한방비만학회지제 18 권제 2 호, 2018 J Korean Med Obes Res 2018;18(2):74-82 https://doi.org/10.15429/jkomor.2018.18.2.74 pissn 1976-9334, eissn 2288-1522 JKOMOR Original Article 흰쥐의알코올유발성간손상에실비음 ( 實脾飮 ) 이미치는보호효과 김범회 동의대학교한의과대학해부학교실, 동의대학교한의학연구소 The Protective Effects of Silbi-um Extract on the Alcoholic Liver Injury in Rats Bum Hoi Kim Department of Anatomy, College of Korean Medicine and Research Institute of Oriental Medicine, Dong-Eui University Received: November 2, 2018 Revised: December 9, 2018 Accepted: December 11, 2018 Correspondence to: Bum Hoi Kim Department of Anatomy, College of Korean Medicine, Dong-Eui University, 52-57 Yangjeong-ro, Busanjin-gu, Busan 47227, Korea Tel: +82-51-850-7411 Fax: +82-51-853-4036 E-mail: bume@deu.ac.kr Copyright 2018 by The Society of Korean Medicine for Obesity Research Objectives: The objective of this study is to investigate the effects of Silbi-um (SBU) extract on the alcoholic fatty liver induced by EtOH administration for 8 weeks. Methods: Male Sprague Dawley rats were used. All animals were randomly divided into 3 groups; Normal, EtOH and EtOH+SBU. The rats of EtOH group were daily treated with ethanol of 25% (v/v) for 8 weeks (n=10). EtOH+SBU group was orally treated with SBU water extract after ethanol administration (n=10). The rats of Normal group were treated with saline (n=10). After 8 weeks, the mean body weight, liver weight, and liver-body weight ratio were calculated. The serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) of all groups were measured. The morphological alterations were observed using hematoxylin and eosin (H&E) and Oil Red O staining. Moreover, the alteration of tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels were analyzed immunohistochemistrically. Results: The histological data showed that liver sections from EtOH group displayed severe steatosis. SBU extract significantly inhibited the progression of the alcoholic liver injury. The increased serum level of ALT and AST induced by ethanol administration were decreased by SBU extract. Furthermore, SBU extract significantly decreased the liver concentrations of TNF-α. Conclusions: SBU water extract attenuated the alcohol induced fatty liver by