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정헌 견
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1 대한임상검사학회지 : 38 권제 1 호, 9-15, 2006 말초혈액조혈모세포채혈및이식후생착에관한연구 을지의과대학교임상병리과 1 충남대학교병원진단검사의학과 2 충남대학교의과대학 3 손계성 1 권흥만 2 권계철 3 A Study of Peripheral Blood Stem Cell Collection and Bone Marrow Engraftment after Peripheral Blood Stem Cell Transplantation Gye-Sung Son, 1 Heung-Man Kwon, 2 and Gye-Cheol Kwon 3 Department of Clinical Laboratory Science, Eulji University, Daejeon , Korea 1 Department of Laboratory Medicine, Chungnam University Hospital, Daejeon , Korea 2 College of Medicine, Chungnam National University, Daejeon , Korea 3 Peripheral bood stem cell collection (PBSCC), including peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT), has been utilized worldwide as a very beneficial treatment method instead of allogenic Bone Marrow Transplantation (BMT) because it has many advantages such as rapid bone marrow engraftment and hematopoietic recovery, easy and safe accessibility and lower risk of rejection compared with allogenic BMT. In order to identify most the observable parameter in PBSCC, we analyzed various hematological parameters before and after PBSCC, and evaluated the correlation between the time of bone marrow engraftment and the number of CD34+ cells. Thirteen patients, who underwent 54 PBSCCs from January, 2003 to August, 2004 at Chungnam National University Hospital due to various systemic neoplasms, were analyzed in aspects of various hematological parameters including CD34+ cells using by Flow Cytometry (FCM). PBSCC harvests are described below: Mononuclear cells (MNC) 2.3 ± /kg and CD34+ cells 0.63 ± /kg on average, respectively. There was a statistical significance in Hb and Hct before and after PBSCC, but not in WBC and platelet counts. The period to reach the hematological bone marrow engraftment was 13.4(10~21) days and 19.5(11~38) days according to the criteria of absolute neutrophile counts (ANC) 500/uL and platelet counts 50,000/μL in peripheral blood, respectively. There was a significant correlation between the numbers of CD34+ cell and ANC (p<0.05), and a borderline significance between MNC and ANC (p=0.051). We found that a group of patients, who were infused with CD34+ cells more than /kg, reached more rapidly the period of bone marrow engraftment in platelet counts (p=0.040). This present study