Oral Biology Research, 2017; December 31, 41(4):229-235 Copyright c 2017, Oral Biology Research Institute DOI: 10.21851/obr.41.04.201712.229 Original Article ORAL BIOLOGY RESEARCH Induction apoptosis and G2/M phase cell cycle arrest by non-thermal plasma in human osteosarcoma MG-63 cell line Byul Bo Ra Choi and Gyoo Cheon Kim* Department of Oral Anatomy, School of Dentistry, Pusan National University, Yangsan 50612, Republic of Korea (Received Sep 5, 2017; Revised version received Sep 19, 2017; Accepted Oct 11, 2017) ABSTRACT Osteosarcoma is a malignant bone tumor that develops in the osteoblast cells that form the outer covering of bone. It is the most frequent malignant bone tumor found at 10-14 years and at >65 years of age. Atmospheric pressure plasma has advantages of high density and rich chemical agents without elevation of the substrate temperature. These non-equilibrium characteristics show promising applications in the biomedical field, opening a new research area called Plasma Medicine, which includes sterilization, coagulation, wound healing, and cancer treatment. However, the mechanism of apoptosis caused by plasma treatment in osteosarcoma is not well understood. In this study, the researchers show that microwave plasma causes selective cell cycle arrest and apoptosis in osteosarcoma cells in vitro. An inhabitation of cell growth of microwave plasma showed that this plasma has selective cytotoxic effects on MG-63 cells in comparison to hfob 1.19 cells. Also, the resesearchers observed that microwave plasma treatmenst significantly showed disruption and aggregation of F-actin. The results demonstrated that treatment of MG-63 cells with microwave plasma induced cell cycle arrest in the G2/M phase, using flow cytometry and western blot assay. To detect PARP and DFF-45 cleavage or a decrease as a result of caspase-3 activation, MG- 63 cells were treated either with various times of microwave plasma. The research studies demonstrated that microwave plasma induced G2/M cell phase arrest and triggered apoptosis. KEY WORDS: Apoptosis, Cell cycle arrest, Non-thermal plasma, Osteosarcoma 서 론 골육종은뼈에발생하는흔한원발성악성종양으로, 악성도가높은경우에는전이의위험이크다 [1, 2]. 또한 10대와 20대에서가장흔히발생되며남성이여성보다발생율이더높은편이다 [3, 4]. 과거항암약물치료없이수술적치료만시행한경우에는골육종환자의 5년생존율이 20% 미만 [1, 2] 으로매우낮기때문에골육종의성장을억제하거나세포사멸을일으킬수있는다른방법이필요한실정이다. 플라즈마는고체, 액체, 기체단계를지난제4의물질상태로서최근다양한분야에많이응용되고있다 [5, 6]. 현재소독, 혈액응고, 피부재생, 암치료등의학적응용 [7] 이가능하며레이저와달리열적인손상이적다는것이장점이다. 