improving hepatic lipid metabolism via suppression of TNF-α protein. SBU could be effective in protecting the liver from alcoholic fatty liver. Key Words: Alcoholic fatty liver, Silbi-um, Aspartate aminotransferase (AST), Alanine aminotransferase (ALT), Tumor necrosis factor-α (TNF-α) 서론 지방간 (fatty liver) 이란여러원인에의해간조직에지질이축적되어지방방울 (lipid droplet) 을함유한간세포가 5% 이상을넘게되어결국간기능을저하시키게되는질환을말한다 1). 지방간은비만, 당뇨, 알코올섭취및이상지질혈증 (dyslipidemia) 등에의해발생할수있다 2). 특히알코올을다량으로장기간섭취하게되면대사기능의장애가나타나고, 이에따라간에서의지방산의증가및중 성지방합성이증가하게되어알코올성지방간 (alcoholic fatty liver) 이발생하게된다 3). 이러한간에서의지질축적은알코올성간질환의중요한특징으로질병의초기단계임을나타내는데, 이후간의염증, 섬유화, 간경화증및간세포의악성종양등을유발할수있다 4). 알코올에의해간손상의가장잘알려진기전은 free radical 형성에따른염증반응과산화적손상 (oxidative stress) 의유발이다. 만성적인알코올섭취는활성산소 (reactive oxygen species) 를증가시키고, 막인지질과지방단백질의과산화를일으킨 74 www.jkomor.org
김범회 : 흰쥐의알코올유발성간손상에실비음 ( 實脾飮 ) 이미치는보호효과 다 5). 간의쿠퍼세포 (Kupffer cell) 와말초혈액의단핵구에의해분비되는 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β 및 IL-6는알코올성간질환의세가지중요한염증성 cytokine이다 6). 특히알코올성간질환에효과가있는약물들이 TNF-α 등의염증성 cytokine의수준을낮춤으로써치료효과를가지게되는것으로밝혀졌다 7). 이전연구를통해 TNF-α는알코올성지방간에서도발현이뚜렷이증가하는것이보고되었고 8), TNF-α receptor의인위적인제거는알코올성지방간의유발을억제하는것으로밝혀졌다 9). 즉 TNF-α는알코올에의한간에서의지방성병변에중요한역할을한다. 실비음 ( 實脾飮 ) 은 < 萬病回春 > 에처음기재된처방으로 10), 理氣, 健脾, 利濕하는약물로구성되어있으며, 身重懶食, 肢體浮腫, 口中不渴, 二便不實 을치료하는효능을가지고있어다양한원인으로발생하는신장질환, 장질환및간질환에사용된다 11). 실비음에대한이전연구로는 Zuker rat 의비만및항산화에대한보호효과 12), gentamicin sulfate 로유발된흰쥐의급성신부전에미치는보호효과등이보고되었다 13). 하지만실비음에대한실험적연구가부족한편이며, 특히간의알코올성병변에대한영향에관해서는아직까지연구가이루어지지않았다. 이에본연구는실비음이이전연구 12) 에서유전적비만동물에서산화적손상을억제함으로써중성지방및총콜레스테롤을감소시키고지질과산화물을유의하게감소시킨점에착안하여알코올성지방간형성에도보호효과가있을것으로사료되어, 알코올섭취로유발된간에서의지질합성에실비음이미치는영향을검증하였다. 이를위해흰쥐에 8주간에탄올을투여하여알코올성지방간을유발하고동시에실비음물추출물을경구투여한후, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) 등의간기능관련지표들의변화를관찰하고 hematoxylin and eosin (H&E) 염색및 Oil Red O 염색을시행하여간세포의해부조직학적변화를관찰하였다. 또한간세포에서의 TNF-α의발현변화를면역조직화학염색법을통해관찰하였다. 대상및방법 1. 실험동물 본연구에사용된실험동물은 Sprague-Dawley계흰쥐 30마리로, ( 주 ) 샘타코 (Samtaco Bio Korea, Osan, Korea) 에 서구입하였으며 8주령, 약 200 g 전후의수컷을사용하였다. 실험에사용된흰쥐들은온도 23 ~ 24, 습도 40 ~ 60% 가항상유지되고 12시간명 / 암조명이자동적으로유지되는사육실에서관리되었다. 실험실환경에 1주이상적응시킨후실험에사용하였으며, 전체기간동안무균음료및사료를자유롭게공급하였다. 본연구에서진행된모든실험동물과관련된과정은동의대학교동물실험윤리위원회의규정및방침에따라진행되었다 ( 승인번호 : R2018-006). 2. 약물의제조실비음의구성약재는 나눔제약 (Namum Herb, Yeoung Cheon, Korea) 에서구입하였으며, 처방구성은 Table 1과같다. 