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이학석사학위논문 Hepatitis B virus 의 Replication 에중요한 Core 단백질의아미노산규명 아주대학교대학원의생명과학과 / 분자의학전공신보혜

Chimeric core protein을이용한 Hepatitis B virus의 Replication 지도교수김경민 이논문을이학석사학위논문으로제출함. 2009 년 2월 아주대학교대학원의생명과학과 / 분자의학전공신보혜

신보혜의이학석사학위논문을인준함. 심사위원장신호준인 심사위원박선인 심사위원김경민인 아주대학교대학원 2008 년 12 월 22 일

- 국문요약 - Hepatitis B virus 의 Replication 에중요한 Core 단백질의아미노산규명 B 형간염바이러스는 Hepadnaviridae Family 로써, 크기가 3.2kb 인 partieally duplex DNA genome 을가지고있으며, 4 개의 open reading frame (ORF) 으로부터 core protein, surface protein, DNA polymerase, X protein 을 발현한다. HBV core protein 은 183 개또는 185 개의 amino acid 로구성되어있는 22kDa 의단백질이며, HBV core protein 은 pgrna 의 encapsidation 및 DNA 합성에관여하는것으로알려져있다. HBV core protein 은기능적으로두부위로나뉜다. core particle 조립에관여하는 core protein 의 N-말단부위와핵산과결합하는부위인 C-말단부위로나뉜다. Core protein 의 N-말단부위 (amino acid 1-149) 만으로도 core particle 을이루지만 pgrna 는 encapsidation 을하지못한다. 이전연구는 HBV core protein 의 C-말단을 DHBV core protein 으로치환한다양한 mutant 를이용한실험을하였다. 이들중에 DHBV core 의 242-250 번 9 개의 amino acid 를 HBV core 의 167-175 번으로치환한 chimeric core HDHD 의 DNA 합성을확인하였을때, HBV RC (relaxed circular) DNA 를합성하는것으로관찰되었다. Chimeric core protein HD 221-262 을기본으로하여 HDHD chimeric core protein 과반대로 242-250 번의 9 개 amino acid 를제외하고나머지를 HBV core 로치환한 chimeric core protein HHDH 에서는 HD221-262 와유사한양상인 i

single strand DNA 를비롯하여 relaxed circular DNA 와 double strand DNA 가합성되고, 그외에작은크기 DNA 합성이관찰되었다. HHDH 의 mutant core protein 의 DHBV 의부분 (amino acid 243 arginine, alanine, serine, proline, leusine, proline, arginine, serine 251 ) 과그부위에해당하는 HBV 의부분 (amino acid 168 arginine, arginine, arginine, serine, glutamine, serine, proline, arginine, arginine 176 ) 을비교하였을때 9 개의 amino acid 중에 4 개의 amino acid (amino acid 168, 171, 174, 175) 가일치하고 5 개의 amino acid (amino acid 169, 170, 172, 173, 176) 가달랐다. 따라서본연구에서는 5 개의 amino acid 를하나씩 HBV core protein 의 amino acid 로치환시켜 5 개의새로운 chimeric core protein mutant 를 cloning 하여 HBV DNA 복제에어떠한 amino acid 가관여하는지밝히고자하였다. HHDH 의 DHBV 부분의 9 개 amino acid 중에 HBV core protein 의 amino acid 와다른 5 개의 amino acid 를 HBV 로다시치환하기하는 point mutation 을실시하기위해, PCR 을이용하여 site-direted mutagenesis 를실시하였다. 5 개의 DHBV core protein amino acid 중에첫번째 amino acid 인 alanine 을 arginine 으로 (A169), 두번째 amino acid 는 glycine 에서 arginine 으로 (G170R), 세번째 amino acid 는 proline 에서 glutamine 으로 (P172Q), 네번째 amino acid 는 leusine 에서 serine 으로 (L173S), 다섯번째는 serine 을 arginine 으로 (S176R) 전환하는 PCR 를실시하여, 각각하나씩전환시킨 mutant 로 cloning 하여새로운 chimeric core protein 을만들었다. 5 개의새로운 chimeric core protein 의 HBV DNA 합성을확인한결과, G170R 과 S176R chimeric core protein 이각각 HBV wild type 과비슷한양상으로 HBV DNA 를합성하였다. ii

결과적으로 HBV DNA replication 에 core 의 C- 말단이관여하고, core 의 C- 말단에서도 G170R 과 S176R 이 HBV DNA replication 에중요한역할을 한다는것을알수있었다. 핵심어 : B 형간염바이러스의 replication, chimeric core protein iii

차 례 국문요약 ⅰ 차례 ⅳ 그림차례 ⅵ Ⅰ. 서론 1 A. B 형간염바이러스의증식 1 B. B형간염바이러스 core protein 및 core particle 2 C. Chimeric core protein 에의한 HBV replication 변화 3 Ⅱ. 재료및방법 A. HBV plasmid DNA construction 7 B. 세포배양및 transfection 8 C. Core particle 의분리 9 D. Encapsidation Assay 9 E. Southern blotting 10 F. Core particle 의 Western blotting 10 G. Endogenous polymerase assay (EPA) 11 Ⅲ. 결과 12 A. Chimeric core construction 과 core particle 의형성 12 B. HBV pregenomic RNA 의 encapsidation 양상 13 C, Chimeric core particle 의 Endogenous polymerase 활성측정 16 D. Chimeric core protein 에따른 HBV DNA replication 양상 17 iv

