대한수혈학회지 : 제 22 권제 2 호, 2011 5% DMSO 와자연냉동보존제를이용한말초혈액조혈모세포채집액의냉동보존 함지연 1 ㆍ손윤희 2 ㆍ서장수 2,3 경북대학교병원진단검사의학과 1, 경북대학교병원국제재생의학연구소 2, 칠곡경북대학교병원진단검사의학센터 3 = Abstract = Cryopreservation of Collected Peripheral Blood Hematopoietic Stem Cell Product with 5% DMSO by Adding Nontoxic Natural Cryoprotectants Ji Yeon Hamm 1, Yun-Hee Shon 2, Jang Soo Suh 2,3 Department of Laboratory Medicine 1, Joint Institute for Regenerative Medicine 2, Kyungpook National University Hospital, Center of Laboratory Medicine, Chilgok Kyungpook National University Hospital 3, Daegu, Korea Background: Cryopreservation of hematopoietic stem cells has become an important process due to the therapeutic protocol, which includes stem cell transplantation after chemotherapy, for many hematological malignancies. The conventional medium contains 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) as a cryoprotectant, but this has been reported to be related with many complications. We analyzed the usefulness of trehalose, catalase and zvad-fmk for cryopreservation along with using a reduced concentration of DMSO to 5%. Methods: Peripheral blood stem cells were frozen in 10% DMSO as a control and also in 5% DMSO with trehalose and catalase. After 3 weeks of storage in a liquid nitrogen tank, the viability of the thawed hematopoietic stem cells was measured using Trypan blue staining and 7-AAD analysis via conducting flow cytometry. The colony forming potential was assessed using methylcellulose culture. We measured the viability of cells in 5% DMSO medium with or without addition of 30 um zvad-fmk right after thawing, and we also did this 6 and 24 hours after incubation. Results: Cryopreserved cells in 5% DMSO with trehalose and catalase showed similar survival (50.42%) compared with the control (49.78%). The viability of cells that were also treated with added zvad-fmk showed a better result (13.12%) than without it (5.5%) after 24 hours of incubation. Colony forming assay showed similar colony formation in 5% DMSO with the natural cryoprotectants. Conclusion: According to the results, lowering the DMSO concentration to 5% is significant and we can expect better cell viability and prevent many side effects of high dose DMSO when adding natural cryprotectants in the cryopreservation medium or by adding caspase-inhibitor right after thawing. (Korean J Blood Transfus 2011;22:89-98) Key words: Cryopreservation, Hematopoietic stem cell, Trehalose, Catalase, zvad-fmk 접수일 :2011년 7월 7일, 수정일 :2011년 8월 12일, 승인일 :2011년 8월 12일책임저자 : 서장수 702-210 대구시북구호국로 807 칠곡경북대학교병원진단검사의학센터 TEL: 053) 200-3530, FAX: 053) 200-3309, E-mail: suhjs@knu.ac.kr 본연구는대구광역시 2011년도재생의학연구지원사업의지원에의하여이루어진것임. - 89 -