실험에사용된약물의제조는실비음 2첩분량인 204 g 을증류수 2 L와함께둥근플라스크에담고냉각기를부착한전탕기에서 2시간동안전탕한다음여과액을감압농축하여동결건조시켜물추출엑기스 62.7 g을얻었다. 투여량은흰쥐체중 10 0g당 268.6 mg을음용수에녹여경구투여하였다. 3. 실험군의분리와약물투여실험군의분리는흰쥐를무작위로 10마리씩나누어 Normal, EtOH, EtOH+SBU 세군으로나누었다. 휜쥐에의알코올성간손상은 25% 의 EtOH (Sigma Aldrich Chem. Co., St. Louis, MO, USA) 용액을 8주간투여함으로써유 Table 1. Herbal Composition of Silbi-um (SBU) Herb name Weight (g) Atractylodis Rhizoma 8 Atractylodis Macrocephalae Rhizoma 8 Magnoliae Cortex 8 Alismatis Rhizoma 8 Cyperi Rhizoma 8 Amomi Fructus 8 Aurantii Immaturus Fructus 8 Citri Pericarpium8 Arecae Pericarpium8 Aucklandiae Radix 8 Polla Cortex 8 Polyporus 8 Junci Medulla 6 Total amount 102 www.jkomor.org 75
한방비만학회지제 18 권제 2 호, 2018 발하였는데, EtOH군, EtOH+SBU군에 5 ml/kg의용량으로 14) 매일오전일정시간에 1회경구투여하였다. Normal 군에는동일량의생리식염수를경구투여하였다. EtOH 투여 30분후에 EtOH+SBU군에는실비음물추출물을 1 ml의투여량으로경구투여하였으며, EtOH군에는같은양의생리식염수를투여하였다. 4. 혈액생화학적검사 8주후실험동물을안락사시킨후심장혹은하대정맥에서혈액을채취하였다. 혈액을냉장고에 2시간저장후원심분리하여혈청을분리하였다. 채취한혈청내 AST, ALT의수치를측정하였다. 5. 체중측정및간의중량측정 8주간의실험기간동안매일오전정해진시간에실험동물의체중을측정하였으며, 실험마지막날에는안락사직전에체중을측정하였다. 부검을통해실험동물의간을분리하여채취하고중량을측정하였다. 이후간조직은 50 의 dry ice-isophentan 용액으로동결시키고 80 에서보관하였다. 6. 간조직의해부조직학적관찰각실험군의동결보관된간조직중앙부분의동일한일정부위를떼내어, 8 μm 두께로냉동절편하였다. 이후 H&E 염색법과 Oil Red O 염색을시행후, 현미경하에서관찰하였다. 염색된간조직은사진촬영후영상분석용 Axiovision LE software (ver. 4.2; Carl Zeiss Vision Inc., San Diego, CA, USA) 를이용하여조직병리학적변화를관찰하였다. 7. 면역조직화학염색 (immunohistochemistry) 자유부유법 (free-floating) 을사용하여면역조직화학염색을시행하였으며, 일차항체 (primary antibody) 는 anti-tnf-α (ab6671, 1:200 dilution, rabbit polyclonal; ABcam) 로 phosphatebuffered saline (PBS) 와 Triton X-100 (Sigma Aldrich Chem. Co., St. Louis, MO, USA) 을섞은용액으로희석한후 4 에서 12시간반응시켰다. 이후조직을 PBS로씻어내고, ABC Vectastain Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 를이용한 abidin-biotin immunoperoxidase의방법에따라각각 1시간씩반응시켰다. 면역반응을정량화하기위해동일한 일정면적내에명확하게적갈색으로염색된세포를면역양성반응으로구분하고세포수를측정하여수치화하였다. 8. 통계학적분석본실험에서얻은모든자료는 Statistical Package for Social Science (SPSS) for Windows (version 10.0; IBM Corp., Armonk, NY, USA) 를이용하여분석하였다. 세실험군에서측정된모든자료는 analysis of variance (ANOVA) 분석후사후검정을시행하고, 두군씩 Student's t-test를사용하여 P<0.05 및 P<0.01의유의수준으로검증하였다. 결과의모든값은평균 ± 표준오차 (mean±standard error) 로표기하였다. 결과 1. 알코올투여후체중및개체의변화 8주간의실험기간동안모든실험군에서실험동물의사망은발생하지않았다. 