 (1.7) 2 (5.4) 14 (41.2) 2 (40.0) 0 (0.0) 0 (0.0) P value* 0.0004 0.008 *P value were determined using chi-square test, which represent the difference in frequencies of marrow involvement and leukemic phase between B-cell and T-cell lineage. Abbreviations: DLBCL, diffuse large B cell lymphoma; MALT, mucosa-associated lymphoid tissue; SLL, small lymphocytic lymphoma; NMZL, nodal marginal zone B- cell lymphoma; PTL, peripheral T cell lymphoma; ALCL, anaplastic large cell lymphoma; AILT, angioimmunoblastic T cell lymphoma; S, syndrome. 3. 백혈병기발현을나타낸비호지킨림프종의임상혈액학적 소견 49 예의백혈병기발현을보인비호지킨림프종환자중전구세포 T 림프모구림프종 (14/49, 28.6%) 이가장높은구성을차지하였고다 음으로외투층세포림프종 (10/49, 20.4%), 버킷림프종 (6/49, 12.2%), 광범위대형 B 세포림프종 (6/49, 12.2%) 의순이었다. 36 예 (73.5%) 의 환자는비호지킨림프종의최초진단시점에백혈병기로발현되었 으나나머지 13 예 (26.5%) 는림프종질환의경과중새롭게백혈병 기로발현하였다 (Table 2). 골수침습을나타낸환자를단순침습만을나타낸경우와백혈 병기로발현된경우로나누어침습시의혈구세포수를분석했을 때백혈병기의환자군에서백혈구수는높았고 (P = 0.04) 혈소판수 는낮았으며 (P = 0.03) 이는통계적으로유의하였다. 각아형별비 교는가능한환자수를고려하여백혈병기환자군과골수침습환 자군의수가각각 5 명이상인비호지킨림프종아형 ( 광범위대형 B 세포림프종, 외투층세포림프종, 버킷림프종, 림프모구림프종 ) 만비 교하였는데외투층세포림프종에서혈소판수의중앙값만의미있 는차이 (82.5 10 3 /μl vs 216.5 10 3 /μl, P = 0.009) 를보였을뿐다 른아형군에서는의미있는혈액학적차이가없었다. 백혈병기의환자군의말초혈액과골수에서관찰되는악성림프 구의평균퍼센트는각각 16.3% 과 59.7% 이었으며 49 예중 32 예 (65.3%) 는악성림프구가말초혈액과골수에서모두관찰되었으나 17 예 (34.7%) 는골수에서는 42.4%±23.3% 의악성림프구가관찰되 었음에도말초혈액에서는악성림프구가관찰되지않았다. 간비장비대는 49 예중 23 예 (46.9%) 에서관찰되었는데간비대보 다는비장비대가보다흔하였으며간비장비대의빈도는골수침습 환자군보다백혈병기환자군에서보다높았으나 (P = 0.03) 비호지 Table 2. Lymphoma subtypes and detection time of leukemic phase in 49 patients showing leukemic phase of non-hodgkin lymphoma Subtypes of Lymphoma N of cases (%) At presentation During course T-lymphoblastic lymphoma 14 (28.6) 11 3 Mantle cell lymphoma 10 (20.4) 7 3 Burkitt lymphoma 6 (12.2) 4 2 DLBCL 6 (12.2) 3 3 B-lymphoblastic lymphoma 2 (4.1) 2 0 ALCL 2 (4.1) 2 0 AILT 2 (4.1) 2 0 MALT lymphoma 2 (4.1) 2 0 PTL, unspecified 2 (4.1) 1 1 NK/T-cell lymphoma, nasal 1 (2.0) 1 0 Follicular lymphoma 1 (2.0) 0 1 SLL 1 (2.0) 1 0 Total 49 (100%) 36 (73.5%) 13 (26.5%) Abbreviations: See Table 1. DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.3 www.labmedonilne.org 83

김지명외 : Marrow Involvement of Non-Hodgkin Lymphoma Table 3. Comparison of clinicohematological findings between leukemic and non-leukemic groups in 172 non-hodgkin lymphoma patients with bone marrow involvement Characteristics 킨림프종아형별로백혈병기환자군과골수침습환자군간에빈도 를비교했을때는의미있는차이를나타내지않았다. 백혈병기환 자군에서중추신경계전이는 12.2% (6/49) 에서관찰되었으며골수 침습환자군의 2.4% (3/123) 에비해의미있게높았고 (P = 0.01) 각 아형별로비교한경우전구세포 T 혹은 B 림프모구림프종의백혈병 기환자군 (31.3%, 5/16) 이골수침습환자군 (0%, 0/12) 에비해높은 중추신경계전이의빈도를보였으나통계학적으로유의하지는않 았다 (P = 0.06). 골수침습을보인 137 명 ( 백혈병기환자군 45 명, 침 습환자군 92 명 ) 에서복합항암요법이시행되었는데완전관해는백 혈병기환자군 55.6% (25/45), 골수침습환자군 85.9% (79/92) 에서 도달하였고이는통계적으로유의한차이를보였다 (P = 0.0002). 완 전관해에도달한후재발의빈도는백혈병기환자군 40.0% (10/25), 골수침습환자군 27.8% (22/79) 로양군간의미있는차이를나타 내지않았다 (Table 3). 비호지킨림프종아형별로백혈병기환자군과골수침습환자군 간에완전관해율과재발률을비교했을때는유의한차이를나타 내지않았다 (Table 4). Leukemic group (N=49) Non-leukemic group P value (N=123) Age (yr) 44.0 (4-79) 55.0 (2-84) 0.09 Male:Female 32:17 83:40 0.93 Hemoglobin (g/dl) 10.4±2.1* 10.8±2.6 0.42 Platelet count (x10 3 /μl) 107 (4-508) 192 (4-605) 0.03 Leukocyte count (x10 3 /μl) 6.8 (0.1-74.3) 5.4 (0.2-28.4) 0.04 Neoplastic lymphoid cells in BM (%) 59.7±23.2* 5.5±7.1 0.01 Hepatosplenomegaly 23 (46.9%) 36 (29.3%) 0.04 Meningeal involvement 6 (12.2%) 3 (2.4%) 0.03 Chemotherapeutic responses Complete remission 25/45 (55.6%) 79/92 (85.9%) 0.0002 Relapse 10/25 (40.0%) 22/79 (27.8%) 0.37 Death 23/49 (46.9%) 37/123 (30.1%) 0.06 Overall survival (months) 11.3 (0.1-69.0) 12.2 (0.5-78.8) 0.11 *Mean±SD; Median (range). Abbreviations: PB, peripheral blood; BM, bone marrow. 골수침습을보인 172 예의환자중추적관찰기간중 60 예의환 자는사망하였으며백혈병기환자군의사망률은 46.9% (23/49) 로 골수침습환자군의 30.1% (37/123) 와비교하여높은경향이있었 다 (P = 0.06). 특히, 외투층세포림프종 (70% vs 33.3%) 과전구세포 T 혹은 B 림프모구림프종 (50% vs 18.2%) 의백혈병기환자군은골수 침습환자군에비해높은사망률을보였다. 이들의총생존기간의 중앙값은백혈병기환자군 11.3 개월 ( 범위 1.0-69 개월 ) 로골수침습 환자군의 12.2 개월 ( 범위 0.5 68.2 개월 ) 보다짧았으나통계학적으 로유의하지는않았으며각아형별로백혈병기환자군과골수침 Table 4. Comparison of therapeutic response and clinical outcome between leukemic and non-leukemic groups of bone marrow involvement in 5 WHO subtypes of non-hodgkin lymphoma Subtypes of Lymphoma CR Relapse Death T/B-Lymphoblastic lymphoma Leukemic (N=16) Non-leukemic (N=11) P-value Mantle cell lymphoma Leukemic (N=10) Non-leukemic (N=6) P-value Diffuse large B-cell lymphoma Leukemic (N=6) Non-leukemic (N=39) P-value Burkitt lymphoma Leukemic (N=6) Non-leukemic (N=3) P-value MALT lymphoma Leukemic (N=2) Non-leukemic (N=19) P-value Abbreviation: CR, complete remission. Overall survival probability (%) 100 90 80 70 60 50 40 습환자군의총생존기간을비교했을때도백혈병기환자군의총 생존기간이짧은경향은있었으나의미있는차이를관찰할수없 었다. 그러나, 백혈병기발현의유무에따른총생존율분석에서는 백혈병기환자군이골수침습환자군에비해유의하게낮은 5 년생 존율을나타냈다 (Fig. 1). 13/16 (81.3%) 9/11 (90%) 1.0 2/9 (22.2%) 4/6 (66.7%) 0.14 2/6 (33.3%) 26/38 (86.7%) 0.17 4/5 (80.0%) 2/3 (66.7%) 1.0 0/2 (0%) 10/13 (76.9%) 0.10 고찰 6/13 (46.2%) 1/9 (11.1%) 0.16 2/2 (100%) 0/4 (0%) 0.07 1/2 (50%) 10/26 (38.5%) 1.0 1/4 (25%) 0/2 (0%) 1.0 2/10 (20%) 8/16 (50%) 2/11 (18.2%) 0.12 7/10 (70%) 2/6 (33.3%) 0.30 3/6 (50%) 13/39 (33.3%) 0.65 2/6 (33.3%) 1/3 (33.3%) 1.0 1/2 (50.0%) 4/19 (21.1%) 0.43 P=0.02 Non-leukemic marrow involvement (N=123) Leukemic marrow involvement (N=49) 0 20 40 60 80 Months from diagnosis Fig. 1. Overall survival in non-hodgkin lymphoma patients with marrow involvement according to the presence or absence of leukemic phase. 비호지킨림프종의 WHO (2008) 분류법에따른각아형별골수 침습과백혈병기발현의빈도는비호지킨림프종아형마다차이를 84 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.3

김지명외 : Marrow Involvement of Non-Hodgkin Lymphoma 보였다. 전체 791예의비호지킨림프종환자에서골수침습의빈도는 21.7% (172/791) 이었으며특히백혈병기로발현된빈도는 6.4% (49/791) 이었다. 이전의외국의보고들은골수침습을 Arber 등 [5] 은 32.5%, Conlan 등 [1] 은 32.2%, Crotty 등 [10] 은 32.4% 의빈도를보고하였고, 백혈병기는 14%[4] 로보고하였는데본연구에서는골수침습및백혈병기의빈도가이전보고보다는낮았다. WHO 분류에의거한한국인악성림프종을대상으로한국내연구 [8] 에서도비호지킨림프종의 12.5% 가골수침습을보이고 4.4% 가말초에서림프종세포가관찰되었다고보고하였는데비록본연구의백혈병기의정의가림프종세포의말초혈액에서의관찰은아니나말초혈액에서림프종세포의출현이악성림프종의광범위한침습을시사하는소견임을고려하여이를백혈병기로본다면한국인비호지킨림프종의골수침습및백혈병기의빈도는서구인에비해낮다는유사한결과를나타냈다. 골수침습의빈도가낮은것은 35% 정도의골수침습을보인다고알려진소포림프종 [3] 이서구에서는전체비호지킨림프종의 22.1% 을차지한다고보고되어있으나 [11] 국내연구에서는빈도가낮은것에기인할가능성이있다. 실제로국내연구 [8] 도소포림프종의빈도를 4.2% 로보고하였고본연구에서도 3.5% 의빈도를보여외국보고와비교해낮았다. 이전의국내연구 [8] 의골수침습률은세포계열간차이가없었다고하였으나본연구는 T세포림프종에서의미있게높은골수침습과백혈병기의빈도를보였다. 이는혈관면역모세포림프종와말초성T세포림프종의골수침습빈도가이전연구보다높게나타났기때문이다. 최근의연구 [12, 13] 는혈관면역모세포림프종과말초성 T 세포림프종의골수침습률을각각 70%, 46% 로보고하여본연구와유사하였다. 그러므로한국인의 T세포림프종의골수침습률은이전보고와달리 B세포림프종보다높을것으로사료된다. 비호지킨림프종의경우 Working formulation (WF) 에의거한연구에의하면 low grade 림프종에서보다높은골수침습의빈도를보이며진단시점에이미골수침습이관찰되는경우가많다고하였다 [3]. 본연구에서일부아형은대상환자수가적은제한점이있기는했으나 low grade 림프종으로분류되는혈관면역모세포림프종 (80%), 소림프구림프종 (66.7%), 외투층세포림프종 (64%) 이의미있게높은골수침윤을보인반면다른 low grade 림프종 ( 소포림프종, MALT림프종, lymphoplasmacytoid 림프종 ) 은골수침습의빈도가높지않아아형마다차이가있음을확인할수있었다. 비호지킨림프종중 high grade 림프종에속하는버킷림프종과림프모구림프종은골수침습이흔한것으로알려져있는데 [3] 본연구에서도림프모구림프종의골수침습은 B세포 60%, T세포 61.7% 로높았고, 특히백혈병기로발현되는빈도는 T림프모구림프종에서 41.1% 로가장높았다. 버킷림프종도골수침습은 39.1% (9/23) 의중등도의빈도를보였으며골수침습의 66.7% (6/9) 가백혈병기로발현되어백혈병기의빈도는 26.1% (6/23) 로높았다. 이는말초혈액침범의비율이두아형에서 37.5%, 23.8% 로높았다는국내보고 [8] 와일치하는것이다. 반면 high grade 림프종으로분류되는광범위대형 B세포림프종은골수침습과백혈병기발현의빈도가다른아형보다낮아차이를보였다. 림프모구림프종은중추신경계나골수로의전이로병기가진행된경우치료에대한반응이불량한데 [14] 본연구에서림프모구림프종은중추신경계침범이다른아형보다많아전체환자군에서중추신경계침범을보인 9예중 5예가림프모구림프종이었으며림프모구림프종의중추신경계침범빈도는 11.4% (5/44) 로중추신경계침범이관찰된소포림프종 (1/27, 3.7%), 역형성큰세포림프종 (1/37, 2.7%), 광범위대형 B세포림프종 (2/333, 0.6%) 에비해높았다. 골수침습도전체림프모구림프종의 61.4% 에서관찰되어 35.4%, 35.3% 의서구의보고 [15, 16] 보다높았다. 국내보고 [8] 도골수침습을 61.1% 로외국보다는높게보고하고있으며중국의한연구 [17] 는골수침습은 77.8%, 백혈병기는 55.5% 로본연구보다높게보고한것을고려할때연구대상군의수가많지않은제한점이있으나동아시아인에서림프모구림프종의높은골수침습의가능성이있었다. 이를통해한국인의림프모구림프종은다른아형보다백혈병기발현및중추신경계침범의빈도가높으므로진단시부터보다강력한치료법을시도해야할것으로사료되었다. 한국인에서가장흔한비호지킨림프종은광범위대형 B세포림프종과 MALT림프종이었으며다른아형과비교하여골수침습이나백혈병기발현의빈도가낮았다. 이들은말초혈액에서악성림프구가관찰되는빈도가낮으며백혈병기로발현된경우는생존기간은짧다고하였는데 [4, 18] 본연구에서도백혈병기로발현된경우완전관해율은단순침습군에비해낮았으며광범위대형 B세포림프종의총생존기간의중앙값은 7개월로단순침습군의 10.1 개월보다짧은경향이있었다 (P = 0.07). 또한두림프종은백혈병기의경우에도악성림프구가말초혈액에서거의관찰되지않았다 (16.7%, 0%). 그러나최근의유세포분석기를이용하여골수와말초혈액에서림프종세포를분석한연구 [19] 는광범위대형B 세포림프종 68.7%, MALT림프종 89.7% 에서골수와말초혈액모두에서림프종세포가관찰되었다고하였다. 이는현미경적관찰이말초혈액에서림프종세포를발견하는데한계가있다는것을나타내는것이다. 외투층세포림프종은일반적으로진단시진행된병기로나타나는성숙 B세포의종양으로백혈구수의심한증가가없는경우에도흔히말초혈액과골수에서악성림프구가관찰되나 [20] 반면말초성T세포림프종은골수침습은종종관찰되지만백혈병기발현은매우드문것으로알려져있다 [3,21]. 본연구도외투층세포림프 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.3 www.labmedonilne.org 85