대한수혈학회지 : 제 22 권제 2 호 서론고용량의항암요법후조혈모세포이식술은이미백혈병, 형질세포골수종이나림프종등과같은여러혈액종양질환에서표준화된치료법으로널리사용되고있다. 이치료법에서특히자가이식을받는환자의경우조혈모세포를채집한후이식전에고농도항암화학요법을받고저장해두었던세포를주입하여야하므로그동안조혈모세포의냉동보관이필수불가결한중요한과정이되었다. 이식후조혈모세포의생착률에는이식한 CD34 양성인조혈모세포의개수와세포의생존율, 그리고해동된조혈모세포의기능유지여부가중요한요소로작용하는데여기에는조혈모세포의냉동보존시냉동속도등의냉동방법, 사용하는냉동보존제그리고해동하는방법등이큰영향을미칠수있다. 1) 냉동속도는조혈모세포의냉동과저장후세포생존율에큰영향을끼치는요인으로작용하기때문에최적화된속도로온도를내려주는프로그램화된냉동기계와변화되는환경에서세포손상을최소화할수있는냉동보존제를사용하게된다. 현재가장널리사용되고있는조혈모세포의냉동전처리과정은냉동보존제인 dimethyl sulfoxide (Me 2SO, DMSO) 를 10% 의농도로첨가하는방법이다. 대표적인냉동보존제로사용되는흡습성극성물질인 DMSO는세포내로침투하여물분자가세포외로배출되지않도록하여세포의탈수손상을막아주는역할을하게된다. 대부분의기관이 10% 농도의 DMSO를사용하고있고이렇게얼려두었던조혈모세포를급속히해동한후환자에게주입하는데실제적으로이방법으로는조혈모세포의생존율이 50 60% 정도밖에미치지못하며, 이때함께주입되는 DMSO 자체가농도가높아짐에따라인체에독성을나타내어이식 후환자에서심각한부작용을유발할수있다고익히알려져있다. 2) DMSO가인체에주입되었을때흔한구역, 구토, 복통외에도확률은낮지만신부전, 저혈압과부정맥등사망에까지이를수있는치명적인부작용도일으킬수있다는보고가있으며이러한부작용의정도는주입되는 DMSO의양과상관관계가있다고알려져있다. 3) 그러므로세포냉동보존시들어가는 DMSO의양을줄이면서도 10% DMSO를사용하였을때와세포생존율은동일하거나혹은더향상시킬수있는더개선된냉동보존법을찾는것이필요하게되었다. 이당류인 trehalose는자연에존재하는독성없는냉동보존제로서냉동시탈수현상이일어날때세포막안정제로작용을하는데이것은자연에서생물이극한의온도와탈수에 trehalose의축적으로견디어내는것으로부터발견된후조혈모세포의냉동보존에도첨가하는연구가이루어지고있다. 4-7) Limaye와 Kale 8) 은조혈모세포의냉동보존에 trehalose가효과적이라고보고하였으며, Buchanan 등 9) 은독성이없는 trehalose를이용하여냉동보존을하였을때 DMSO를이용한경우와별차이가없어 trehalose만을이용하여냉동보존을시도하여 DMSO로인한독성을없앨수있으리라기대하였다. Scheinkönig 등 10) 은골수와말초조혈모세포의집락형성능유지에 trehalose 와그것의흡수를돕는 insulin 첨가가도움이된다고보고하였다. 세포생존율을떨어뜨리는또하나의중요한요인으로는냉동시형성되는산소유리라디칼의산화작용을들수있는데이러한산화작용을막아주기위하여냉동보존시항산화제사용이대두되었으며 Limaye 등 11) 은 catalase와같은항산화제를냉동보존제에첨가하여나은생존율을보고하여조혈모세포의냉동보존에첨가시유용하리라생각되었다. 또한모세 - 90 -
5% DMSO 와자연냉동보존제를이용한말초혈액조혈모세포채집액의냉동보존 포의해동시에 caspase로인한세포자멸사가유도되는것이밝혀지면서 12,13) caspase-inhibitor를다른냉동보존제와섞어사용할수있다면해동시발생하는세포자멸사를막아주어세포생존율을더욱높일수있을거라기대할수있다. 이에저자는기존에 10% 의고농도로사용되고있는 DMSO의양을 5% 로줄여채집한조혈모세포를환자에게주입시고농도의 DMSO로인해발생할수있는부작용을낮추면서조혈모세포의생존율은유지혹은높일수있도록하기위하여 trehalose와 catalase를첨가하는것이효과적인지알아보았다. 또한해동시 pan-caspase-inhibitor인 Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) fluoromethylketone (zvad-fmk) 를첨가하여그유용성을확인하였다. 1. 대상 대상및방법 2011년 2월부터 3월까지경북대학교병원혈액종양내과에조혈모세포채집을위해내원한형질세포골수종환자 1명, 림프종 1명과건강한동종공여자 2명에서동의서를받은후말초조혈모세포를채집하였다. 수집한말초조혈모세포는대상자 4명에서채집한총 6예였다. 2. 