각실험군에서의체중변화를살펴보면, EtOH군과 EtOH+SBU군에서 Normal군에비해상대적으로체중이감소되는경향이나타났다 (Fig. 1). 8 주후의최종적인체중을측정한결과에서는 Normal군에서 425.4±8.0 g, EtOH군이 376.2±8.7 g, EtOH+SBU 군에서 382.5±7.6 g으로관찰되어, EtOH군과 EtOH+SBU군모두에서 Normal 군에비해평균체중이유의하게감소되었으며 (P<0.01), EtOH 군과 EtOH+SBU 군의비교에서는 EtOH+SBU 군이 EtOH군에비해평균체중이약간회복되었으나, 통계적으로유의한차이를나타내지는않았다. 2. 간손상의생화학적지표 8주후각군의실험동물로부터채취한혈액에서혈청 AST, ALT 의수준을비교분석한결과, AST의경우 Normal 군에서 111.1±3.3 IU/L로측정된반면, EtOH군에서 180.5± 3.6 IU/L로급격한상승을나타냈다 (Table 2, P<0.01). 한편, EtOH+SBU군에서는 167.8±2.8 IU/L로측정되어 EtOH군에서와마찬가지로 Normal군에비해유의하게증가되었으나 (Table 2, P<0.01), EtOH군과의비교에서는유의하게감소되었다 (Table 2, P<0.05). ALT의경우에서도 Normal군이 27.4±0.7 IU/L, EtOH군이 38.5±0.6 IU/L로측정되어 EtOH군에서 Normal 군에비해유의하게증가되었으며 (Table 2, P<0.01), EtOH+SBU군에서는 36.6±0.7 IU/L로측정되어 Normal군에비해유의하 76 www.jkomor.org
김범회 : 흰쥐의알코올유발성간손상에실비음 ( 實脾飮 ) 이미치는보호효과 Fig. 1. The changes of mean body weights of rats during the 8 weeks. The mean body weight of both EtOH and EtOH+Silbi-um (SBU) groups were decreased as compared with Normal group. There were no significant differences in the mean body weights between EtOH and EtOH+SBU groups. Table 2. Blood Serum Chemistry Values of Rats in Normal, EtOH and EtOH+Silbi-um (SBU) Groups Group Normal EtOH EtOH+SBU AST (IU/L) 111.1±3.3 180.5±3.6 167.8±2.8 * ALT (IU/L) 27.4±0.7 38.5±0.6 36.6±0.7 * AST/ALT ratio 4.05 4.69 4.58 Data were expressed as mean±standard error and were analysed by the Student's t-test. AST: aspartate aminotransferase, ALT: alanine aminotransferase. * P<0.05 compared with Control group; P<0.01 compared with Normal group. 게증가되었다 (Table 2, P<0.01). 하지만 EtOH군과 EtOH+ SBU군간의비교에서는 EtOH+SBU군이 EtOH군에비해유의하게감소되었다 (Table 2, P<0.05). AST/ALT 비율의비교에서는 Normal군에서 4.05, EtOH군에서 4.69로계산되어 EtOH군이 Normal군에비해증가되었으며, EtOH+SBU 군에서는 4.58로측정되어 EtOH군에비해상대적으로감소되는것으로관찰되었다. 3. 간의중량변화 8주후각실험군흰쥐의간을적출하여무게를측정하여비교하고, 체중대비중량으로환산하여변화를관찰하였다. 그결과, 간의평균무게는 Normal군에서 18.2±0.3 g, EtOH군에서는 15.5±0.3 g으로측정되어유의하게감소되 Table 3. Changes in Body Weight and Liver-body Weight Ratio of Rats in Normal, EtOH and EtOH+Silbi-um (SBU) Groups Group Normal EtOH EtOH+SBU Liver weight (g) 18.2±0.3 16.6±0.3 17.5±0.3 * Liver-body weight ratio (%) 4.23±0.11 4.42±0.08 4.49±0.11 Data were expressed as mean±standard error. * P<0.05 compared with Control group; P<0.05 compared with Normal group; P<0.01 compared with Normal group. 