연구분야 ( 코드 ) 과제번호 1210360 과제성격 ( 기초, 응용, 개발 ) 응용실용화대상여부비실용화 연구과제명 과제책임자 세부과제 지원목적과제프로그램공개가능여부공개 ( 공개, 비공개 ) ( 국문 ) 전장유전체유전자다형데이터를이용한표적유전자의발굴 ( 영문 ) Identification of disease-related target genes through the integration of GWAS data with expression profiling 구분 1 2 3 소속융합기술연구부직위대학원장 성명김인후전공생화학 세부과제명 세부과제책임자 성명 소속 ( 직위 ) 전공 총연구기간 2012 년 1 원 ~ 2013 년 12 월 ( 총 2 년 ) 참여연구원수 ( 단위 : 명, MY) 11 명 (4.8 MY) 연구기간및 연구비 ( 단위 : 천원 ) 구분연구기간계 계 제 1 차 제 2 차 제 3 차 2012 년 1 월 ~ 2013년 12월 2012년 1월 ~ 2012년 12월 2013년 1월 ~ 2013 년 12 월 ~ 국립암센터 500,000 500,000 200,000 200,000 300,000 300,000 참여기업명칭전화 FAX 기업부담금소계현금현물 기관고유연구사업관리규칙에따라본연구개발사업을성실히수행하였으며아래와같이최종보고서 를제출합니다. 2013 년 10 월 30 일 과제책임자김인후 ( 서명 )
연구목표 (200 자이내 ) < 최종목표 > 한국인전장유전체분석데이터를바탕으로암발생위험도, 수술후재발및치료반응성, 생존율과관련된유전자변이및기능적연관성을보이는표적유전자를발굴하고임상적의미를검증함. < 당해연도목표 > 1기비소세포폐암환자의전장유전체염기서열분석데이터를바탕으로유전자변이및발현변화를조사하여조기폐선암및수술후재발예측마커발굴과 druggable 표적유전자발굴 1. 한국인폐암환자의전장유전체유전자다형데이터를이용한유전자기능기반의경로분석 - 유전자다형의연관분석데이터를이용하여 post-gwas 의한가지접근방법으로주목받고있는경로분석을수행 2 한국인폐암환자의전장유전체유전자분석데이터를이용하여폐암발생의위험인자및치료후예후와관련된 locus 의맵핑 - 4q35의 rs1454694 를중심으로 5Mb 내에위치하는유전자다형의 linkage disequilibrium map 을작성하고 Tag SNP 를선별하여 genotyping 을실시 연구내용및방법 (500 자이내 ) 3. 4q35 유전자다형과연관된표적유전자발굴 - 4q35 유전자다형중심 1 Mb 내에연관된유전자를검색하여 1 기비소세포폐 암환자의예후와연관성을분석 4. 폐암관련유전자 CHD7 의기능분석및임상적의미검증 - 폐암세포에서 CHD7 유전자의단백질발현을조사하고폐암세포및제브라피쉬, 마우스등의동물모델에유전체디자인기술 (TALEN) 을적용하여생체내기능분석과임상적적용을위한타당성검증. 5. 조기폐암환자의수술후재발및예후에관련된표적유전자발굴 연구개발에따른기대성과 - 기존에공개된폐암환자 Omics 데이터를활용하여, 조기폐암환자의수술후 재발및예후에관련된표적유전자발굴.