김지명외 : Marrow Involvement of Non-Hodgkin Lymphoma 종의골수침습및백혈병기발현의빈도는각각 64%, 40% 로매우높았으나말초성T 세포림프종의골수침습은 38.5% 에서관찰되었지만이중 2예 (3.1%) 만백혈병기발현을보여이전의보고와일치하였다. 두림프종모두백혈병기는불량한예후및항암요법에대한반응과관련된다고하였는데 [21-23] 외투층세포림프종백혈병기의완전관해율 (22.2%) 은낮고재발률 (100%) 과사망률 (70%) 은매우높았으며말초성T 세포림프종은비록대상환자수의제한점이있지만이들은항암요법에반응하지않았고추적관찰중사망하여예후도불량함을확인할수있었다. 특히, 외투층세포림프종은혈소판수의감소가백혈병기발현을시사하는소견이었다. 소포림프종과비형림프절외 NK/T 세포림프종은이전의동양인을대상으로한연구에서각각 64%, 23% 의골수침습의빈도를보고하였다 [13,24]. 그러나본연구에서소포림프종의골수침습및백혈병기발현의빈도는 14.8%, 3.7% 이며비형림프절외 NK/T 세포림프종의골수침습및백혈병기발현의빈도는 10.2%, 1.7% 로한국인에서는두림프종아형의골수침습이많지않았다. 이들에서골수침습, 특히광범위한침습은불량한예후와관련된다고하나 [25] 본연구에서는환자수가각 1예로너무적어예후적영향을판단하는데제한이있었다. 그러므로한국인소포림프종과비형림프절외 NK/T 세포림프종에서백혈병기발현의예후를평가하기위해서는다기관연구가진행되어야할것으로사료되었다. 역형성대세포림프종은흔히전이된형태로진단되지만골수침윤은많지않으며백혈병기발현은매우드물다. 최근백혈병기발현을보인 anaplastic large cell lymphoma kinase (ALK) 음성림프종이보고되었지만대부분의백혈병기발현을보인역형성대세포림프종은 ALK 양성이었다 [26-28]. 본연구에서도골수침습은 37명의환자중 6명 (16.2%) 에서만관찰되었으며백혈병기발현을보인 2명은 ALK 염색에서모두양성소견을보였다. 결론적으로한국인비호지킨림프종의백혈병기발현의빈도는서구인에서보고된것보다는낮았으며 B세포림프종보다 T세포림프종에서높았다. 광범위한침습인백혈병기발현은단순한골수침습보다낮은완전관해율및높은사망률을보였다. 또한백혈병기발현은낮은생존율과도관련됨을확인할수있었다. 요약 배경 : 본연구의목적은한국인비호지킨림프종환자에서골수침습과백혈병기발현의임상혈액학적소견을조사하고자한다. 방법 : WHO (2008) 기준에따라분류된 791예의비호지킨림프종환자를대상으로하였다. 검사소견, 골수의조직형태학적소견및의무기록이검토되었다. 백혈병기발현은말초혈액에서 10% 이상혹은골수에서 25% 이상의악성림프구가관찰되는경우로정의하 였다. 결과 : 골수침습은 791예중 172예 (21.7%) 에서관찰되었으며백혈병기발현은 49예 (6.2%) 이었다. 백혈병기발현의빈도가높은비호지킨림프종의아형은외투층세포림프종 (40%), 혈관면역모세포 T 림프종 (40%), 림프모구림프종 (36.4%) 및버킷림프종 (26.1%) 이었다. 골수침습및백혈병기발현은 B세포림프종 (19.2%, 5.3%) 보다는 T세포림프종 (35.0%, 10.3%) 에서보다빈도가높았다 (P = 0.0004, P = 0.008). 완전관해율은단순골수침습 (85.9%) 보다는백혈병기발현 (55.6%) 에서낮았으나 (P = 0.0002) 재발률은양군간차이가나지않았다. 사망률은단순골수침습 (30.1%) 보다는백혈병기발현 (46.9%) 에서높았으며 5년생존율은백혈병기발현군에서의미있게낮았다 (P = 0.02). 결론 : 본연구는한국인비호지킨림프종의백혈병기발현의빈도가서구인보다낮으며 B세포림프종보다 T세포림프종에서높은빈도를나타냄을보여주었다. 또한비호지킨림프종의백혈병기발현은불량한예후와관련됨을확인하였다. 참고문헌 1. Conlan MG, Bast M, Armitage JO, Weisenburger DD. Bone marrow involvement by non-hodgkin s lymphoma: the clinical significance of morphologic discordance between the lymph node and bone marrow. J Clin Oncol 1990;8:1163-72. 2. Pittaluga S, Bijnens L, Teodorovic I, Hagenbeek A, Meerwaldt JH, Somers R, et al. Clinical analysis of 670 cases in two trials of the European Organization for the Research and Treatment of Cancer Lymphoma Cooperative Group subtyped according to the Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms: a comparison with the Working Formulation. Blood 1996;87:4358-67. 3. Bain BJ and Catovsky D. The leukaemic phase of non-hodgkin s lymphoma. J Clin Pathol 1995;48:189-93. 4. Come SE, Jaffe ES, Andersen JC, Mann RB, Johnson BL, DeVita VT Jr, et al. Non-Hodgkin s lymphomas in leukemic phase: clinicopathologic correlations. Am J Med 1980;69:667-74. 5. Arber DA and George TI. Bone marrow biopsy involvement by non- Hodgkin s lymphoma: frequency of lymphoma types, patterns, blood involvement, and discordance with other sites in 450 specimens. Am J Surg Pathol 2005;29:1549-57. 6. Lee WI, Lee JH, Kim IS, Lee KN, Kim SH. Bone marrow involvement of non-hodgkin s lymphoma. J Korean Med Sci 1994;9:402-8. 7. Swerdlow SH, Campo Elias, et al. eds. World Health Organization classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues, 4th ed. 86 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.3

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원저 Lab Med Online Vol. 1, No. 2: 88-93, April 2011 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.4 진단혈액학 빈혈환자에서철결핍의예측인자로서혈중 Pro-hepcidin Serum Pro-hepcidin as a Predictor of Iron Deficiency in Anemic Patients 김지명 1 손용학 2 임춘화 2 Jimyung Kim 1, Yonghak Son 2, Chunhwa Ihm 2 충남대학병원진단검사의학과 1, 을지대학병원진단검사의학과 2 Department of Laboratory Medicine 1, Chungnam National University Hospital, Daejeon; Department of Laboratory Medicine 2, Eulji University Hospital, Daejeon, Korea Background: Hepcidin has recently been known as a negative regulatory hormone of iron. Hepcidin precursor, pro-hepcidin has been used as a surrogate and reported to be related to iron deficiency. We investigated serum pro-hepcidin levels in patients with iron deficiency anemia (IDA), anemia of chronic disorder (ACD) and ACD concomitant iron deficiency (ACD/ID) to assess its usefulness as a marker of iron deficiency and examined whether its level is associated with anemia, iron status or inflammation profiles involved in the synthesis of hepcidin. Methods: We enrolled 50 patients with IDA, 46 with ACD, 12 with ACD/ID and 60 healthy controls. Complete blood cell count, iron parameters (iron, TIBC, trasferrin saturation, ferritin), C-reactive protein (CRP) and serum pro-hepcidin were measured. Results: Patients with iron deficiency, the IDA group and ACD/ID group had lower serum pro-hepcidin levels than healthy controls and the ACD group. The cutoff value of pro-hepcidin for detecting iron deficiency was 230 ng/ml (sensitivity 88.1%, specificity 51.2%). Patients with increased CRP showed higher mean pro-hepcidin level than those with normal CRP and the difference was significant in the IDA group (P =0.02). And serum pro-hepcidin level was positively correlated with CRP level (r=0.30, P =0.04) in the IDA group but not with hemoglobin. Conclusions: In patients with anemia, pro-hepcidin measurement may be useful for differentiating anemia patients with iron deficiency, IDA and ACD/ID from those with ACD. Serum pro-hepcidin levels may be more affected by inflammation than by the degree of anemia. Key Words: Anemia, Inflammation, Iron deficiency, Pro-hepcidin 서론 철결핍빈혈과만성병빈혈은가장흔한빈혈의원인으로발병기 전상서로다른기전즉, 철결핍빈혈은적혈구생성에필요한철의 부족에의해서, 만성병빈혈은철의이용능감소에의해나타나게 된다. 이러한발병기전의차이로두질환을감별하기위한다양한 지표들이개발되어왔으며현재는혈중페리틴과트랜스페린포화 도가가장일반적으로사용되고있다 [1]. 그러나혈중페리틴은급 Corresponding author: Jimyung Kim Department of Laboratory Medicine, Eulji University Hospital, 1306 Dunsan-dong, Seo-gu, Daejeon 302-799, Korea Tel: +82-42-611-3477, Fax: +82-42-611-3464 E-mail: jmkim@eulji.ac.kr Received: August 16, 2010 Revision received: October 18, 2010 Accepted: October 25, 2010 This article is available from http://www.labmedonline.org 2011, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 성기반응물질로염증의영향을받으며트랜스페린포화도는하루변이와영양상태등이검사값에영향을미치므로해석시한계점이있다. 또한만성병빈혈과철결핍빈혈이혼재하는경우만성병빈혈과동일하게낮은혈중철농도와트랜스페린포화도를나타내며만성질환에서흔히동반되는염증에의해혈중페리틴이상승하기도하므로만성병질환과감별하는것이어렵다. 최근철결핍이동반된만성병빈혈과단순만성병빈혈을감별하는데있어서철의체내이용을조절하는 hepcidin의유용성이제기되었는데 hepcidin은간에서합성되는펩타이드호르몬으로십이지장에서는철의흡수를억제하고세망내피계로부터는철의동원을막는역할을한다 [2, 3]. 혈중 hepcidin의농도는간에서의합성에따라결정되는데철과다시는합성이증가하고철결핍시는합성이감소된다. 또한빈혈이나염증도합성에영향을미치는데염증이있는경우는합성이증가되며빈혈이있는경우는합성이반대로감소한다 [4-6]. 혈중 hepcidin은전구체인 pro-hepcidin 에서분해된형태들로존재하며 hepcidin-20, hepcidin-22 및 hepcidin-25 가주요형태들이다. 이중 84개의아미노산으로구성된 hepcidin-25 가가장강력한활성물질이나높은 cysteine의양으로인한안정적인항체분리의어려움이있어최근효소면역법을이용한 hepcidin-25 측 88 www.labmedonilne.org eissn 2093-6338

김지명외 : Pro-hepcidin and Iron Deficiency 정법이개발되었으나 [7] 상품화의제한점으로대부분의연구들은질량분석계 (mass spectrometry) 를주로이용하여왔다. 그러나질량분석계를이용한방법은간편하지않은단점이있어 hepcidin의대용지표로 hepcidin의전구체인 pro-hepcidin [8] 을분석하는상품화된효소면역측정법이개발되어철분상태를평가하는지표로연구되고있다 [9, 10]. 비록 hepcidin과 pro-hepcidin 을함께평가한최근의연구 [11, 12] 에서두검사간의의미있는상관성이증명되지는않았지만철결핍빈혈군에서혈중 pro-hepcidin 을평가한이전의연구들은 pro-hepcidin 이철결핍과관련된다고보고하고있다 [9, 10, 13, 14]. 철결핍빈혈뿐아니라만성병빈혈및철결핍이동반된만성병빈혈에서 hepcidin의진단적가치를평가한연구 [15] 는드물게있었으나 pro-hepcidin 에관한연구는없었다. 이에저자들은철의체내이용상태를평가하는지표로현재임상적적용이용이한혈중 pro-hepcidin 을빈혈환자에서분석하여철결핍을감별함에있어 pro-hepcidin 의유용성과또한 hepcidin의합성에영향을미치는빈혈, 철분상태및염증인자와 pro-hepcidin 의농도간의관련성을평가하고자하였다. 재료및방법 1. 대상환자 2009년 4월부터 12월사이에일반혈액검사상남자는혈색소 12 g/dl 미만, 여자는 11 g/dl 미만의빈혈소견을보인환자중신장기능에이상이없으며 6개월이내에철분치료나재조합 erythropoietin 투약력, 수혈력이없는 20세이상의성인을대상으로하였다. 용혈성빈혈, 혈액종양및거대적아구성빈혈은배제되었다. 내원시감염, 종양, 자가면역질환의기저질환이없으면서혈중페리틴이 30 ng/ml 미만이고트랜스페린포화도가 16% 미만인경우는철결핍빈혈군으로하였으며감염, 종양, 자가면역질환의기저질환이있고트랜스페린포화 16% 이상, 혈중페리틴 30 ng/ml 이상인경우및트랜스페린포화도 16% 미만이지만혈중페리틴 100 ng/ml 이상인경우는만성병빈혈군으로분류하였다. 또한기저질환을가지면서트랜스페린포화도 16% 미만, 혈중페리틴 100 ng/ ml 미만인경우와트랜스페린포화도 16% 이상이더라도혈중페리틴이 30 ng/ml 미만인경우는철결핍이동반된만성병빈혈군으로분류하였다 [3, 16, 17]. 철결핍빈혈군은 50명, 만성병빈혈군은 46 명이연구군으로포함하였으며철결핍이동반된만성병빈혈군은연구기간중 12명이모집되었다. 만성병빈혈군 46명의기저질환은 12명암종, 11명류마티스성관절염, 6명관상동맥질환, 4명위염, 3 명장염, 3명전신홍반성루푸스, 3명전신성경화증, 2명폐렴, 2명요로감염이었다. 철결핍이동반된만성병빈혈군 12명의기저질환은 3명류마티스성관절염, 2명전신홍반성루푸스, 2명위염, 2명 암종, 1명관상동맥질환, 1명폐렴, 1명장염이었다. 전체대상군 108명의평균연령은 51.8±17.8 세이었으며남자 49명, 여자 59명이었다. 각분류군의연령과성별은만성병빈혈군은평균연령 53.4± 16.7 세, 남 : 여 =24:22, 철결핍빈혈군은평균연령 48.1±14.9 세, 남 : 여 =20:30, 철결핍이동반된만성병빈혈군은평균연령 51.4±16.1 세, 남 : 여 =5:7이었다. 건강대조군은환자군의연령과성별을고려하여빈혈이없고철관련검사가모두정상이며염증소견이없는 60명 ( 평균연령 50.7±12.8 세, 남 : 여 =30:30) 을선택하였다. 2. 검사방법환자군은내원시적혈구지수 ( 평균적혈구용적, 평균적혈구혈색소량, 평균적혈구헤모글로빈농도 ) 를포함한일반혈액검사를자동혈액분석기 ADVIA2120i (Simens Diagnostics, Deerfield, USA) 로측정하였으며철지표인철, 총철결합능, 페리틴과염증의정도를나타내는 C-반응단백질은 ADVIA 1650 analyzer (Simens Diagnostics) 를이용하여측정하였다. 혈청 pro-hepcidin 의농도는일간변동을최소화하기위해공복상태인오전 8시이전에채혈된혈액을선별한후 [18] 2,500 g, 10분간원심분리하여혈청을분리하고검사전까지 -70 에서보관하였다가 hepcidin prohormone immunoassay kit (DRG Instrument, Marburg, Germany) 를이용하여효소면역측정법으로시행하였으며측정가능범위는 0-1,000 ng/ ml이었다. 3. 통계분석모든값들은평균 ± 표준편차로표현하였으며각군간에는 Student t-test나 Mann-Whitney U-test를이용하여비교하였다. Prohepcidin과철관련인자 ( 철, 페리틴, 트랜스페린포화도 ) 및 C-반응단백질간의상관관계는 Spearman s test를이용하여분석하였다. 각군간의빈도비교는카이제곱을이용하였고철결핍여부의진단을위한 pro-hepcidin 의감별력은 ROC 곡선을이용하여경계치를정하였다. 통계분석은 MedCalc Statistical Software 11.3.0.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium) 를이용하였으며통계적유의성은 P value<0.05 로하였다. 결과 1. 빈혈환자군의혈액학적검사지표의비교 진단시혈색소의농도는철결핍빈혈군 9.3±1.3 g/dl, 철결핍이동반된만성병빈혈군 9.7±2.1 g/dl, 만성병빈혈군 9.8±1.5 g/dl로각군간통계학적으로의미있는차이가없었으며적혈구지수인평균적혈구용적, 평균적혈구혈색소량, 평균적혈구헤모글로빈농도는철결핍빈혈군이다른두군보다의미있게낮은값을나타내었 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.4 www.labmedonilne.org 89

김지명외 : Pro-hepcidin and Iron Deficiency Table 1. Laboratory data in different groups of patients with anemia 다 (P <0.0001). 백혈구수는철결핍빈혈군에서만성병빈혈군 (P = 0.0007) 보다낮은값을보였으나다른군간에는의미있는차이는 없었으며혈소판수는각군간차이가없었다. 염증지표인 C- 반응 단백질은만성병빈혈군에서철결핍빈혈군 (P <0.0001) 이나철결핍 이동반된만성병빈혈군 (P = 0.043) 보다높은값을보였다. 철은철 결핍빈혈군 (23.0±16.5 μg/dl) 에서만성병빈혈군 (53.1±38.9 μg/ dl) 이나철결핍이동반된만성병빈혈군 (40.1±28.0 μg/dl) 보다의 미있게낮은값을나타냈으나 (P = 0.0001) 만성병빈혈군과철결핍 이동반된만성병빈혈군간에는차이가없었다 (P = 0.25). 본연구 의빈혈군분류기준인트랜스페린포화도는철결핍빈혈군에서다 른두군보다낮았으나만성병빈혈군과철결핍이동반된만성병빈 혈군간에는의미있는차이가없었다 (P = 0.47). 페리틴은분류기 준의영향으로각군간차이를보였다 (Table 1). 2. 건강대조군과빈혈환자군의혈중 pro-hepcidin 의비교 건강대조군과각빈혈환자군의 pro-hepcidin 의농도는 Fig. 1 과 같았다. IDA (N=50) ACD/ID (N=12) ACD (N=46) Hemoglobin (g/dl) 9.3±1.3 9.7±2.1 9.8±1.5 WBC (x 10 3 /μl) 6.9±3.0 7.9±3.8 9.6±4.0* Platelet (x 10 3 /μl) 403±143 365±179 333±185 MCV (fl) 72.5±7.6 83.1±10.0* 86.2±4.9* MCH (pg) 22.8±4.2 28.1±3.9* 29.2±2.3* MCHC (pg/ml) 31.0±2.5 33.9±2.8* 34.7±3.6* Iron (μg/dl) 23.0±16.5 40.1±28.0* 53.1±38.9* TSAT (%) 6.6±5.3 14.4±8.8* 17.3±13.0* Ferritin (ng/ml) 13.9±18.9 59.3±36.5* 446.3±489.8* Pro-hepcidin (ng/ml) 186.3±43.0 195.9±51.0 258.0±91.9* CRP (mg/dl) 0.9±1.7 1.2±1.9 3.6±4.0* *P <0.05 when compared to IDA group; P <0.05 when compared to ACD/ID group. Abbreviations: IDA, iron deficiency anemia; ACD, anemia of chronic disorder; ACD/ ID, anemia of chronic disorder with concomitant iron deficiency; WBC, white blood cell; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuscular hemoglobin; MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration; TSAT, transferrin saturation; CRP, C-reactive protein. 건강대조군의 pro-hepcidin 의평균 ± 표준편차는 261.2±81.3 ng/ml 이었으며 120-460 ng/ml 의넓은범위에분포하고있었다. 건강대조군에비교하여철결핍빈혈군은 186.3±43.0 ng/ml 로통 계적으로유의하게낮았으며 (P <0.0001) 철결핍이동반된만성병 빈혈군도 195.9±51.0 ng/ml 로유의한차이를보였다 (P = 0.01). 그 러나만성병빈혈군은 258.0±91.9 ng/ml 로건강대조군과유의한 차이를나타내지않았다 (P = 0.85). 또한철결핍빈혈군과철결핍이 동반된만성병빈혈군은만성병빈혈군에비해의미있게낮은 prohepcidin 값을나타냈다 (P <0.0001, P = 0.03). 그러나철결핍빈혈군 Prohepcidin (ng/ml) 500 450 400 350 300 250 200 150 100 P<0.03 P<0.0001 P<0.01 과철결핍이동반된만성병빈혈군간 pro-hepcidin 의평균은의미 있는차이를나타내지않았다 (P = 0.50). 철결핍빈혈군과철결핍이 동반된만성병빈혈군을철결핍군으로, 만성병빈혈군을비철결핍 군으로분류한후두군을감별함에있어 pro-hepcidin 의 ROC 분 석을하였을때경계치 (cutoff value) 230 ng/ml 에서민감도 88.1%, 특이도 51.2%, area under curve (AUC) 0.728 이었다. 또한만성병빈 혈군과철결핍이동반된만성병빈혈군을감별하는데경계치를적 용했을때민감도 83.3%, 특이도 53.5% 이었다. P<0.0001 ACD ACD/ID Control IDA Fig. 1. Serum prohepcidin levels in healthy control, anemia of chronic disorder (ACD), iron deficiency anemia (IDA), and ACD with iron deficiency (ACD/ID) groups. Data are depicted as lower quartile, median, and upper quartile (boxes) and minimum/maximum ranges (whiskers). 각환자군에서 C- 반응단백질이정상상한치인 0.5 mg/dl 을초 과한경우는철결핍빈혈군 9 명 (18%), 만성병빈혈군 20 명 (43.5%), 철 결핍이동반된만성병빈혈군 3 명 (25%) 으로모두 32 명에서 C- 반응 단백질의증가가관찰되었다. 만성병빈혈군과철결핍빈혈군간에 만 C- 반응단백질증가의빈도가의미있는차이를보였고 (P = 0.008) 다른군간에는차이가없었다. 각환자군을 C- 반응단백질 정상군과증가군으로나누어 pro-hepcidin 의평균값을비교한결 과만성병빈혈군은 220.7±60.4 ng/ml, 260.5±100.8 ng/ml, 철결 핍빈혈군은 179.1±40.0 ng/ml, 214.0±31.8 ng/ml, 철결핍이동반 된만성병빈혈군은 185.7±47.5 ng/ml, 226.3±58.6 ng/ml 로 C- 반 응단백질증가군이정상군에비해 pro-hepcidin 의평균값이높았 다. 그러나철결핍빈혈군에서만유의한차이를나타내었으며 (P = 0.02) 만성병빈혈군 (P = 0.09) 과철결핍이동반된만성병빈혈군 (P = 0.25) 에서는두군간통계학적유의성을나타내지않았다. 3. 혈색소및철지표들과 pro-hepcidin 의상관성분석 건강대조군에서 pro-hepcidin 농도는혈색소및철관련인자 ( 철, 총철결합능, 트랜스페린포화도, 페리틴 ) 와의미있는상관관 계를나타내지않았으며전체빈혈환자군에서도혈중 pro-hepci- 90 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.4