최근연구에서몇몇의잘알려진암세포의죽음과성 *Corresponding author: Gyoo-Cheon Kim Department of Anatomy and Cell Biology, School of Dentistry, Yangsan Campus of Pusan National University, 49 Busandaehak-ro, Mulgeumeup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do 50612, Republic of Korea Tel.: +82-510-8243, Fax: +82-51-510-8241 E-mail: ki91000m@pusan.ac.kr 장저해, 즉세포자멸사를유도하는것으로많은발표가되고있다 [8, 9]. 세포주기정지와세포자멸사는암세포의성장저해및죽음을유도하는한방법으로앞서설명된암치료에있어매우중요하다고볼수있다. 세포는 G1, S, G2 그리고 M기의순으로계속순환되는데이중 S기는 DNA의복제가일어나고 M기는세포분열이일어난다. 이사이의휴지기를 G1기과 G2기라고하는데이시기는분열과복제가완전히일어났는지확인하는단계이다. 세포주기를진행하는데에있어핵심적으로세포주기를진행시키는 cyclin-dependent kinases (CDK) 와 cyclin간의특이적인조절이이루어진다. G1기에는 cyclin D/CDK4, S기에는 cyclin A/CDK2, 그리고 G2/M기에는 cyclin B/CDC 2 복합체가각각세포주기조절에관여한다. 만약세포의손상이일어날시세포주기는정지된다 [10-12]. 세포자멸사는세포골격붕괴, 세포막변화및 DNA 절편화의특징을가지며외인성경로와내인성경로로구별되는데특히내인성경로는미토콘드리아의기능이상으로발생된다. 이경로는미토콘드리아의막전위변화로 AIF (apoptosis inducing factor) 가핵이나세포질로방출된다거나 caspase cascade를유발하여 caspase 3의최종활성화를 - 229 -
Byul Bo Ra Choi and Gyoo Cheon Kim 통해세포자멸사가일어난다. Caspase는 protease의한일종이며, 세포자멸사가유도되면세포내손상된세포를인식하고보호하는일에관여하는 poly ADP-ribose polymerase (PARP) 나 caspase의활성화를억제시키는 Inhibitor caspase activated DNase (ICAD) 와같은단백질을분해하는역할을한다 [13-15]. 현재플라즈마에의한골육종세포의증식억제및세포자멸사에관련한기전연구는매우부족한실정이다. 이에본연구에서는플라즈마에의한골육종세포의증식에미치는영향을관찰하고세포자멸사효과에대한기전을규명하고자하였다. 재료및방법 항체 Rabbit polyclonal anti-human cyclin B1, DFF (DNA fragmentation factor)-45 항체들은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 에서구입하였고 mouse monoclonal anti-human CDC2, PARP-1, caspase 3, GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 항체들은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 로부터구입하여 1:3000으로희석하여실험에사용하였다. 세포주및세포배양 본실험에사용된세포는골육종세포인 MG-63과골모세포인 hfob 1.19를사용하였다. 각각의세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) 에서분양을받아서본실험에사용하였다. MG-63세포는 25 mm Hepes, 100 μg/ml penicillin/streptomycin, 4 mm L-glutamine, 10% fetal bovine serum가함유된 Dulbecco s modified Eagle s medium 배지를사용하였고 37 o C, 5% CO 2 배양기에배양되었다. hfob 1.19세포는 25 mm Hepes, 100 μg/ ml penicillin/streptomycin, 4 mm L-glutamine, 10% fetal bovine serum가함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) 1:1 배지를사용하였고 34 C, 5% CO 2 배양기에배양되었다. 저온상압플라즈마 실험에사용된플라즈마는 Fig. 1과같다. 플라즈마는전력공급장비를이용하게설계되었으며 900-MHz의주파수로가해진다. 또한아르곤가스는 2.5 slm으로관을통과하도록하였다. 플라즈마를처리하기위해크기 35 ø의 dish를사용했으며, 처리하기 24시간전세포를분주하여배양하였다. 배양기에 24시간동안배양후 2 ml의새배지로교환하여 1 cm 거리를두고플라즈마를처리하였다. 플 Fig. 1. Schematic diagram of plasma device and process. 라즈마의처리시간은 1분, 3분, 5분으로처리하였으며처리된세포는다시배양기에 24시간배양하였다. Cell viability assay 플라즈마를처리한후세포생존율을확인하게위해 WST-1 분석을하였다. 35 ø dish에 2 10 5 개의세포를분주한후 24시간동안배양하였다. 24시간뒤세포의상층액을제거하고, 새로운배지로바꾼다음, 플라즈마를 1분, 3 분, 5분씩처리하였다. 