비소세포폐암전장유전체연관분석유전자다형 국문 경로분석 예후 색인어 non-small cell lung g e n o m e - w i d e s i n g l e - n u c l e o t i d e 영문 cancer pathway-based analysis association study prognosis polymorphism
Identification of disease-related target genes through the integration of GWAS data with expression profiling non-small cell lung cancer, genome-wide association study, single-nucleotide polymorphism, pathway-based analysis, prognosis
CHR SNP Position A1 A2 MAF HR (95% CI) P-value N HR (95% CI) N HR (95% CI) P-value Codominant model Dominant model 22 12+11 Recur RFS 250 308 pooled 250 308 pooled 2 rs1377949 52835192 G A 0.48 0.38(0.2-0.72) 2.99 10^-03 54 1 184 0.23(0.1-0.5) 2.06 10^-04 3 rs3804850 7663702 T C 0.15 2.4(1.4-4.12) 1.38 10^-03 183 1 67 3.53(1.68-7.41) 8.66 10^-04 4 rs1454694 182434941 C T 0.20 6.2(3.01-12.78) 7.37 10^-07 154 1 96 6.22(2.61-14.81) 3.68 10^-05 5 rs380181 172956532 T G 0.22 2.52(1.31-4.84) 5.39 10^-03 153 1 97 2.66(1.22-5.81) 1.38 10^-02 6 rs700496 83540074 C G 0.33 3.1(1.73-5.54) 1.35 10^-04 105 1 132 3.15(1.35-7.33) 7.70 10^-03 2 rs1377949 52835192 G A 0.45 0.72 (0.53-0.99) 4.62 10^-02 88 1 217 0.69 (0.44-1.07) 9.67 10^-02 3 rs3804850 7663702 T C 0.16 1.42 (0.97-2.08) 6.91 10^-02 215 1 89 1.32 (0.85-2.05) 2.22 10^-01 4 rs1454694 182434941 C T 0.23 1.71 (1.25-2.33) 7.10 10^-04 185 1 120 2.35 (1.53-3.61) 9.66 10^-05 5 rs380181 172956532 T G 0.21 1.39 (1.00-1.94) 5.15 10^-02 192 1 113 1.57 (1.02-2.42) 3.88 10^-02 6 rs700496 83540074 C G 0.29 1.39 (1.02-1.91) 3.95 10^-02 155 1 153 1.42 (0.93-2.17) 1.09 10^-01 2 rs1377949 52835192 G A 0.46 0.62(0.47-0.83) 1.30 10^-03 142 1 401 0.52(0.35-0.76) 6.55 10^-04 3 rs3804850 7663702 T C 0.15 1.67(1.22-2.28) 1.22 10^-03 398 1 156 1.66(1.14-2.41) 7.55 10^-03 4 rs1454694 182434941 C T 0.21 2.15(1.64-2.83) 4.22 10^-08 339 1 216 2.93(2.01-4.26) 2.12 10^-08 5 rs380181 172956532 T G 0.21 1.54(1.15-2.05) 3.50 10^-03 345 1 210 1.75(1.21-2.53) 2.96 10^-03 6 rs700496 83540074 C G 0.31 1.61(1.23-2.11) 5.70 10^-04 260 1 285 1.62(1.12-2.36) 1.08 10^-02 Codominant model Dominant model 22 12+11 CHR SNP Position A1 A2 MAF HR (95% CI) P-value N HR (95% CI) N HR (95% CI) P-value 2 rs1377949 52835192 G A 0.48 0.35(0.2-0.61) 2.34 10^-04 54 1 184 0.35(0.2-0.61) 1.56 10^-05 3 rs3804850 7663702 T C 0.15 2.55(1.58-4.13) 