Ⅳ. 고찰 21 참고문헌 24 ABSTRACT 28 v

그림차례 Fig. 1. Schematic diagram of core protein and HBV replication by chimeric core protein 5 Fig. 2. Encapsidation assay of HBV pgrna and western blot of core particle 15 Fig. 3. Endogenous Polymerase Assay (EPA) of chimeric core protein 19 Fig. 4. HBV DNA replication by chimeric core protein 20 vi

I. 서 론 A. B 형간염바이러스의증식 Hepatitis B virus (HBV) 는작고, envelope 을가지는 DNA virus 로써, 간세포에서증식하며, 간암을일으키는데관여를한다 (Wands 와 Blum, 1991). Hepadnavirus 의원형인 HBV 는 partially double stranded DNA 를가지고있고, RNA 역전사작용을통해 replication 을하는 virus 이다. HBV 에감염되면세포에들어간 core particle 이핵으로이동하여세포내의 DNA polymerase 에의하여 covalently closed circular DNA (ccc DNA) 가된후바이러스의 mrna 및 pregenomic RNA (pgrna) 를합성하여세포질에서단백질을합성한다. pgrna 는 capsid (C) 와 polymerase (P) 의 mrna 로써이용되고, 역전사의주형으로써도이용된다 (Ganem 과 Schmeider, 2001). 세포질에있는 pgrna 는중합효소와함께 core particle 내부로들어가게된다 (Bertenschlager 등, 1990; Hirsch 등 1990; Bartenschlager 와 Schaller, 1992). Subgenomic 2.4kb RNA 는커다란 HBV 의표면항원 (HBs antigen, HBsAg) 을발현시키기위한 mrna 이고, 2.1kb mrna 는중간크기와작은크기의 HBsAg 을발현시키는 mrna 이며, 0.7kb mrna 는 HBx protein 을발현시키기위한 mrna 로써이용된다. HBV DNA polymerase 가 pgrna 의 encapsidation (Ű) 신호를인지하여 RNA-protein 복합체 (RNP, ribonucleoprotein) 를이룬다 (Tavis 와 Ganem, 1996; Beck 과 Nassal, 1998; Tavis 등, 1998). Core protein dimer 가삼차원적구조를이룬 RNA-protein 복합체를싸서 core particle 을이루면서 pgrna 가 core particle 에 encapsidation 되어미성숙한 core particle 을이룬다. HBV DNA replication 는 DNA polymerase 의말단단백질 (terminal protein, TP) 부위의 tyrosine 의 OH 기가 1

Ű 신호의 bulge 구조를주형으로생성된첫번째 nucleotide 와공유결합을이루며 Ű 신호의 bulge 구조를주형으로처음 4 개의 nucleotides 를합성하는 priming 반응이일어나면서이는미성숙한 core particle 내부에서시작된다 (Weber 등, 1994; Zoulim 과 Seeger, 1994; landford 등, 1997). 이러한 nucleotides 와 DNA polymerase 복합체는 pgrna 의 3 말단의 direct repeat I (DR I) 염기서열로이동되어 pgrna 를역전사하는 DNA 합성을시작하여완전한 (-) 가닥 DNA 를합성하여 hepadnavirus 의 DNA 가복제된다. HBV DNA 를가지는성숙한 core particle 은세포질내의세포막으로지질이중막 (lipid bilayer) 를획득하여 virion 을형성하거나세포핵으로다시되돌아간다. 세포핵으로성숙한 core particle 이되돌아가는것은세포핵내부의 HBV cccdna 양을유지시키기위한중요한단계이기도하다. B. B 형간염바이러스 core protein 및 core particle HBV nucleocapsid 의조립에는 HBV 의 core protein, polymerase 와 pregenomic RNA (pgrna) 가필요하다 (Hatton 등, 1992). Core particle 은 183 개또는 185 개의 amino acid 으로이루어져있고, dimer 를형성하여 core particle 로조립을한다 (Zhou 와 Sandring, 1992). Core particle 은 core protein 의 N 말단부위 (amino acid 1-144) 가약한결합으로 protein 간의상호작용에의해 core particle 조립한다 (Birnbaum 와 Nassal, 1990; Gallina 등, 1989). Core protein 의 C 말단부위는 nucleic acid 과결합하는부분으로 arginine 을많이가지고있는부분이다. 비록 core protein 의 C 말단이 capsid particle 조립에는관여를하지않지만, pgrna 의 encapsidation 과관련하여 viral replication 에관여를하는부위로알려져있다 2

