Korean Chem. Eng. Res., 51(6), 716-726 (2013) http://dx.doi.org/10.9713/kcer.2013.51.6.716 효소를이용한아실화반응의최근동향과전망 박오진 연변대학과학기술학원생물화공학부중국길림성연길시조양가 3458 (2013 년 8 월 14 일접수, 2013 년 10 월 11 일수정본접수, 2013 년 10 월 17 일채택 ) Recent Developments and Prospects in the Enzymatic Acylations Oh-Jin Park Department of Biological and Chemical Engineering, Yanbian University of Science and Technology, 3458 Chaoyang St. Yanji City, Jilin Province 133000, China (Received 14 August 2013; Received in revised form 11 October 2013; accepted 17 October 2013) 요 약 가수분해효소 ( 혹은아실전이효소 ) 를이용한알콜과아민의아실반응은에스터의가수분해반응 (hydrolysis, deacylation) 과더불어효소를이용한유기합성반응에서이미잘확립된기술로서, 산업체에서제약의합성이나고분자의합성에서널리응용되고있다. 이러한효소를이용한아실화반응은주로열역학적인제한으로인해그동안대부분이주로유기용매에서이루어지고있다. 최근들어서, 수용액에서아실화반응을전이효소를이용하여효율적으로할수있다는보고와함께그반응기제에대한연구들이, X-ray 구조와이러한반응을가능하게하는효소의단백질서열비교연구, 그리고계산화학에의한효소의설계연구등을통해새롭게밝혀지고있다. 본총설에서는효소를이용한아실화반응을유기용매와수용액에서의수행함에있어서장단점을비교해보면서, 앞으로의전망도함께제시하고자한다. 특별히다양한천연물들의구조변화에아실화반응생체촉매를사용할수있는가능성에대해살펴볼것이다. Abstract Enzymatic acylations catalyzed by hydrolytic enzymes, along with enzymatic hydrolysis, are established reactions in the synthesis of fine chemicals such as chiral intermediates and polymerizations in the industry. Those reactions have been carried out mostly in organic media due to the thermodynamic limitations. Recently, there have been reports on enzymatic acylations in aqueous media. They have dealt with the elucidation of reaction mechanisms of hydrolases and acyl transferases based on their X-ray structures, homology comparison of the two kinds of enzymes, substrate engineering of acyl donors and computational design of acyl transferases for enzymatic acylations in aqueous media. Enzymatic acylations play an important role in the combinatorial synthesis of natural products such as polyketides and nonribosomal peptides. In this review, the historic developments of enzymatic acylations and industrial examples are described briefly. In addition, recent developments of enzymatic acylations in the modification of natural products and their prospects will be discussed. Key words: Enzymes, Biocatalysis, Acylations, Regioselectivity, Natural Products, Combinatorial Biosynthesis 1. 서론 효소를이용하여유용한화학제품을합성하는기술 (biocatalysis) 은최근학계뿐아니라산업계에서도많은관심을모으고있다. 