그런다음 24시간이후배지를제거하고 phosphate buffered saline (PBS) 로세척하였다. 200 µl의 WST-1 용액을배지와희석한다음각 dish에넣고 2 시간동안처리하였다. 이후, ELISA reader (Sunrise Remote Control, Tecan, Austria) 로 450 nm 파장에서흡광도를측정한다음그래프로백분율로환산하여나타내었다. 이분석은 3회정도반복하여시행하였다. F-actin stain 플라즈마가세포내의골격배열에미치는영향을확인하기위해 F-actin염색후관찰을하였다. Cover slip에 50 μg/ ml 농도의콜라겐으로 24시간코팅시킨후 DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) 로세척하였다. 그런다음 Cover slip에세포를 3 10 4 으로분주한뒤 24시간동안배양하였다. 24시간이후플라즈마를처리하기위해 35 ø dish에세포가부착된 cover slip을넣은다음플라즈마를 5분동안처리하였다. 처리한세포는다시 24시간을배양한후 DPBS로세척하였다. 그후고정액인 4% Paraformaldehyde 용액을처리하고 PBS 로세척후 0.1% Triton X-100을이용하여 10분간세포막을투과시켰다. 염색약인 Rhodamine phalloidin을 1% BSA에희석한다음 30분간 37 o C의암실 - 230 -
Apoptosis and cell cycle arrest of osteosarcoma cells 에서 반응시켰다. PBS로 3번 세척 후 DAPI (4',6-diamidino-2- 바꾼 다음, 플라즈마를 1분, 3분, 5분씩 처리하였다. 24시 phenylindole)가 포함된 용액(Molecular Probes, CA, USA)으 간 동안 배양을 하고 이후 세포를 4oC에서 모은 다음 PBS 로 봉입한 다음 공초점 레이저 현미경 LSM 700 (Carl Zeiss, 로 세척하였다. 세척한 세포들은 적당량의 lysis buffer (10 mm Tris/HCl, ph 7.2, 1% Triton X-100, 150 nm NaCl, 5 Germany)을 이용하여 관찰하였다. mm EDTA, protease inhibitor cocktail)를 첨가해 4oC에서 Flow cytometry assay 1시간 동안 반응시킨 후, 원심 분리를 하고 상층액에 있는 35 ø dish에 2 105개의 세포를 분주한 후 24시간 동안 단백질만을 따로 분리했다. 각 단백질의 농도는 Bradford 배양하였다. 24시간 뒤 세포의 상층액을 제거하고, 새로운 assay를 통해 정량하였다. 동량의 sample을 만든 후 7.5- 배지로 바꾼 다음, 플라즈마를 1분, 3분, 5분씩 처리하였다. 15% polyacrylamide SDS gel을 이용해 전기영동으로 분리 그런 다음 24시간 이후 세포를 모아 PBS로 세척하였다. 하고 PVDF membrane으로 전이시켰다. 전이시킨 PVDF o 각각의 세포들을 70% 에탄올에 고정한 다음 4 C에 24시 membrane은 각각 1차, 2차 항체를 처리하고 특정 단백질 간 보관하였다. 24시간 후 PBS로 세척을 하고 RNase A를 의 발현 양을 Alpha Imager HP (AlphaInnotech, Santa 100 μg/ml이 되도록 넣어준 뒤 PI (Propidium iodide; Sigma, Clara, CA, USA)를 통해 분석하였다. St. Louis, MO, USA)를 100 μg/ml의 농도로 처리하였다. 30분 후 염색된 세포는 수거하여 분석기용 tube에 담아 유 통계 분석 통계 분석을 위해 통계 프로그램인 SPSS Window 세포 분석기(CYTOMICS FC500 Beckman Coulter, FL, CA, USA)를 통해 FL 3파장에서 관찰하였다. ver. 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 통해 분석 Western blot assay paired t-test method로 확인하였으며 p<0.05으로 분석 하였다. 플라즈마를 처리하지 않은 군과 처리한 군을 35 ø dish에 2 105개의 세포를 분주한 후 24시간 동안 배양 하였다. 24시간 뒤 세포의 상층액을 제거하고, 새로운 배지로 한 결과값을 통계학적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판단하였다. Fig. 2. Cytotoxic effect of plasma on MG-63 and hfob 1.19 cells. MG-63 and hfob 1.19 cells were treated with plasma at different times (0-5 min) for 24 h. NT: non treated group, GO: gas treated group, µp: plasma treated group. (A) Cell viability was estimated by WST-1 assay. *p<0.05 and **p<0.01 versus control. (B) Cell morphology was visualized by an inverted light microscopy. - 231 -