suggested that Hb and Hct were the most useful parameters and should be closely monitored before and after PBSCC, that a PBSCT with the dosage of more than /kg of CD34+ cells was needed to perform successful bone marrow engraftment, and additionally that platelet counts could be more useful in indicating bone marrow engraftment than ANC. Key Words : Peripheral Blood Stem Cell Collection(PBSCC), Peripheral Blood Stem Cell Transplantation(PBSCT), Bone Marrow Tranplantation(BMT), Mononuclear Cell(MNC), Absolute Neutrophile Count(ANC) 1) 교신저자 : 손계성, ( 우 ) 대전광역시중구용두동 143-5, 을지의과대학교, 임상병리학과. Tel : , gsson44@lycos.co.kr 9

2 I. 서론 최근다양한혈액종양환자와고형암환자치료에있어서 1990년대고안된말초혈액조혈모세포이식법과고용량의항암제요법이임상에적용되어자가조혈모세포이식건수가급격하게늘었다 ( 김, 1996). 국내에서도백혈병, 림프종, 위암, 다발성골수종등의환자에서말초혈액조혈모세포이식이많이시행되어왔다 ( 민등, 1995; 김등, 1996; Kim 등, 1997). 말초혈액조혈모세포이식술은고용량의항암요법을받고있는환자에서자가및동종조혈모세포공급원으로중요하며, 기존의동종골수이식에비해안전하고, 이식후골수의생착이빠르고, 비교적채집이용이하고, 조혈기능회복이빨라서, 골수이식을대체하여널리시행되어지고있다 (Liberti 등, 1994; Demuynck 등, 1995). 말초혈액조혈모세포는 G-CSF(granulocyte-colonystimulating-factor) 나화학요법등으로조혈모세포를가동화한후반복적인백혈구성분채집술을시행하여채집하게되는데최소한의백혈구성분채혈을시행하기위해서는최대로가동화된시기를예측하는것이중요하며, 이식후생착시기를예측하는것이환자의예후에매우중요한것으로알려져왔다. 말초혈액조혈모세포채혈은채혈시기, 채혈방법및채혈자에따라그양이달라질수있는데가동화시기의예측인자로는과거로부터 CFU-GM(colony-forming unitgranulocyte monocyte) assay가널리사용되어왔으나고가의비용이들고 2주이상의시간이소요되며표준화가어려운단점이있다 (Keung 등, 1996; Schwella 등, 1996; Remes 등, 1997; Brown 등, 1997; Humpe 등, 1997; Suzuki 등, 1998). 이에채혈을시작하는시점과채집기간을결정하기위한여러지표중가장적절한것을선택하기위한연구가진행되어왔고 (Schwella 등, 1995; Schwella 등, 1996; Elliott 등, 1996), 이인자로말초혈액내백혈구수, 단핵구수, CD34+ 세포수측정이유용하며, 이중유세포분석기에의한 CD34+ 세포수측정이객관적이고재현성이좋으며단시간에분석할수있는방법으로알려져있다 (Remes 등, 1997; Brown 등, 1997; Humpe 등, 1997; Suzuki 등, 1998). 이에본연구는말초혈액내백혈구수, 단핵구수, 혈소판수등의여러인자를분석하여어떤인자가채집에유용한지를알아보고말초혈액조혈모세포채혈시행전, 후 를비교하고말초혈액조혈모세포이식후 CD34+ 세포수와골수생착시기와의상관관계를분석하여 CD34+ 세포수의임상적유용성을알기위해본연구를시행하였다. II. 재료및방법 1. 대상및기간충남대학교병원에서 2003년 1월 1일부터 2004년 8월 31일까지 54회의말초혈액혈모세포채혈술을이식받은 13명을대상으로하였다. 13명의성별은남자 10명 (76.9%), 여자 3명 (23.1%) 이였으며, 나이는평균 43세 (19 ~60) 이었고, 분포는각각 20세이하 1명 (7.8%), 21~40 세 3명 (23.0%), 41~60세 9명 (69.2%) 이었다. 진단명은급성골수구성백혈병 4명 (30.8%), 림프종 6명 (46.1%), 다발성골수종 3명 (23.1%) 이었다. 2. 방법 1) 말초혈액조혈모세포채혈말초혈액조혈모세포채집은성인의경우백혈구가최하수치까지내려갔다가다시증가하기시작하여절대호중구수 (ANC;Absolute Neutrophil Count) 가 500/μL 이상된다음날시작하였다. 연속적성분채집기인 Fenwal CS-3000 Plus(Baxter Healthcare corp, IL, USA) 의 GSC(Granulocyte Separation Chamber) 과 collection chamber에 A-35 또는 SVCC(Small Volume Collection Chamber) 를장착하여총 54회시행하였다. 