(Gallina 등, 1989; Birnbaum 와 Nassal, 1990; Nassal, 1992; Beames 와 Landford, 1993;.Pogam 등, 2005). 하지만여전히 C 말단의어느특정부분이 pgrna 의 encapsidation 과 DNA replication 에관여하는지알려져있지않다. C. Chimeric core protein 에의한 HBV replication 변화많은연구들을통해서 retrovirus 나 avian hepadnavirus 의 chimeric virus 들의 protein 부분의기능과 virus 의 cis-acting 조각에대해서알려져있다 (Berkowitz 등, 1995; Kaye 와 Lever, 1998; Certo 등, 1999; Kristin 등, 2004). 본연구에서는 HBV replication 에관여하는 nucleic acid binding 부위를확인하기위해, duck hepatitis B virus (DHBV) 를이용하여 chimeric core protein 을제작하였다. HBV 와 DHBV 는상동성이낮은반면에, woodchuck HBV (WHBV) 와는 60% 의상동성을가진다. WHBV 와달리 DHBV core protein 은 HBV 증식을할수없다. 이전실험에서 core protein 의 C 말단일부를 DHBV 로치환시킨 chimeric core protein 에의해서 HBV 증식이회복되는것을확인하였다. HBV core 단백질의 C 말단을 DHBV core 단백질로치환한다양한 chimeric core 단백질들중에 HBV core 의 146 에서 185 번아미노산부분을 DHBV core 의 221-262 번아미노산으로치환한 chimeric core 단백질 HD 221-262 는 HBV single strand DNA 를비롯하여 double strand DNA 와 relaxed circular DNA 를합성하며 single strand DNA 보다작은크기의 DNA 도합성하였다. Chimeric core protein HD 221-262 를기본으로하여 DHBV core 의 242-250 번 9 개의아미노산을 HBV core 의 167-175 번으로치환한 HDHD chimeric core protein 을가진 HBV DNA 합성은 HBV wt (wild type) core protein 에서처럼 HBV RC (relaxed circular) DNA 가합성되는것으로관찰되었다. HDHD 와는반대로 HBV core 의 168-176 번을 DHBV core 의 242-250 번으로치환한 chimeric core 3

protein 인 HHDH 에서는 HD 221-262 와유사한양상으로 HBV DNA level 이낮게나타났으며, HHDH 의경우에는모든 amino acid 가 HBV 이고단지 168-175 번 9 개의 amino acid 만이 DHBV 였으나, HBV replication 은현저하게감소하였다. HHDH 의 mutant core protein 은서로다른 9 개의아미노산중 4 개의아미노산이일치하고 5 개의아미노산이서로달랐다 (Fig. 1.). 즉, 이 5 개의다른 amino aicd 가 HBV replication 을현저히감소시킬것으로생각되어진다. 따라서, 본연구에서는 chimeric core protein HHDH 에서 HBV core 와 DHBV core protein 간의서로다른 5 개의 amino acid 를하나씩 HBV core protein 으로 치환시켜 5 개의새로운 chimeric core protein 을 cloning 하여 HBV DNA replication 에어떠한 amino acid 가관여하는지밝히고자하였다. 4

A. B. C. 5

Fig. 1. Schematic diagram of core protein and HBV replication by chimeric core protein. (A) Core and chimeric core proteins for trans complementation. HBV and DHBV sequences are depicted as blue and red, respectively, and the Ű sequences at 3 -ends are marked. (B) In the previous study, we constructed the series of chimeric core proteins which contain various lengths of corresponding DHBV sequences and found that the replication of core-protein deficient HBV was rescued by chimeric core proteins with different efficiencies. Small sized HBV DNA than the full length of single stranded HBV DNA was synthesized by chimeric core particles with HD221-262 chimeric core protein. Relaxed circular HBV DNAs were synthesized by chimeric core particles with HDHD chimeric core protein. However, small sized DNAs were synthesized HHDH. (C) HHDH contains the most of HBV core proteins sequences except the 9 amino acids from the corresponding DHBV sequences. Among these 9 amino acids of DHBV sequences from HHDH, 5 amino acids were actually different with the corresponding sequences of HBV core protein. 6

Ⅱ. 재료및방법 A. HBV plasmid DNA construction Chimeric core protein 을 C deficient mutant 와 co-transfection 하는방법으로실험을진행하기위해정상적인 core protein 을형성하는 phcp 를 wild type 으로사용하였다. C deficient mutant 는 core protein 을발현하지못하는 mutant 로써, core protein 의 8 번째 amino acid Glu (GAA) 을 fusion PCR 방법을이용하여 stop codon 으로 (TAA) 전환한 mutant 이다. 이 C deficient mutant 는 core protein 을제외한다른 HBV protein 들과 pgrna 는발현을한다. Chimeric core protein 중에 HBV 서열을대부분차지하지만 HBV replication 효율이낮았던 HHDH mutant 의 DHBV 부분을 HBV 와비교하였을때, 9 개의 amino acid 중에 5 개의 amino acid 가서로달랐다. 서로다른 5 개의 amino acid 를각각 DHBV 서열에서 HBV 서열로하나씩전환시키기위해 site-directed mutagenesis 방법을이용하였다. Site-directed mutagenesis 방법을하기위해각각 amino acid 에대한 PCR 을실시하였다. 5 개의 DHBV core protein amino acid 중에첫번째 amino acid 인 alanine 을 arginine 으로바꾸기위해 HHDH 를주형으로하여 primer HBV 127 (5 -GCCTCGCCGTCGCGGCTCCCCTCTCCCAC-3 ) / primer HBV 19 (5 -GTGCGCAGACCAATTTATGC-3 ) 과 primer HBV 128 (5 -GAGGGGAGC CGCGACGGCGAGGCGAGG-3 ) / primer HBV 20 (5 -GCAACTATTGTGGTTTCATAT ATCTTGCC-3 ) 를사용하여 95 에 30 초, 55 에 30 초, 72 에 30 초씩 30cycle 로 PCR 을한후생성물을 primer HBV 20/ HBV 19 로다시같은 7