채집및냉동보관 대상자에게과립구집락자극인자를투여해말초로조혈모세포를가동시킨후자가이식환자인경우는백혈구수치가 3.0 10 9 /L을넘을때 CS-3000+ (Fenwal Inc., Lake Zurich, IL, USA) 으로, 동종이식공여자인경우는과립구집락자극인자주사를맞고 3일정도지난후 Cobe Spectra (CaridianBCT Inc., Lakewood, CO, USA) 로수집을 시작하였다. 채집한세포수를확인한후 1 10 7 개의세포만큼의용량을따로원심분리하여 Rosewell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI 1640 medium, Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 에재부유하였으며하나의 cryotube 당총 100 ul, 그안에 1 10 6 개의세포가분주되도록하였다. 10%, 5%, 2가지의 DMSO (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 농도를비교하기위하여농도별로 DMSO 양을조절하여기본배지 RPMI 와섞어배지를만들었으며해동후실험을위하여각농도당 3개씩 cryotube를만들었다. Trehalose (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 와 catalase (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 첨가없이 10% DMSO와기본배지인 RPMI 를넣은것을대조군으로비교하였다. 5% 로 DMSO 농도를맞춘 cryotube에는 DMSO를줄이는대신 RPMI를넣어주고일정양의 trehalose와 catalase를첨가하여총용량을 1 ml로모두동일하게만들었다. 세포를 tube마다분주하자마자적정속도로온도를내리는 programmed freezer에즉시넣어 90 o C까지온도를떨어뜨린뒤 156 o C 온도를유지하는액체질소냉동고에 3주간저장하였다. 3. 해동냉동되었던조혈모세포를 37 o C 수조에넣어주어재빨리해동시켜눈으로보아얼음결정이없어졌을때각 DMSO 농도별로세포를모아 RPMI 3 ml를더해 1,500 rpm으로 5분간원심하고침전된세포를 RPMI에재부유하였다. 5% DMSO 농도는두그룹으로나누어 caspase-inhibitor인 zvad-fmk (R&D systems Inc., Minneapolis, MN, USA) 를한그룹에만해동시키자마자 30 um을넣어주었다. 해동후시간이지남에따라 caspase-inhibitor를넣어준그룹과아닌그룹의세 - 91 -
대한수혈학회지 : 제 22 권제 2 호 Table 1. The composition of three different cryopreservation media DMSO Trehalose Catalase zvad-fmk (%) (m mol/l) (mg/ml) (μm) 1 10 0 0 0 2 5 60 100 0 3 5 60 100 30 포생존율비교를위하여 3가지의냉동보존제조합표를만들어그대로시행하였다 (Table 1). 4. 세포생존율확인 처음에넣은총 3 10 6 개의세포중에서생존단핵구의측정은 Trypan blue (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 로염색한다음 Hemocytometer (Marienfeld GMBH & Co., Lauda- Königshofen, Germany) 를이용하여계산하였다. 또한 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, Beckman Coulter Inc., Marseille, France) 로염색하여유세포분석기 (FACSCalibur, Becton Dickinson Co., San Jose, CA, USA) 를이용하여각농도간의세포생존율을측정하여냉동후 DMSO 농도에따른해동직후세포생존율을비교하였다. 또한 5% DMSO 배지에넣어준세포는 caspase-inhibitor인 zvad-fmk를넣어준것과아닌것모두 37 o C, 5% CO 2 배양기에넣어 6시간, 24시간지난뒤세포생존율을 Trypan blue 염색과 7-AAD 염색으로측정하여 % 로확인하였다. 5. 집락형성능의측정 DMSO 농도별로해동후에검체중 3 10 5 개의세포농도로나누어배지에각각섞어주었다. 2% fetal bovine serum이함께첨가된 Iscove Modified Dulbecco s Medium (Iscove MDM medium, Stem cell technologies Inc., Suite, Vancouver, Canada) 과반고체상태의배지인 Methocult H4230 methylcellulose medium (Stem cell technologies Inc., Suite, Vancouver, Canada) 을 1:4로섞어서세포가자랄수있는적합한점도로만들어준다음그배지에집락형성이잘될수있도록성장인자 human stem cell factor 50 ng/ml (h-scf, R&D Systems Inc., Lille, France), granulocyte