환자의중심정맥에서삽입화된관, double lumen catheter(glsh biomedical inc. lrvine, USA) 을이용하여 30~50 ml/min의혈류속도로채집하였으며전혈과항응고제의비율은 10~11:1로 interphase offset detector는 100~150으로설정하였다. 항응고제는 ACD(acid citrate dextrose) 용액을사용하였고총혈액량의 3배이상을처리하는대용량백혈구성분채혈을시행하였다. 채집된조혈모세포 CD34+ 세포수가 2.0~ /kg 이상인경우를목표채집량의성공여부를판단하는기준치로설정하였다 ( 우등, 2000). 채집된말초혈액조혈모세포는원심분리후세포수가 /ml이하가되도록자가혈장과 10% Dimethylsul- 10

3 foxide(dmso, Cryoserv, Research Industries, Co, Salt Lake USA) 의혼합액에 1:1로부유시킨후, cell freezing system(cry med 1010 Inc, USA) 에서분당 1 씩감소시키면서 -196 의액체질소에동결저장시켰다. 해동할때에는이식할조혈모세포를약 2시간정도 vapor phase에대기시킨후 37.5 의진동수조에서재빨리녹여한꺼번에정맥주사하거나수혈세트를이용하여 5분이내에투과시켜이식하였다. 2) 말초혈액조혈모세포채혈술전, 후검사방법말초혈액조혈모세포채혈술실시전에환자의검체를 EDTA(Vacuette Greiner Bio-one, Austria) 용기에채혈하여자동혈구계산기인 SE-9000(Sysmex Co Kobe, Japan) 으로환자의백혈구수, 혈소판수를측정하였다. 또한검체를유리슬라이드에도말한후자동염색기인 Sysmex SP-100(Sysmex Co) Kobe, Japan 으로 Wright 염색을시행하여수기적백혈구감별계산을시행하여림프구와단구를합하여단핵세포의백분율을구하였다. 말초혈액조혈모세포채혈술완료후채집백에서 EDTA 용기에검체 1mL를채취한후, 0.85% saline으로 10배로희석하여 SE-9000으로백혈구수, 혈소판수를측정하였고, 동일한방법으로백혈구감별계산을시행하였다. CD34+ 세포수는 54검체에서측정하였는데 Beckman- Coulter Stem-kit CD34+ Hema-topoietic Progenitor Cell(HPC) Enumeration kit(beckman-coulter, USA) 를이용하여유세포분석기 (flow cytometry) 인 COULTER (EPICS XL, USA) 으로검사하여, Lysis 프로그램으로분석하였고, 전체단핵구중 CD34+ 세포의비율을측정하였다. 3) 말초혈액조혈모세포이식후골수생착속도말초혈액조혈모세포이식후환자들의기록이남아있는 10명에대해서절대호중구수 (ANC; Absolute neutrophil count) 가 500/μL 이상을회복된경우로정의하였고, 연속 3일간혈소판수가 50,000/μL 이상인경우를혈액학적회복으로정의하였다 ( 황등, 2000). 4) 통계및분석통계적분석은 SPSS version 10.0을이용하여말초혈액조혈모세포채혈술전, 후의상관관계및이식후 CD34+ 세포수에따른골수생착시기를상관관계및 T-test, ANOVA 분석을통하여검증하였고 p < 0.05 인경우를 통계적으로유의성이있다고판단하였다. III. 결 과 1. 말초혈액조혈모세포채혈산물의세포분석 말초혈액조혈모세포 1 회채집된평균양은 61.3 ml(47 ~110) 이며, 채집횟수는평균 4회 (1~6) 이었다. 채집된환자의총단핵구수는평균 2.6 ± /μl(0.1~5.7) 이었으며환자몸무게로환산하면 2.3 ± /kg(0.05~ 5.89) 이었다. 또한총 CD34+ 세포수는 33.8 ± 20.1/μL(1.6 ~107.6) 이며환자몸무게로환산하면 0.63 ± /kg (0.03~2.03) 이었으며, CD34+ 세포수와단핵구수의상관관계는통계학적으로유의하였다 (Table 1). Table 1. Amount of MNC and CD34+ in PBSCC harvests (n=54) PBSCC * harvest Parameters Per Patient Total Body Weight MNC 2.6 ± 1.5/μL 2.3 ± /kg CD ±20.1/μL 0.63 ± /kg p-value *PBSCC, peripheral blood stem cell collection; MNC, mononuclear-cell p-value; cμorrelation 1) 이식된환자의세포수양 말초혈액조혈모세포채집후채집된 CD34+ 세포수는 이상이 6명 (60.0%) 으로나타났으며, 최소한생착에필요한최소세포수인 이상인경우는 7명 (70.0%) 이었다 (Table 2). Table 2. Number of patients according to CD34+ cell yields CD34+cell/kg Number of patients(%) 0.1~ (30.0) 1.00~ (10.0) 2.00~ (20.0) 3.00~ (10.0) 4.00~ (20.0) > (10.0) Total 10(100.0) 11