김지명외 : Pro-hepcidin and Iron Deficiency Table 2. The correlation between laboratory parameters and serum pro-hepcidin levels in healthy control and anemia patients din 은다른지표들과는의미있는상관관계를보이지않았다. 각 빈혈군에서도혈중 pro-hepcidin 은다른지표들과의미있는상관 성을보이지않았으나 (Table 2) 철결핍빈혈군에서는 C- 반응단백질 과 pro-hepcidin 간의유의한상관성 (r = 0.30, P = 0.04) 이관찰되었 다 (Fig. 2). 그러나염증지표인 C- 반응단백질을기준으로정상군과증가군 으로나누어각군에서 pro-hepcidin, 페리틴, C- 반응단백질간의 상관성을분석했을때는세지표간에유의한상관관계가나타나 지않았다. IDA (N=50) ACD/ID (N=12) 고찰 ACD (N=46) Controls (N=60) r P r P r P r P Hemoglobin -0.14 0.34 0.10 0.48-0.06 0.52 0.07 0.72 Iron 0.29 0.12 0.09 0.33 0.08 0.48 0.15 0.23 TIBC -0.15 0.48-0.05 0.39-0.13 0.30-0.20 0.12 TSAT 0.16 0.21 0.18 0.28 0.10 0.36 0.18 0.17 Ferritin 0.20 0.17 0.29 0.35 0.31 0.13 0.19 0.15 CRP 0.30 0.04 0.11 0.52 0.25 0.13 Abbreviations: See Table 1. 철의항상성을조절하는호르몬인 hepcidin 은체내철에의해 간에서의합성이조절됨으로써혈중농도가변화하며철결핍빈혈 의경우낮은혈중농도를나타내는것으로알려져있다 [19, 20]. 본 연구에서도철결핍빈혈군과철결핍이동반된만성병빈혈군은건 강대조군에비해의미있게낮은혈중 pro-hepcidin 의농도를나 타내었으며이는낮은 pro-hepcidin 은철결핍과관련된다는것을 입증하는것이다. 그러나만성병빈혈군의 pro-hepcidin 농도는건 강대조군과는차이가없었다. 이전의연구 [3, 14, 15] 에의하면만성 병빈혈에서는 hepcidin 의증가가관찰되고이는만성병빈혈의병 태생리에중요한역할을하는것으로추정되고있었다 [3, 21, 22]. 그러나본연구에서는만성병빈혈군의 pro-hepcidin 농도가건강 대조군보다의미있게높지는않았다. 그원인으로몇가지를추정 할수있는데첫째, pro-hepcidin 은 hepcidin 을간접적으로반영 하는검사로널리사용되어져왔지만최근개발된 hepcidin 측정 법을이용한연구들에의하면 pro-hepcidin 의혈중농도는 hepcidin 보다높으며 hepcidin 농도와상관성을보이지않았다 [11, 12]. 이는전구체인 pro-hepcidin 이활성형 hepcidin-25 에비해혈중에 서불안정하기때문으로추정되고있는데이로인해 hepcidin 과는 달리 pro-hepcidin 은만성병빈혈군에서의미있는증가를보이지 Prohepcidin 350 300 250 200 150 않았을가능성이있다. r=0.30, p=0.04 100 0 2 4 6 8 10 CRP Fig. 2. Relationship between serum prohepcidin and C-reactive protein levels in patients with iron deficiency anemia. 둘째, 이전의연구에서는만성병빈혈로분류된환자의 60% 이 상이감염질환이었던반면본연구에서는 1/3 만감염질환을가진 경우였으며 C- 반응단백질의증가도 43.5% 에서만있었다. 감염에 의한염증은 hepcidin 의합성을증가시키는역할을하므로만성병 빈혈군중상대적으로감염질환이적게포함된것이만성병빈혈군 에서 pro-hepcidin 증가정도에영향을미쳤을수도있다. 만성병빈혈에서는대식세포내철의잔류, 사이토카인이매개하 는 hepcidin 의작용, 만성혈액소실등에의해철결핍이동반될수 있으며 [3] 철결핍이동반된만성병빈혈은보다심한빈혈이나타나 고철분치료가필요하므로만성병빈혈과철결핍이동반된만성병 빈혈은감별이필요하다. 그러나낮은혈중철과트랜스페린포화 도는만성병빈혈에서도나타나므로도움이되지않으며페리틴은 염증시해석하기가어렵다. 용해성트랜스페린수용체를페리틴 의로그값으로나눈비가유용하다는보고도있으나 [23] 이는임 상적으로널리이용되고있지않다. 그러므로철의요구도를반영 하는새로운검사의필요성이대두되고있으며최근 hepcidin 이나 pro-hepcidin 이제시되고있다. 본연구에서 pro-hepcidin 은철결 핍의진단인자로 ROC 분석을시행했을때경계치 230 ng/ml 에서 민감도 88.1%, 특이도 51.2%, AUC 0.728 로유용성을보였다. 또한 철결핍이동반된만성병빈혈군은만성병빈혈군보다낮은혈중 pro-hepcidin 평균값을나타냈으며두군간의감별에경계치를적 용했을때도유사한민감도와특이도를나타내었다. 빈혈을가진 환자에서철결핍을진단함에있어 hepcidin 을분석한이전의한 연구에서는경계치 129.5 ng/ml 에서민감도 50%, 특이도 85% 를 보고하고있는데 [19] pro-hepcidin 은 hepcidin 과는달리민감도가 높은반면특이도는낮은차이점이있었다. 그러나기존의철결핍 을진단하는검사들의 AUC 를평가한이전보고 [23] 와비교시본 연구의빈혈분류기준이다르다는제한점이있지만 pro-hepcidin DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.4 www.labmedonilne.org 91

김지명외 : Pro-hepcidin and Iron Deficiency 은기존의검사보다우수하지는않았다. 최근여러외국연구들은혈중이나소변의 hepcidin과페리틴간의상관관계를보고하고있는데 [9, 22, 24, 25] 본연구에서는건강대조군및환자군에서 pro-hepcidin 과페리틴간에는상관성이없었다. 혈중 pro-hepcidin 은 hepcidin을간접적으로반영하므로활성 hepcidin의농도와페리틴의관련성을분석한다른연구들과차이를나타낸것으로추측하며건강한영아를대상으로한 Ulukol 등 [26] 의연구나투석환자를대상으로한 Kato 등 [12] 의연구에서도 pro-hepcidin 과페리틴간에는상관성이없다고보고하고있다 [26]. 이전연구에서 pro-hepcidin 은철지표들과상관성을보이지않았으며 [8, 12, 13] Dallalio 등 [24] 의보고에서도 hepcidin 은급성반응기물질인페리틴외다른철지표들과상관성을보이지않았다. 본연구에서도철지표들은 pro-hepcidin 과연관성이없었는데이는체내철분상태가 hepcidin의합성에영향을미치는요인이기는하나 hepcidin이나 pro-hepcidin 의혈중농도는염증과같은다른요인에의해보다영향받음을시사하는소견이다. 본연구에서 pro-hepcidin 은급성반응기물질인페리틴과상관성이증명되지않았지만철결핍빈혈군에서염증지표인 C-반응단백질과 pro-hepcidin 간의의미있는상관성이관찰되었다. 또한백혈구수나 C-반응단백질이다른두군에비해높았던만성병빈혈군이다른비교군에비해높은 pro-hepcidin 의평균값을보이고 C-반응단백질증가군이 C-반응단백질정상군보다높은 pro-hepcidin 평균값을나타낸것은염증과 pro-hepcidin 간의연관성을보이는소견이라고사료된다. 그러므로혈중철분상태보다염증이 pro-hepcidin 에더큰영향을미칠것으로추측되며류마티스관절염환자를대상으로한국내보고에서 IL-1β, IL-6, TNF-α 등의염증지표들이 pro-hepcidin 과연관됨을보고 [27] 한것은저자들의주장을뒷받침하는것이다. 철결핍빈혈군과는달리만성병빈혈군에서는 pro-hepcidin 과 C-반응단백질간의의미있는상관성이증명되지않았는데 Sasu 등 [11] 도 hepcidin과는상관성을보고했으나 pro-hepcidin 은상관되지않는다고하였다. 저자들도염증자체는 pro-hepcidin 의농도를증가시킬수있지만염증의정도가 hepcidin과는달리 pro-hepcidin 의농도와비례하지않을것으로추측하였다. 다만, 철결핍빈혈에서 pro-hepcidin 과 C-반응단백질간의상관성이관찰된것은철결핍빈혈군은만성병빈혈군에비해 C-반응단백질증가의빈도가낮았기때문에이차이가상관성으로나타난것으로생각하였다. 혈중 pro-hepcidin 의농도는여자대학생들을대상으로한국내보고에서혈색소및헤마토크리트와양의상관성을보인다고하였다 [28]. 그러나본연구에서는 pro-hepcidin 은혈색소와의미있는상관성이없었는데이는이전의연구는빈혈여부와상관없이대상자들을함께분석함으로써철결핍빈혈과정상군간의 pro-hepcidin의 차이가혈색소와의관련성으로나타난것으로사료된다. 빈혈환자와건강대조군을나누어혈색소와 hepcidin의연관성을평가한다른연구들도 [21, 24] 연관성을보이지않는다고보고하고있는데이를통해빈혈의정도가 hepcidin이나 pro-hepcidin 의농도에미치는영향은제한적임을알수있다. 결론적으로혈중 pro-hepcidin 은철결핍빈혈및철결핍이동반된만성병빈혈에서정상대조군이나만성병빈혈에비해낮은농도를보여빈혈환자에서철결핍을진단하는인자로유용하였다. 혈중 pro-hepcidin 은 C-반응단백질증가군에서 C-반응단백질정상군에비해높은농도를보였고혈색소나철지표 ( 철, 트랜스페린포화도, 페리틴 ) 들과는상관성이없었으나철결핍빈혈군에서 C-반응단백질과양의상관관계를보여염증이 pro-hepcidin 의농도에중요한역할을할것으로사료되었다. 요약 배경 : 최근 hepcidin은철의역조절호르몬으로알려져왔다. 그러나널리쓰이는측정법이없어그전구체인 pro-hepcidin 이대용검사로이용되어져왔으며철결핍과관련된다고보고되어왔다. 본연구에서저자들은철결핍빈혈, 만성병빈혈, 철결핍을동반한만성병빈혈에서혈중 pro-hepcidin 을측정하여철결핍의예측인자로서유용성을평가하고 hepcidin의합성에관여되는빈혈, 철분상태및염증인자들이 pro-hepcidin 의농도와관련되는지보고자하였다. 방법 : 철결핍빈혈 50명, 만성병빈혈 46명, 철결핍을동반한만성병빈혈 12명의환자와 60명의건강인을대상으로일반혈액검사, 철분인자 ( 철, 총철결합능, 트랜스페린포화도, 페리틴 ), C-반응단백질, 혈중 pro-hepcidin 을측정하였다. 결과 : 철결핍을가진철결핍빈혈군과철결핍을동반한만성병빈혈군은건강대조군과만성병빈혈군에비해낮은혈중 pro-hepcidin 농도를나타내었다. 빈혈환자에서철결핍의검출을위한 prohepcidin의경계치는 230 ng/ml이었으며민감도는 88.1%, 특이도는 51.2% 이었다. 각군에서증가된 C-반응단백질환자들은정상 C-반응단백질환자들에비해높은 pro-hepcidin 평균값을나타냈으며특히철결핍빈혈군에서는유의한차이 (P = 0.02) 를보였다. 또한, 혈중 pro-hepcidin 은철결핍빈혈군에서혈색소수치와는상관성이없었으나 C-반응단백질과양의상관성 (r = 0.30, P = 0.04) 을보였다. 결론 : 빈혈환자에서 pro-hepcidin 의측정은철결핍을가진철결핍빈혈군및철결핍을동반한만성병빈혈군을만성병빈혈군과감별하는데도움이될수있다. 혈중 pro-hepcidin 농도는빈혈의정도보다는염증에의해더영향을받는다. 92 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.4

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원저 Lab Med Online Vol. 1, No. 2: 94-99, April 2011 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.5 진단혈액학 Coapresta 2000 을이용한혈액응고검사의평가 Evaluation of an Automated Coagulation Analyzer Coapresta 2000 최종현 송성욱 박용정 최종락 송재우 Jonghyeon Choi, Sungwook Song, Yongjung Park, Jong Rak Choi, Jaewoo Song 연세대학교의과대학진단검사의학교실 Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Background: The Coapresta 2000 (Sekisui Medical CO., LTD, Japan) is a fully automated random-access multiparameter hemostasis coagulation analyzer, which is equipped with a photo-optical clot detection unit and a cap-piercing system. It is able to perform clotting time assays as well as colorimetric assays (synthetic substrate method and latex turbidimetric method). In this study, we evaluated the analytical performance of the Coapresta 2000 for coagulation test items and compared with that of the ACL-TOP (Instrumentation Laboratory, Lexingtion, MA, USA) analyzer, which is currently used for routine coagulation test items in our hospital. Methods: The Coapresta 2000 was evaluated with respect to its technical characteristics in the determination of 8 routine coagulation test items: prothrombin time, activated partial thromboplastin time, fibrinogen, fibrin-degradation product (FDP) antithrombin III, D-dimer, factors VIII and IX. Analyse-it (Analyse-it Software Ltd, UK) and SigmaStat (Systat Software, Inc., USA) were used for statistical analysis between items on the Coapresta 2000 and the ACL-TOP analyzer. Results: The intra-assay and inter-assay coefficients of variation (CV) were below 5% for both groups of samples having values within the reference interval and outside the reference interval. Significant interference was observed with hemolytic and icteric samples. Carryover was not detected. The results obtained by Coapresta 2000 were well correlated with those obtained by the ACL-TOP analyzer (r 2 in the range from 0.781 to 0.969). Conclusions: We concluded that Coapresta 2000 analyzer was well correlated with ACL-TOP analyzer for the routine coagulation test items tested. Key Words: Coapresta 2000, Evaluation, Correlation, ACL-TOP 서론 혈액응고검사는혈액응고이상질환의선별검사에서부터확진 및치료에대한추적검사에이르기까지다양하게쓰이고있어그 중요성은점차커지고있고검사요구가증가함에따라검사방법은 좀더신속하게결과를내기위해발전되고있다 [1]. 현재대부분의 Corresponding author: Jaewoo Song Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine, 250 Seongsan-ro, Seodaemun-gu, Seoul 120-752, Korea Tel: +82-2-2228-2445, Fax: +82-2-313-0956 E-mail: labdx@yuhs.ac Received: August 10, 2010 Revision received: February 10, 2011 Accepted: February 11, 2011 This article is available from http://www.labmedonline.org 2011, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 검사실에서혈액응고분석을위해다양한자동화된기기를사용하고있고, 최근에소개된기기들은다양한원리의방법을동시에진행할수있는시스템을갖추고있어서많은항목의혈액응고검사가실시간으로수행될수있다 [2, 3]. 그러나기기마다검체분석시사용방법이다소차이가있고같은분석방법을쓴다고해도사용하는시약이나여러요인들에의해결과치가영향을받을수있으므로새로운혈액응고자동분석기가검사실에도입되려면기기의경제성, 효율성, 신속성등과함께기능성을고려해야하며기존기기와의상관성을반드시평가해주어야한다 [4]. 그리고국내에서도그동안혈액응고자동분석기평가에대한많은보고가있었다 [5-7]. Coapresta 2000 (CP 2000, Sekisui Medical CO., LTD, Tokyo, Japan) 은여러가지분석원리를갖춘혈액응고자동분석기로비교적조작이간편하고크기가작아공간에대한효율성이좋으며다양한항목의혈액응고검사가실시간가능하다. 총 20가지의혈액응고항목검사를수행할수있고한번에 60검체의검사가가능하다. 검사원리는응고시간분석법및비색법을이용하며, 응고시간분석법의경우시간당 400건의검사를할수있고, 비색법의경우 94 www.labmedonilne.org eissn 2093-6338