었다 (Table 3, P<0.01). EtOH+SBU군에서는 16.4± 0.2 g으로측정되어, Normal군에비해유의한중량감소가관찰되었으나 (Table 3, p<0.05), EtOH군에비해서는무게감소의회복이확인되었다 (Table 3, P<0.05). 체중에대한간중량의비율로환산하여계산한간-체중비의결과에서는 Normal군에서 4.23±0.11%, EtOH군이 4.14±0.12%, EtOH+ SBU군에서 4.22±0.08% 로측정되어, EtOH군과 EtOH+SBU 군에서모두 Normal군에비해증가되었고, EtOH+SBU군이 EtOH군에비해약간더증가하였으나세군간에통계적인유의성은확인되지않았다 (Table 3). 4. 간의해부조직학적변화 적출된간조직을 8 μm 두께로냉동절편하여 H&E 염색법을시행후현미경하에서관찰한결과, Normal군은 www.jkomor.org 77
한방비만학회지 제18권 제2호, 2018 정상적인 간 조직의 형태를 나타낸 반면, EtOH군에서는 Normal군에 비해 면역반응이 뚜렷이 증가되는 것이 관찰 8주간의 알코올 투여로 인해 간 조직의 괴사 및 지방방울 되었다. EtOH+SBU군에서도 면역반응이 증가되었으나 (fat droplet)의 형성을 뚜렷이 관찰할 수 있었다. EtOH+SBU EtOH군에 비교해서는 상대적으로 발현이 감소된 것을 확 군에서도 지방방울의 형성이 관찰되었으나 EtOH군에 비 인할 수 있었다(Fig. 4). 해 그 크기와 수가 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다 현미경을 통해 확인된 TNF-α의 발현을 객관적으로 수 (Fig. 2). Oil Red O 염색을 시행한 결과에서도 EtOH군과 치화하기 위하여 일정 면적에서 양성반응을 보인 세포의 EtOH+SBU군에서 Normal군에 비해 간 조직으로의 지질 개수를 측정한 결과에서는, Normal군에서 양성반응세포수 축적(lipid accumulation)이 상대적으로 많이 관찰되었으나, 가 4.9±0.9개/1.2 105μm2인 반면, EtOH군에서는 45.7±3.1 EtOH+SBU군에서 EtOH군에 비해 현저히 줄어든 것이 확 개/1.2 105μm2로 측정되어 Normal군에 비해 유의하게 증 인되었다(Fig. 3). 가되었다(P<0.01). EtOH+SBU군에서는 34.6±3.1개/1.2 105 μm2로 관찰되어 EtOH군과 마찬가지로 Normal군에 비해 5. 간 조직에서의 TNF-α의 발현 변화 면역조직화학염색법을 통하여 TNF-α에 대한 면역반 유의하게 증가되었으나(P<0.01), EtOH군에 비해서는 면역 양성반응 세포수가 유의하게 감소되었다(Fig. 4, P<0.05). 응을 관찰한 결과, Normal군에서는 TNF-α의 면역반응이 거의 발견되지 않았으나 알코올을 투여한 EtOH군에서는 Fig. 2. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of liver tissue from Normal, EtOH, and EtOH+Silbi-um (SBU) groups. The normal histological structures of hepatocytes (A) were observed in Normal group. The significant histological alterations such as ballooning, fatty and hydropic degeneration were found in EtOH group (B) and the histological changes were ameliorated in EtOH+SBU group (C). Magnification: 200, Scale bar=50 μm. Fig. 3. Oil Red O staining of liver tissue from Normal, EtOH, and EtOH+Silbi-um (SBU) groups. No lipid accumulation was observed in Normal group (A). Whereas, EtOH group (B) showed the significant accumulation of lipids, as indicated by an increased number of red hepatocytes when compared with Normal group. EtOH+SBU group (C) demonstrated significantly decreased lipid infiltration compared with EtOH group. Magnification: 400, Scale bar=100 μm. 78 www.jkomor.org