4 Table 3. Number of patients according to MNC yields MNC * /kg Number of patients (%) < (70.0) 10.0~ (20.0) 20.0~ (10.0) Total 10(100.0) *See Table 1 말초혈액조혈모세포채혈후 MNC 수는환자체중당 1~ 이상이 10명 (100.0%) 으로나타났다 (Table 3). 2. 혈액학적회복말초혈액조혈모세포이식이시행된총 13명에서동종골수이식이시행된 2명과자가말초혈액조혈모세포이식이시행된 1명을제외한 10명에서혈액학적회복을관찰하였다. 절대호중구수가 500/μL 이상에도달하기까지의평균기간은 13.4일 (10~21) 이었고, 3일간혈소판수혈없이혈소판수치가 50,000/μL 이상에도달하기까지의평균일수는 19.5일 (11~38) 이었다. 이식된세포수와생착속도와의상관관계를분석한결과말초혈액조혈모세포이식에서체중 kg당 CD34+ 세포수와절대호중구수사이에서만 통계학적으로유의한상관관계가있었다 (Table 4). 말초혈액조혈모세포이식후생착관계를보면 CD34+ 세포수의양과생착시기와통계학적유의한상관관계는없었으나절대호중구수회복일은 미만인군과이상인군에서각각 14일과 12.8일로 미만인군에서생착일수가길었고, 혈소판회복일도각각 27.8일과 18.6일로 미만에서길게나타났으나, 통계적인유의성은없었다 이상인군에서는혈소판일수만통계적인유의성이있었다 (p<0.05, p=0.040)(table 5). IV. 고찰 한국에서조혈모세포이식은 1983년급성림프구성백혈병에서의형제간동종골수이식이성공적으로시행된것을시작으로 ( 김, 1996) 1990년대들어고안된말초혈액조혈모세포이식법과고용량의항암제요법이활발히임상적용되어자가조혈모세포이식건수가급격하게늘었다. 이는말초혈액조혈모세포이식술은기존의동종골수이식에비해안전하고, 이식후골수의생착이빠르고, 비교적채집이용이하고, 종양세포의오염이적고, 이식편대숙주반응의위험도가적고, 전신마취가필요없으며조혈기능회복이빨라서골수이식을대치하여널리시행되고있다 (Liberti 등, 1994; Demuynck 등, 1995). Table 4. Relationship of hematological parameters with engraftment and progenitor cell * Hematopoietic engraftment A N C * 500 / μl Platelet 50,000/ μl Engraftment (days) 13.4(10~21) 19.5(11~38) Progenitor cell dose p-valuea MNC /kg CD34+cells/kg MNC/kg CD34+cells/kg ANC, absolute neutophil count ; MNC, mononuclear cell ; p-value : correlation Table 5. Correlation betwen engraftment time and CD34+cell/kg various groups ANC 500 Platelet 50,000 CD34+cell/kg p-value * M±SD M±SD < ± ± ± ± 0.9 < ± ± ± 1.5 *p-value, t-test ; M±SD, mean±standard deviation p-value *

5 말초혈액조혈모세포이식술이혈액종양환자와고형암환자의효과적인치료방법으로이용되고있으나, 채집산물내에서세포수사이의상관관계나용량, 생착속도, 생착에필요한최소이식세포수에대한상이한결과들이보고되고있어채혈술과이식술에대한뚜렷한기준이정립되지않은형편이다. 말초혈액조혈모세포채혈술에서는말초혈액에서이식에필요한채혈양을얻기위해서 G-CSF나화학요법등으로조혈모세포를가동화하는데, 가동화되는시기는항암화학제제의종류, 용량, 방사선치료유무, 진단명, 골수침범여부등에따라달라질수있다 (Kotasek 등, 1992), 시기를정하는데있어서는일반적인기준은없어어떤인자가채집에유용한가를분석하고그중 CD34+ 세포수가생착과어떤관계인가를알기위해본연구를시행하였다. 백혈구수치및증가양상, CD34+ 세포수등이일반적으로적용되어왔으며 (Gianni 등, 1989; Siena 등, 1991; Emminger 등, 1990), 일반적인기준으로백혈구수가 1000/uL 정도 (Haas 등, 1994), Dreger 등은백혈구수가 10,000/uL 이상된후에채집술을시작하는것이좋다고주장하였다 (Dreger 등, 1993). 시행전백혈구수치는대부분 330~69,000/μL 사이이며, 평균백혈구수는 34,200/μL로서높았다. 말초혈액조혈모세포채집전, 후의혈액학적변화에서백혈구및혈소판수는통계적으로유의한상관관계는없었다 (p>0.05 p=0.548, 0.287). 