과거 20~30년동안화학자들은효소가가지는장점들 ( 상온-상압반응, 다단계의보호기도입과탈리없이반응이가능함, 위치선택성 (regioselectivity), 화학기능기선택성 (chemoselectivity), 이성질체선택성 (enantioselectivity, stereoselectivity)) 을이용하여많은연구와노력을기울인결과, 이제생체촉매기술을유기합성의교과내용으로 To whom correspondence should be addressed. E-mail: parkojs@yust.edu or parkojs@gmail.com 이논문은 KAIST 양지원교수님의정년을기념하여투고되었습니다. 새로이추가해야한다는주장도등장하고있다 [1-3]. 생체촉매기술은녹색화학의조건들을잘만족시키는특징으로인해지속가능성장을위한중요한기술로인식되고있으며, 지난 20년간의발전과더불어앞으로그성장가능성이기대가되고있다 [4-9]. DNA 재조합기술의발전으로 heterologous expression에의한단백질의대량생산이가능함에따라, 더효율적이고다양하며값싼효소들을얻을수있게되고, 다양한유기반응에사용할수있는효소들을시약제공회사들에서공급하고있다. 또한분자생물학에서의많은진보를통해 in vitro protein engineering 기술 (in vitro directed evolution, 정향진화 ) 과고속스크리닝기술 (high throughput screening, HTS) 의등장으로, 목적에맞는효소를개량할수있게됨에따라 [10-13], 효소를이용한합성기술은정밀화학제품뿐아니라생물연료나화학제품의생 716
효소를이용한아실화반응의최근동향과전망 717 산에도응용할수있게되었다 [16]. 본총설에서는효소를이용한아실화반응의역사와응용, 그리고최근새롭게등장하고있는수용액에서의아실화반응의가능성에대해알아보고자한다. 이러한유기용매와수용액에서의효소의아실화반응은특별히천연물의구조변화에의한신약개발, 개량신약등개발단계에서뿐아니라, 특허가만료된제품의경쟁력있는공정의개발에이르기까지다양한가능성을갖고있다고하겠다. 기존의가수분해효소 (hydrolase) 뿐아니라 polyketide나 non-ribosomal peptide 의생합성에서발견되는효소들을 in vitro에서효율적으로이용하는방안에대해서도살펴보고자한다. 특별히, 다양한관능기 (functional group) 를가진천연물의구조수식에있어서, 기존의가수분해효소의아실화반응의변천과새로운전개에대해살펴보고, 천연물의구조변화에있어서아실전이효소 (acyl transferase, AT) 의가능성에대해서살펴보고자한다. Fig. 2. Biocatalytic synthesis of dipeptide sweetener aspartame precursor by a theromostable protease, thermolysin, in aqueous media (Holland Sweetener Compnay). 2. 효소의아실화반응 효소를이용한아실화반응을통해 amide 결합과 ester (thioester 포함 ) 결합을형성할수있다 (Fig. 1). 이러한반응은가수분해효소 (EC 3분류 ) 의가수분해반응의역반응을이용하는것이다. 이러한반응은다양한천연물의구조에서발견된다. 생체내에서는주로 CoA ester나 N-acetylcysteamine의 thioester 형태의 acyl donor를사용한다. 때로는 polyketide synthetase (PKS) 나 non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) 와같은거대한효소복합체에서는, acyl carrier protein (ACP) 과같은단백질에결합된형태를취하기도한다. Thioesterase 또한 thioester를인식하여 nucleophile (-OH, -NH 2 ) 에의해 PKS나 NRPS의마지막단계에서 macrocyclization에의해서 amide나 ester를형성한다. 생체내에서는, 수용액의환경으로물이대부분을차지하지만, acylation 반응이가능하게된다. 그러나 in vitro에서가수분해반응의역반응을통해합성쪽으로유도하기위해서는평형의이동을위해서물을제거한환경을유지해야하는데, 유기용매를사용하거나반응중에생성되는물을제거해주는방법을채택한다. 또한생성물의침전을유도하여수용액상황이지만합성반응쪽으로평형을이동시키는것이다. 물이존재하게되면가수분해효소에의해 acyl donor와생성물의가수분해가일어나게되어수율이떨어지고생성물의분리에영향을주게된다. 