colony stimulating factor 20 ng/ml (G-CSF, R&D Systems Inc., Lille, France), granulocyte macrophage colony stimulating factor 20 ng/ml (GM-CSF, R&D Systems Inc., Lille, France), interleukin-3 20 ng/ml (IL-3, R&D Systems Inc., Lille, France), interleukin-6 20 ng/ml (IL-6, R&D Systems Inc., Lille, France), erythropoietin 20 U/mL (EPO, Eprex, Jassen-Cilag, Issyles-Moulineaux, France) 를모두넣어섞어주었다. 배지 3.3 ml에각농도에맞게세포를풀어주고 6-well dish에서 3개의 well에분주후 37 o C, 5% CO 2, 습윤한환경에서 14일간배양하였다. 도립현미경으로형성된집락의수와모양을관찰하였는데 50개이상의세포가모인경우에집락형성으로간주하였으며집락형성단위수를 3개의 well에서모두세어하나의 well 당평균값을구하여두 DMSO 농도별로비교하였다. 6. 통계통계분석프로그램은 SPSS version 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를사용하였고자료는평균값 ± 표준편차로표현하였다. 평균값은 paired t-test로비교하였다. P 값이 0.05 미만인경우에통계적으로유의하다고판단하였다. - 92 -
5% DMSO 와자연냉동보존제를이용한말초혈액조혈모세포채집액의냉동보존 결과 1. 세포생존율 Trypan blue exclusion test와유세포분석기를사용한 7-AAD 염색법으로각군에따른세포생존율을측정하였다. Trypan blue exclusion test로측정한세포생존율은 trehalose와 catalase를첨가한 5% DMSO의냉동보존제조합에서평균 50.42% 를보였고, 10% DMSO만사용하여냉동보관한대조군에서는평균 49.78% 로두군간에서로통계학적으로유의한차이를보이지않았으며 (Fig. 1) 7-AAD로측정한생존율도이와유사한결과를나타내었다. 5% DMSO에 trehalose, catalase를넣은세포를해동할때 zvad-fmk를첨가해준경우와첨가하지않은경우의시간에따른세포생존율을비교하였는데 6시간배양후결과는 15.8% 과 14.9% 로유의한차이가없었지만, 24시간배양후확인한세포생존율은 zvad-fmk를 첨가해준경우에서 13.12% 로첨가해주지않은경우의 5.5% 와통계학적으로유의한차이를보이는 (P<0.05) 더높은생존율을보였다 (Fig. 2). 2. 집락형성능비교 Iscove MDM과 Methocult 배지에성장인자를더해주어 14일동안 37 o C, 5% CO 2 인환경에서배양하고난후에 DMSO 10% 와 5% 농도에서각각형성된집락의모양과그수를두증례에서확인하였다 (Fig. 3). 첫번째증례의경우에서 10% DMSO 배지에서는집락이형성되지않은것에비해 5% 배지에 trehalose와 catalase를넣어준그룹에서는평균 6개가관찰되었으며, 두번째증례에서는기준이되는그룹인 10% DMSO 그룹에서와 5% 그룹에서동일하게평균 8개씩형성된집락을관찰할수있었다 (Table 2). Fig. 1. After 3 weeks of freezing, post thaw cell viability of conventional 10% DMSO medium (48.78%) and 5% DMSO with trehalose and catalase (50.42%) showed similar results using Trypan blue exclusion test. Fig. 2. The cells in medium of 5% DMSO with trehalose and catalase were divided into two groups and one of them was added with zvad-fmk right after thawing. The viability of cells with zvad-fmk showed better survival than without it especially after 24 hours of incubation. - 93 -