1.33 10^-04 183 1 67 2.55(1.58-4.13) 5.71 10^-05 4 rs1454694 182434941 C T 0.20 5.07(2.68-9.61) 6.27 10^-07 154 1 96 5.07(2.68-9.61) 2.11 10^-05 5 rs380181 172956532 T G 0.22 2.93(1.72-5) 7.71 10^-05 153 1 97 2.93(1.72-5) 3.52 10^-04 6 rs700496 83540074 C G 0.33 2.97(1.8-4.9) 1.88 10^-05 105 1 132 2.97(1.8-4.9) 1.38 10^-03 2 rs1377949 52835192 G A 0.45 0.72(0.53-1.00) 4.75 10^-02 88 1 217 0.69(0.44-1.07) 9.87 10^-02 3 rs3804850 7663702 T C 0.16 1.42(0.97-2.08) 6.90 10^-02 215 1 89 1.32(0.85-2.05) 2.22 10^-01 4 rs1454694 182434941 C T 0.23 1.71(1.25-2.33) 7.47 10^-04 185 1 120 2.34(1.52-3.60) 1.03 10^-04 5 rs380181 172956532 T G 0.21 1.39(1.00-1.94) 5.24 10^-02 192 1 113 1.57(1.02-2.41) 3.92 10^-02 6 rs700496 83540074 C G 0.29 1.40(1.02-1.92) 3.87 10^-02 155 1 153 1.42(0.93-2.17) 1.08 10^-01 2 rs1377949 52835192 G A 0.46 0.58(0.44-0.77) 1.36 10^-04 142 1 401 0.47(0.33-0.68) 4.93 10^-05 3 rs3804850 7663702 T C 0.15 1.72(1.28-2.32) 3.02 10^-04 398 1 156 1.78(1.25-2.53) 1.53 10^-03 4 rs1454694 182434941 C T 0.21 2.12(1.62-2.76) 3.21 10^-08 339 1 216 2.83(1.98-4.06) 1.32 10^-08 5 rs380181 172956532 T G 0.21 1.63(1.24-2.14) 4.97 10^-04 345 1 210 1.89(1.33-2.69) 4.21 10^-04 6 rs700496 83540074 C G 0.31 1.69(1.3-2.19) 8.02 10^-05 260 1 285 1.74(1.21-2.5) 2.76 10^-03
Codominant model Dominant model 22 22 12+11 CHR SNP Position A1 A2 MAF N HR (95% CI) P-value N HR (95% CI) N HR (95% CI) P-value 4 rs12512774 182039199 C T 0.27 287 0.79(0.58-1.07) 1.28 10^-01 287 1 253 0.75(0.52-1.09) 1.33 10^-01 4 rs2056488 182131064 G C 0.28 273 0.86(0.64-1.16) 3.26 10^-01 273 1 269 0.84(0.59-1.2) 3.41 10^-01 4 rs7693803 182229507 T C 0.09 458 1.12(0.75-1.68) 5.74 10^-01 458 1 90 1.19(0.76-1.87) 4.44 10^-01 4 rs12511513 182229612 G A 0.48 155 1.08(0.85-1.38) 5.05 10^-01 155 1 389 1.22(0.82-1.81) 3.36 10^-01 4 rs13102039 182237258 G C 0.14 409 0.65(0.43-0.98) 3.84 10^-02 409 1 140 0.67(0.44-1.05) 7.80 10^-02 4 rs7665204 182267639 T C 0.24 307 0.83(0.61-1.11) 2.07 10^-01 307 1 238 0.79(0.55-1.14) 2.05 10^-01 4 rs6837440 182273641 T C 0.29 270 0.81(0.62-1.07) 1.43 10^-01 270 1 278 0.81(0.57-1.15) 2.43 10^-01 4 rs10030827 182285244 C A 0.25 308 0.86(0.65-1.15) 3.22 10^-01 308 1 241 0.84(0.59-1.21) 3.54 10^-01 4 rs9994261 182285492 T C 0.25 308 0.88(0.66-1.17) 3.79 