후자의예로는, 1980년대말 DSM 계열회사인 Holland Sweetener Company 사가 Bacillus thermoproteolyticus 유래의단백질분해효소인 thermolysin이가지는위치선택성과이성질체선택성을이용하여 dipeptide 인공대체감미료아스파탐 (aspartame) 의합성에성공한뒤현재에이르고있다 (Fig. 2). D/L-PheOME 가운데 L 형태만반응하며, D 형태는생성물 Cbz-APM과복합체를형성하여침전되기때문 Fig. 1. Enzymatic acylations of alcohols in aqueous and organic media by hydrolytic enzymes. 에반응이수용액에서수행되지만, 생성물의합성이가능하게된다. 전자의해결방법으로는반응매질에서물을제거하는것인데이를위한방법으로유기용매를사용하는것을생각할수있다. 1960~ 1980년대의효소의고정화연구에이어서, 1980년대중반에들어서효소공학에있어서큰진전을이룬분야는유기용매에서의효소반응이라고할수있을것이다. 물에서는불가능했던반응들을효소의안정화기술을통하여유기용매에서수행할수있게되었다 [15-17]. 미국 MIT의 Klibanov 교수를비롯하여다양한연구자들이이분야에서개척적인역할을함으로써, 효소공학분야의국제학회에서수여하는 Enzyme Eng. Award를통해그공로를인정받게되었다. 3. 유기용매에서의효소의아실화반응의역사와응용유기용매를이용한효소반응이 acylation 반응에사용된것은, 유기용매에효소가쓰일수있음을증명한뒤얼마후, 1988년 Riva 등이유기용매에서가수분해의역반응을이용하여다양한당류, 스테로이드, 핵산등 multihydroxy 화합물의 acylation 반응에 protease와 lipase를이용하여선택적으로 hydroxyl기에아실화반응을보고한것이였다. 이들은친수성인화합물을녹이기위해 DMF와같은효소의활성에는좋지않은용매를사용할수밖에없었지만, 유기용매에서의 acylation 반응의선구적인역할을한가치를인정할필요가있을것이다 [17]. 그이후에, 이러한유기용매에서의아실화반응을용이하게하기위해, 주로가수분해효소 (lipase나 proease) 를중심으로염을첨가하거나, 동결건조시에안정화제를첨가하는방법, 유기용매대신이온성액체를첨가하는방법등다양한연구가계속되고있다 [18]. 아실화반응의다양한제약분야에서의산업적성공예들이최근의 review를통해보고되고있다 [7]. 최근, Hanefeld 등은가수분해효소를사용하여유기용매내에서다양한 acyl donor을이용하여아실화반응을수행할때의장단점을, 주로경영학의전략기획에서사용하는 SWOT (strength-weaknessopportunities-threats) 분석을통해, 녹색화학의관점에서비교하였다 [19]. 단순히효소반응단계만이아니라, 전체적인관점에서공정의 greenness 를평가하였다. Atom economy와 E-factor의인자들을사용하여비교한결과, 자주사용되는 enol ester (vinyl ester) 보다는 carboxylic acid를사용하되물을제거하는방법이더환경친화적임을
718 박오진 Fig. 3. Lipase-catalyzed acylation for kinetic resolution of racemic amine (BASF) [22]. 보고하고있다 [20]. Kostos 등은, 연구단계에서생산단계로넘어가는과정에서우리가고려해야할사항가운데전체공정에서차지하는분리와정제비용을고려해야할것과, 효소의재사용을위한고정화를통해에멀젼생성의예방, 전체공정에있어서의생성물의분리및 work-up 과정등다양한고려사항들을, 유기용매에서의아실화반응과가수분해반응의관점에서고찰하였다 [21]. 다음으로는효소의아실화반응을이용하여합성할수있는몇가지예를통해, 기존의성공예들을살펴보고자한다. megawatts의전력을절약하게되었다 [26-29]. Lipase로생산된 polyester는분자량이균일하여녹는점의분포가기존의금속촉매로합성한것에비하여좁아서고온성형이가능한접착제로전구체로사용될수있다. 환경적인측면과생산된고분자의성능면에서의향상을통해서 Green polymerzation 의가능성을열어주었다. 의료분야나화장품분야의응용에서는효소를이용한고분자가가능성이있을것이다. 효소를이용한고분자합성은다양한관능기를가진 monomer의경우보호기의도입과탈리없이가능한경우, 에너지를절감할수있고, 고온에서분해가되거나부반응을가져다주는반응의경우, 혹은이성질체가운데특이적으로반응하는경우에화학적합성에비해장점을가질수있다. Gross 등은 activated ester를사용하지않고서도, lipase를이용하여폴리에스터를합성할수있음을보고하면서, 그러나좀더광범위하게효소를이용하여 polyester 고분자를합성하기위해서극복해야할점들을지적하였다 [30]. 