Byul Bo Ra Choi and Gyoo Cheon Kim 결 과 저온상압플라즈마에의한골육종세포의생존율저해플라즈마가골육종인 MG-63 세포와골모세포인 hfob 1.19의세포사멸에미치는영향을관찰하기위해플라즈마를적정시간처리후 WST-1 분석을수행하였다. Fig. 2A의결과와같이플라즈마를 MG-63에처리시 100, 98, 90, 56, 36% 으로처리시간의증가에따라유의적으로감소되었다. 반면플라즈마를 hfob 1.19에처리시 100, 102, 105, 103, 86% 으로 MG-63 에비해세포사멸효과가나타나지않았음을확인하였다. 또한 Fig. 2B와같이현미경상으로세포의형태학적모양을관찰할시 hfob 1.19보다 MG-63 에서세포의불규칙한형태와세포수의감소를확인하였다. 저온상압플라즈마에의한골육종세포의 F-actin 형태이상세포형태를유지하는골격을염색하기위해 F-actin에특이적으로결합할수있는 phalloidin 염색을시행하였다. 플라즈마를처리하지않은군에서는세포골격이정상적으로섬유형태를유지하고있는것을관찰하였으나반면플라즈마를 5분동안처리한군에서는섬유다발의구조가분리되어섬유형태의구조물이거의없음을관찰하였다 (Fig. 3). Fig. 3. Morphology of MG-63 cells treated with plasma. The morphology of MG-63 cells was visualized by using F-actin staining after treatment with 5 min of plasma for 24 h. 였다. 플라즈마를 1, 3, 5분으로처리한결과, Fig. 4A에따르면플라즈마를 1분처리후 G1, S, G2/M기의세포의분포는 51.5, 7.5, 29.1% 이었고, 3분처리후는 17.9, 8.9, 62.8% 이었으며, 5분처리후는 8.4, 9, 64.1% 이었다. 이결과는 G1기의세포수를감소시키고 G2/M기의세포수를증가시켰는데즉, 플라즈마가골육종세포를 G2/M기에서정지시킨다는것을의미한다. 또한세포자멸사를나타내는지표인 sub-g1의백분율을관찰했을시처리하는시간이증가함에따라 2.4%, 6.7%, 9.9% 로증가하였다. 이와같은결과로세포주기와관련된신호단백질을관찰하였을때 G2/M기와관련된 cyclin B와 CDC2가플라즈마를각각 3분과 5분을처리하였을때다른군보다확연히증가됨을확인하였다 (Fig. 4B). 저온상압플라즈마에의한골육종세포의세포주기정지 플라즈마가골육종세포주기와관련하여미치는영향을확인하기위해유세포분석을통해세포주기를분석하 저온상압플라즈마에의한골육종세포의세포자멸사유도 세포자멸사신호전달에서의대표적최종산물인 caspase-3와이의기질로알려진 PARP-1과 ICAD의결과 Fig. 4. Cell cycle arrest of MG-63 cells treated with plasma. MG-63 cells were treated with 1-5 min of plasma for 24 h. (A) The cells were stained with propidium iodide solution and analyzed by using flow cytometry. (B) The total protein lysates were used for SDS-PAGE followed by western blot analysis. Antibodies against cyclin B1 and CDC 2 were used. *p<0.05 versus control. - 232 -
Apoptosis and cell cycle arrest of osteosarcoma cells Fig. 5. Expression of apoptosis related protein by plasma treatment in MG-63 cells. The total protein lysates were used for SDS-PAGE followed by western blot analysis. Antibodies against PARP-1, caspase-3, and DFF 45 were used. *p<0.05 versus control. 를확인하였다. 실험결과, 플라즈마를각각 3분과 5분처리시 PARP-1의 116 kda이줄어드는반면 85 kda은증가된양상을보였고 ICAD는 45 kda과 40 kda에서점차줄어드는양상을보였다. 또한 caspase 3의 cleaved form이라불리는 19 kda와 17 kda가 3분처리시증가되는양상을보아각각의기질들이쪼개짐으로써세포자멸사가유도되었음을관찰할수있었다 (Fig. 5). 고찰 플라즈마는최근의학분야에서각종질환의치료효과가뛰어나다고알려져있으며특히간세포암, 흑색종, 직장암그리고구강편평세포암에서플라즈마로인한세포자 멸사및세포주기정지로세포죽음을유도한다는연구결과가보고된바있다 [16-19]. 구강편평세포암에서많이발현되는 EGFR의발현을감소시킴으로써선택적죽음유도한다는보고 [20] 가있었으며흑색종세포에서 TNF- ASK1의기전을통한 ROS의발생으로세포자멸사를유도한다는보고도있었다 [21]. 그외에도플라즈마가화학요법에내성이있는난소암에서항종양효과가있다는사실을 in vivo의실험을통하여증명되었다 [22]. 본연구에서는골육종세포로알려진 MG-63세포에서플라즈마가미치는영향을알아보고이와관련하여세포자멸사와세포주기정지여부에대해조사하였다. 플라즈마가골육종세포의사멸효과를알아보기위해 WST-1 의분석을한결과플라즈마를처리시처리시간의존적으로감소하였으며반면정상세포인 hfob 1.19세 - 233 -