김범회 : 흰쥐의알코올유발성간손상에실비음 ( 實脾飮 ) 이미치는보호효과 Fig. 4. Immunohistochemical staining for tumor necrosis factor-α (TNF-α) in liver sections from Normal, EtOH, and EtOH+SBU groups. TNF-α expressions were hardly observed in the liver tissue of Normal group (A). EtOH group (B) showed the increased level of TNF-α immunoreactivity. The expressions of TNF-α protein in EtOH+SBU group (C) were decreased as compared with EtOH group. Mean number of TNF-αositive cells counted (D). Data were expressed as mean±standard error. Magnification: 200, Scale bar=50 μm. * P<0.05 compared with EtOH group; P<0.01 compared with Normal group. 고찰 실험동물에간의알코올성손상을유발하는방법은여러가지가존재하는데 14-18), 일반적으로 20% 이상의에탄올을 8주이상섭취할경우간에알코올성병변이나타나는것으로보고되었다 14,18). 본연구에서는흰쥐에 25% 의에탄올을 8주동안매일일정한시간에경구투여함으로써간의알코올성지방변증을유도하였다. 알코올을장기간섭취할경우영양불균형으로인해체중이감소되는것으로알려졌는데 19), 본연구에서도 Normal군에비해에탄올을 경구투여한 EtOH군과 EtOH+SBU 군에서전반적으로체중이감소되었으며, 8주후에는두군모두 Normal군에비해유의하게감소되었다. EtOH군과 EtOH+SBU군의비교에서는 EtOH+SBU군이 EtOH군에비해평균체중이약간회복되었으나, 유의한차이는없었다. 따라서실비음의투여는알코올섭취로인한체중감소에유의한영향을미치지는않는것으로사료된다. 간손상의진단에있어 ALT 와 AST는중요한지표로활용되는데, 일반적으로알코올성지방간의경우 AST가 ALT 보다높으며, AST/ALT 의비율이상승하는것으로알 www.jkomor.org 79
한방비만학회지제 18 권제 2 호, 2018 려졌다 20,21). 본연구에서는알코올섭취로인한간손상과그에대한실비음의영향을살펴보기위하여혈청내 ALT 와 AST 효소의농도를측정한결과, 에탄올을 8주간투여한 EtOH군과 EtOH+SBU군에서 Normal군에비해 ALT 와 AST 의뚜렷한상승이관찰되었다. EtOH군과 EtOH+SBU군의비교에서는 EtOH+SBU군이 EtOH군에비해 ALT와 AST 수치의상승이모두유의하게억제되었다. 또한 AST/ALT 의비율에있어서도, EtOH군과 EtOH+SBU군모두 Normal 군에비해증가되었으나, EtOH군과 EtOH+SBU군의비교에서는 EtOH+SBU군이 EtOH군에비해상대적으로감소되는것이관찰되었다. 이러한결과는실비음이장기간의알코올섭취로인한 ALT와 AST의증가및 AST/ALT 의상승을억제시키는효과가있음을보여주는것이라할수있다. 오랜기간알코올을섭취했을때가장먼저나타나는변화중하나는간에서의지방축적, 즉지방간발생이다. 이러한알코올성지방간의형성에있어중성지방 (triglyceride) 생성의증가가중요한역할을하게되는데 22), 간에서의지방축적으로인해상대적으로간의실질조직이감소하게되면간의전체무게도감소하는것으로알려졌다 23). 본연구에서도 8주간알코올투여후실험동물의간을적출하여무게를측정한결과, 에탄올을투여한 EtOH군과 EtOH+SBU 군모두에서 Normal 군에비해간의평균무게가유의하게감소되었다. EtOH군과 EtOH+SBU군의비교에서는실비음을투여한 EtOH+SBU군에서 EtOH군에비해간중량의감소가유의하게회복된것을확인할수있었다. 체중에대한간의상대적무게를환산한간-체중비의비교에서는알코올을투여한 EtOH군과 EtOH+SBU군에서 Normal군에비해간-체중비가증가되었으며, EtOH+ SBU 군과 EtOH군의비교에서는 EtOH+SBU군이 EtOH군에비해간-체중비가좀더증가되었다. 