조건으로 PCR 을수행하여최종산물을얻었다. 두번째 amino acid 인 alanine 을 glycine 으로바꾸기위해 primer HBV 129 (5 -TCGCCGTGCGA GATCCCCTCTCCC AC-3 ) / primer HBV 19 와 primer HBV 130 (5 -AGAGGGGATCTCGCACGG CGAGG CGAG-3 ) / primer HBV 20 으로각각 PCR 후생성물을 HBV 20/ HBV 19 로다시 PCR 을수행하여최종산물을얻었다. 세번째 amino acid proline 은 primer HBV 131 (5 -GCGGGCTCCCAA CTCCCACGTAGTAGAAG-3 ) / primer HBV 19 와 primer HBV 132 (5 -TACGTGGGA GTTGGGAGCCCGCACGGC-3 ) / primer HBV 20 를사용하여각각 PCR 후생성물로두번째 PCR 을실시하여 glutamine 으로전환을하였다. 네번째 amino acid leusine 을 serine 으로바꾸기위해 primer HBV 168 (5 - GGGCTCCCCTTCGCCACG TAGTAGAAGATCTC AATCTCGGGAATC-3 ) / primer HBV 19 와 primer HBV 134 (5 -TACTACGTGGCG AAGGGGAGCCCGCACG-3 ) / primer 20 으로 PCR 하여얻은생성물로 2nd PCR 을통해최종산물을얻었다. 마지막다섯번째 amino acid serine 을 arginine 으로바꾸기위해 PB 를주형으로하여 primer HBV 135 (5 -TCTCCCACGTCGCAGAAGATCTCAATC-3 ) / primer HBV 21 (5 -GCTCCGAATGCA GGGTCCAACTGATG-3 ) 과 HHDH 를주형으로하여 primer HBV 136 (5 -GAGAT CTTCTGCGACGTGGGAGAGGGGAG-3 ) / primer HBV 20 을사용하여각각 PCR 후두번째 PCR 로최종산물을얻었다. 이러한방법으로다섯개의새로운 chimeric core protein 을만들었다. 모든구조들은특정 mutant 임을확인하기위해서열화하였다. B. 세포배양및 transfection 8

HuH7 cell 은 HBV wt 과 chimeric core construct 들을 transfection 하는데 이용하였다. HuH7 cell 은 penicillin 과 streptomycin, 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, invitrogen) 이첨가되어있는 Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM, Gibco, invitrogen) 으로배양하였다. HuH7 cell 에 HBV wt plasmid 8 μg을 transfection 하였고, C deficient mutant 와여러가지 chimeric core protein construct plasmid 를각각 2 μg, 6 μg (1 : 3) 으로 transfection 하고, trnasfection reagent 로는 polyethylenimine (PEI) 를사용하였다. 각각의 plasmid 와 PEI 의비율은 1 : 1 로하고, 10 분동안실온에서반응후 cell 에 co-transfection 하였다. Transfection 한다음 1 일후에 10% FBS DMEM 을 5% FBS DMEM 으로바꿔주었다. C. Core particle 의분리 Transfection 을한 3 일후, HuH7 cell 을 1ml 1% Nonidet P-40(Sigma) 이첨가되어있는 TNE (10mM Tris-HCl [ph 8.0], 50mM NaCl, 1mM EDTA) buffer 를사용하여 lysis 하였다. Lysate 는 12000rpm 으로원심분리하여 10mM MgCl 2, 8mM CaCl 2, 20U DNase I, 60U micrococal nuclease(fermentas) 와 37 에서 1 시간 30 분이상반응하였다. Core particle 은 6.5% polyethylene glycol 로 ice 에서 1 시간 30 분이상침전한후 13000rpm 으로 4 에서 15 분동안원심분리하였다. D. Encapsidation Assay Encapsidation 된 RNA 를확인하기위해, HuH7 cell 에여러가지 chimeric core protein construct plasmid 와 core protein 을발현하지못하지만다른 HBV RNA 만을 9