고정화효소와기질과의비율이 1/10 w/w 정도인데더낮추어야하는점, 재사용이가능한고정화담체개발의필요성, 효소의열안정성을더높여야할것, 각고분자합성의필요에맞는효소를개발할것등을지적하였다. 이러한장애물들이극복될때, 효소가원가에서차지하는비중을줄여서, 전체공정의경제성을확보할수있을것이다. 3-1. Chiral Intermediates 유기용매에서아실화반응이나가수분해반응을통해의약, 농약및향료등의중간체를합성하는연구는가장큰시장을차지하는분야라고하겠다. 독일 BASF 사는 Burkholderia 속유래의 lipase를이용하여농약의원료인 chiral amine를합성하는데성공하였다. 유기용매에서 methoxyethyl ester를사용하여효율적으로한쪽형태의이성질체만을효율적으로분리해낼수있음을보고하였다 (Fig. 3)[22]. 제약이나의약분야뿐아니라전자산업에서 LCD의원료물질인액정물질의합성에도 lipase가사용되고있다 [23]. 3-2. Enzymatic Acylations for the Synthesis of Polyesters 효소를이용한폴리머의합성은지난몇년간많은연구를통해그가능성을입증하였다 [24]. 폴리에스터는섬유나필름, 그리고플라스틱음료수병에쓰이는 Poly(ethylene terephthalate, PET) 를비롯하여, 최근생물학적방법으로 monomer가생산되는 1,4-butanediol과 succinic acid로부터만들어지는생분해성고분자 Poly(butylene succinate, PBS) 등, 우리주위에광범위하게사용되고있다. Diol과 diacid의축합반응은화학적인방법으로상업적인폴리에스터를생산하는주된방법이다. 효소를이용하여폴리에스터를합성하는방법에서가장널리쓰이는효소는 Lipase (EC 3.1.1.3) 이다. Lipase를이용하여폴리에스터를합성하는것은 in vivo에서 lipase 가지방산을분해하는반응의역반응을이용하는것으로서, 크게 lactone의 ringopening polymerization (RPO) 과 diacid와 diol의축합반응 (polycondensation) 두가지가있다 [25]. 폴리에스터의양쪽끝이 alcohol로끝나는 polyol-polyester는폴리우레탄의전구체가된다. 영국의 Baxenden Chemicals 사는기존의폴리에스터의합성에쓰이는 titanium이나 tin 을촉매로고온에서 (200 o C), 유기용매, 무기산을사용하던공정을, Candida antarctica 유래의 lipase (Novozym 435) 를이용하여저온에서 (60 o C) 축합반응으로폴리에스터를생산하는공정으로대체하여, 유기용매와무기산의사용이불필요하게되었고, 대량생산에서 2000 3-3. Enzymatic Acylations for the Synthesis of Functional Nanomaterials 유기분자가기능성구조를가지려면, 단위구성 building block들이질서정연하게배열되어야한다. Organogel은이러한 nano 구조물가운데중요한예라고할수있다. 친수성기와소수성기를함께가지는, 양친성분자 (amphiphile) 는, 친수성기는수소결합에의해서그리고소수성기는유기용매와작용하여, 자기조립에의하여규칙적인배열을만들수있는물질로서 organolgelator로서기능을할수있다. Multihydroxyl 화합물에 lipase, protease를이용한아실화반응을이용하여 [31], Park 등은유기용매내에서이당류의탄수화물을출발물질로하여, protease와 lipase를이용하여아미노산에스터와지방산에스터를합성하였다 [32,33]. 특별히, glucose 두분자가대칭구조를가지고 1,1 glycosidic bond로연결된이당류 trehalose만이 6- OH와 6 -OH에 acylation이되어대칭구조를가지게된다 (Fig. 4). Candida ancarctica 유래 lipase B (CALB) 를촉매로, divinyladipate를 acyl donor로사용하여, acetone에서 sucrose diester와 trehalose diester 를합성하였다. 생성물의분리과정에서 trehalose-6,6 -diester가 gel 을형성함이관찰되였다. John 등은다양한 fatty acid vinyl ester를사용하여얻은 trehalose diester ( 수율 50% 이상 ) 가, 유기용매에서 gel 을형성하고, 그특성을고찰하였으며, 이를이용하여해양에유출된기름을정화하는데탄수화물기반의 organogelator를사용할수있는가능성에대하여보고하였다 [34,35]. Trehalose 6,6 -diacetate의경우, ethyl acetate에서 0.04% (w/v; 0.84 mm) 의농도에서도 gel을형성하였는데, 이는 sugar ester류의 gelator 가운데가장낮은농도이다. 화학적으로합성한여러가지 trehalose ester 혼합물가운데유일하게 trehalose-6,6 -diester만이효과적으로 gel을형성하는현상을통해서, 효소를이용하여위치선택적인 acylation을통해 nanostructure를가진물질을형성할수있음을통해서, 효소의선택성과초분자화학의결합에의한새로운기능성물질합성의가능성을열어주고있다.