이러한결과를통해실비음투여는알코올섭취로인한간의무게감소에유의한방어효과가있음을알수있다. 알코올에의한간손상은초기에간에서의지방방울 (fat droplet) 의생성으로나타나는데, 축적된지방산 (fatty acid) 들은간에독성으로작용하게된다 2,24). 따라서알코올섭취로인한간에서의지방축적은간의염증, 섬유화, 간경화증및간세포의악성종양등으로이어질수있는간질환의초기단계를의미하게된다 4). 본연구에서에탄올투여후간세포의조직병리학적변화를관찰하기위해 H&E 염색을시행하였다. 그결과, 8주간에탄올을투여한 EtOH 군에서 Normal군에비해간조직에서염증세포침윤과간조직괴사및지방방울 (fat droplet) 의형성이뚜렷이관찰되었다. 8주간의에탄올투여와함께실비음물추출물을투여한 EtOH+SBU군에서도 EtOH군과비슷한양상의조직학적변화가관찰되었으나, EtOH군에비해현저히감소되었다. 간조직에축적된지방함량을확인하기위해시행한 Oil Red O 염색에서도 EtOH군에서 Normal군이비해간조직으로의지질침윤이뚜렷이관찰되었다. EtOH+SBU 군에서도지질침윤이관찰되었으나, EtOH군에비해현저히감소된것으로확인되었다. 이러한결과는실비음투여가알코올섭취로인한간세포의병리조직학적변화, 특히지방방울의형성을억제하여간의지방변성을감소시키는효과가있음을보여주는결과라할수있다. 알코올성지방간의병리기전에는다양한요소들이관여하며발생과정에서서로영향을미치며복잡한과정을거치게된다 3,25). 활성산소종 (reactive oxygen species), 장유래내독소 (gut-derived endotoxin), TNF-α와같은 adipocytokine들은알코올로인한간손상과초기의지방변성을일으키는주요원인이된다 26). 특히 TNF-α는여러간질환에서중요한매개체로서의역할을하며간손상이유발될경우수치가증가하는것으로보고되었다 27). 알코올로인한지방간형성에도이러한 TNF-α가핵심적인역할을수행하게되는데, TNF-α는간에서의콜레스테롤, 지방산및중성지방을합성하는 sterol regulatory element-binding protein의활성을촉진시킴으로써간의지방변성을유발하는것으로알려졌다 28). 알코올성지방간에대한역학연구에서알코올섭취량과혈청 TNF-α의농도간에서로상관관계가있음이밝혀졌으며 29), 동물을이용한실험연구에서도장기간의알코올섭취후에 TNF-α가증가하는것으로확인되었다 18,30). 본연구에서는에탄올투여에따른 TNF-α의발현변화에실비음이미치는영향을확인하기위해면역조직화학염색법을통해관찰하였다. 그결과, 8주간에탄올을투여한 EtOH군에서 Normal군에비해 TNF-α에대한면역반응이뚜렷이증가하는것이관찰되었다. 면역반응을정량화하기위해일정면적에서의 TNF-α에대해양성반응을보인세포수를측정한결과에서도 EtOH군은 Normal 군에비해면역양성세포수가유의하게증가되었다. 이러한결과는실험동물에 8주간의알코올투여후간세포에서의 TNF-α의발현이유의하게 80 www.jkomor.org
김범회 : 흰쥐의알코올유발성간손상에실비음 ( 實脾飮 ) 이미치는보호효과 증가하였다는이전의연구와도일치하는것이다 18). 한편, EtOH+SBU군에서도 Normal군에비해 TNF-α의면역반응이증가하였으나, EtOH군에비해서발현이감소된것으로관찰되었다. 면역반응을정량화하여측정한결과에서도 EtOH+SBU군이 EtOH군에비해면역양성반응세포수가유의하게감소되었다. 이러한결과들을통해실비음물추출물의투여는알코올섭취로인한간에서의 TNF-α 의증가를유의하게억제시키는것으로확인되었으며, 실비음은알코올섭취로인한간손상및지방간생성과정에서유의한보호효과가있는것으로사료된다. 종합하면, 이전연구를통해실비음이비만을유의하게억제하고항산화효능을가지고있음이보고 12) 되었으며, 실제임상에서도비만을치료하기위한처방으로사용 11) 되고있음에도불구하고기존연구는주로신장질환에관한것이대부분이었다. 따라서본연구는임상에서알코올성지방간질환에대해실비음을활용할수있는근거자료를마련한것이라할수있다. 다만, 본연구에서는알코올로인한간손상발생기전에있어 TNF-α에미치는영향만을확인하였으나추후지속적인연구를통해다른기전에미치는영향에대해서도검증할필요가있다. 또한이미알코올성간손상에유의한보호효과가있는것으로알려진 silymarin 31) 등과같은약제들과의효능비교도이루어진다면좀더임상에적극적으로활용가능하리라생각된다. 나아가, 비만, 스트레스등으로인한비알코올성지방간뿐아니라여러가지원인에의해발생되는간손상에실비음이미치는효과에대해서도검증할필요가있다고사료된다. 결론 본연구는알코올투여로유발된지방간에대한실비음의영향을검증하기위하여흰쥐에 25% EtOH을 8주간경구투여하여지방간형성을유발하고동시에실비음물추출물을경구투여한결과, 다음과같은결론을얻었다. 