최종현외 : Coapresta 2000 을이용한혈액응고검사의평가 시간당 200건의검사가가능하다. 또한검사도중응급검체발생시사용자는이를우선적으로검사할수있다. 하지만아직 CP 2000에대한국내평가보고서가없기에본저자들은최근소개된혈액응고자동분석기인 CP 2000을사용하여혈액응고검사항목인프로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간, 섬유소원, 섬유소원분해산물 (fibrin-degradation product, FDP), antithrombin III, D-dimer, 응고인자 VIII 및 IX 등을평가하고 ACL-TOP (Instrumentation Laboratory, Paris, France) 과의상관성을비교해보았다. 대상및방법 였다. 검체는먼저 ACL-TOP 으로측정되었고, 되도록 1시간내에 CP 2000에의해측정되었으나부득이하게지연되는경우냉장보관 (2-4 ) 하여 4시간내에검사였다. 또한프로트롬빈시간측정은모두실온보관상태에서즉시검사를시행하였다. 혈장은 3.2% sodium citrate 시험관 (Becton Dickinson Ltd, Frankin Lakes, NJ, USA) 에정맥혈과항응고제의비율이 9:1이되도록검체량 2 ml를채취하였으며 10분이상 2,500 g으로원심분리하여얻었다. 두기기간상관성분석을위한검사항목들은통상검사시시행되는검사들로서프로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간, 섬유소원, 섬유소원분해산물, D-dimer, antithrombin III, 응고인자 VIII 및 IX 등이었다. 1. 기기및시약 CP 2000 (Sekisui Medical CO., LTD, Tokyo, Japan) 은응고시간분석법 (coagulation time assay), 비색측정법합성기질 (synthetic substrate) 을이용한분석법및라텍스혼탁측정법 (latex tubidimetry) 등의다양한원리를이용하여최대 20가지의혈액응고검사항목을시행할수있다. 응고시간분석법은고도의발광다이오드 (light emitting diode, LED) 광원을사용하여검체와시약의혼합액으로부터 90도산란광의강도를전기적신호로변경하여측정한다. 이러한원리로프로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간, 섬유소원, 응고인자등의검사가가능하다. 또한비색측정법은검체가분주된큐벳에시약을첨가하여큐벳의흡광도를측정하는방법으로합성기질을이용한분석법과라텍스혼탁측정법두가지가있으며합성기질을이용한벙법으로는 antithrombin III, protein C 등의검사를, 라텍스혼탁측정법으로는섬유소원분해산물, D-dimer 등이있다. 본평가를위해 CP 2000에사용된시약및 calibrator 는 Table 1 에제시하였다. 이중섬유소원완충액은 3일마다교체해주었고모든검사는제조사지침에따라실시되었다. 2. 측정대상및검체보관 2008년 10월부터 11월까지병동및외래에서본검사실로혈액응고검사가의뢰된 360명의검체들을무작위로선별하여검사하 3. 평가항목 1) 측정내정밀도 (intra-assay precision) 평가프로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간, 섬유소원, 섬유소원분해산물, 항트롬빈 III, D-dimer 등항목의측정내정밀도를분석하기위하여제조사에서제공된정상정도관리물질 (fresh normal plasma) 과비정상정도관리물질 (fresh abnormal plasma) 을각각 10개의시험관에분주하여당일에 10회씩반복측정하였다. 그리고각항목별평균값, 표준편차, 변이계수등을구하여평가하였다. 2) 측정간정밀도 (inter-assay precision) 평가측정간정밀도는프로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간, 섬유소원, 섬유소원분해산물, 항트롬빈 III, D-dimer 등의항목에서제조사에서제공하는정상정도관리물질과비정상정도관리물질을각각 40개씩분주하여오전오후 2회씩 10일간반복측정하였다. 측정내정밀도평가시와동일하게각항목들의평균값, 표준편차, 변이계수등을구하여평가하였다. 3) 검체간상호오염 (Carry-Over) 평가활성화부분트롬보플라스틴시간을이용하여검체간상호오염여부를평가하기위해 ACL-TOP 으로검사를시행했던환자검체중활성화부분트롬보플라스틴시간이긴검체 (200 sec) 와짧은검 Table 1. Reagents and calibrators used in this study for comparison of two coagulation analyzers Test (unit) Reagent (Manufacturer) Calibrators Cuttoff PT (sec) QuikCoag PT with Calcium (Biomedica) Normal calibrator 13-15 aptt (sec) QuikCoag APTT (Biomedica) - 24-39 Fibrinogen (mg/dl) Coagpia Fibrinogen (SEKISUI) Fibrinogen Buffer 200-400 FDP (µg/ml) Nanopia FDP (SEKISUI) FDP Calibrator 5.0 Antithrombin III (%) Test TeamS AT III (SEKISUI) Normal plasma control 11-140 D-dimer (µg/ml) Nanopia D-dimer (SEKISUI) D-dimer Calibrator 0.3-60 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.5 www.labmedonilne.org 95

최종현외 : Coapresta 2000 을이용한혈액응고검사의평가 체 (35.8 sec) 를각각 1개씩선별하여혈장을분리한뒤각각 4개의시험관에분주하였다. 그리고활성화부분트롬보플라스틴시간이긴검체 4개를먼저차례로측정하고이어서시간이짧은검체 4개를측정하였다. Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) H- 57-A에따라총 10회반복측정한후검체간상호오염에대한비율 (%) 을구하였다. 이때상호오염도를구하는식은아래에제시하였다. 이때평가의통과기준은검체간상호오염도 1% 이하로하였다. Carry-Over (%) = {L1-(L3-L4)/2}/{(H2+H3)/2-(L3+L4)/2} 100 4) ACL-Top 과의상관성비교 CLSI H30-A2, 47-A2에지침을근거로측정된프로트롬빈시간 (%), 프로트롬빈시간 (INR), 활성화부분트롬보플래스틴시간, 섬유소원, 항트롬빈 III, D-dimer, 응고인자 VIII 및 IX 등의항목에서 CP 2000과 ACL-TOP 의상관성을평가하였다 [8, 9]. 검체는정상과비정상결과가골고루포함되도록선별하여두장비모두에서측정하였으며용혈검체및황달검체는평가에서제외하였다. 프로트롬빈시간의경우정확한비교를하기위해퍼센트 (%) 값과국제정상화비율 (international normalized ratio, INR) 값을나누어각각평가하였다. 처리된결과에대한통계분석을위해본검사실에서현재사용하고있는 ACL-TOP 을기준장비로하였고비교장비 CP 2000을통계처리하여 r 2 값과 P값을산출하였다. 3.10 (Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA) 를사용하였다. 두장비간상관성검증을위해 Pearson 상관계수를구하였고 Altman Bland Plot 분석법으로두장비간편차를분석하였으며 95% 신뢰구간을일치한계선으로정의하였다. 그리고 P <0.05일경우통계적으로유의한것으로간주하였다. 결과 1. 정밀도 모든항목에서정밀도는변이계수 5% 미만의비교적양호한결과를보였다. 측정내정밀도의경우변이계수가 0.4% 에서 3.3%, 측정간정밀도는변이계수가 1.8% 에서 4.9% 까지범위를보였다 (Table 2). 2. 검체간상호오염높은수치의검체및낮은수치의검체는 CP 2000으로검사한결과각각거의비슷한값을보였다. 총 10회반복하여계산결과 L1-(L3+L4)/2 값은모두 0.1 미만이었고, (H2+H3)/2-(L3+L4)/2 값은평균 164.4였다. 따라서검체간상호오염도는 0.1% 이하로모두통과기준을만족하여검체간상호오염은일어나지않음을확인하였다. 5) 용혈검체와황달검체에서간섭평가용혈검체와황달검체의간섭여부를평가하기위해본저자들은의뢰된환자검체중육안소견상용혈된검체 (n= 9) 와혈청총빌리루빈이 15.0 mg/dl 이상의황달검체 (n=2) 를선별하여프로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간결과에관하여 ACL- TOP과 CP 2000을비교하였다. 6) 통계학적분석통계학적분석을위해통계프로그램은 Analyse-it Method Evaluation Edition version 2.20 software (Analyse-it Software Ltd, City West Business Park, Leeds, UK) 및 SigmaStat for window version 3. ACL-TOP 과의상관성비교두장비간상관성을비교한결과사용된모든항목에서상관계수범위는 0.781 에서 0.969 로나타났으며, 응고인자 VIII 및 IX를제외한모든항목에서 P값은모두 0.0001 미만으로통계적으로유의하였다. 두장비간상관관계및편차는 Figs. 1, 2에제시하였고각항목에대한환자검체수, 평균값, P값및상관계수는 Table 3에정리하였다. 4. 용혈검체와황달검체에서간섭평가두기기모두대부분의용혈검체및황달검체에서참고치보다높은값을보였다. 용혈검체의경우 CP 2000에서프로트롬빈시간 Table 2. Intra-assay & inter-assay precisions of the CP 2000 analyzer Test Unit Mean Intra/inter-assay Fresh nomal plasma (n=10) SD Intra/inter-assay CV (%) Intra/inter-assay Mean Intra/inter-assay Fresh abnormal plasma (n=10) SD Intra/inter-assay CV (%) Intra/inter-assay PT % 112.6/116.1 3.7/5.7 3.3/4.9 22.4/21.5 0.7/1.0 3.1/4.4 aptt Sec 31/59.5 0.2/1.8 0.8/3.0 58.3/30.1 0.5/0.6 0.8/1.9 Fibrinogen mg/dl 312.6/292.2 4.8/6.7 1.5/2.3 98/90.5 1/3.9 1.0/4.4 FDP μg/ml 8.9/28.8 0.4/0.7 0.8/2.6 28.4/8.7 0.4/0.3 1.5/2.9 Antithrombin III % 34.8/102.0 0.8/1.8 2.3/1.8 103.2/31.7 0.4/1.4 0.4/4.5 D-dimer μg/ml 3.1/9.5 0.01/0.2 1.0/2.5 9.4/3.1 0.1/0.1 1.2/2.5 96 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.5

최종현외 : Coapresta 2000 을이용한혈액응고검사의평가 CP 2000 (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 PT (%) y=1.1259x-11.34 R 2 =0.893 50 100 ACL-TOP (%) CP 2000 (INR) 7 6 5 4 3 2 1 0 PT (INR) y=0.7019x+0.2971 R 2 =0.781 CP 2000 (sec) 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 aptt y=0.921x+2.171 R 2 =0.875 5 10 20 70 120 170 220 0 200 400 600 800 1,000 A ACL-TOP (INR) B ACL-TOP (sec) C ACL-TOP (mg/dl) D CP 2000 (mg/dl) 1,200 1,000 800 600 400 200 0 Fibrinogen y=1.233x-74.58 R 2 =0.900 CP 2000 (%) 200 150 100 50 0 Antithrombin III y=0.950x+3.685 R 2 =0.963 0 50 100 150 200 ACL-TOP (%) ACL-TOP (μg/ml) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 D-dimer y=0.323x+0.005 R 2 =0.965 CP 2000 (%) 140 120 100 80 60 40 20 Factor VIII y=1.064x-32.83 R 2 =0.969 0 10 20 30 40 50 40 60 80 100 120 140 50 70 90 110 130 E CP 2000 (μg/ml) F ACL-TOP (%) G ACL-TOP (%) H Fig. 1. Correlation of the test results between ACL-TOP and CP 2000 analyzers for 8 coagulation test items. CP 2000 (%) 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 Factor IX y=1.042x-30.74 R 2 =0.926 Identity Bias (-0.123) 95% Limits of agreement (-0.962 to 0.717) Difference (CP 2000 [%]-ACL- TOP [%]) Difference (CP 2000 [%]-ACL- TOP [%]) 40 30 20 10 0-10 -20-30 -40 60 50 40 30 20 10 0-10 -20 PT, % (Difference plot) 0 50 100 Mean of all Antithrombin III (Difference plot) 0 100 200 Mean of all Difference (CP 2000 [INR]-ACL- TOP [INR]) 1 0-1 -2-3 -4-5 -6-7 -8 PT, INR (Difference plot) Difference (CP 2000 [sec]-acl- TOP [sec]) 40 20 0-20 -40-60 -80 aptt (Difference plot) Difference (CP 2000 [mg/dl]-acl- TOP [mg/dl]) 0 5 10 20 120 220 0 500 1,000 A Mean of all B Mean of all C Mean of all D Difference (CP 2000 [µg/ml]-acl- TOP [µg/ml]) 35 30 25 20 15 10 5 0-5 -10 D-dimer (Difference plot) Difference (CP 2000 [%]-ACL- TOP [%]) 350 250 150 50-50 -150 Fibrinogen (Difference plot) 0 20 40 20 70 120 20 70 120 E Mean of all F Mean of all G Mean of all H Fig. 2. Bias of the test results between ACL-TOP and CP 2000 analyzers for 8 coagulation test items. 5 0-5 -10-15 -20-25 -30-35 -40 Factor VIII (Difference plot) Difference (CP 2000 [%]-ACL- TOP [%]) 5 0-5 -10-15 -20-25 -30-35 -40 Factor IX (Difference plot) 이 9 개의검체중 7 개의검체가 15 초이상으로참고치보다높았고 9 개의검체모두 ACL-TOP 보다높은수치를보였다. 활성화부분트 롬보플라스틴시간은 CP 2000 에서 9 개의검체중 8 개의검체가 39 초이상으로참고치보다높았으며프로트롬빈시간과마찬가지로 9 개의검체모두 CP 2000 이 ACL-TOP 보다높았다. 황달검체는프 로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간은각각 25 초이상, DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.5 www.labmedonilne.org 97

최종현외 : Coapresta 2000 을이용한혈액응고검사의평가 Table 3. Comparison of the results of coagulation tests performed on the ACL-TOP and the CP 2000 analyzers Test n ACL-TOP CP 2000 Comparison (P) Correlation (r 2 ) PT (%) 352 86 (5,100) 81 (4,135) <0.0001 0.8928 PT (INR) 352 1.03 (0.83, 6.94) 1.11 (0.88, 11.92) <0.0001 0.7809 aptt 287 32.7 (24.5, 200) 34.4 (0.88, 200) <0.0001 0.8759 Fibrinogen 177 348 (50, 900) 300 (46, 1,099) <0.0001 0.9006 Antithrombin III 231 76 (7, 200) 74 (16, 200) <0.0001 0.9632 D-dimer 119 800 (52, 15,684) 2,690 (270, 48,010) <0.0001 0.9651 Factor VIII 12 76.7 (44.8, 139) 48.9 (20.6, 121.3) 0.0397 0.9694 Factor IX 17 75.0 (57.0, 137.0) 47.4 (28.4, 122.1) 0.0022 0.9261 Results are expressed as the median values with ranges in parentheses. 55초이상으로참고치보다높았고 CP 2000값이 ACL-TOP 보다모두높았다. ACL-TOP 이비교적용혈검체및황달검체에간섭이적은것을감안해봤을때 CP 2000은용혈검체및황달검체에간섭을더받는것을알수있었다. 따라서 CP 2000 검사시용혈검체및황달검체는적용하기어려울것으로생각된다. 고찰 혈액응고검사는혈액응고질환의진단에있어서매우중요한역할을해왔다. 해마다혈액응고검사는꾸준한양적발전을하여왔고, 이로인한검사장비의경제성, 효율성, 신속성등도점차중요해지고있다 [1]. 근래에소개되는혈액응고자동분석기는대부분완전자동화된장비들로광학적분석법을이용하고있다. 이들은빛의산란이증가하는것을측정함으로써재현성이기계적응괴- 검출에기반한분석기 (mechanical clot-detection-based analyzer) 보다우수한것으로보고되었다 [5, 10, 11]. 과거에는검사실에서 mechanical clot-detection-based analyzer를사용하였지만이후광학적분석기가소개되면서, 기계적응괴-검출에기반한분석기를기준장비로하고광학적분석기를비교장비로하여상관성을평가한연구가진행되었고그결과두장비간상관성은우수하다는보고가있었다. 뿐만아니라광학적분석으로인해야기될수있는간섭현상도기존기계적응괴-검출에기반한분석기에비교했을때큰차이가없다는보고도있었다 [3, 4]. 이에저자들은본검사실에서현재사용중인 ACL-TOP 을기준장비와통상혈액응고검사항목에대해 CP 2000을평가하게되었다. 정밀도는프로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간, 섬유소원, 항트롬빈 III, 섬유소원분해산물, D-dimer 등에서정도관리물질로평가하였으며측정내정밀도및측정간정밀도모두변이계수가 5% 미만으로비교적양호한결과를보였다. 여기에응고인자 VIII 및 IX를추가하여 ACL-TOP 측정값과상관성을비교한결과검사항목의상관계수범위는 0.781 에서 0.969 로나타났으며, P값은대부분통계학적으로유의하였다. 그리고두장비간편 차는대부분 95% 신뢰구간내에있음을확인할수있었다. 검체간상호오염평가에서는부분트롬보플라스틴시간이높은검체와낮은검체를이용하여평가하였다. 10회반복해서얻은 L1- (L3+L4)/2 값은모두 0.1 미만이었고상호오염도는모두 1.0% 이하로통과기준내에들었다. 헤파린투여환자의경우헤파린농도가시약의민감도에따라달라질수있으므로이에대한부분트롬보플라스틴시간의민감도는새로운혈액응고장비도입시기본적으로평가가되어야하는항목이다. 그러나본저자들은이에대한평가를시행하지못하여추후좀더보완되어야할것이다. 광학적분석기사용시용혈및황달검체는검사시흡광도에영향을줄수있으므로이에대한간섭현상평가는반드시필요하다. Fischer 등은용혈및황달검체에대한간섭현상여부를평가하기위해기계적응괴-검출에기반한분석기중하나인 STAR 분석기 (Diagnostica Stago, Asnieres, France) 를사용하여광학적분석기인 ACL-TOP 및 CA7000 (TOA Medical Electronics Co., Kobe, Japan) 를비교한바있다 [3, 4]. 그결과간섭현상이 CA 7000에서는나타났지만 ACL-TOP 에서는나타나지않았다. 저자들의연구에서는 CP 2000의프로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간수치가 ACL-TOP 보다높아간섭현상을확인하였다. 이러한검체에서기계적응괴-검출에기반한분석기에대한비교분석이더필요할것으로생각된다. 또한고농도중성지방검체에대한간섭평가도시행되어야하지만그러한검체의수가부족하여검사를시행하지못하였다. CP 2000은통상혈액응고검사에널리쓰이는 ACL-TOP 과의평가에서비교적좋은상관관계를보였다. 하지만이는측정원리가유사한기기간의비교였으며용혈검체와황달검체에대한간접현상을확인할수있었지만 CP 2000은검사실에서제한적사용이가능할것으로판단하였다. 요약 배경 : Coapresta 2000 은광학적응괴분석기가있으며채혈관의뚜 98 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.5