최근에는유세포분석기를이용한말초혈액내의 CD34+ 세포수의측정이비교적용이하여실제로채집시작시기를정하는데기준으로이용할수있게되었다. 말초혈액조혈모세포채집술은단핵구수, CD34+ 세포수, CFU-GM을기준으로채집목표를삼는데골수기능의회복에단핵구수는 1~ /kg, CD34+ 세포수는 1~ /kg으로알려져있다 (Smith and Sweetnham, 1995: 한등, 2000). 본연구결과에서단핵구수는 10명중 1~ /kg 이상이 10명 (100%) 이채집되었으며, CD34+ 세포수는 10명중 1~ /kg 이상이 7명 (70%) 이채집되었다. 말초혈액조혈모세포이식후절대호중구수가 500/μL 이상에도달한일수는 13.4일 (10~21) 이었고, 3일이상지속되면서혈소판수혈없이혈소판수치를 50,000/μL 이상으로생착에걸린시간은 19.5일 (11~38) 이었다. 이는자가말초혈액조혈모세포이식을받은생착에대해 Schwella 등 (1995) 의결과와비슷하였다 (Perez-Simon 등, 1998). 가능한많은수의 CD34+ 세포를이식할경우생착속도가빨라진다고 Ringden 등과 Mavroudis 등이보고하였으며, 특히 /kg CD34+ 세포수이상을이식했을경우와그미만의세포를이식했을경우에통계적으로유의하게생착속도의차이를보인다고알려져있다 ( 우, 등, 2000). 그러나본연구결과에서는 /kg 미만 CD34+ 세포수를이식했을경우절대호중구수의경우 14.0±2.3일이었고, 그이상은 12.8±1.7일로통계학적인생착속도차이는없었는데 (p>0.05, p=0.407), 이것은환자의수가적어서생긴것으로생각되어좀더많은실례를이용한연구가필요할것으로생각되었다. 혈소판수도 /kg 미만의 CD34+ 세포수를이식했을경우 27.8±12.7일이었으며, 그이상은 18.6±0.9일이었으나통계적유의성은없었다 (p>0.05, p=0.321). 또한 /kg 미만과그이상의 CD34+ 세포수를이식했을경우혈소판생착속도는 29.2일과 13.7일로통계적으로유의한상관관계가있어서 (p<0.05, p=0.040) 이등 (2000) 의 14일과도일치하였다. 본연구결과에서말초혈액조혈모세포수확량을예측할수있는가장좋은지표는말초혈액의 CD34+ 세포수이며, 말초혈액조혈모세포를이식한후생착일수의여부는 CD34+ 세포수와절대호중구수의증감에따라유의한상관관계가있었으며, 이식한 CD34+ 세포수가 /kg 미만일경우에는백혈구및혈소판생착일수가길어지기때문에 /kg 이상의 CD34+ 세포수를이식하는것이좋다고생각되었다. 따라서말초혈액조혈모세포채집술및이식술을시행하는데있어서 CD34+ 세포수만으로생착속도를충분히예측할수있으며, 또한저자가실험대상이적은관계로성별, 연령별, 진단명별등으로 CD34+ 세포수생착속도를분석하지는못하였으나더많은사례를분석한다면아마도그결과는말초혈액조혈모세포채집술및이식을시행하는데더유용한참고자료가될수있을것으로생각된다. 2003년 1월 1일부터 2004년 8월 31일까지충남대학교병원에서 54회의말초혈액조혈모세포채집술을시행받은 13명을대상으로말초혈액조혈모세포채집시행전, 후백혈구수, 단핵구수, 혈소판수등을비교하고말초혈액조혈모세포이식후 CD34+ 세포수와골수생착시기와의상관관계를분석하여 CD34+ 세포수측정의임상적유용성을연구한결과아래와같은결론을얻었다. 13

6 1. 말초혈액조혈모세포이식을받은환자의절대호중구수가 500/μL 이상에도달하기까지의평균일수는 13.4 일 (10~21) 이었고, 3일간혈소판수혈없이혈소판수치가 50,000/μL 이상에도달한평균일수는 19.5일 (11~38) 이었다. CD34+ 세포수와절대호중구수의생착일수는유의한상관관계가있었다 (p<0.05, p=0.008). 2. 이식후 CD34+ 세포수의양에따라 /kg 미만군과이상군에서생착일수를보면절대호중구수는 14일, 12.8일이었으며, 혈소판수는 28.8일, 18.6일로생착일수의감소는있었지만유의한상관관계는없었다 (p>0.05, p=0.321). 또한, /kg 미만군과이상군에서생착일수를보면혈소판수는각각 29.2일, 13.7일로생착일수의감소로통계학적인유의한상관관계가있었다 (p<0.05, p=0.040). 3. 말초혈액조혈모세포채집전, 후의혈액학적변화에서백혈구및혈소판수는통계적인유의성은없었다 (p>0.05 p=0.548, 0.287). 본연구에서말초혈액조혈모세포채집술및생착일수에관한혈액학적회복등을분석하였으며, 생착일수와이식된절대호중구수사이에도상관관계를보여 CD34+ 세포수는 /kg 이상을이식하는것이생착일수가빠르다는결론을얻었다. 