합성하는 C deficient RT YMHA 를 transfection 하고세포에서 core particle 을앞서 설명과같이분리하였다. 분리한 core particle 을 1% native agarose gel 에 전기영동을한후, nytron membrane(whatman) 으로 transfer 하였다. Membrane 상에서 core particle 을 0.2M NaOH 로 denaturation 시키고 0.2M Tris-cl(pH 7.5) 로 neutralization 를거쳐 HBV 서열에특이적인 α 32 P-labeled random-primed probe 를 사용하여 68 에서 hybridization 하였다. E. Southern blotting Southern blotting 으로 HBV DNA 합성을확인하기위해 core particle 을분리한후, proteinase K (100 μg /ml) 를이용하여 core particle 을제거하였다. HBV core DNA 는 400 μl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25 : 24 : 1) 과섞은후 13000rpm 으로 5 분동안원심분리를한다음, 3M NaAc 와섞고 100% EtOH(Merck) 함께 -20 에서침전하여분리하였다. 분리된 HBV core DNA 는 0.9% native agarose gel 전기영동한후, nytron membrane(whatman) 으로 transfer 하여 HBV 서열에특이적인 α 32 P-labeled random-primed probe 로 hybridization 하였다. F. Core particle 의 Western blotting 분리한 core particle 을 1% native agarose gel 에서전기영동하였다 (Koschel et al., 2000). Core particle 은 polyvinylidene fluoride (PVDF, Milipore) membrane 으로 transfer 하였다. Immunoblotting 은 5% skim milk 로 1 시간동안 blocking 후, anti- HBc antibody (DAKO, Glostrup, Denmark) 로 1 : 1000 으로희석한후 1 시간반응 10

하였고, 1XPBST 로 membrane 을 10 분동안 3 번반복하여씻은다음 Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody(dako, Glostrup, Denmark) 를 1 : 2000 으로희석한후 1 시간반응시켰다. 1XPBST 로 membrane 을 15 분동안 3 번반복하여씻은후에 ECL (Enhanced Chemical Luminescence) 로 1 분간반응을시켜 HBV core particle 을시각화하였다. G. Endogenous polymerase assay (EPA) 분리한 core particle 을 0.5mM dctp, dgtp, dttp(takara) 와 10 μg α- 32 P-dATP (specific activity, 3000Ci/mmol), EPA reaction buffer (50mM Tris-HCl [ph 7.5], 75mM NH 4 Cl, 1mM EDTA, 25mM MgCl 2, 0.1% β-mercaptoethanol, 0.5% Nonidet P-40) 와함께 37 에서 overnight 반응하였다. EPA reaction 하고있는 core particle 일부에서 32 P- labeled HBV DNA 를분리하였다. Radiolabeled HBV DNA 는앞서 core DNA 를 분리하는방법과동일하게분리하였고, EPA reaction 하는 core particle 과분리한 HBV DNA 를각각 1% agarose gel 에서전기영동을하고, agarose gel 을 gel dryer 에서말린후필름에노출시켜확인하였다. 11

Ⅲ. 결과 A. Chimeric core construction 과 core particle 의형성 HBV replication 에서 HBV core protein 의 nucleic acid binding 부위가관여를한다는보고가있었고, 이 nucleic acid binding 부위에서도어떤 amino acid 가영향을끼치는지알아보기위해, chimeric core HHDH 의 DHBV core amino acid 를 HBV core amino acid 와비교하여서로다른 5 개의 amino acid 를각각 HBV core amino acid 로바꾸어새로운 chimeric core protein 을만들었다. HHDH 를 vector 로사용하여각각의 amino acid 의 mutant 를가진 primer 로 PCR 을이용하여 sitedirected mutagenesis 를실시하였다. 서로다른 5 개 amino acid 에대한각각의 mutant 를가진새로운 5 개 chimeric core 의 core particle 형성을확인하기위하여, HBV core particle 에대한 Western blot 을실시하였다. Anti-HBc antibody 와 Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody 로확인하고, ECL (Enhanced Chemical Luminescence) 로 HBV core particle 을시각화하였다. 새롭게만든 5 개 chimeric core 들은모두 HBV core particle 을형성하고 (Fig 2A), 그중에서 L173S 과 S176R 으로바뀌었을때, HBV core particle 의형성양상이높아지는것을확인하였고, 이로인해 HBV core particle 이형성에있어서 HBV C 말단의 L173S 과 S176R 이관여를하며, HBV core particle 형성이다른 mutant 에비해더욱잘이루어진다는것을알수있었다. L173S 과 S176R 가 HBV core particle 을잘형성하는반면에 P172Q 는 HBV core particle 형성은하지만낮은 level 로형성되는것을보았다. 각각의 mutant 에대한차이는있지만새롭게제작되어진 chimeric core protein 과기존에 12