최종현외 : Coapresta 2000 을이용한혈액응고검사의평가 껑을뚫는장치를갖추었으며다양한검사항목을수행할수있는혈액응고자동화분석기이다. 본기기는응고시간측정법뿐아니라비색법등의검사원리를수행할수있다. 본연구에서저자들은혈액응고검사에대하여 Coapresta 2000을평가하였으며, 현재본원에서통상적인혈액응고검사에쓰이는 ACL-TOP 과의상관성을비교하였다. 방법 : Coapresta 2000은여덟가지의통상적인혈액응고검사항목 ( 프로트롬빈시간, 활성화부분트롬보플라스틴시간, 섬유소원, 섬유소원분해산물, 항트롬빈 III, D-dimer, 응고인자 VIII 및 IX) 에대한값을결정함으로써그기술적특성을평가하였다. 두기기간통계적분석을위해 Analyse-it (Analyse-it Software Ltd, UK) 과 Sigma- Stat (Systat Software, Inc., USA) 을사용하였다. 결과 : 정상검체와비정상검체를사용하여분석한측정내정밀도와측정간정밀도의변이계수값은모두 5% 미만이었다. 용혈검체와황달검체를사용하였을때간섭현상이관찰되었다. 검체간상호오염은나타나지않았다. Coapresta 2000에서얻은결과는 ACL-TOP 에서얻은결과와좋은상관관계를보였고 r 2 값의범위는 0.781 에서 0.969 였다. 결론 : 저자들은통상혈액응고검사를통해 Coapresta 2000과 ACL- TOP이좋은상관관계가있음을결론지었다. 참고문헌 1. Walenga JM and Fareed J. Automation and quality control in the coagulation laboratory. Clin Lab Med 1994;14:709-28. 2. Amiral J, Adalbert B, Adam M. Application of enzyme immunoassays to coagulation testing. Clin Chem 1984;30:1512-6. 3. Fischer F, Appert-Flory A, Jambou D, Toulon P. Evaluation of the automated coagulation analyzer Sysmex CA-7000. Thromb Res 2006;117: 721-9. 4. Appert-Flory A, Fischer F, Jambou D, Toulon P. Evaluation and performance characteristics of the automated coagulation analyzer ACL TOP. Thromb Res 2007;120:733-43. 5. Kim YA and Sun YK. Measurement of PT, aptt, and fibrinogen by automatic coagulation analyzer, ACL9000. J Lab Med Qual Assur 2002; 24:201-7. 6. Kim HS, Nam KH, Lee DH. Measurement of PT, APTT, and fibrinogen by automatic coagulation analyzer, Sysmex CA-540. J Clin Pathol Qual Control 2001;23:247-52. 7. Lee YW, Chang CW, Lim MS, Lim BJ, Lee YK. Laboratory evaluation of automated coagulation analyzers sysmex CA-1500TM and CA-7000TM. J Clin Pathol Qual Control 2001;23:253-8. 8. Clinical and Laboratory Standards Institute. One-stage prothrombin time (PT) test and activated partial thromboplastin time (APTT) test; approved guideline. CLSI Document H47-A2. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedure for the determination of fibrinogen in plasma; approved guideline-second edition. NCCLS Document H30-A2. Wayne, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2001. 10. Milos M, Herak D, Kuric L, Horvat I, Zadro R. Evaluation and performance characteristics of the coagulation system: ACL TOP analyzer- HemosIL reagents. Int J Lab Hematol 2009;31:26-35. 11. Eschwège V, Catillon C, Robert A. Evaluation of the automated coagulation analyser ACL TOP (instrumentation laboratory). Ann Biol Clin (Paris) 2006;64:259-64. DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.5 www.labmedonilne.org 99

원저 Lab Med Online Vol. 1, No. 2: 100-104, April 2011 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.6 임상미생물학 LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR 의말라리아진단유용성 Evaluation of the LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR for the Diagnosis of Malaria 이혜진 김하늬 유병준 김장수 김명한 임채승 이갑노 Hye Jin Lee, Ha Nui Kim, Byong Joon Yoo, Jang Su Kim, Myong Han Kim, Chae Seung Lim, Kap No Lee 고려대학교의과대학진단검사의학교실 Department of Laboratory Medicine, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea Background: Malaria is a problematic disease in Korea, and microscopic examination of Giemsa-stained blood smear has been used as the gold standard for its diagnosis. However, this technique is time-consuming and has low sensitivity in samples with low numbers of malarial parasites (<20 parasites/µl). Here, we evaluated the performance characteristics of the LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR (LG life sciences, Korea). Methods: Blood samples from 173 persons who visited Korea University Ansan Hospital were evaluated. QPCR was performed in 73 malaria patients and 100 healthy subjects by using the LG Advansure Malaria P.f./P.v. real-time QPCR kit, and the results were compared with those of microscopy. The detection limit of this kit was determined by serial dilution of Plasmodium-infected blood with normal blood (blood not infected with Plasmodium). Results: Among the 73 patients that were microscopically confirmed to have malaria (Plasmodium vivax infection, N=70, P. falciparum infection, N=3), 69 patients were diagnosed with P. vivax infection and 3 were diagnosed with P. falciparum infection by LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. realtime QPCR. Both the tests indicated absence of infection in the 100 healthy subjects. The detection limit of LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR was 0.1 parasite/μl. Conclusions: LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR is a very sensitive and specific technique and can be used as a confirmatory test for malaria. Key Words: Malaria, Real time quantitative PCR, Diagnosis 서론 말라리아는 Plasmodium 속원충이적혈구와간세포내에기 생함으로써발병하는급성열성감염증이다 [1]. 말라리아감염은 Corresponding author: Chae Seung Lim Dapartment of Laboratory Medicine, Korea University Guro Hospital, Guro 2-dong, Guro-gu, Seoul 152-703, Korea Tel: +82-2-2626-1455, Fax: +82-2-2626-1465 E-mail: malarim@korea.ac.kr Received: October 21, 2010 Revision received: January 31, 2011 Accepted: January 31, 2011 This article is available from http://www.labmedonline.org 2011, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 열대와아열대지방에서유행하고있으며, 전세계적으로매년 3.5-5 억명의환자가발생하며, 백만명정도가사망하고있다 [2]. 국내에서도말라리아확산방지및근절방안에도불구하고비무장지대인접지역과인천, 강화, 경기북부지역을중심으로삼일열말라리아 (Plasmodium vivax) 가유행하고있다. 뿐만아니라아프리카와동남아시아등의말라리아유행지역으로의해외여행의증가로인하여열대열원충 (Plasmodium falciparum) 에의한감염도보고되고있다 [3]. 국내의삼일열말라리아토착화와함께수입성말라리아의증가로수혈전파성감염의위험도함께증가하고있는데우리나라에서도 1997년에수혈로인한말라리아감염환자의발생이보고되었다 [4]. 말라리아는원충의종류에따라치료방법이달라조기진단이질병의진행경과를단축시킬수있기때문에빠르고정확한진단이매우중요하다 [5]. 현재까지말라리아진단은김자염색 (Giemsa stain) 을통한박층도말표본과후층도말표본을현미경으로판독하는것이표준검사법으로되어있다. 이방 100 www.labmedonilne.org eissn 2093-6338

이혜진외 : LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR 의말라리아진단유용성 법은경제적이고신속하며비교적민감하여원충의종간의구별이가능하다는장점이있으나, 결과해석이주관적이고숙련된기술을필요로한다. 특히혈중원충농도가낮을경우에는위음성으로해석될가능성이있고혼합감염의경우정확한진단이어려운단점이있다 [6]. 최근에는 DNA 증폭을이용한분자진단법이말라리아진단에유용하게이용되고있다. 고식적인중합효소연쇄반응법과이중중합효소연쇄반응법 (nested PCR) 등의여러가지중합효소연쇄반응법이말라리아진단에사용되고있으며, 이방법은 1 μl당 5개이하의원충감염도진단할만큼민감도가높고혼합감염의감별에도특이도가높다고알려져있다 [7-9]. 그러나복잡하고노동집약적이며검사소요시간이길어임상검사실에서통상검사로사용하기에부적절하며증폭후산물의오염이흔하게발생하여위양성결과를초래할수있다 [7,10]. 실시간중합효소연쇄반응은유전자증폭확인이객관화되고실시간으로할수있으며사용법이간단하고상대적으로검사소요시간이짧으며실험실오염을줄일수있는정량검사법이다 [8]. 본연구는삼일열말라리아와열대열말라리아감염의진단에있어실시간중합효소연쇄반응검사법인 LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR (LG 생명과학, 서울, 대한민국 ) 의유용성을평가하고자하였다. 대상및방법 1. 대상 2000년 4월부터 2009년 12월까지말라리아감염이의심되어고려대학교안산병원에내원하여박층및후층혈액도말표본을통한고전적인검경법으로원충이발견되었던 73명의환자를대상으로시행되었다. 대조군으로는 100명의증상이없는건강한성인을대상으로하였다. 환자군의나이는 24세에서 60세사이였으며이들은내원당시발열이있거나최근에발열증상의병력이있었다. 환자군과대조군모두에게연구의목적과방법을설명하고동의를얻었으며고려대학교안산병원윤리위원회의심의를거쳤다 (IRB Number: AS0844-002). μl) 를간접적으로계산하였다. 2) 검출한계설정말라리아의검출민감도를결정하기위해서열대열말라리아양성검체를감염되지않은혈액으로 10배희석하여검사를실시하였다. μl당 10,000개의원충농도를보였던말라리아감염혈액을정상혈액으로희석하여혈중원충농도를 μl당 10,000개에서 0.001개까지 10배로배수희석하였다 [2]. 각각의희석된검체로부터 DNA를키트설명서에따라분리하고실시간중합효소연쇄반응을시행하였다. 또한각각의희석된검체에대하여박층및후층혈액도말표본을만들어현미경으로양성여부를판독하였다. 결과판독은현미경검경법과중합효소연쇄반응법모두한번씩만시행하였고음성결과에대하여중합효소연쇄반응재검은하지않았다. 3) 중합효소연쇄반응 EDTA 시험관에채혈한뒤 -80 냉동고에보관하였고, QiAamp DNA mini kit (Quiagen, Chatsworth, CA, USA) 를사용하여전혈 200 μl로부터 DNA를키트설명서에따라분리하였다. 분리된 DNA 5 μl를실시간중합효소연쇄반응에사용하였다. LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR은인체의감염을일으키는삼일열원충과열대열원충의 18S rrna 유전자영역을증폭시키도록고안되었다. 중합효소연쇄반응검사와분석은 SLAN 실시간 PCR system (LG 생명과학 ) 을사용하였다. EDTA 시험관에채혈하여추출한말라리아 DNA, 중합효소연쇄반응혼합액, 시발체 / 탐색자혼합액, 정량표준물질과양성대조액, 음성대조액을첨가한후실시간중합효소연쇄반응기기에서반응을진행하였고음성대조액으로는 salmon sperm DNA, 양성대조액으로는 P.f./P.v. 양성클론을사용하였다. 중합효소연쇄반응조건은먼저 95 에서 10분간 Taq 중합효소 (Taq polymerase) 를활성화시킨후, 95 에서 15 초, 57 에서 45초, 72 에서 20초간 40회반복했다. 중합효소연쇄반응결과는실시간중합효소연쇄반응기기에의해실시간으로측정되어 Cycle threshold (Ct) 값으로나타난다. 각각의양성판정기준 Ct 값은삼일열원충과열대열원충모두 40 이하로정의하였다. 2. 방법 1) 검경법말라리아가의심되는환자는박층도말과후층도말을시행하고 Wright Giemsa 염색을하여숙련된판독자가원충의종과농도를광학현미경으로판독하였다. 원충의농도는 1,000 배율에서백혈구 200개당나타나는원충의수를계수한후에자동혈구계산기 (Cell-dyn 4000, Abbott diagnostics, Santa Clara, CA, USA) 에서측정된백혈구수로부터 μl당원충의수 ([ 원충수 /200 WBC]) WBC/ 결과 총 73명의환자중 70명이고전적인혈액도말검사상삼일열말라리아감염으로진단되었고 3명은열대열말라리아로진단되었다. 삼일열말라리아로진단받은 70명중 69명 (98.6%) 이 LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR 검사에서양성을보였고 1명 (1.4%) 은음성이었다. 혈액도말검사의검경법으로열대열말라리아로진단받은 3명의경우중합효소연쇄반응검사법에서 100% 양성 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.6 www.labmedonilne.org 101

이혜진외 : LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR 의말라리아진단유용성 Table 1. Comparison of the results of real time quantitative PCR and microscopic examination of Giemsa-stained blood film Microscopy Advansure Malaria P.f/P.v real time quantitative PCR P. v* P. f Negative P. v* (N=70) 69 (98.6%) 0 (0%) 1 (1.4%) P. f (N=3) 0 (0%) 3 (100%) 0 (0%) Negative (N=100) 0 (0%) 0 (0%) 100 (100%) *Plasmodium vivax; Plasmodium falciparum. 결과이었다. 또한혈액도말검사의검경법에서말라리아가검출되 지않았던건강한성인 100 명의경우실시간중합효소연쇄반응검 사에서삼일열말라리아와열대열말라리아모두음성결과를보 였다 (Table 1). 본실시간중합효소연쇄반응검사는 μl 당 0.1 개의 원충이있는희석검체까지양성으로검출할수있었다 (Table 2). 고찰 말라리아감염후질병의경과는감염된원충의종류와조기진 단여부에달려있어신속하고정확한진단이중요하다. 특히, 열대 열원충에감염될경우병의경과가매우빠르고예후가치명적이 므로민감한검사법이더욱필요하다. 현재까지말라리아진단에 는혈액도말표본의현미경검사법, 급속항원검출법, 그리고분자 진단에서는전통적중합효소연쇄반응법, 이중중합효소연쇄반응 법, 다중중합효소연쇄반응 (multiplex PCR) 법등이소개되어있다 [11-14]. 그러나혈액도말표본의염색을통한검경법은숙련도에따 라결과의차이를보이고종간의판별력이주관적이며검사결과의 표준화가이루어지기어렵다. 또한판독에많은시간이소모되며 혈중말라리아원충의농도가낮을경우에진단의예민도가떨어 지는단점이있다. Mathieu 등 [9] 의보고에따르면 2002 년영국의 262 개의기관에서검경법으로평가했을때정확한말라리아종의 진단율이 63.7% 에서 95% 까지다양했다 [9]. 면역크로마토그래피 시약지 (immunochromatographic strip) 와단클론항체 (monoclonal antibody) 를이용한신속항원, 항체검출법의경우에도말검 사법과비교하였을때민감도와특이도가떨어진다는보고가있 고 [9,12] 현재감염과과거감염을구분할수없어추적검사로는 적합하지않다 [15]. 1980 년대후반부터중합효소연쇄반응과같은 핵산증폭검사법이말라리아의진단에사용되고있으나중합효 소연쇄반응법의종류에따라민감도와특이도가매우광범위하게 보고되고있다 [16]. 이중중합효소연쇄반응법의경우혈액도말검 사법보다민감도가높다고알려져있지만상대적으로검사소요 시간이길고결과의정량화가어렵다는단점이있다 [13]. 혈액도말 검사에서음성이나임상적으로말라리아감염이의심이되는경 우, 혼합감염이의심될때, 그리고혈액도말검사의시행이불가능 Table 2. Detection limit of Plasmodium falciparum parasitemia by real time quantitative PCR 한상황에서신속진단이필요한경우, 이러한검사법의단점을보 완한검사가요구되고있다. Parasitemia level (parasites/μl) 10,000 1,000 100 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 Microscopy P P P P P N N N N PCR P P P P P P N N N Abbreviations: P, positive; N, negative. 이연구의목적은말라리아감염진단을위한 LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR 제품을평가하기위한것으로본 연구결과분석시간이신속하고민감도 (98.6%) 와특이도 (100%) 가 모두높게나타났다. 현미경검경법에서삼일열원충감염을확인 하였으나중합효소연쇄반응검사에서음성이나온 1 예의경우, 중합효소연쇄반응검사의재검을하지는않았으나, 그원인으로핵 산추출과정에서 DNA 가변성되었거나핵산추출이불완전한경 우, 증폭저해물질의존재또는중합효소연쇄반응과정의오염, 증 폭과정중에민감도의저하등을생각해볼수있다. 검출한계는 μl 당 0.1 개의원충까지검출할수있어서혈액도말표본의현미경 검사법보다 10 배예민하여, 현미경검경법에서위음성결과를보 이는경우라도중합효소연쇄반응법으로말라리아감염을진단할 수있다. 이는실시간중합효소연쇄반응법을이용한말라리아검 출의기존보고와유사한결과였다 [2]. 원충농도의정량화는말라 리아치료시약제내성을미리예측할수있으므로말라리아치 료효과추적에매우중요하다. 이연구에사용된실시간중합효소 연쇄반응키트는농도를알고있는정량표준물질을이용하여표 준곡선을얻고이를바탕으로원충의농도를정량화할수있다. 실 시간중합효소연쇄반응의경우증폭과정과증폭산물의감시가밀 폐된공간에서일어나검체의불필요한조작과정을줄이며증폭 산물검출을위해필요한중합효소연쇄반응후증폭산물의조작 과정을생략할수있어오염을최소화할수있다. 또한조작과정이 단순하며중합효소연쇄반응과정과 DNA 증폭과정을동시에감시 할수있으며검사소요시간을단축시킬수있다. 또한 DNA 기반 검사이므로약물치료로인하여말라리아의형태가변하거나현미 경으로관찰했을때삼일열원충이나열대열원충의전형적인형 태를보이지않아말라리아의종을판별하기모호한경우에도유 용하게사용될수있다. 18S rrna 유전자가비말라리아종의 DNA 와교차반응을일으킨다는보고도있으나본연구에서는교차반 응으로인한위양성결과는관찰되지않았다 [7]. 아직까지말라리아감염의진단에있어실시간중합효소연쇄반 응법에대한평가연구는드물다. 실제로검사결과가나오기까지 한시간이상이소요되는경우응급상황에서신속검사로분류되 102 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.6