10^-01 308 1 237 0.85(0.59-1.22) 3.72 10^-01 4 rs6855247 182287248 C T 0.28 283 0.79(0.59-1.04) 8.99 10^-02 283 1 262 0.76(0.53-1.09) 1.34 10^-01 4 rs998399 182291823 C T 0.24 319 0.69(0.5-0.94) 1.79 10^-02 319 1 230 0.66(0.45-0.95) 2.76 10^-02 4 rs7696741 182294387 G C 0.13 412 1(0.71-1.42) 9.86 10^-01 412 1 135 1.04(0.69-1.56) 8.61 10^-01 4 rs28582585 182296055 A G 0.14 411 1.05(0.75-1.48) 7.65 10^-01 411 1 137 1.11(0.74-1.65) 6.22 10^-01 4 rs6824894 182302345 C T 0.29 282 1.09(0.84-1.43) 5.14 10^-01 282 1 265 1.13(0.79-1.61) 4.90 10^-01 4 rs6830512 182302478 G T 0.28 286 1.13(0.86-1.47) 3.90 10^-01 286 1 259 1.18(0.83-1.68) 3.58 10^-01 4 rs10027441 182306567 C G 0.24 323 0.86(0.64-1.16) 3.32 10^-01 323 1 225 0.82(0.57-1.17) 2.74 10^-01 4 rs6835617 182308665 A G 0.21 333 0.88(0.63-1.22) 4.30 10^-01 333 1 214 0.82(0.56-1.19) 2.88 10^-01 4 rs12503294 182314469 T G 0.17 379 0.89(0.62-1.27) 5.11 10^-01 379 1 169 0.85(0.57-1.25) 4.03 10^-01 4 rs12511716 182314531 G A 0.18 367 0.83(0.58-1.18) 3.00 10^-01 367 1 179 0.79(0.53-1.18) 2.48 10^-01 4 rs12504151 182314713 T G 0.17 369 0.85(0.6-1.21) 3.71 10^-01 369 1 173 0.82(0.55-1.21) 3.19 10^-01 4 rs12499597 182316004 T C 0.49 144 0.9(0.7-1.16) 4.18 10^-01 144 1 402 0.78(0.53-1.14) 2.03 10^-01 4 rs9312273 182326491 C T 0.32 251 1.05(0.81-1.38) 7.07 10^-01 251 1 293 1.13(0.79-1.62) 4.95 10^-01 4 rs1563221 182331126 C T 0.20 343 0.87(0.62-1.21) 3.98 10^-01 343 1 204 0.8(0.55-1.17) 2.46 10^-01 4 rs62335883 182331142 C G 0.30 263 1.31(1-1.73) 5.30 10^-02 263 1 283 1.42(0.99-2.04) 5.54 10^-02 4 rs10016407 182333239 T C 0.38 211 1(0.77-1.29) 9.70 10^-01 211 1 336 0.98(0.68-1.41) 9.16 10^-01 4 rs28455537 182348570 C T 0.14 407 1.13(0.8-1.59) 4.98 10^-01 407 1 138 1.26(0.85-1.86) 2.52 10^-01 4 rs10004651 182354194 G C 0.38 216 1.05(0.82-1.36) 6.89 10^-01 216 1 330 0.98(0.68-1.41) 9.08 10^-01 4 rs10021600 182361038 T C 0.39 208 0.83(0.64-1.08) 1.59 10^-01 208 1 339 0.82(0.57-1.17) 2.75 10^-01 4 rs10029643 182368609 C T 0.05 489 1.1(0.61-1.96) 7.54 10^-01 489 1 59 1.1(0.61-1.96) 7.54 10^-01 4 rs12645410 182396936 C G 0.40 199 1(0.78-1.28) 9.77 10^-01 199 1 343 1.08(0.74-1.56) 6.94 10^-01 4 rs9992143 182404816 T C 0.26 304 1.58(1.21-2.06) 6.92 10^-04 304 1 243 1.86(1.3-2.66) 6.23 10^-04 4 rs11930209 182410255 