존재하던 chimeric core protein 모두 HBV core particle 을형성을하는것으로 확인하였다. B. HBV pregenomic RNA 의 encapsidation 양상 HBV pgrna 는 core protein 의 nucleic binding 부위에결합하여 core particle 로 encapsidation 되기때문에 chimeric core protein 에의한 HBV pgrna 의 encapsidation 양상을알아보기위해, core particle 을분리하여 HBV pgrna 에대한 encapsidation assay 를실시하였다. Core particle 내의 HBV pgrna 만을확인하기위해, RT 의기능이상실되어있는 YMHA 와 core 를발현하지못하는 plasmid 인 C deficient-rt YMHA ( C-RT YMHA) 를제작하여다양한 chimeric core protein 들과함께 HuH 7 cell 에 co-transfection 하였다. Transfection 한후, 3 일뒤에 core particle 을분리하여전기영동하여, membrane 으로 core particle 을 transfer 한후, membrane 상에서 core particle 을 0.2M NAOH 로분해하여 RNA 를노출시켰다. 노출된 RNA 를 HBV 에특이적으로결합하는 probe 와결합시켜분석하였다. 분석된결과를이전연구의 HBV replication 양상과비교하면기존의 HHDH 경우에 encapsidaition 이되지않아서 HBV replication 이일어나지않은것으로확인되었고, 반면에 HD221-262 의경우는 encapsidation 은잘일어나지만 HBV replication 의양상이낮게나타났다. 이결과를통해서 HHDH 의 duck 서열이 HBV pgrna 의 encapsidation 에관여하는것을예측할수있었다. Duck 서열에서어떤 amino acid 가관여하는지정확하게알기위해새롭게만든 5 개의 chimeric core protein 들은 L173S 를제외한 4 개의 chimeric core protein 들이 encapsidation level 이 HHDH 에비해높은것으로확인되었다 (Fig. 2B). 이로 13

인해, amino acid 하나가달라짐에따라 encapsidation 의양상이 wild-type 의 level 만큼뚜렷하게좋아지는것을알수있었고, HBV replication 의양상또한각각 amino acid 에의해서로다르게나타날것으로예상할수있었다. 14

Fig. 2. Encapsidiation assay of HBV pgrna and Western blot of core particle. (A) Isolated core particles were electrophoresed on a 1% native agarose gel. Core particles were transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Immunoblotting was performed using an anti-hbc antibody. (B) Encapsidation assay was performed to detect encapcidated pregenomic RNA(pg RNA) into core particle. Core particles were isolated, separated, transferred to nylon membranes, nutralization, denaturenation on membrane, hybridized with a random-primed 32 P-labeled HBV specific probe, and subjected to autoradiography. 15

C. Chimeric core particle 의 Endogenous polymerase 활성측정 Core particle로 encapsidation 된 pgrna를 DNA로전사하는데있어서 core particle 내의 endogenous 한 polymerase가얼마나활성을가지는지측정하기위해, endogenous polymerase assay (EPA) 를실시하였다. 다양한 chimeric core protein 들과새롭게만든 chimeric core protein 들을 C deficient mutant 함께 HuH7 cell에각각 co-transfection 한후, 3일뒤에 core particle 로 EPA 반응을하였고, EPA 반응후 core particle 에서 HBV DNA 를분리하여 EPA 반응을한 core particle 과 HBV DNA를분리한것을각각전기영동하여분석하였다. 앞선 encapsidation assay에대한결과로 EPA 결과를예상하기로는 L173S 를제외한나머지 chimeric core protein 들은 EPA 반응이잘이루어졌을것이라생각하였다. 먼저 chimeric core protein 의 core particle 을 Western blot 하였을때, 모두 chimeric core particle 을형성한다는것을확인하였고 (Fig. 3C), EPA reaction 후 core particle 의 endogenous polymerase 의활성은 G170R 과 S176R 이 HHDH 에비해서 HBV wild-type 의활성과비슷하게회복되는것을확인하였다 (Fig. 3A). Core particle EPA 반응후 HBV DNA 를분리하여 HBV DNA의 replication 을확인하였을때, G170R 의경우 single strand DNA 의 level이높게나타났고 double strand DNA와 relaxed DNA 합성도 HBV DNA level 보다낮지만합성하는것을알수있었다. S176R 도 single strand DNA 를합성하고 double strand DNA 와 relaxed DNA 합성도일어나지만 single strand DNA 보다작은크기의 DNA를많이합성하였다 (Fig. 3B). HHDH chimeric core protein 에서 amino acid 하나만을바꾼 G170R 과 S176R 의 HBV DNA replication 양상은 HHDH 에비해 HBV DNA replication 이잘일어났다. 이로인해, 예상했던결과와는다르게 encapsidation 된 pgrna의 level과는 16