이혜진외 : LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR 의말라리아진단유용성 지는않는다. 본검사실에서도중합효소연쇄반응검사법은말라리아감염의초기진단이아닌현미경검사로는음성이나임상증상으로말라리아가강력히의심되는경우, 또는현미경검사상정확한종간판별이어려운경우에이차적으로사용하고있다. 이러한점으로미루어볼때말라리아감염의초기진단이아닌헌혈혈액중말라리아감염혈액의선별검사로서실시간중합효소연쇄반응검사의적용가능성을고려해볼수있을것이다. Hang 등 [17] 은헌혈혈액내에는원충의농도가매우낮으므로토착지역에서혈액선별검사에중합효소연쇄반응법이필요하다고주장한바있다. 결론적으로 LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR은높은민감도와특이도를보여말라리아의정확한진단과진단후환자의치료평가와추적관찰에적합하다. 또한이검사법은방법이간단하고소요시간이짧아대규모검사로도이점이있다. 최근증가하고있는여행자클리닉이나말라리아감염의역학조사와같이검체의수가많은경우, 실시간중합효소연쇄반응검사가효율적으로사용될수있다. 뿐만아니라높은민감도를필요로하는헌혈혈액검사에도적용할수있을것이다. 요약 배경 : 말라리아는국내에서여전히유행하고있는감염질환이다. 현재까지말라리아의진단에는혈액도말검사의검경법이표준방법으로되어있으나혈중원충농도가낮을경우에예민도가떨어지고판독하기까지많은시간이소요된다. 본연구자들은최근개발된 LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR (LG 생명과학 ) 의수행능력을평가하고자한다. 방법 : 고려대학교안산병원에내원한 173명의검체를사용하였다. 고전적인검경법으로말라리아로진단받았던 73명의환자와 100 명의건강인을대상으로하여 LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR를시행하였고그결과를비교하였다. 또한말라리아양성혈액을정상혈액으로 10배로배수희석하여검출한계를설정하였다. 결과 : 총 73명의환자중혈액도말검사상 70명이삼일열말라리아로진단받았으며중합효소연쇄반응검사상 69명 (98.6%) 이양성률을보였다. 또한혈액도말검사상열대열원충이발견되었던 3명 (100%) 의경우중합효소연쇄반응검사상모두양성결과였다. 본중합효소연쇄반응키트의경우 µl당 0.1개의원충까지검출할수있는높은예민도를보였다. 결론 : LG Advansure TM Malaria P.f./P.v. real-time QPCR 검사는민감도와특이도가높았으며원충의농도가매우낮을경우에도검출할수있어말라리아감염의진단에유용할것으로생각한다. 참고문헌 1. Sinden R and Gilles H. The malaria parasites. In: Warrell DA and Gilles HM, eds. Essential malariology. 4th ed. London: Arnold, 2002:8. 2. Gama BE, Silva-Pires Fdo E, Lopes MN, Cardoso MA, Britto C, Torres KL, et al. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Exp Parasitol 2007;116:427-32. 3. Park J, Shin ES, Woo JH, Kim Y, Bae I, Jang J, et al. Two cases of falciparum malaria with acute respiratory distress syndrome. Tuberc Respir Dis 1998;45:888-95. 4. Cho YH, Kwon SY, Seo DH, Kim SI. Transfusion transmitted malaria in Korea 10 cases during 1997-2001. Korean J Blood Transfus 2001;12: 263-70. 5. WHO, ed. Guidelines for the treatment of malaria. 2nd ed. Geneva: WHO, 2010:10-1. 6. Amexo M, Tolhurst R, Barnish G, Bates I. Malaria misdiagnosis: effects on the poor and vulnerable. Lancet 2004;364:1896-8. 7. Vo TK, Bigot P, Gazin P, Sinou V, De Pina JJ, Huynh DC, et al. Evaluation of a real-time PCR assay for malaria diagnosis in patients from Vietnam and in returned travellers. Trans R Soc Trop Med Hyg 2007; 101:422-8. 8. Farcas GA, Zhong KJ, Mazzulli T, Kain KC. Evaluation of the RealArt Malaria LC real-time PCR assay for malaria diagnosis. J Clin Microbiol 2004;42:636-8. 9. Rougemont M, Van Saanen M, Sahli R, Hinrikson HP, Bille J, Jaton K. Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rrna gene subunit-based and species-specific real-time PCR assays. J Clin Microbiol 2004;42:5636-43. 10. Hanscheid T and Grobusch MP. How useful is PCR in the diagnosis of malaria? Trends Parasitol 2002;18:395-8. 11. Moody A. Rapid diagnostic tests for malaria parasites. Clin Microbiol Rev 2002;15:66-78. 12. Lim HS and Kim HS. Evaluation of diagnostic methods of re-emerging malaria in Korean patients. Yonsei Med J 2001;42:84-90. 13. Snounou G, Viriyakosol S, Jarra W, Thaithong S, Brown KN. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Mol Biochem Parasitol 1993;58:283-92. 14. Calderaro A, Piccolo G, Zuelli C, Galati L, Ricci L, Perandin F, et al. Evaluation of a new plate hybridization assay for the laboratory diagnosis of imported malaria in Italy. New Microbiol 2004;27:163-71. 15. Mehlotra RK, Lorry K, Kastens W, Miller SM, Alpers MP, Bockarie M, et DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.6 www.labmedonilne.org 103

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원저 Lab Med Online Vol. 1, No. 2: 105-109, April 2011 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.7 임상미생물학 체액및요검체접종을위한자동접종장비 PREVI Isola 의유용성평가 Evaluation of an Automated Instrument, PREVI Isola for Inoculation of Body Fluids and Urine Samples onto Agar Plates 김윤정 1 윤서영 1 손영숙 1,2 이양순 1,2 정혜선 1,2 이운형 1 용동은 1,2 정석훈 1,2 이경원 1,2 정윤섭 1,2 Yoonjung Kim 1, Seoyoung Yoon 1, Young Sook Sohn 1,2, Yangsoon Lee 1,2, Hae-Sun Chung 1,2, Woonhyoung Lee 1, Dongeun Yong 1,2, Seok Hoon Jeong 1,2, Kyungwon Lee 1,2, Yunsop Chong 1,2 연세대학교의과대학진단검사의학과 1, 연세대학교의과대학세균내성연구소 2 Department of Laboratory Medicine 1, Yonsei University College of Medicine, Seoul; Research Institute of Bacterial Resistance 2, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Background: In most clinical microbiology laboratories, inoculation of specimens on plates is performed manually and is a time-consuming process. The efficiency of this process can be improved by using an automated instrument. Currently, several automated instruments have been introduced for inoculation of samples. In this study, we have evaluated an automated instrument, PREVI Isola (Biomerieux, France), used for inoculation of body fluids and urine specimens. Methods: Both manual and automated instrument methods were used to inoculate 74 body fluid and 204 urine samples. Precision was evaluated by testing 3 types of urine samples (A, 6 10 3 colony-forming units (CFU)/mL; B, 3 10 4 CFU/mL; and C, >10 6 CFU/mL) in replicates of 20. Results of the 2 methods were compared by counting the isolated colonies on agar plates after incubation. The time required for both methods was also compared. Results: The coefficient of variation (CV) of samples A, B, and C examined using the automated instrument method was 176.1%, 18.1%, and 12.6%, respectively. The sensitivity and specificity of testing body fluid samples were 77% and 100%, respectively, and those of urine samples were 87% each. The time required for testing 15 body fluid specimens and that for inoculation of each specimen was 9.7 min shorter using PREVI Isola than using the manual method. Conclusions: The results of body fluid and urine culture by inoculation using the automated instrument, PREVI Isola, showed relative good agreement with those obtained using the manual method. The use of PREVI Isola would be expected to reduce the time and labor involved in inoculating various kinds of specimens. Key Words: Microbiological technique, Laboratory automation, Body fluids, Urine Corresponding author: Dongeun Yong Department of Laboratory Medicine, Research Institute of Bacterial Resistance, Yonsei University College of Medicine, 134 Sinchon-dong, Seodaemun-gu, Seoul 120-752, Korea Tel: +82-2-2228-2442; Fax: +82-2-364-1583 E-mail: deyong@yuhs.ac Received: August 9, 2010 Revision received: September 13, 2010 Accepted: September 20, 2010 This article is available from http://www.labmedonline.org 2011, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 서론 최근진단검사의학과에서는업무효율의증대가요구되고있고, 이를위한한가지방법으로검사업무자동화가진행되고있다. 전통적으로수기법에의존도가높은임상미생물검사실에서도부분적이기는하나혈액배양, 균종동정및항균제감수성시험등에서자동화된장비이용이점차늘어나고있다 [1]. 미생물검사실업무중검체접종은배양성적을좌우하므로매우중요한업무이다. 그러나, 검체접종은업무의특성상수기법으로시행되어왔고이에는많은인력과시간이요구된다. 이를개선하기위해검체자동접종장비가개발되어소개되고있는데 Inoculab instrument (Dynacon Inc., Mississauga, Ontario, Canada), eissn 2093-6338 www.labmedonilne.org 105

김윤정 외: 검체 자동 접종장비 PREVI Isola 의 유용성 평가 Walk Away Specimen Processor (Copan Diagnostic, Inc., Murrieta, CA, USA)와 PREVI Isola (Biomerieux, Marcy-l Etoile, France) 등 이 있다[2, 3]. 이들 중 2009년 최초로 국내에 소개된 검체 자동화 접종장비인 PREVI Isola (Biomerieux)의 유용성을 체액 및 요검 체에서 평가하였다. 재료 및 방법 1. 검체 2009년 7월 임상미생물검사실에 배양 의뢰된 체액 및 요검체 중 임의로 각각 74검체와 204검체를 선택하였다. 2. 검체 접종: 수기법 및 자동화 장비법 체액검체는 0.01 ml 백금이로 평판배지의 1/4 구역에 접종한 후 평판의 나머지에 획선하였다. 요검체는 0.001 ml 백금이를 요의 Fig. 1. The colony morphology on plate by PREVI Isola. The agar plate is divided in 8 sections (quadrant 1 quadrant 4 and outer/inner zone). 수면 바로 밑까지 수직으로 담근 후, 요가 채워진 것을 확인하고 배지의 중앙에 한 줄로 긋고, 이어서 이 줄에 직각이 되게 적절한 4. 정밀도 평가 간격으로 획선하였다[4]. 검체 접종은 혈액 한천과 MacConkey 한 요검체 중 A 검체(6 103 CFU/mL), B 검체(3 104 CFU/mL)와 C 천평판배지에 시행 후 35, 5% CO2 배양기에 최소 18시간 배양하 검체( >106 CFU/mL)를 임의로 선택하였다. Clinical and Laboratory 였다[5]. Standards Institute (CLSI) 지침[6]에 따라 자동화 접종 장비 이용하 자동화 장비 PREVI Isola (Biomerieux)는 장비회사의 지침서에 여 각각 20회씩 반복하여 혈액한천 평판배지와 MacConkey 한천 따라서 운용하였다. 즉, 일회용 tip을 이용하여 체액 또는 요검체 평판배지에 접종하였다. 접종된 배지는 35, 5% CO2 배양기에 최 10 µl를 혈액한천과 MacConkey 한천평판에 자동으로 분주 후 접 소 18시간 배양하였다. 배지 전체의 독립된 집락을 계수하였고 한 종기구(applicator)를 사용하여 50 rpm의 속도로 원형 회전하는 사분면에 100개 이상의 집락이 증식되었을 때는 100 으로 산정하 한천배지에 획선하였다. 접종한 배지는 모두 35, 5% CO2 배양기 여 독립된 균집락의 수를 산출하였다. 이를 기준으로 표준편차와 에서 최소 18시간 배양하였다. 변이계수를 산출하였다. 3. 균집락 수 산출 5. 수기법과 자동화 장비법의 비교 그람양성 균주는 혈액한천 배지, 그람음성 균주는 MacConkey 한천배지에서 증식된 독립된 균집락을 계수하였다. 체액과 요검체는 산정된 전체 배지의 균집락 수를 기준으로 비 교하였다. 체액검체에서 수기법과 자동화 장비법의 양성 기준은 수기로 접종한 체액검체는 균집락이 자라난 범위가 셋째 구역 접종한 배지에서 하나 이상의 균집락을 보이는 것으로 각각 정하 이상이면 다수(many), 둘째 구역까지면 중등도(some), 첫째 구역 였다. 요검체는 Glasson 등[3]의 방법을 적용하였다. 즉, 자동화 장 은 소수(few), 균집락이 없는 경우 No growth 로 표시하였다. 수기 비법에서 배지의 제3사분면에 증식된 균집락 수가 30 이상인 경우 로 접종된 요검체는 균집락의 수를 세고. 그 수에다 1,000을 곱하 는 양성으로, 수기법에서는 병원균 여부 판단 기준인 105 CFU/mL 여 요 1 ml당의 세균수로 하였고 균 증식이 관찰되지 않은 경우를 [7] 이상은 양성, 105 CFU/mL 미만은 음성으로 두 방법을 비교 평 < 103 CFU/mL 로 표시하였다[5]. 가하였다[8]. 자동화 장비로 접종한 배지의 inner zone 은 균집락의 밀도가 높아 균종 동정 및 항균제감수성시험을 위한 독립된 균집락을 얻 6. 검체 접종 소요시간 기가 어려웠다. 따라서 배지를 4사분면(Q1-Q4,)을 inner와 outer 임의로 선택한 요 180검체, 체액 40검체를 대상으로 하였다. 검 zone으로 나누어 총 8개로 구분하고 각 구역에서 독립된 균집락 체의 준비로 부터 접종된 배지를 배양기에 넣을 때까지의 소요시 을 계수하였다(Fig. 1). 간을 각 방법 간에 비교하였다. 106 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.7

김윤정외 : 검체자동접종장비 PREVI Isola 의유용성평가 결과 1. 정밀도 자동화장비법에서 A검체의평균집락수와표준편차는각각 0.25 10 3 CFU/mL 과 0.4이었고변이계수는 176.1% 이다 (Table 1). B 검체와 C검체에서의평균과표준편차는각각 94.3 10 3 CFU/mL, 17.1 과 318 10 3 CFU/mL, 38.9이었고, 변이계수는각각 18.1% 과 12.6% 이었다. 2. 수기법과자동화장비법의비교평가체액을수기법으로접종한 74검체중 63검체에서균이증식되지않았고, 11검체에서만 13균주가증식하였다 (Table 2). 자동화장비법에서는 74검체중 66검체에서균이증식되지않았고 8검체에서 10균주가증식되었다. 자동화장비법에서세균이증식된경우는모두수기법에서도균집락이관찰되었다. 그러나수기법에서의균집락증식정도가 Few 이었던 3개검체에서자동화장비법으로는세균이배양되지않았다. 또한, 수기법에서 Many 로집락이형성된 4검체중한개가자동화장비법의 outer zone에서는균증식이없었다. 양성기준은접종한배지에서하나이상의균집락을보이는것으로두방법에각각적용하였다. 수기법을기준으로하였을때자동화방법의민감도과특이도는각각 77% 와 100% 이었고일치도는 96% 이었다. 요검체 204개중 64검체에서수기법에서세균이증식되지않았고, 103개에서는한가지균집락, 35개에서는두가지균집락, 그리고 2개에서는세가지균집락이증식되었다. 자동화방법으로접종한검체역시 No growth 이었던검체수와자라난균집락의수 는수기법과동일하게관찰되었다. 수기법에서균집락수가 100개미만인검체는자동화장비법에서대부분 Q2-3의 outer zone에서독립된균집락을얻을수있었다. 수기법을기준으로하였을때 Glasson 등 [3] 의방법을적용하여비교평가한자동화장비법의민감도와특이도는각각 87% 이었고일치도는 90% 이었다 (Table 3). 3. 검체처리소요시간요 180검체, 체액 40검체처리시수기법에서총 2시간 40분이, 자동화장비법에서 2시간 15분이각각소요되었다. 15검체당소요시간을비교한결과, 수기법으로는요검체와체액검체접종에각각 10분과 15.4 분이소요되었고자동화장비법으로는 10분과 5.7 분이소요되었다. 본연구에서는요검체처리속도는자동화장비법과수기법에서동일하게나타났지만자동화장비법로체액검체접종시수기법에비해 63% 의시간이절약되었다 (Table 4). 고찰 PREVI Isola (Biomerieux) 는액상미생물검체를한천배지에자동으로접종하는장비이다. 최대 144개의검체와 150개의한천배지를장착할수있고, 시간당 180개의배지에검체를한천배지에접종할수있다. 접종시일회용 tip과일회용접종기구를사용하여일정한양의검체를분주및접종하는과정을진행한다. 본연구에서시행한정밀도평가에서균집락이적게증식된 A 검체에서는평균균집락수가적었으므로변이계수가 176.1% 로높게나타났다. 그러나, 평균균집락수가많은 B검체 (3 10 4 CFU/mL) 와 C검체 (>10 6 CFU/mL) 에서는각각변이계수가 18.1% 과 12.6% 로 Table 1. Precision of colony count on plates prepared with PREVI Isola Sample Mean ( 10 3 CFU/mL) SD CV (%) A 0.25 0.4 176.1 B 94.3 17.1 18.1 C 318.0 38.9 12.6 Abbreviation: CFU, colony-forming units. Table 2. Comparison of PREVI Isola with manual body fluid counts Bacterial counts by the manual method No. of samples/ isolate No. of isolate (inner/outer) prepared by PREVI Isola No growth Q1 a Q2 b Q3 c Q4 d No growth 63 63 0/0 0/0 0/0 0/0 Few 8 3/3 4/5 1/0 0/0 0/0 Some 1 0/0 0/0 0/1 0/0 1/0 Many 4 0/1 0/0 0/0 0/1 4/2 a-d: quadrants 1-4. Table 3. Comparison of PREVI Isola with manual urine counts Colony counts (CFU/mL) by the manual method No. of isolates No. of samples with >30 colonies in Q3 of plates prepared by PREVI Isola 10 3 to 10 4 39 1 (2.6%) 10 4 to 10 5 66 13 (19.7%) >10 5 74 64 (86.5%) Cut off was >10 5 colonies in manual method and >30 colonies in Q3 in PREVI Isola preparation. Sensitivity (87%, 64 positive samples using PREVI-Isola divided by 74 positive samples using manual method) and specificity (87%, 91 negative samples using PREVI-Isola divided by 105 negative samples using manual method ) were calculated. Abbreviation: CFU, colony-forming units. Table 4. Spending time measurement for both methods from inoculation to incubation Specimen Spending time (minutes) for 15 samples: Manual PREVI-Isola Reduced working time (%) Urine 10.0 10.0 0 Body fluid 15.4 5.7 63 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.7 www.labmedonilne.org 107