효소를이용한아실화반응의최근동향과전망 719 Fig. 4. Enzymatic acylations of disaccharides top sucrose, bottom trehalose with divinyl adipate in organic solvents for the synthesis of organogelators [33]. Fig. 5. Hypothesis of how the orientation of the oxyanion loop affects the activation of water [34]. 4. 수용액서의효소아실화반응 연구자들이오랜동안 AT와가수분해효소의단백질의형태가비슷하며, 촉매반응의기제가비슷할것이라고여겨져왔으나, 반응성이다른현상의분자수준의설명은오랜동안미스테리로남아있었다. 최근, Kazlauskas 등은 Haemophilus influenza 유래 homoserine acyl transferase (HiHAT) 과 Pseudomonas fluorescens 유래의 esterase (PFE) 의 X-ray 구조비교분석을통하여, 활성중심에서 oxyanion loop의방향이가수분해효소 (esterase/lipase) 에서는 carboxyl oxygen이활성중심쪽으로향하지만, AT 에서는 amide의 NH가활성중심으로향하고있음을보고하였다 [36]. 두단백질은아미노산서열로는 13% 정도의상동성을가지는데,. 아미노산의비교로는알수없는단백질의구조를 X-ray 구조분석을통해서분석하였다. Eesterase에서는주쇄의 carboxyl oxygen과다른물분자 (attacking water) 사이에또다른물분자 (bridging water) 가있어서 acyl-enzyme (serine) 복합체를공격할수있도록하지만, AT에서는 bridging water가 attacking water를불활성화하여가수분해가되지않는다고보고하였다 (Fig. 5). AT 가수용액에서도물이대량으로존재하더라도물에의해 acyl donor가가수분해되지않고, alcohol ( 혹은 amine) nucelophile에의해서 acylation이되는기제를설명한것이다 [36]. 한편 Neang 등은, 원래 Candida antarctica 유래의 lipase A (CalA) 와 30% 정도의아미노산서열유사성을가진 Candida parapsilopsis 유래의 lipase 유사단백질 (CpLIP2) 이, 물의활성도 (A w ) 가 0.9가되는거의수용액에서, 가수분해보다 alcoholysis를촉매하는것을관찰하였다. 더나아가, Candida tropicalis 유래의 CtroL4 (CpLIP2와 59% 상동성 ) 와 Aspergillus flavus 유래의 AflaL (CpLIP2와 35% 상동성 ) 도, CpLIP2와유사하게같은조건에서가수분해보다 alcoholysis를촉매하는것을관찰하고세단백질의아미노산서열을분석한결과 alcoholysis 반응도와아미노산 homology가관련성을맺고있음을보고하면서, CpLIP2과 CtroL4는 AT로, CalA와 AflaL 는 lipase 분류하였다 [37,38]. 이러한가수분해효소와 AT의 X-ray 구조와아미노산서열비교를통해, AT 를이용하여수용액에서도 Fig. 6. Enzymatic acyations in aqueous media using AT. acylation 반응을수행할수있음을보여주었다 (Fig. 6). 기초연구를통해기존의유기용매에서가능하던아실화반응을수용액에서도수행할수있음을보여주는예들이라고하겠다. Tang 등은고지혈증치료제로쓰이는 polyketide 계화합물 lovastatin 의생합성경로의연구과정에서, lovastatin의생합성마지막단계, 즉 monacolin J (multihydroxyl 화합물 ) 에 methylbutyryl CoA thioester를 acylation 반응하는단백질인 LovD를가지고, 구조가약간다른 acyl donor인 α-dimethylbutyryl-s-methyl-mercaptopropionate (DMB-S-MMP, 값이비싼 dimethyl butyryl CoA thioester대신사용함 ) 를이용하여 acylation 이가능함을 E. coli를이용하여 in vivo에서확인하였다 [39]. 