T C 0.40 200 0.92(0.72-1.18) 5.24 10^-01 200 1 345 0.99(0.69-1.43) 9.61 10^-01 4 rs61521238 182412628 T G 0.12 425 0.82(0.54-1.26) 3.67 10^-01 425 1 123 0.77(0.49-1.2) 2.45 10^-01 4 rs11727860 182416564 T C 0.40 195 0.85(0.66-1.11) 2.31 10^-01 195 1 352 0.82(0.57-1.17) 2.79 10^-01 4 rs1454704 182422712 C T 0.35 229 1.47(1.14-1.9) 3.05 10^-03 229 1 316 1.81(1.23-2.67) 2.61 10^-03 4 rs10019279 182435473 C T 0.21 334 2.04(1.56-2.67) 2.32 10^-07 334 1 209 2.64(1.84-3.8) 1.37 10^-07 4 rs12506088 182437732 T C 0.48 159 0.86(0.68-1.08) 1.98 10^-01 159 1 390 0.93(0.63-1.36) 7.04 10^-01 4 rs5012808 182440245 A C 0.20 352 2(1.52-2.63) 7.21 10^-07 352 1 196 2.46(1.72-3.5) 6.95 10^-07 4 rs6833861 182443881 T C 0.28 283 0.65(0.48-0.88) 5.84 10^-03 283 1 258 0.59(0.41-0.86) 5.56 10^-03 4 rs17241910 182444812 A G 0.19 352 2.13(1.6-2.84) 2.36 10^-07 352 1 191 2.49(1.74-3.55) 5.27 10^-07 4 rs28431436 182454221 G A 0.17 371 1.95(1.44-2.65) 1.60 10^-05 371 1 173 2.31(1.61-3.3) 4.64 10^-06 4 rs2309470 182459027 T C 0.50 143 0.94(0.74-1.2) 6.42 10^-01 143 1 402 1.16(0.77-1.77) 4.79 10^-01 4 rs17071070 182474991 G A 0.22 324 0.69(0.49-0.97) 3.49 10^-02 324 1 223 0.7(0.48-1.02) 6.19 10^-02 4 rs56191804 182485446 A G 0.10 445 0.67(0.41-1.1) 1.15 10^-01 445 1 101 0.68(0.41-1.14) 1.43 10^-01 4 rs6552489 182486495 A G 0.12 423 0.8(0.52-1.24) 3.24 10^-01 423 1 126 0.81(0.52-1.27) 3.57 10^-01 4 rs6842553 182492867 T A 0.22 325 0.68(0.48-0.96) 2.66 10^-02 325 1 218 0.7(0.48-1.03) 6.73 10^-02 4 rs7674604 182508874 A G 0.13 412 1.55(1.1-2.19) 1.32 10^-02 412 1 136 1.6(1.1-2.32) 1.47 10^-02 4 rs9990743 182510397 T C 0.45 158 0.96(0.75-1.25) 7.80 10^-01 158 1 388 0.96(0.65-1.41) 8.35 10^-01 4 rs2309462 182515050 C A 0.33 237 1.01(0.76-1.33) 9.65 10^-01 237 1 306 1.12(0.78-1.61) 5.35 10^-01 4 rs2871246 182516467 G C 0.46 153 0.97(0.75-1.25) 7.93 10^-01 153 1 392 0.96(0.65-1.42) 8.37 10^-01 4 rs6833454 182517615 T C 0.33 243 1(0.76-1.32) 9.91 10^-01 243 1 302 1.11(0.77-1.59) 5.82 10^-01 4 rs17246059 182521635 G A 0.24 305 1.17(0.87-1.57) 3.01 10^-01 305 1 244 1.24(0.87-1.77) 2.39 10^-01 4 rs10520477 182523806 C G 0.12 418 0.82(0.54-1.25) 3.61 10^-01 418 1 128 0.81(0.52-1.26) 3.49 10^-01 4 rs12647971 182525054 A G 0.21 340 0.78(0.55-1.1) 1.58 10^-01 340 1 209 0.74(0.5-1.09) 