김윤정외 : 검체자동접종장비 PREVI Isola 의유용성평가 평가되었다. 수기법에서소수의집락이형성된 3개의체액검체에서자동화장비법으로세균이배양되지않았다 (Table 2). 이는점도가높은검체인경우검체내의균분포가균일하지않을수있기때문인것으로판단하였다. 그러므로세균수가적거나점도가높은관절액과척수액등의검체는위음성결과를주의해야할것으로사료된다. 또한수기법에서다수의집락이형성되었지만자동화장비법으로 inner zone에만세균이증식된한개의검체의경우는검체내균의분포가고르지않았기때문인것으로판단하였다. 수기법으로접종시에는배지의 1구역에검체를균일하게펴게된다. 이러한균질화조작이본자동화장비법에서부족한부분으로판단하였다. 증식된균주가배지위에고르게분포하지않는경우균종동정및항균제감수성시험을위한독립된집락을얻기가어려우므로재접종을해야하는번거로움이있을수있다. 자동화장비법에의한검체접종시적은수의세균이포함된검체인경우 50 rpm 이하로, 많은수의세균을포함한검체는 50-100 rpm 사이의속도로검체를획선하면보다양질의독립된균집락을얻을수있다고하였다 [3]. 그러나본시험장비는배지획선속도를조절할수없도록고정되어있었다. 따라서본연구에서는제조회사에서권장에따라서분당회전수를 50 rpm으로고정하여평가를시행하였다. 실제임상미생물검사실에서운영되는경우, 검체의점도와접종량에따른배지회전속도의재설정이필요할것으로사료된다. 또한, Glasson 등 [3] 의보고에서는수기법과비교시자동화장비법에서 99% 의민감도와 99.7% 의특이도로예측할수있다고하였다. 본연구에서는민감도와특이도는각각 87% 를보였다. 이와같이민감도와특이도가상대적으로낮았던원인은본연구에서사용한자가제조한천배지의수평에원인이있었던것으로판단하였다. 본자동화장비법은직선으로고안된접종기구를사용하기때문에한천배지의수평정도가독립된집락형성에큰영향을줄수있음을경험하였다. PREVI Isola (BioMerieux) 는검체분주시일회용 tip을사용하여검체간의오염이없으므로잔효오염에대한평가는시행하지않았다. 본자동화장비법연구는장액성검체인체액과요검체만을대상으로하였으나, 그외에도객담, 변검체등의접종이가능하다. 그러나이러한점액성혹은고형검체는자동화장비에장착전에희석혹은액상화가필요하다. 이과정은수기로시행되어야하기에번거롭고시간이소요된다 [9]. 따라서본연구에서는이에대한비교는제외하였다. 또한이들점액성혹은고형검체에서의접종방법비교를위해서는특정세균의증식에영향을주지않는희석액선택과희석비율에대한고려가선행되어야할것이다. 수기법과자동화장비법으로검체접종시의건수당소요시간을 비교해본결과, 요 15검체, 체액 15검체접종을위하여수기법으로는각각 10분과 15.4 분이소요되었고자동화장비법으로는각각 10분과 5.7분이소요되었다. 본연구에서는요검체처리속도는자동화장비법과수기법에서동일하게나타났지만자동화장비법로체액검체접종시수기법에비해 63% 의시간의절약되었다. 이는다량의다양한종류의임상검체를접종하는경우, 자동화장비를사용함으로써시간절약과오류감소의효과가있을것으로예상하였다 [10]. 요약 배경 : 검사실의업무효율향상을위해검사업무자동화가도입되고있으며, 최근임상미생물검사실에서도전통적으로수기법에의존하던검체접종업무를자동으로수행하는 PREVI Isola (Biomerieux, France) 가최근소개되었다. 이에체액및요검체접종시실무에서의본자동화장비의유용성을평가하였다. 방법 : 2009년 7월임상미생물검사실에배양의뢰된체액 74검체및요 204검체를임의로선택하였다. 증식세균수가서로다른요검체를 A검체 (6 10 3 CFU/mL), B검체 (3 10 4 CFU/mL) 와 C검체 (>10 6 CFU/mL) 를각각 10 µl씩 20회반복접종하여정밀도를평가하였다. 수기법과자동화장비법의상관관계는한천배지에서자란독립된균집락을계수하여비교분석하였다. 또한각방법의검체접종소요시간을비교하였다. 결과 : 자동화장비의변이계수는 A, B 그리고 C 검체에서각각 176.1, 18.1과 12.6이었다. 수기법과자동화장비법의비교평가에서수기법을기준으로하였을때체액검체에서는자동화방법의민감도과특이도가각각 77% 와 100% 이고, 일치도는 96% 이다. 요검체에서자동화방법의민감도와특이는모두 87% 를보였고일치도는 90% 이다. 수기법과자동화장비법으로검체접종시의소요시간을비교해본결과, 요 15검체, 체액 15검체접종을위하여수기법으로는각각 10분과 15.4 분이소요되었고자동화장비법으로는각각 10분과 5.7분이소요되었다. 결론 : 자동화장비 PREVI Isola (Biomerieux) 는수기법과의일치도가체액검체와요검체가 96% 와 90% 로비교적우수하였고, 특히다양한종류의임상검체접종시소요시간감소효과가있을것으로판단하였다. 참고문헌 1. Woods GL. Automation in clinical microbiology. Am J Clin Pathol 1992; 98(S):S22-30. 2. Bourbeau PP and Swartz BL. First evaluation of the WASP, a new auto- 108 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.7

김윤정외 : 검체자동접종장비 PREVI Isola 의유용성평가 mated microbiology plating instrument. J Clin Microbiol 2009;47:1101-6. 3. Glasson JH, Guthrie LH, Nielsen DJ, Bethell FA. Evaluation of an automated instrument for inoculating and spreading samples onto agar plates. J Clin Microbiol 2008;46:1281-4. 4. Albers AC and Fletcher RD. Accuracy of calibrated-loop transfer. J Clin Microbiol 1983;18:40-2. 5. Chong Y, Lee K, et al. eds. Diagnostic Microbiology. 4th ed.seoul: Seoheung Publishing Company; 2009:58-113. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of the precisionperformance of clinical chemistry devices; approved guideline. Document EP05-A2. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute 2004. 7. Isenberg HD, ed. Clinical microbiology procedures handbook. 2th ed. Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 2004. 8. Kass EH. Asymptomatic infections of the urinary tract. 1956. J Urol 2002;167:1016-9. 9. Tilton RC and Ryan RW. Evaluation of an automated agar plate streaker. J Clin Microbiol 1978;7:298-304. 10. Scarparo C, Piccoli P, Ricordi P, Scagnelli M. Evaluation of the DipStreak, a new device with an original streaking mechanism for detection, counting, and presumptive identification of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol 2002;40:2169-75. DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.7 www.labmedonilne.org 109

증례 Lab Med Online Vol. 1, No. 2: 110-114, April 2011 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.8 진단혈액학 클론성염색체이상을보인혈구포식림프조직구증 1 예 A Case of Hemophagocytic Lymphohistiocytosis with Clonal Karyotype Abnormalities 최계령 김하늬 조치현 유병준 김명한 김장수 임채승 이갑노 Gae-Ryung Choi, Ha-Nui Kim, Chi-Hyun Cho, Byoung-Joon Yoo, Myung-Han Kim, Jang-Su Kim, Chae-Seung Lim, Kap No Lee 고려대학교의과대학진단검사의학교실 Department of Laboratory Medicine, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea There have been a few reports of hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) with chromosomal abnormalities. Clonal chromosomal abnormalities in HLH patients are usually found in association with hematologic malignancies and rarely with epstein-barr virus (EBV) infection. Here, we report a fatal case of HLH with clonal karyotype abnormalities. A 75-yr-old man was admitted with persistent anorexia and high fever. Laboratory data revealed pancytopenia, hypofibrinogenemia, hyperferritinemia, prolonged prothrombin time and activated partial thromboplastin time, and marked elevated level of serum transaminases. In real time-pcr using whole blood, EBV DNA was not detected but cytomegalovirus (CMV) DNA was detected. The bone marrow aspiration smear showed hyperplasia of mature histiocytes with prominent hemophagocytosis. In chromosomal analysis of bone marrow aspirates, complex chromosomal abnormalities were found. In spite of steroid pulse therapy and antibiotic treatment, he died of disseminated intravascular coagulopathy. Key Words: Hemophagocytic lymphohistiocytosis, Epstein-Barr virus cytomegalovirus, Chromosomal abnormality 서론 혈구포식림프조직구증 (hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH) 은활성화된림프구와포식성조직구가골수, 중추신경계, 간, 비장등에광범위하게침윤하여혈구가파괴되는단핵구탐식 체계의반응성질환이다. HLH 은상염색체열성으로유전하는원 발성 HLH 와감염, 면역질환및악성종양과연관되어유발되는속 발성 HLH 로분류된다. 국내에서최근 20 년간보고된대부분은감 염질환과연관된속발성 HLH 였으며 [1], 이들중바이러스감염에 의한것이 30% 로가장많았고, 그중절반이상에서 ebstein-barr virus (EBV) 감염이보고되었다 [2, 3]. 그러나위의증례들대부분이 Corresponding author: Chae-Seung Lim Department of Laboratory Medicine, Korea University Guro Hospital, Guro 2-dong, Guro-gu, Seoul 152-703, Korea Tel: +82-2-2626-1455, Fax: +82-2-2626-1465 E-mail: malarim@korea.ac.kr Received: August 3, 2010 Revision received: December 12, 2010 Accepted: January 5, 2011 This article is available from http://www.labmedonline.org 2011, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. HLH를전통적으로비종양성반응성질환으로만인식하여진단시염색체분석, 바이러스검사및바이러스유전체의클론성확인, 면역글로불린또는 T세포수용체유전자의재배열등클론성이상유무를확인하기위한추가적인검사들이체계적으로이루어지지못한경우가대부분이었다. 따라서 HLH에서의클론성염색체이상에대한연구가미흡한것이현실정이고, 저자들이고찰한국내문헌에서도 EBV 감염증례외에다른감염원과연관된 HLH 중클론성이확인된증례는없었다. 이에본저자들은 cytomegalovirus (CMV) 감염이확인되었고, 클론성염색체이상이동반된 HLH 증례를보고하며그임상적, 병인론적의미를고찰하고자한다. 증례 주소및현병력 : 75세남자환자로내원 3주전식욕부진및전신쇠약증상이지속되었고, 1주일전부터시작된열감과함께내원 2일전노란객담을동반한기침이심해져내원하였다. 내원 7개월전타병원비뇨기과에서실시한전립선생검상전립선암이진단되었으나골전이는동반되지않았다. 3개월전본원에서총장골동맥폐쇄로경피적경혈관관상동맥확장술을시행받은과거력이있으나, 그외가족력에서특이소견은없었다. 신체검사소견 : 입원당시체온은 38 C였고, 결막은창백하였으나공막과피부의황달소견은보이지않았다. 늑골궁아래로비장 110 www.labmedonilne.org eissn 2093-6338

최계령외 : 클론성염색체이상을보인혈구포식림프조직구증 1 예 이 3 cm, 간이 4 cm 정도촉지되었으나림프절종대는없었다. 혈액검사소견 : 혈액검사상혈색소 8.2 g/dl, 백혈구수, 0.7 10 3 / μl, 혈소판수 55 10 3 /μl 로범혈구감소증소견을보였으며, 말초혈 액도말에서관찰한감별계산상절대적호중구감소증과상대적단 구증가증이있었으며호중구의좌방이동및독성과립소견을보였 다 (Table 1). Table 1. Laboratory findings of the patient Laboratory tests Patient s results Reference ranges Hemoglobin (g/dl) 8.2 13.5-17.5 WBC (10 3 /μl) 0.7 4.5-11.0 Neurtophil (%) 32.0 40-75 Lymphocyte (%) 42.0 13-44 Monocyte (%) 17.0 2.4-11.8 Eosinophil/Basophil (%) 0.0/0.0 0.0-5.0/0.0-3.0 Myelocyte (%) 2.0 Metamyelocyte (%) 1.0 Neutrophil stab (%) 6.0 Platelet (10 3 /μl) 55 150-440 PT (sec) 14.9 12.3-14.4 aptt (sec) 67.9 30.2-42.4 FDP (µg/ml) 5,0-20.0 Negative D-dimer (ug/ml) 0.20 0.0-0.35 Fibrinogen (mg/dl) 450 213-444 AST/ALT (IU/L) 160/90 10-44 Lactate dehydrogenase (IU/L) 943 0.0-480 Total bilirubin/ Direct bilirubin (mg/dl) 3.62/1.02 0.2-1.2/0.0-0.4 CRP (mg/l) 168 0.0-5.0 Ferritin (ng/ml) 2,766 32-284 Total cholesterol (mg/dl) 87 144-265 Total PSA (ng/ml) 0.16 0-4.0 Free PSA (ng/ml) 0.08 0-0.93 Rheumatoid factor (IU/mL) <3.0 0.0-15.0 FANA/ANCA Negative/Negative Widal typhi O/H Negative/Negative 0.0-20.0 Mycoplasma Ab (titer) 1:40 Negative HIV Ag & Ab Neg/0.17 0.0-1.0 Parvo B19 PCR Negative - EBV-PCR Negative <1000 copies/ml CMV Real-time PCR 319 copies/ml <250 copies/ml IgM Anti-HAV - +/- HBs Ag - +/- Anti-HBs Ab - +/- IgM Anti-HBc Ab - +/- HBe Ag - +/- Anti-HBe Ab + +/- Anti-HCV Ab - +/- Abbreviations: WBC, white blood cell; PT, prothrombin time; aptt, activated partial tromboplastin time; FDP, fibrinogen degradation product; PSA, prostate specific antigen; FANA, fluorescent antinuclear antibody; ANCA, anti-neutrophil cytoplasmic antibody; VDRL,venereal disease research laboratory test; EBV, Ebstein-Barr virus. 생화학검사 : 내원당시 AST 160 IU/L, ALT 90 IU/L, LDH 943 IU/L, ALP 394 IU/L, 총빌리루빈 3.62 mg/dl, 나트륨 132 mmol/l ( 참고치 135-145 mmol/l), ferritin 2,766 ng/ml ( 참고치 32-284 ng/ ml) 이었고, 총콜레스테롤은 87 mg/dl였다. 전립선암진단당시총전립선특이항원 (Total PSA) 은 293.8 ng/ml ( 참고치 0-4 ng/ml), 유리전립선특이항원 (Free-PSA) 은 111.8 ng/ml ( 참고치 0-1 ng/ml) 이었으나항안드로겐약물치료후 Total PSA 0.16 ng/ml로정상범위를유지하였다. 혈액응고검사 : 섬유소원 (fibrinogen) 450 mg/dl ( 참고치 213-444 mg/dl), 프로트롬빈시간 14.9 초, 79% ( 참고치 12.3-14.4 초, 83-111%), 활성화부분프로트롬보플라스틴시간 67.9 초 ( 참고치 30.2-42.4초 ) 였다. 면역혈청검사 : 내원 5일째에전혈에서실시한 EBV RT-PCR 및 parvovirus B19 RT-PCR 검사결과는모두음성이었다. 그러나본원에서실시한 CMV RT-PCR에서는 319 copies/ml ( 참고치 250 copies/ml 미만 ) 소견을보였다. 이전병원에서내원 7개월전 RIA을이용하여실시한항체검사에서는 CMV IgM은 0.18 Au/mL ( 참고치 <0.30 Au/mL) 로음성, CMV IgG는 150.0 U/mL ( 참고치 <0.60 U/ ml ) 로양성이었으며본원에서 CMV 항체검사는시행하지않았다. 바이러스간염검사 : 특이소견발견되지않았다. 바이러스배양검사및임상미생물검사 : 내원당일시행한혈액배양및소변배양결과는음성이었고, 내원 2일째에객담에서시행한 respiratory syncytial virus, adenovirus, influenza A 및 B virus, parainfluenza virus 배양결과는모두음성이었으며내원 2일째에객담, 내원 7일째에골수천자액에서시행한항산성염색과결핵균배양결과도음성이었다. 진단영상검사 : 상복부컴퓨터촬영결과는비장종대소견외에특이소견관찰되지않았으며, 양전자단층촬영검사에서도골전이및골수전이소견은관찰되지않았다. 골수천자흡인도말및골수생검검사 : 내원 6일째에시행한골수천자흡인도말상골수유핵세포의 5% 에서두드러진혈구탐식을보이는성숙한양성조직구의증가소견이관찰되었다. 적혈구계세포는상대적으로증가한반면과립구계세포는감소한양상을보였으며 (M:E ratio:0.6:1), 이형성소견은동반되지않았다. 또한거대핵세포수는증가되어있었으며 (12개 /HPF), 일부거대핵세포는비정상적으로작고미성숙한형태의이형성소견을보였다. 골수생검도말상세포충실도는정상범위 (30-40%) 를유지하였고, 전립선암의골수전이를시사할만한비정상세포무리는보이지않았다. 골수생검조직으로시행한조직화학염색에서골수전체에산재되어있는 CD68 항원양성대식세포의수적증가를관찰할수있었고 (Fig. 1), 전립선특이항원 (prostatic specific antigen) 염색은음성이었다. DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.8 www.labmedonilne.org 111