더나아가서 Tang 등은 LovD를 in vitro 단백질공학기술인 directed evolution에의해개선된 engineered LovD를통해촉매활성, 용해도, 열안정성을증가시켰다 [40]. Codexis 사는이기술을 license in하여, directed evolution, substrate engineering 등을통해 in vitro에서대량생산에성공하여, 2012년미국녹색화학대통령상을수상하였다 [41]. 기존의화학적합성에서는 simvastatin을합성하기위해서 Fig. 7. Engineered AT (LovD)-catalyzed One step synthesis of cholesterol lowering drug, simvastatin [39].
720 박오진 다단계의보호기의도입과탈리의과정을거치게되는데, UCLA의 Tang 교수그룹은 Codexis 사의연구진들과함께한단계의효소반응을통해이것을완성하였다 (Fig. 7). 이를통해 AT를이용하여, 수용액에서도위치선택적인 acylation 반응이산업단계에서가능함을보여주었다. 특별히 PKS와 NRPS에서사용되는 AT는단백질공학을이용하여 in vivo에서뿐아니라 in vitro에서도 acylation 을위한좋은후보단백질이될수있을것이다 [42]. 5. Regioselective Modifcation of Natural Products Through Enzymatic Acylations in Aqueous Media-PKS & NRPS 미생물이나식물로부터얻어지는천연물은시장에진출한의약에서많은부분을차지하고있으며, 항암제, 면역억제제, 항생제등다양한생물활성을나타낸다. 이러한물질들은기본구조 (scaffold) 에변화를주어새로운약물특성을갖도록하거나, 새로운효능을갖게할수있다. 과거 20년동안등장한신약의 2/3은 polyketide 나 nonribosomal peptide의유도체이다 [43]. 특별히 PKS나 NRPS를통해합성되는 polyketide나 nonribosomal peptide는구조적다양성과약효의우수성으로연구가활발히진행되고있으며, 그생합성경로가밝혀짐에따라이러한화합물의 in vivo 합성과정에서사용되는 acyl transferase와 glycosyltransferase 새롭게밝혀지고있다 [42,44-46]. Tang 등은이러한 acyl transferase나 glycosyltransferase 류의효소가 polyketides나 nonribosomal peptides에서천연물의다양성을제공하는기능을담당하는주요한효소라고여겨, decorative enzyme ( 수식효소 ) 라고부르고있다 [47,48]. 최근들어이러한 acyl transferase를 in vivo에서대사공학을통해다른균주에대사경로를 cloning하여생산량을늘리거나, modular 형태의 PKS나 NRPS의성질을이용하여 hydrid 천연물을생산하고자하는연구가진행되고있다 [49-51]. 기존의연구들은 PKS나 NRPS의전체 assembly 과정의관점에서 in vivo 합성에촛점이맞추어져왔다 (combinatorial synthesis). In vivo 에서사용되는 acyl donor인 acyl CoA thioester 대신에 simvastatin 합성의경우와같이간단한구조의다양한 acyl donor analog를사용한다면, in vitro에서천연물의구조변화를 acyl transferase 혹은가수분해효소나 glycosyltransferase를사용해서할수있을것이다 (combinatorial biocatalysis) [43,52]. 그러나 PKS나 NRPS의경로를먼저밝힘으로서얻어지는다양한정보가 in vitro combinatorial biocatalysis 에유용하게쓰일것이다. 효소의아실화반응이가장크게각광을받는응용분야는다양한관능기를갖고있는 (multifunctional) 천연물의변형을통해새로운가능성을개척하는것이다 [53]. 이를통해이미다양한천연물의다양성을더욱확대할수있을것이다. 효소를이용한아실화반응이가장광범위하게연구되고있는분야는천연물의구조를변화시켜새로운혹은더욱강화된생물학적약물특성이나약물전달특성을갖도록하는것인데, 이를통해약물활성, 안정성, 약물동력학적특성이향상되는결과를가져오게된다. 다음은몇가지천연물의경우에특별히 acylation의관점에서최근주목을받고있는몇가지예를살펴보고자한다. 