Byul Bo Ra Choi and Gyoo Cheon Kim 포에서는별다른영향이없다는사실을관찰할수있었다. 이결과, 플라즈마가골육종세포인 MG-63에서시간의존적으로세포생존율감소및사멸율을증가시킨다는것을확인할수있었다. 액틴은세포질내소기관으로세포의형태를유지하며섬유형태로다발을이루고있다. 세포골격을이루는액틴은세포손상시무너지게되면세포모양을유지하지못하고결국에는세포사멸이나타날수있다 [23]. 본연구에서플라즈마를처리하지않을시정상적인액틴을유지되는반면플라즈마를 5분처리시액틴의변화가일어나세포본래의형태를유지하지못하는것으로관찰되었다. 이는골육종세포가플라즈마에의해세포사멸이유도된다는사실을관찰할수있었다. 이러한세포생존율감소및세포골격의변화를보이는것이어떠한기전을통하여유발되었는지확인하기위해유세포분석과단백질발현변화에대한실험을진행하였다. 플라즈마를처리후세포정지가유도된사실을확인하기위해정량적으로분석이가능한유세포분석기를사용하였다. 세포정지에대한분석을통해측정한결과, G2/ M기에서다른주기에서의수치보다증가되는것으로확인되었다. 이는단백질발현실험을통한결과와도유사하게나타난다. G2/M기에관련된 cyclin B/CDC2 복합체의발현이플라즈마가 3분처리시증가되는것을확인하였으며이는플라즈마가골육종세포에서 G2/M기의세포정지를유도한다는사실을나타난다. PARP-1은 DNA의복구를위해세포내에서매우중요한역할을하는데세포자멸사과정에서 caspase-3가활성이되면 PARP-1의절단현상이일어나고손상된세포를복구하는능력을소실하게된다 [24, 25]. 그중 capase-3의표적기질중하나인 DFF 45도마찬가지로세포자멸사가유발되면세포내에서분해가일어나단편화현상이일어나게되며미토콘드리아에위치하고있는 AIF도핵이나세포질내로이동하게된다 [26]. Western blot분석법을시행한결과 PARP-1에서플라즈마를 3분처리시기질이단편화되기시작하면서 5분처리시에는기질자체에서도감소가되어있는현상을확인하였다. 또한 caspase 3도마찬가지로 3분처리시부터활성화및단편화가시작되는것을확인하였고 DFF 45는플라즈마의처리시간이증가함에따라기질이점차감소되는현상을관찰하였다. 이는플라즈마를골육종세포에처리시세포자멸사와관련된기질들이분절이되면서세포자멸사를유도했다고볼수있다. 본연구는플라즈마가정상세포인 hfob 1.19세포에서세포사멸의효과를보이지않는반면 MG-63세포에서특이적세포사멸의효과를나타나는것으로확인되었다. 이 는정상세포와암세포사이의함유된활성산소차이인것으로생각된다. 암세포가정상세포보다활성산소의비율이높기때문에플라즈마를처리시정상세포보다더빠른세포사멸의효과를나타나게된다 [27]. 이를바탕으로실험한결과암세포의세포주기억제효과를확인하였으며이는세포자멸사로인한세포사멸까지유도한다는사실을확인할수있었다. 이는추후플라즈마가암치료장치로서의가능성을보이며보다암치료에있어중요한역할을할수있을것으로생각된다. 비록본연구에서는정상세포인 hfob 1.19세포에서의세포골격, 세포주기, 세포사멸반응에대해연구하지않았으나후속연구를통해보다많은연구가이루어져야할것으로사료된다. 감사의글 이논문은부산대학교기본연구지원사업 (2년) 에의하여연구되었음 (Kim GC). Conflict of Interest The authors declare that they have no competing interests. ORCID Byul Bo Ra Choi 0000-0001-7134-9734 Gyoo Cheon Kim 0000-0003-3568-3529 References 1. Ritter J, Bielack SS. Osteosarcoma. Ann Oncol 2010;21: vii320-325. doi: 10.1093/annonc/mdq276. 2. Eilber F, Giuliano A, Eckardt J, Patterson K, Moseley S, Goodnight J. Adjuvant chemotherapy for osteosarcoma: a randomized prospective trial. J Clin Oncol 1987;5:21-26. doi: 10.1200/JCO.1987.5.1.21. 3. Hogendoorn PC; ESMO/EUROBONET Working Group, Athanasou N, Bielack S, De Alava E, Dei Tos AP, et al. Bone sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2010;21: v204-213. doi: 10.1093/annonc/mdq223. 4. Morishita M, Kawamoto T, Hara H, Onishi Y, Ueha T, Minoda M, Katayama E, Takemori T, Fukase N, Kurosaka M, Kuroda R, Akisue T. AICAR induces mitochon- - 234 -
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