상관없이 HBV replication의회복은다른것으로알수있었다. 새롭게만들어진 chimeric core protein 각각의 amino acid 들은 L173S 를제외하고 4개의 chimeric core protein 들은 encapsidation에관여는하지만 HBV replication에는 G170R 과 S176R 이관여하는것으로나타났다. D. Chimeric core protein 에따른 HBV DNA replication 양상 EPA 로 polymerase 의활성을측정하여 HBV DNA replication level 의변화를볼수있었지만정확하게 chimeric core protein 에의해 HBV DNA replication 이회복되는지확인하기위해, HBV wt 과 chimeric core protein 들을 C deficient 와 co-transfection 한 HuH7 cell 에서 core particle 을분리하여 Western blot 을하고, HBV DNA 를분리하여 Southern blot 을하였다. Core particle 의형성을확인하기위한 Western blot 의결과는모든 chimeric core particle 이형성되는것을확인하였고 (Fig. 4B), HBV DNA replication 을확인하기위한 Sourthern blot 의결과는앞서확인한 EPA 결과가유사하게 G170R 과 S176R 에서 HHDH 에비해 single strand DNA 가합성되었고낮은 level 이지만 double strand DNA 와 relaxed circular DNA 를합성하였다 (Fig, 4A). HBV pgrna 가 encapsidation 되는 level 과 HBV DNA replication 과의관련성을확인하기위해, 앞서나온 pgrna 의 encapsidation 양상과비교를해보면 A169R 과 P172Q 는 pgrna 를 HBV core particle 내부로 encapsidation 을잘일어나게하지만 HBV DNA replication 에는크게관여하지않았고, 이는 A169R 과 P172Q 가 nucleic acid 와결합은잘일어나지만, HBV DNA replication 에는관여를하지않으며, 반면에 G170R 과 S176R 은 nucleic aicd 와결합이잘일어나서 pgrna 의 encapsidation 에관여하고, HBV DNA replication 17

에도관여하였다. 이로인해 HBV core particle 의 C 말단 amino acid 가 HBV DNA replication 과관련이있다는것을확인하였다. 18

Fig. 3. Endogenous Polymerase Assay (EPA) of Chimeric core protein. (A) Isolated core particles were incubated with EPA reation buffer supplemented with 0.5mM each of dctp, dgtp, dttp and 10uCi α 32 P-dATP (3000Ci/mmol) at 37 for overnight incubation. Reaction mixtures were electrophoresed on 1% agarose gel and subjected to autoradiography. (B) After EPA reaction, 32 P-labeled DNA was estracted, separated by 1% agarose gel electrophoresis and subjected to autoradiography. Single-, double-stranded, and partially double-stranded relaxed circular forms of HBV DNA are marked as ssdna, dsdna, and RC, respectively. (C) Isolated core particles were electrophoresed on a 1% native agarose gel. Core particles were transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Immunoblotting was performed using an anti- HBc antibody. 19

Fig. 4. HBV replication by Chimeric core protein. (A) Southern blot analysis to detect HBV DNA replication. HBV DNA was extracted from isolated core particles, separated, transferred to nylon membranes, hybridized with a random-primed 32 P-labeled HBV specific probe, and subjected to autoradiography. Single-, double-stranded, and partially doublestranded relaxed circular forms of HBV DNA are marked as ssdna, dsdna, and RC, respectively. (B) Isolated core particles were electrophoresed on a 1% native agarose gel. Core particles were transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Immunoblotting was performed using an anti-hbc antibody. 20

Ⅳ. 고 찰 HBV core protein 의 C 말단은 arginine 을많이가지고있는부위로써, nucleic acid 가결합하는부위로알려져있고, C 말단이 capsid particle 조립에도 관여한다. 그러나많은연구를통해서 core protein 의 C 말단이 pgrna encapsidation 과 DNA replication 에도관여한다는보고가있었다. 이전연구에서 chimeric core protein 을발현하는여러가지 plasmid 를제작하였고, 이 chimeric core protein 들은 HBV core 와 DHBV core 로이루어져있다. 그리고이전연구를통해다양한 chimeric core protein 들중에 HBV core 의 C 말단이전부 DHBV 로이루어져있는 HD 221-262 는 HBV DNA 를합성하지만, HBV genomic DNA 보다 작은크기의 DNA 를합성하는것으로나타났고, encapsidation level 은높게 나오는데비해 DNA 합성이이루어지지않는것을확인하였다. HD 221-262 는 nucleic acid 를 core particle 내로 encapsidation 하는것이쉽게일어나지만 core particle 내에서 HBV DNA replication 하는것은 DHBV 서열을가지기때문에어려운것으로예상되었다. 반면에 HBV core 의 C 말단이대체적으로 DHBV 서열로이루어진 HDHD 는 double strand DNA 와 relaxed circular DNA 및 single strand DNA 를합성하며, 대부분 HBV core 의 C 말단이 Human 서열로이루어진 HHDH 는 HD 221-262 와마찬가지로작은크기 HBV DNA 를합성하는것을확인하였다 (Fig. 1). 그래서 chimeric core protein HHDH 의 DHBV 서열이 HBV pgrna encapsidation 과 HBV DNA replication 에관여할것으로생각하여 HHDH 의 DHBV 서열을 HBV WT 과비교하였다. 두서열을비교한결과, HBV chimeric core protein HHDH 에서 DHBV 에해당하는부분은단지 9 개의 amino acid (amino acid 168-176) 으로이루어져있고, 9 개 amino acid 중에서도 5 개의 amino acid 만이 21