참고문헌 1. Brown RA, Adkins D, Goodnough LT, Haug JS, Todd G, Wehde M, et al. Factors that influence the collection and angraftment of allogeneic peripheral-blood stem cells in patients with heamtopoietic malignancies. J Clin Oncol 15: , Demuynck H, Delforge M, Zachee P, Verhoef GEG, Vandenberghe P, Boogarerts MA. An update on peripheral blood progenitor cell transplantation. Ann Hematol 71:29-33, Dreger P, Marquardt P, Haferlach T, Jacobs S, Mulverstedt T, Eckstein V, et al. Effective mobilization of peripheral blood progenitor cells with 'dexa-beam' and G-CSF: Timing of harvesting and composition of the leukapheresis product. Br J Cancer 65: , Elliott C, Samson DM, Armitage S, Lyttelton MP, McGuigan D, Hargreaves R, Giles C, Abrahamson G, Abboudi Z, Brennan M, Kanfer EJ. When to harvest peripheral-blood stem cells after mobilization therapy: prediction of CD34-positive cell yield by preceding day CD34-positive cincentration. J Clin Oncol 14(3): , Emminger W, Emminger-Schmdmeier W, Hocker P, Gerhatl C, Kundi M, Gadner H. The median daily increment of leukocytes during haematopoietic recovery reflects the myeloid progenitor yield during leukapheresis in children. Bone Marrow Transplant 5: , Gianni AM, Siena S, Bregni M, Tarella C, Stern AC, Pileri A, et al. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor to harvest circulating haematopoietic stem cells for autotransplantation. Lancet 2: , Haas R, Mohle R, Fruhauf S, Goldschmidt H, Witt B, Flentje M, et al. Patient characteristics associated with successful mobilizing and autografting of peripheral blood progenitor cells in malignant lymphoma. Blood 83: , Humpe A Riggert J, Vehmeyer K, Troff C, Hidemann W, Kohler M, et al. Comparison of CD34+ cell numbers and colony growth before and after cryopreservation of peripheral blood progenitor and stem cell harbests:influence of prior chemotherapy. Transfusion 37: , Keung YK, Cobos E, Dunn D Park M, Dixon S, Wu K, et al. Determining factors for the outcome of peripheral blood progenitor cells and harverts. J Clin Apheresis 11:23-26, Kim HS, Cho YK, Choi JK, Kim HC. High Dose Chemotherapy with autologous peripheral blood stem cell transplantation in the treatment of gastric cancer.kor J of Hematopoietic Stem Cell Transplantation 1:55-63, Kotasek D, Shepherd KM, Sage RE, Dale BM, Norman JE, Charles P, et al. Factors affecting blood 14

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( )Jkstro011.hwp 비인강암의방사선치료결과및생존율에관한예후인자분석 2005 2 1 2005 3 28. :, Tel: 053)250-7665, Fax: 053)250-7984 E-mail: jhkim@dsmc.or.kr 정영연외 2 인 : 비인강암의예후인자분석 정영연외 2 인 : 비인강암의예후인자분석 Carcinoma of the nasopharynx treated by radiotherapy