1.23 10^-01 4 rs17247032 182536590 C T 0.36 218 1.01(0.78-1.32) 9.22 10^-01 218 1 329 1.08(0.75-1.54) 6.90 10^-01 4 rs12647539 182540206 T C 0.22 339 0.77(0.56-1.04) 9.11 10^-02 339 1 209 0.71(0.49-1.04) 7.89 10^-02 4 rs12640265 182542109 C T 0.23 334 0.75(0.56-1.02) 7.04 10^-02 334 1 213 0.7(0.48-1.02) 6.26 10^-02 4 rs2309475 182546165 T C 0.50 144 1(0.78-1.28) 9.88 10^-01 144 1 403 0.91(0.62-1.35) 6.45 10^-01
- NCBI GEO database 상에공개된폐암환자의 microarray data (GSE31210) 을수집, 분석하였을때, Histone H3의 variant 중에하나인 H3F3A가 1기비소세포폐암의재발과밀접한관련이있는유전자로발굴되었음. 재발한환자군에서재발하지않은환자군보다통계적으로유의한수준으로더높은발현량을보임 ( 그림 18). 그림 18. 비재발군과재발군에서의 H3F3A 발현의차이 - GSE31210 의전체폐암환자군을 H3F3A 의발현량에따라두개의그룹으로나누고이들의 수술후생존예후를분석한결과발현이높은그룹에서통계적으로유의한수준으로생존율이 낮음을확인할수있음 ( 그림 19 왼쪽 ). - GSE31210의 1기폐암환자군만 H3F3A의발현량에따라두개의그룹으로나누고이들의수술후생존예후를분석한결과, 전체폐암환자군분석과마찬가지로발현이높은그룹에서통계적으로유의한수준으로생존율이낮음을확인할수있음 ( 그림 19 오른쪽 ). 즉, H3F3A의발현량이 1기폐암환자의생존율을예측하는바이오마커로서가치가있는것으로보임. 그림 19. H3F3A 발현량이폐암환자의생존율에미치는영향. ( 파란색 : H3F3A 의발현이낮은 그룹, 빨간색 : H3F3A 의발현이높은그룹 )
- 폐암세포주 (A549) 에서 H3F3A 를 overexpression 또는 knock-down 한후 invasion assay 를수행해본결과 H3F3A 가폐암세포의 invasion 을촉진하는역할을하는것으로판단됨 ( 그 림 20). 그림 20. 폐암세포주 (A549) 에서 H3F3A 를 overexpression (H3F3A-WT) 또는 knock-down - H3F3A 가조절하는표적유전자를찾기위해, 폐암세포주 (A549) 에서 H3F3A 를 overexpression 또는 knock-down 한후 microarray 분석을수행하였음 ( 그림 21). 그림 21. H3F3A 의 overexpression, knock-down 샘플의 microarray 분석
- 발현에차이를보이는표적후보유전자들을선별하여 Gene Ontology를분석해본결과암세포의 invasion에관련이많은 collagen metabolism에관계되어있음을알수있었으며, 이에포함된유전자들중 MMP9과같은암세포의 invasion에직접적인역할을하는유전자들이다수포함되어있었음. 즉, H3F3A는 MMP9과같은유전자들의발현을촉진시켜암세포의 invasion을촉진하는것으로판단됨 ( 그림 22). 그림 22. H3F3A 표적후보유전자들의 Gene Ontology 분석 - H3F3A 발현과밀접한상관관계를보이는표적후보유전자들만선별하여발현량을 qpcr 로 검증하였음. 검증결과이들은 H3FA 에의해서직접또는간접적으로그발현이조절되는표적유 전자임을확인할수있었음 ( 그림 23). 그림 23. qpcr 을통한표적유전자들의발현검증 - 검증된표적유전자들의임상적의미를알아보기위해, 앞서수집한 GSE31210 microarray 데 이터를이용해생존분석을수행하였음. 그결과표적유전자의대다수가환자의수술후생존율과 통계적으로유의한수준에서관련이있음을확인할수있었음 ( 그림 24).
그림 24. H3F3A 표적유전자의생존분석 ( 파란색 : 발현이낮은그룹, 빨간색 : 발현이높은그룹 ) - 표적유전자들중 GPR87는세포막수용체중하나인 G protein-coupled receptor의일종으로 small molecule이나항체, 앱타머등의표적치료제개발이가능하고, GREM1은세포밖으로분비되는단백질중의하나로항체나앱타머등의표적치료제개발이가능한 druggable target들이므로 sirna를통해그가능성을검증하였음. 그결과두유전자모두 invasion이감소되어향후저해제개발이가능함을알수있었음 ( 그림 25). 그림 25. 폐암세포주 (A549) 에서 GPR87 과 GREM1 을각각에대한 sirna 로 knock-down 한 후 invasion assay