HBV WT 과서로달랐다. 이 5 개의 amino acid 에의해서 HBV DNA replication level 차이가크게나타난것이었다. 이전보고에따르면 HBV core protein 의 amino acid 165-173 번이 HBV DNA 합성에중요한반면 174-183 은중요하지않은것으로알려졌다 (Nassal, 1992). 그리고최근연구보고에의하면 HBV core protein amino acid 172, 173 번에해당하는 arginine 이 HBV DNA 를합성하는데필요하다고알려져있으며 (Pogam 등, 2005), 본그룹에서제작한 chimeric core protein HHDH 의 DHBV 서열은 amino acid 168-176 에해당하여 HHDH 의 DHBV 서열이 HBV DNA 합성에중요한지중요하지않은지를알수있을것으로생각하였다. 그래서본연구에서는 HHDH 에서 DHBV 의서로다른 5 개의 amino acid 를각각 HBV 서열로치환하여새로운다섯개의 chimeric core protein 을제작하여각각의 HBV DNA replication 을확인하였다. 먼저새로운 chimeric core protein 에의해서 pgrna 의 encapsidation level 이어떻게달라지는지확인하였을때 (Fig. 2), 하나의 amino acid 만바뀌었음에도불구하고 HHDH 에비해서 L173S 만제외하고 pgrna 의 encapsidation level 이확연히회복되는것을알수있었다. 이결과를통해서하나의 amino acid 에의해서 pgrna 와 core particle 간의결합력이높아지고, core particle 내로 pgrna 의 encapsidation level 도높아지는것을알았다. 새로운 chimeric core protein 을 HuH7 cell 에 transfection 하여각 mutant 에대한 chimeric core particle 내에있는 polymerae 의활성 (Endogeneous polymerase assay, EPA) 을측정하였다 (Fig. 3). EPA 를실시한결과 5 개의아미노산중 G170R 과 S176R mutant 에서 endogenous polymerase activity 를가지는것으로확인하였고, 이결과를통해 G170R 과 S176R 이완벽한 HBV DNA 를합성하는것인지알수는없지만 HBV DNA replication 에관여할것으로예상하였다. 더욱정확한 HBV 22

DNA replication 양상을확인하기위해, HBV DNA 에대한 Southern blot 을실시하였다 (Fig. 4). 그결과, 앞서나타난 EPA 결과와유사하게 G170R 과 S176R 이 single strand DNA 와함께약하지만 double strand DNA 및 relaxed circular DNA 도합성하는것으로나타났다. 최근연구에서는 HBV core 의 C 말단에서인산화가일어났을때, core particle 내에서 HBV DNA replication 이일어난다는보고가있다 (Suresh 등, 2006). 이연구에서는 HBV core 의 C 말단의 serine 과 threonine 이인산화가되면 HBV DNA 가합성되고, 성숙한 core particle 이형성되면 C 말단에서탈인산화가일어난다고하였다. 이연구에서나타내어진인산화가되는 C 말단은본연구에서는 HBV core 의 171 번 amino acid 에해당하는 serine 이포함된다. 본연구에서보여지는 HBV core chimeric core protein 뿐만아니라인산화또한 HBV DNA replication 에관여를하고, HBV core protein 의 arginine-rich domain 에해당하는 G170R 과 S176R 이 HBV DNA replication 에중요한역할을한다는것을알수있었다. 이로인해이전에보고된 HBV core protein 172, 173 번의 arginine 이외에 170 번 amino acid arginine 과 176 번의 arginine 도 HBV DNA replication 에관여하고, HBV C 말단인 arginine rich-domain 이 nucleic acid binding 역할뿐만아니라 HBV DNA replication 에관여하는것으로추측되어진다.. 23

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-ABSTRACT- Critical C-terminal Amino Acids of Hepatitis B virus Core Proteins for HBV Replication Shin Bo-Hye Department of Biomedical Sciences The Graduate School, Ajou University (Supervised by Associate Professor Kyongmin Kim) Hepatitis B virus (HBV) core proteins are involved in pregenomic RNA encapsidation and viral DNA replication. C-terminal domain of core protein is nucleic acid binding domain, while N-terminal domain is involved in capsid particle assembly. DHBV core protein has low homology with that of HBV. The replication of core protein-deficient HBV can not be rescued by the trans-complementation of DHBV core protein. In the previous study, we constructed the series of chimeric core proteins which contain various lengths of corresponding DHBV sequences and found that the replication of core-protein deficient HBV was rescued by chimeric core proteins with different efficiencies. Small sized HBV DNA than the full length of single stranded HBV DNA was synthesized by chimeric core particles with HD221-262 chimeric core protein. Relaxed circular HBV DNAs were synthesized by chimeric core particles with HDHD chimeric core protein. However, small 28

sized DNAs were synthesized HHDH which contain the most of HBV core proteins sequences except the 9 amino acids from the corresponding DHBV sequences, which were similar to those by HD221-262. Among these 9 amino acids of DHBV sequences from HHDH, 5 amino acids were actually different with the corresponding sequences of HBV core protein. In this study, the respective amino acid was changed to the corresponding HBV sequence. Then, replication of core protein-deficient mutant was examined by the transcomplementation of new chimeric core proteins. We found that the replication of core protein-deficient HBV were rescued by some of new chimeric core proteins, indicating that these residues in C-terminal domain of core protein are the critical residue for HBV DNA replication. Key words : replication of Hepatitis B virus, chimeric core protein 29