실비음은 8주간의알코올섭취로인한흰쥐의체중감소에는유의한영향을미치지않았으나, 알코올로인한간의무게감소를유의하게억제하였다. 간-체중비의변화에는유의한변화를나타내지않았다. 또한알코올섭취로인한 AST와 ALT의상승을유의하게억제시켰으며, AST/ALT 비율의상승을억제하였다. 간세포의해부조직 학적변화에있어서도실비음물추출물은알코올섭취로인한간조직의괴사, 지방방울의형성과같은병리적변화를억제시켰다. 이러한실비음의알코올성지방간에대한보호효과는알코올로인한간세포에서의지방변성에중요한매개체인 TNF-α의발현을효과적으로억제시키기때문인것으로사료된다. 이와같은결과로실비음은알코올섭취로인한간에서의지방축적에유의한보호효과가있는것으로사료된다. References 1. Okumura T. Role of lipid droplet proteins in liver steatosis. J Physiol Biochem. 2011 ; 67(4) : 629-36. 2. Carr RM, Ahima RS. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Exp Cell Res. 2016 ; 340(2) : 187-92. 3. Liu J. Ethanol and liver: recent insights into the mechanisms of ethanol-induced fatty liver. World J Gastroenterol. 2014 ; 20(40) : 14672-85. 4. Dongiovanni P, Romeo S, Valenti L. Hepatocellular carcinoma in nonalcoholic fatty liver: role of environmental and genetic factors. World J Gastroenterol. 2014 ; 20(36) : 12945-55. 5. Ceni E, Mello T, Galli A. Pathogenesis of alcoholic liver disease: role of oxidative metabolism. World J Gastroenterol. 2014 ; 20(47) : 17756-72. 6. Chen YL, Peng HC, Hsieh YC, Yang SC. Epidermal growth factor improved alcohol-induced inflammation in rats. Alcohol. 2014 ; 48(7) : 701-6. 7. Suk KT, Kim MY, Baik SK. Alcoholic liver disease: treatment. World J Gastroenterol. 2014 ; 20(36) : 12934-44. 8. Lin HZ, Yang SQ, Zeldin G, Diehl AM. Chronic ethanol consumption induces the production of tumor necrosis factor-alpha and related cytokines in liver and adipose tissue. Alcohol Clin Exp Res. 1998 ; 22(5) : 231-7. 9. Ji C, Deng Q, Kaplowitz N. Role of TNF-alpha in ethanol-induced hyperhomocysteinemia and murine alcoholic liver injury. Hepatology. 2004 ; 40(2) : 442-51. 10. Gong YX. Wan Bing Hui Chun. 1st ed. Taipei : Greater China Book Company. 1983 : 174. 11. Wang YY, Li YX. Clinical experience of Shi pi yin. Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine. 2011 ; 18(6) : 83-4. 12. Jeon GT, Keum DH, Lee MJ. The effects of Silbi-um (Shipi-yin) on obesity and antioxidant activities in Zucker rat. J Korean Med Rehabil. 2003 ; 13(2) : 69-85. 13. Lim HW, Kang SB, Kim MR. Effects of Silbieum and Lieum Jeon on rats with acute renal failure induced by www.jkomor.org 81
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