5-1. In vitro Acylations with Hydrolases and Acyl Transferses for the Modification of Paclitaxel Analogs 항암제로사용되는 taxol은좋은효능에도불구하고, 물에잘녹지않음으로인하여약물전달의제한점을갖고있다. Dordick 등은잘녹지않는 Paclitaxel의용해도를증가시키고자단백질가수분해효소 thermolysin을사용하여유기용매에서 divinyladipate를 acyl donor로사용하여 2 위치에위치선택적으로도입한뒤 (100% yield), 다시 Novozym 435를이용하여 deacylation을통해 1개의 amide, 3개의 ester, 1개의 internal ester 등은반응하지않고 adipate의 terminal vinyl ester만 acid 형태로전환되었다 (Fig. 8). 이를통해 1,700배의용해가증가하였다 [54]. 식물주목에서 taxol의생합성경로는모두밝혀져있다. 한편식 Fig. 8. Regioselective acylation and deacylation of paclitaxel using the combination of protease and lipase [54].
효소를이용한아실화반응의최근동향과전망 721 Fig. 9. AT-catalyzed regioselective acylation of 10-deacetylbaccatin III in aqueous media [55]. 물체에서 Taxol의생합성경로를통해얻어진 acyl transferase를이용하여 Taxol analog를합성하는연구는, Taxol 의항암특성을개선할수있는방법이될것이다. Walker 등은재조합 E.coli에서 10-deacetylbaccatin III에 in vivo에서합성된 acetyl CoA thioester를사용하여 10-OH에위치선택적으로 acylation을할수있음을보고하였다 [55]. Croteau 등은 taxol의 in vivo 합성경로에서가장마지막단계에해당하는 N-acylation에대해조사하였다. Aliphatic/aroyl CoA thioester 에대해서 N-acyltransferase 의기질특이성을조사한결과, aroyl transferase임을보고하였다 [56]. Walker 등은 N-dearoylpaclitaxel에다양한 CoA thioester에대해서 BAHD N-aroyl transferase의기질특이성을조사하였다 [57]. Taxus 식물에서 BAHD family에속하는 N-benzoyltransferase를 cloning 하여 E. coli에서발현한뒤, 정제한단백질로 in vitro에서다양한 acyl (aliphatic/aroyl) CoA thioester (benzoyl; ortho-, meta-, and para-substituted benzoyls; heterole carbonyls; alkanoyls; and butenoyl) 에대해 acylation 활성을조사하였다. Hexanoyl, acetyl, and butyryl기가 butenoyl, benzoyl기에비해우수한활성을나타내었다. 물론각각의 taxol analog에대해약효평가는하지않았지만, 이러한개념을통하여다양한 taxol analog에대한합성을통한선구물질에대한조사를할수있을것이다. 5-2. Regioselective Modification of Rapamycin Sirolimus라고도알려진 rapamycin은 31개의탄소로이루어진 polyketide 계통의면역억제제로서, Wyeth 사에의해판매되고있는 macrolide 계통의약물이다. 최근, 항체생산을위해서다양한변형약에대한연구가진행중이다. 특별히 rapamycin의 hemisuccinyl terminal methyl, benzyl ester를반응물로 Pseudomonas sp. 유래의 Lipase Amano LPL-80 가지고 terminal ester와 internal ester의가수분해실험을한결과 benzyl ester는 internal ester가가수분해되지않고, methyl ester는상당부분이 rapamycin으로가수분해되었다 [58]. Pfizer 사는 rapamycin 유도체를항암제로서의가능성을조사하는과정에서, 42번째위치한 hydroxyl기를선택적으로변화시키고자하였다. 41-desmethoxyrapamycin을이용한 lipase에의한 acylation 실험에서, 널리쓰이던 vinyl ester [19] 대신에 quartenary carboxylic acid monooxime ester를사용하였는데, 이는공정에서도큰문제없이쓰일수있는 acyl donor이다 (Fig. 9)[59]. 