대한수혈학회지 : 제 22 권제 2 호 Fig. 3. Formed various colonies were checked by inverted microscopy after incubation in methylcellulose medium with many growth factors and cytokines. (A) Colonies after 7 days incubation, (B) Colonies after 14 days incubation (Inverted microscopy, unstained, 100). Table 2. Average number of formed colonies after colony forming assay No. case 10% DMSO 5% DMSO with trehalose, catalase 1 0 6 2 8 8 고찰 조혈모세포의이식은고용량항암화학요법및전신방사선조사에따른골수부전을회복시키기위하여미리채집해두었던자가모세포혹은건강한공여자로부터얻은조혈모세포를주입하는치료이다. 2) 조혈모세포의냉동보관법이성공함으로써 1958년처음으로자가골수이식이시행되었고자가말초혈액조혈모세포이식이개발되어임상에사용된이후, 자가조혈모세포이식은 혈액종양치료에있어서중요한치료법으로자리잡게되었다. 1) 이치료방법이여러혈액종양질환에있어서가장효과적이라여겨지면서점점더많은환자를대상으로널리쓰이고있기때문에조혈모세포를채집후이식전에가장적절한방법으로냉동보존시키는것이치료의아주중요한단계가되었다. 조혈모세포를냉동시킬때는너무느린속도로냉동하면너무많은물이세포내에서빠져나와세포외얼음결정을형성하여세포에탈수손상을입히고그와반대로너무빠른속도로냉동하게되면물이너무적게빠져나가세포내얼음결정형성으로세포막이파열되는등으로세포가손상되기때문에자동냉각장치를이용하여온도를떨어뜨린후 150 o C 보다낮은액체질소탱크에보존하는방법이가장널리사용되고있다. 해동시에는세포내외의삼투압차이를적게하면서얼음결정의재형성을방지하기위하여가급적빠른것이좋다고알려져 - 94 -
5% DMSO 와자연냉동보존제를이용한말초혈액조혈모세포채집액의냉동보존 37 o C 수조에넣어급속해동하는것이표준방법으로사용되고있다. 자연에서생물들은극한의온도와탈수상태에도생존할수있는능력을갖고있는데이러한현상을 anhydrobiosis라고하며이것은모세포를냉동보존시모세포에일어나는탈수현상과유사하다고알려져있다. 자연생물체에서이러한환경에서의생존능은 trehalose의축적으로이뤄지는것이밝혀지면서최근에는조혈모세포를냉동보존시키는데독성없는자연냉동보존제로서의 trehalose의사용을고려하게되었다. 5-7) 10% DMSO 농도를이런자연냉동보존제를첨가하여 5% 로낮추어실험한보고는없어본실험과직접비교할수는없었지만 Limaye와 Kale 8) 은조혈모세포의냉동과정중일어나는탈수과정에의한손상을막기위하여세포막안정화제로서 trehalose를첨가해주었을때기존의 10% DMSO만사용하여냉동보존시킨것과비교하여집락형성능결과가월등히더좋았다는것을보고하였다. 또한냉동보존중유리되는산소라디칼을제거해주는 catalase는 ascorbic acid, alpha-tocopherol과같은자연에존재하는독성이없는항산화제들중가장냉동보존효과가좋았다고보고되었으며조혈모세포의냉동보존시기전이서로다른 trehalose와함께사용하였을경우첨가하지않은것보다조혈모세포의회복율을빠르게하였다는보고도있다. 8,14) 그외에도세포의냉동손상원인중특히해동과정중에 caspase 내인통로로작용하는 caspase-9와외인통로로작용하는 caspase-8의활성화가일어나유도되는세포자멸사가중요한것으로밝혀짐에따라 5,12) caspase-inhibitor를냉동보존시혹은해동시첨가해주어생존율을높이고자하는노력이지속되고있는데그독성에관한연구는아직까지미흡하므로더필요하다. 이렇게조혈모세포가포함된혈액은냉동방법이나해 동그리고냉동보존제에따라서세포생존율이나이식능이현저히달라질수있기때문에혈액종양환자에서항암화학요법후이식을위한조혈모세포의냉동보존에있어서가장적합한방법에대한연구가활발하게진행되고있다. 본연구는혈액종양환자에서채집한조혈모세포를냉동보관후해동하였을때세포생존율의향상과 DMSO가주입되는양에따라나타날수있는부작용을줄일수있도록하기위하여시행되었다. 가장널리사용되는 10% DMSO 냉동보존제를사용할때보다 DMSO의양을 5% 로줄여이식후고용량의 DMSO 주입으로인한환자의부작용을낮추면서도세포생존율은유사하거나혹은더높게나타날수있도록 DMSO 함량을낮춘대신독성이없는자연냉동보존제인이당류 trehalose와항산화제인 catalase를첨가하여세포생존율을비교하였다. 10% DMSO를넣은경우를기준군으로삼았을때 5% DMSO에 trehalose, catalse를첨가한경우가거의비슷한세포생존율을보여 5% 로 DMSO 농도를낮추어냉동보존하여발생가능한부작용을줄일수있을거라생각되었다. 또한해동시진행되는세포자멸사를막아주기위하여 zvadfmk를 5% DMSO를이용하여냉동한세포를두그룹으로나누어그중한그룹에만해동시첨가하여해동하자마자, 6시간이지난후그리고 24 시간후의세포생존율을확인하고비교하였다. 세포생존율을 Trypan blue exclusion test와 7- AAD 염색으로두번확인하였으며그결과 5% DMSO에서 caspase-inhibitor를넣어준후 6시간이지났을때의세포생존율은두그룹간에별차이가없었지만 24시간후세포생존율을확인하였을때는같은농도에서첨가하지않은경우보다확실히증가하는것을확인할수있었다. 또한 6 시간, 24시간에서모두대조군보다는더나은세 - 95 -