최계령 외: 클론성 염색체 이상을 보인 혈구포식 림프조직구증 1예 A B Fig. 1. Bone marrow aspirate and biopsy findings of the patient with hemophagocytic lymphohistiocytosis. (A) Bone marrow aspirate smear shows benign-appearing histiocytes exhibiting prominent hemophagocytosis (Wright-Giemsa stain, 1,000). (B) Bone marrow biopsy section shows increased numbers of diffusely scattered CD68(+) macrophages (Immunohistocytochemical stain for CD68, 200). 면, 가족성 혈구포식 림프조직구증(familial HLH)에서 관찰되는 PRF gene, UNC13D gene, STX11 gene의 돌연변이 등 HLH에 상 1 2 3 4 응하는 분자유전학적이상이 발견되거나, 진단기준에 포함된 8개 5 의 임상증상 및 검사소견 중 5가지 이상을 만족하는 경우 HLH로 진단되며, 특히 골수, 간, 비장, 림프계 등의 조직에서 현저한 혈구 6 7 8 9 10 11 12 포식 림프조직구 증가가 진단에 필수적인 병리학적 소견이다. 최 근에는 자연세포 독성세포 활성도의 저하, 페리틴(ferrtin)의 상승, 13 14 15 16 17 18 수용성 CD25 (IL-2 수용체)의 증가 등이 새로운 진단기준 항목으 로 추가되었다. 19 20 21 22 X Y 본 환자는 7일 이상의 발열, 이학적 검사 및 복부 컴퓨터 단층촬 영에서 3 cm 이상의 비장종대, 혈색소 9.0 g/dl 미만, 말초혈액상 r 범혈구감소증, 호중구 1 103/μL 미만, 혈소판 100 103/μL 미만, Fig. 2. A Karyotype of patient with hemophogocytic lymphohistiocytosis showing 48,X,t(X;7)(p22.1;q11.2),add(3)(p21),t(4;16)(q31.1;q24), t(9;11)(p22;p11.2)+18,+r. 골수에서 악성종양의 침범 근거가 없는 현저한 혈구포식 림프조직 구 증가증이 확인되어 HLH의 진단기준에 합당한 소견을 보였다. 본 증례의 경우, HLH에서 통상적으로 EBV 감염에 의해 T림프 세포유전검사: 골수천자액으로 시행한 핵형 분석결과 분열중기 구의 변화가 생기고 이것이 탐식구의 활성화 및 증식에 관여한다 상 세포 20개 중 6개에서 48,Y,t(X;7)(p22.1;q11.2),add(3)(p21),t(4;16) 는 여러 증례보고들[5]을 바탕으로 우선 EBV의 감염여부를 확인 (q31.1;q24),t(9;1),p22; p11.2),+18,+r[6]의 복잡한 클론성 염색체이상 하기 위해 전혈에서 EBV RT-PCR을 시행하였으나 음성이었다. 따 을 발견하였다(Fig. 2). 라서 EBV외에 HLH을 유발할 만한 다른 바이러스 및 세균의 감염 임상경과: 혈구포식 림프조직구증으로 진단되어 내원 6일째부 유무를 확인하고, 감염 및 자가면역질환에 의한 속발성 HLH가 아 터 스테로이드 충격요법과 항생제 치료를 시작하였으나 증상은 호 닌 유전학적이상 동반 여부를 확인하기 위해 염색체 검사를 추가 전되지 않고, 내원 13일째 파종성 혈관내응고로 사망하였다. 로 실시하였다. 먼저 입원 중 혈액에서 시행한 CMV RT-PCR에서 319 copies/ml의 양성소견을 보였다. 따라서 EBV 감염 외에 HLH 고 찰 를 유발할 수 있는 다른 원인 바이러스로서 CMV 감염을 의심하였 고, 또한 염색체 검사에서 염색체이상을 발견하여, CMV 감염과 클 최근 Histiocyte Society가 제안한 2004년 가이드라인[1]에 따르 112 www.labmedonilne.org 론성 염색체이상의 연관성 및 그 의의를 검토해 보았다. DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.8

최계령외 : 클론성염색체이상을보인혈구포식림프조직구증 1 예 HLH 환자들의검체를대상으로한 HLH와 EBV 감염과의연관성에대한연구에서 EBV 감염시 T림프구클론성이발생하고이것이탐식구의활성화유발에기여한다는사실이증명되었으며 [4], 이중몇몇증례에서는염색체검사상다양한불균형적이고무작위적인재배열 (+X,Y,add(7)(p21),add(9)(p13),dup(11),del(12)(q24), add(13)(p10),del(17)(p13),+20,add(21)(p11) 등 ) 의클론성염색체이상이최근보고되었다 [7]. 국내외에보고되는 HLH는증례수자체가적고, 그중에서도염색체이상이검출된증례는극히소수이며, EBV외의다른바이러스감염에의해발생하는 HLH에서의염색체이상에대한연구는현재까지전무하다. 그리고이러한염색체이상이임상적으로어떠한의의를지니며이것이얼마나유용한가치를지닌정보인가에대해서는아직많은논란이존재한다 [7]. 또한클론성변화의다형성및감염에대한각개인의면역반응의민감도차이및그와관련된유전적결함등에대해서는아직많은연구가이루어지지않아비교가될만한결과물이나정보도불명확하고충분치않은것이현실정이다. 지금까지발표된연구와사례를통해 T림프구의기능이상및클론성증식으로과도한사이토카인 (IL-6, IFN-γ, TNF-α, 등 ) 이생성되고이것이탐식구의활성화를유발 [8] 하여 HLH가발생할수있다는가설이제시되어왔다. 그러나대부분그러한면역학적이상을유발하는원인및 HLH의병태생리는아직면역체계가성숙되지못한소아기에 EBV 감염에의한경우나혈액종양혹은고형암의골수전이를동반한면역저하자에 [9] 국한되어도출된결과로서, 발병전까지정상적인면역기능을유지하는성인에서갑자기발생한 HLH의발병원인을설명하기에는부족하였다. 또한 HLH를통상적으로비종양성증식반응으로간주하여클론성염색체이상을동반할경우이것이 B세포혹은 T세포악성림프종과어떠한연계성이나차별성을갖고있는가에대한점은아직확실히밝혀지지않았다 [10, 11]. 그러나본증례는정상면역기능을가진성인에서 EBV가아닌 CMV 감염에의해발생한 HLH라는점, 가족성 HLH에서보이는것과는다른염색체이상을동반하였다는점등이기존증례들과달랐다. 단, CMV 감염과염색체이상의선후관계가불분명하여본환자에서보인염색체이상이 T세포악성림프종의일종으로서기저에존재하다가감염혹은바이러스의재활성화에의해촉발되어발생한 HLH인가아니면 CMV가 EBV처럼클론성염색체이상을유발하여생긴결과인가에대해서는더많은연구가필요하다. 최근 HLH 치료성적에대한연구및보고에따르면면역화학요법에불응성을보이거나재발성인경우뿐만아니라가족성및염색체이상을포함한 HLH인경우 [12] 에는더욱치명적인임상경과를보이는것으로알려져있다. 염색체이상이진단이전부터존재하였는가아니면질병의진행과정중에발생한것인가에대해서는 그선후관계가불분명하나일단비정상적인세포유전학적클론의유입이동반된것이확인되었다면, 이를악성변화로생각하여조기에강력한면역화학요법및골수이식을필요로하는고위험군으로분류하고, 고위험군에게적절하게맞춰진신속한치료가필요하다. 이를통해치료성과및생존율향상을도모할수있기때문에 HLH에서염색체검사를통해그이상유무를확인하는것은임상적으로매우중요하다. HLH의진단및치료과정에서철저한감염원조사및염색체이상에대한연구는환자의치료방침및예후결정에주요정보로활용될수있는가능성이있기때문에반드시필요하고의미있는검사이다. 요약 혈구포식림프조직구증 (hemophagocytic lymphogistiocytosis, HLH) 에서관찰되는클론성염색체이상은혈액종양이골수조직을침범한경우에흔하게발견되며, 혈액종양의근거가없는환자에서 EBV 감염과관련되어드물게보이는경우가있다. 본저자들은혈액종양병력도없고 EBV 감염도없이클론성염색체이상을동반하였으며치명적인임상경과를보인 HLH 1예를경험하여보고하는바이다. 본증례는지속적인발열및상기도감염증상을주소로내원한 75세남자환자였다. 검사소견에서범혈구감소증, 저섬유소원증, 간기능이상과비장종대, 골수에서현저한혈구탐식을보이는성숙한양성조직구의증식이관찰되었다. 전혈에서실시한 EBV RT-PCR 결과는음성이었으나 CMV RT-PCR에서는 319 copies/ml 의양성소견이관찰되었다. 골수검체를이용한핵형분석결과에서는복잡한클론성이상을보이는비정상염색체가존재하였다. 본환자는염색체이상을동반한 HLH 진단하에스테로이드충격요법과감염에대한예방적항생제치료를시행하였으나, 내원 13일째파종성혈관내응고로사망하였다. 참고문헌 1. Kim KH, Kim SH, Lee JK, Cho YJ, Kim YK, Shin DH, et al. A case of Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis with clonal karyotype abnormality. Korean J Lab Med 2005;25:85-9. 2. Hoang MP, Dawson DB, Rogers ZR, Scheuermann RH, Rogers BB. Polymerase chain reaction amplification of archival material for Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, human herpesvirus 6, and parvovirus B19 in children with bone marrow hemophagocytosis. Hum Pathol 1998;29: 1074-7. 3. Kim SY, Yoon JY, Lee SJ, Chung NG, Jang PS, Cho B, et al. The clinical manifestations of hemophagocytic lymphohistiocytosis. Korean J Pe- DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.8 www.labmedonilne.org 113

최계령외 : 클론성염색체이상을보인혈구포식림프조직구증 1 예 diatr Hematol-Oncol 2003;10:244-54. 4. Henter JI, Horne A, Aricó M, Egeler RM, Filipovich AH, Imashuku S, et al. HLH-2004: Diagnostic and therapeutic guidelines for hemophagocytic lymphohistiocytosis. Pediatr Blood Cancer 2007;48:124-31. 5. Ito E, Kitazawa J, Aria K, Otomo H, Endo Y, Imashuku S, et al. Fetal Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis with clonal karyotype abnormality. Int J Hematol 2000;71:263-5. 6. Janka G, Imashuku S, Elinder G, Schneider M, Henter JI. Infection-and malignancy-associated hemophogocytic syndromes.secondary hemophagoctic lymphohistocytosis. Hematol Oncol Clin North Am 1998; 12:435-44. 7. Han K, Kim Y, Kahng J, Lee J, Moon Y, Kang C, et al. In situ hybridization studies of cytomegalovirus and Epstein-Barr virus in reactive histiocytic hyperplasia with hemophagocytosis. Acta Haematol 1996;96: 140-5. 8. Akashi K, Hayashi S, Gondo H, Mizuno S, Harada M, Tamura K, et al. Involvement of interferon-gamma and macrophage colony-stimulating factor in pathogenesis of haemophagocytic lymphohistiocytosis in adults. Br J Haematol 1994;87:243-50. 9. Koizumi K, Haseyama Y, Machino R, Sato Y, Sawada K, Koike T. The hemophagocytic syndrome in prostate cancer revealed by disseminated carcinomatosis of the bone marrow. J Urol 2002;168:1101-2. 10. Deepi A, Ruchika G, Sompal S, Kusum G, Madhur K. Hemophagocytic Lymphohistiocytosis in B-Cell lymphoproliferative disorder: Report of a Rare Association. Indian J Hematol Blood Transfus 2010;26:74-6. 11. Yao M, Cheng A, Su I. Clinicopathological spectrum of hemophagocytic sundrome in Epstein-Barr virus-associated peripheral T-cell lymphoma. Br J Haematol 1994;87:535-43. 12. Kaneko Y, Maseki N, Sakurai M, Ido M, Tsunematusu Y, Mizutani S, et al. Clonal and non-clonal karyotypically abnormal cells in haemophagocytic lymphohistiocytosis. Br J Haematol 1995;90:48-55. 114 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.8

증례 Lab Med Online Vol. 1, No. 2: 115-119, April 2011 DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.9 진단유전학 MCCC2 유전자의새로운변이에의한 3-Methylcrotonyl-CoA Carboxylase 결핍증 Identification of a Novel Mutation in the MCCC2 Gene of a Korean Patient with 3-Methylcrotonyl-CoA Carboxylase Deficiency 김병철 1 이동환 2 기창석 3 박형두 3 최태윤 1 신정원 1 이용화 4 Byung Chul Kim 1, Dong Hwan Lee 2, Chang-Seok Ki 3, Hyung-Doo Park 3, Tae-Youn Choi 1, Jeong Won Shin 1, Yong-Wha Lee 4 순천향대학교서울병원진단검사의학과 1 소아과 2, 성균관대학교의과대학삼성서울병원진단검사의학과 3, 순천향대학교부천병원진단검사의학과 4 Departments of Laboratory Medicine 1 and Pediatrics 2, Soonchunhyang University Seoul Hospital and Soonchunhyang University College of Medicine, Seoul; Department of Laboratory Medicine and Genetics 3, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul; Department of Laboratory Medicine and Genetics 4, Soonchunhyang University Bucheon Hospital and Soonchunhyang University College of Medicine, Bucheon, Korea 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency is an autosomal recessive disorder characterized by a defect in leucine catabolism. We report the case of an 80-day-old patient with 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency who had elevated levels of 3-hydroxyisovalerylcarnitine (45.56 μmol/l; reference range, <0.65 μmol/l), which was detected using tandem mass spectrometry during newborn screening, and elevated levels of 3-hydroxyisovaleric acid (375.75 mmol/mol Cr) and 3-methylcrotonylglycine (502.36 mmol/mol Cr ), which were detected in urine organic acid analysis. We performed direct sequence analysis of all the exons of the MCCC1 and MCCC2 genes. No mutations were detected in the direct sequence analysis of MCCC1. However sequencing of the MCCC2 gene revealed a mutation caused by a heterozygous G to C transversion [c.313g>c (p.gly105arg)] at nucleotide position 313 and a mutation caused by a heterozygous A to T transversion [c.1252a>t (p.lle418phe)] at nucleotide position 1252. Identification of these 2 novel MCCC2 gene mutations in our patient suggested that analysis of the MCCC1 and MCCC2 genes might prove useful in the diagnosis of 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency. Key Words: 3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase, 3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency, MCCC2 mutation 서론 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase (3-MCC) 는류신의이화과정 중에 3-methylcrotonyl-CoA 가 3-methylglutaconyl-CoA 로변환되는 과정에작용하는효소로, 결핍시 3-methylcrotonyl-CoA 가 3-hy- Corresponding author: Yong Wha Lee Department of Laboratory Medicine & Genetics, Soonchunhyang University Bucheon Hospital, Soonchunhyang University College of Medicine, 1174 Jung-dong, Wonmi-gu, Bucheon 420-767, Korea Tel: +82-32-621-5943, Fax: +82-32-621-5944 E-mail: lywmd@schmc.ac.kr Received: December 7, 2010 Revision received: January 5, 2011 Accepted: January 5, 2011 This article is available from http://www.labmedonline.org 2011, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. droxyisovaleric acid (3-HIVA), 3-methylcrotonylglycine (3-MCG), 3-hydroxyisovalerylcarnitine (3-HIVA-C) 로변환되어요유기산분석에서 3-HIVA와 3-MCG의현저한증가와혈장내에서 3-HIVA-C 의축적과이차적인카르니틴의결핍이관찰된다 [1]. 임상양상은무증상부터유아기사망에이르기까지매우다양하며, 과거에는증상을나타내는환자가많았으나, 탠덤질량분석기를사용한신생아선별검사로발견이가능해지면서무증상환자의검출빈도가증가하고있어 [2-4] 치료및예후판단에대해논의가이루어지고있으나아직그예가많지않아대부분전문가의권고수준의지침만이있을뿐이다 [5]. 3-MCC는 3q26-q28 에위치한 MCCC1 과 5q13 에위치한 MCCC2 유전자에의해만들어지는데, 이들유전자의돌연변이에의해 3- MCC 결핍증이발생하며, 상염색체열성으로유전된다. 지금까지다양한위치에서다양한종류의대립유전자들이보고되고있으며 [6], 한국인에서는 Kim[7] 이 1명의환자에서 MCCC2 유전자에서 D280Y, T357T 돌연변이를보고한예가있다. 저자들은탠덤질량분석기를이용한신생아선별검사에서 eissn 2093-6338 www.labmedonilne.org 115

김병철 외: Novel Mutation of the MCCC2 Gene in 3-MCC Deficiency 3-HIVA-C, 혈장 아미노산 검사에서 류신, 요 유기산 분석 검사에 임신으로 제왕절개하였으며, 과거력상 특이소견이 없었다. 출생 직 서 3-HIVA와 3-MCG이 증가된 소견을 보여 3-MCC 결핍증 의심하 후 타 병원에서 시행한 탠덤질량분석기를 이용한 신생아 선별검사 에 시행된 MCCC1과 MCCC2 유전자 염기순서 검사에서 MCCC2 에서 3-HIVA-C이 증가된 소견을 주소로 전원되었다. 생후 80일째 유전자의 새로운 변이 2개가 관찰되어 3-MCC 결핍증으로 진단한 탠덤질량분석기를 이용한 신생아 선별검사에서 3-HIVA-C이 45.56 1예를 보고하고자 한다. μmol/l (참고치: < 0.65 μmol/l)로 증가된 소견을 보였고, 혈장 아 미노산 검사에서 류신이 258.0 μmol/l (참고치: 90.8 182.6 μmol/ 증 례 L)로 증가되어 있었으며, 요 유기산 분석 검사에서 3-HIVA와 3-MCG은 각각 375.75 mmol/mol Cr (참고치: 67 mmol/mol Cr 이 하)과 502.36 mmol/mol Cr (참고치: not detected)으로 증가되어 있 력상 다른 유전질환은 없었으며, 산모는 첫 번째 임신이었고 지연 었다(Fig. 1). 3-MCC 결핍증 의심하에 이 질환의 원인 유전자를 밝 8.00 10.00 14.00 16.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 Unknown Unknown 5-Hydroxyindole-3-acetic acid 3-Hydroxysebacic acid 4-Hydroxyhippuric acid Acotinic acid Azelaic acid 4-Hydroxybenzoic acid cis-4-octenedionate Suberic acid 3-Phenyllatic acid 3-Methyladipic acid Unknown Citric acid 18.00 Vanilmandelic acid + Sebacic acid 4-Hydroxyphenylacetic acid Pentanodecanoic acid Unknown 3-Methylcrotonylglycine 3-Methylglutaric acid Unknown Adipic acid Methylmalonic acid Unknown Phosphoric acid Succinic acid Fumaric acid 12.00 threo-2, 3-Dihydroxybutyric acid 3-Hydroxyisovaleric acid Oxalic acid 3-Hydroxybutyric acid Urea 9,500,000 9,000,000 8,500,000 8,000,000 7,500,000 7,000,000 6,500,000 6,000,000 5,500,000 5,000,000 4,500,000 4,000,000 3,500,000 3,000,000 2,500,000 2,000,000 1,500,000 1,000,000 500,000 0 Lactic acid Abundance 환아는 재태연령 36주에 출생체중 3.36 kg으로 태어났다. 가족 40.00 Time Fig. 1. Urine organic acid analysis of an 80-day-old patient who had 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency and elevated levels of 3-hydroxyisovaleric acid and 3-methylcrotonylglycine. Patient Patient Father Father Mother Mother c.313g>c (p.g105r) A c.1252a>t (p.i418f) B Fig. 2. Mutation analysis of the MCCC2 gene in a Korean patient with 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency. Direct sequencing of the MCCC2 gene shows overlapping peaks (arrow) at nucleotide position 313 because of a heterozygous G to C transversion [c.313g>c (p.gly105arg)] (A) and at nucleotide position 1252 because of a heterozygous A to T transversion [c.1252a>t (p.lle418phe)] (B). 116 www.labmedonilne.org DOI 10.3343/lmo.2011.1.2.9