대한수혈학회지 : 제 22 권제 2 호 포생존율을보였다. 집락형성능도 5% DMSO인경우에서 10% 농도와비교하여 3개의 well에서세어평균을낸집락수가동일하거나더많이형성되어두군의차이를확인할수있어세포생존율의결과와일맥상통하는소견으로생각할수있었다. 이러한실험의결과로미루어볼때독성이없는자연냉동보존제로 trehalose를이용하여세포막을안정화시켜탈수손상을줄여주고항산화제인 catalase로산소유리라디칼을막아주는것만으로도 DMSO 농도를기존에사용하던 10% 에서 5% 로줄이는것이가능하다고사료되며더불어아직인체에유해한영향에관하여더연구되어야하지만세포해동시 caspase-inhibitor인 zvad-fmk를첨가하여세포자멸사를늦추어주면같은 5% 농도에서라도첨가하지않은경우보다 24시간후에는세포생존율을더높은것이확인되어 DMSO의용량을줄이는것과더불어해동후더높은세포생존율을기대할수도있겠다. 이렇게세가지각기다른기전의냉동보존제를사용하여기존에 10% 의농도로사용하고있는 DMSO의양을낮추어고용량의 DMSO가주입되어환자에게발생할수있었던여러가지부작용을감소시키면서도주입되는조혈모세포의생존율을좀더높일수있으리라기대된다. 해동후확인한세포생존율이 10% DMSO 군만을비교해보았을때, 대체로 50 60% 라는보고도있지만실제로조혈모세포를냉동보존후해동하여확인한경험이나평균적으로 70 80% 정도라발표한다른보고를고려해보면전반적으로낮게측정됨을알수있었다. 1,2) Reich-Slotky 등 15) 은조혈모세포의냉동보존후이식하였을때 CD34 양성인세포의생존율이단핵구의생존율보다채집된세포의더정확한질을반영한다고밝히면서그연구에서확인한결과 CD34 양성인조혈모세포의생존율은 86.4% 로높게확인된 데반해전체적인단핵구의생존율을확인하였을때는 74.0% 나 57.0% 로더낮게측정되어단핵구의생존율측정만으로는채집된조혈모세포의생존율과이식능을정확히예측할수없음을알수있었다. 본실험에서는채집한단핵구의전반적인생존율을확인하고 CD34 양성인세포만의해동후생존율을추가적으로확인하지못해정확한비교가어려운점이있고채집액의 CD34 양성세포수가적은경우가많아이실험만으로는 CD34 양성인세포수회복율의비교를할수없는한계점이있다. 또한보존액의구성에서동물혈청에서유리되는단백을철저히배제하기위하여 fetal bovine serum (FBS) 를넣지않았고그외에도추가로자가혈장을넣어주지않은것이나하나의 cryotube 당세포의수선정등실험의조건중에문제점이있어전체적인생존율이낮게측정되었을가능성도배제할수없어앞으로최적화된보존액의구성과추가적인연구등의개선이필요하리라생각된다. 요약배경 : 항암요법후시행하는조혈모세포이식술이여러혈액종양질환에서표준화된치료법으로널리사용되면서조혈모세포채집후이식전냉동보존이꼭필요한과정이되었다. 대부분 10% DMSO를냉동보존제로사용해왔지만주입되는 DMSO의양이많아다양한부작용이문제시되어 DMSO 농도를줄이는대책이필요하다. 최근냉동보존제로자연계에존재하는세포막안정제 trehalose, 산화억제제 catalase나세포자멸사를억제하는 zvad-fmk의첨가로더적은 DMSO 로더나은생존율이보고되었다. 이에 DMSO를기존 10% 에서 5% 로줄이면서위의보존제를더하여 DMSO로인한부작용을줄이면서도좋은 - 96 -
5% DMSO 와자연냉동보존제를이용한말초혈액조혈모세포채집액의냉동보존 생존율을얻을수있는지알아보았다. 방법 : 환자의조혈모세포를말초로유리시켜채집하고세포는 10% DMSO 배지외, trehalose와 catalase를첨가해 DMSO 농도를 5% 로낮춘것에도냉동시켜 3주간보관하였다. 해동후세포생존율은 trypan blue와 7-AAD 검사로확인하고 Methylcellulose에 2주간배양하여집락형성능을확인하였다. 결과 : 해동후세포생존율은 trypan blue와 7-AAD 로확인한결과 trehalose, catalase 를첨가한 5% 에서 50.42%, 10% DMSO의 49.78% 와유사한결과를보였다. 해동시 zvad-fmk를첨가해주고 24시간배양후세포생존율이 13.12% 로첨가하지않은경우의 5.5% 보다더높았다. 결론 : 자연보존제의첨가로기존에사용하던 DMSO를 10% 에서 5% 로낮추어냉동보존할수있으며해동시 zvad-fmk를첨가해주어더나은조혈모세포생존율을기대해볼수있으리라사료된다. 참고문헌 1. Jang SJ, Park E, Park SB, Jung SK, Kim HS, Kang CM. Viability and colony forming capacity of hematopoietic stem cells after cryopreservation. Korean J Pediatr Hematol Oncol 2001;8:298-304 2. Lee HK, Ryu KH, Whang IT, Kang ES, Hong KS, Kim KH, et al. The improvement of cell viability due to dilution and removal of DMSO in thawing of stem cells. J Korean Pediatr Soc 2000;43:241-6 3. Fleming KK, Hubel A. Cryopreservation of hematopoietic and non-hematopoietic stem cells. Transfus Apher Sci 2006;34:309-15 4. Patist A, Zoerb H. Preservation mechanisms of trehalose in food and biosystems. Colloids Surf B Biointerfaces 2005;40:107-13 5. Sasnoor LM, Kale VP, Limaye LS. Supplementation of conventional freezing medium with a combination of catalase and trehalose results in better protection of surface molecules and functionality of hematopoietic cells. J Hematother Stem Cell Res 2003;12:553-64 6. Sasnoor LM, Kale VP, Limaye LS. A combination of catalase and trehalose as additives to conventional freezing medium results in improved cryoprotection of human hematopoietic cells with reference to in vitro migration and adhesion properties. Transfusion 2005;45:622-33 7. Sasnoor LM, Kale VP, Limaye LS. Prevention of apoptosis as a possible mechanism behind improved cryoprotection of hematopoietic cells by catalase and trehalose. Transplantation 2005;80:1251-60 8. Limaye LS, Kale VP. Cryopreservation of human hematopoietic cells with membrane stabilizers and bioantioxidants as additives in the conventional freezing medium. J Hematother Stem Cell Res 2001;10:709-18 9. Buchanan SS, Gross SA, Acker JP, Toner M, Carpenter JF, Pyatt DW. Cryopreservation of stem cells using trehalose: evaluation of the method using a human hematopoietic cell line. Stem Cells Dev 2004;13:295-305 10. Scheinkönig C, Kappicht S, Kolb HJ, Schleuning M. Adoption of long-term cultures to evaluate the cryoprotective potential of trehalose for freezing hematopoietic stem cells. Bone Marrow Transplant 2004;34:531-6 11. Limaye LS. Bone marrow cryopreservation: improved recovery due to bioantioxidant additives in the freezing solution. Stem Cells 1997;15:353-8 12. Xu X, Cowley S, Flaim CJ, James W, Seymour L, Cui Z. The roles of apoptotic pathways in - 97 -
대한수혈학회지 : 제 22 권제 2 호 the low recovery rate after cryopreservation of dissociated human embryonic stem cells. Biotechnol Prog 2010;26:827-37 13. Berz D, McCormack EM, Winer ES, Colvin GA, Quesenberry PJ. Cryopreservation of hematopoietic stem cells. Am J Hematol 2007; 82:463-72 14. Zhang XB, Li K, Yau KH, Tsang KS, Fok TF, Li CK, et al. Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-scid repopulating cells. Transfusion 2003;43:265-72 15. Reich-Slotky R, Colovai AI, Semidei-Pomales M, Patel N, Cairo M, Jhang J, et al. Determining post-thaw CD34+ cell dose of cryopreserved haematopoietic progenitor cells demonstrates high recovery and confirms their integrity. Vox Sang 2008;94:351-7 - 98 -