가수분해반응에서나 acylation 반응에서 lactone ring은영향을받지않았다. 5-3. Tetracycline Tetracyclne은방향족 polyketide 로서그람양성, 음성균에효능을가진항생제이다. 내성균의맞서서, tetracycline이가지는 2-naphthacenecarboxyamide의구조를유지하는 2, 3 세대항생제로서, minocycline, doxycycline, tigecyclne등이등장하게되었다. 이러한성공은 tetrcycline 중심구조 (scaffold) 의수식을통해새로운항생제개발을위한출발점이될수있음을시사한다 [60]. 물질 SF2575는 tetracycline계의천연물로서방선균 Streptomyces sp. SF2575. 으로부터생산되는데, 항암제의성질을가진천연물이다. SF2575를비롯하여, oxytetracycline, chlortetracycline 등은방선균의 type II PKS에의해 malonyl-coa를기본물질로하여 Claisen-like decarboxylate condensation에의해합성된다. SF2575의생합성경로에서거의마지막단계에서 salicylic acid를 scaffold 의 C4 위치에아실화반응을촉매하는효소 SsfX3는다른 PKS의 AT와는성질이다르다. SsfX3 단백질은 tetraccycline에작용하는첫번째로보고된 AT 이다 [61]. X-ray 구조분석을통하여당에결합하는 N-말단의 sandwich domain 과촉매부위에해당하는 C-말단은가수분해효소 (hydrolase) 의구조를갖는 GDSL 계열인것이밝혀졌다. 돌연변이실험을통하여 N-말단결합부위를제거하였을때, 반응성이사라지는것이확인되었다. 고무적인것은 Taxol의 DBAT 와같이, salicylic acid 이외에도다양한 acyl group을전이할수있음이밝혀졌다 (Fig. 10). 따라서다양 Fig. 10. Lipase catalyzed regioselective acylation of 41-demethoxyrapamycin with two acyl donors [59].
722 박오진 Fig. 11. Structure of Tigecycline (a) and regioselective acylation of SF2575 with SsfX3 (b) [61]. 한 SF2575 유도체의구조-활성분석에따라우수한항암활성혹은다른생물학적활성을가진화합물 library의제조가가능할것이다. BLAST 검색을통하여 SsfX3와단백질서열이유사한기능이밝혀지지않은단백질들이검색되는것을통해, 천연물합성 ( 계통은다르지만 ) 에관여하는 AT들이비슷한구조들을가지고있음을보여주었다 [62]. 더나아가 Tang 그룹은세가지 tetracycline (SF2575, oxytetracycline, dactylocycline) 의생합성유전자를 S. lividans K4-114 에서발현하여각화합물의생합성경로에서불분명한반응들을해석하는데성공하기도하였다 [63]. 이와같은노력들은 heterologous platform을통해 combinatorial synthesis에의한 tetracycline 유도체의합성을가능하게하며, in vitro에서이러한효소들을사용하여대량생산의가능성을열어주는연구라고하겠다. daptomycin 유도체를만들기위한노력이시작되었다고해도과언이아닐것이다 [66-68]. Actinoplanes utahensis 균주에서발견된 deacylase 를이용하여 decaonyl기를제거하는효소화학적 (chemoenzymatic) 방법을통하여 daptomycin의 scafffold를만든후, 다시유도체를합성하기위해 N-말단을 tert-butoxycarbonyl (tert-boc) 으로보호하고다시아실화반응 (activated acyl donor) 후탈리하는과정을거쳐서다양한약물에대한구조-활성실험을하였다 [69,70]. Daptomycin의생합성경로에대한이해가증가함에따라구조-활성을통한다양한구 5-4. Daptomycin Daptomycin 은방선균 Streptomyces roseosporus 에서유래된 A21878C 인자들가운데하나로, 1970년대 Eli Lilly 사가항생제로개발하던중근육독성으로인해개발이중단되었다가, 2003년 Cubist Pharmaceuticals 사에의해다시정맥주사로 FDA의승인을받은 MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 균을포함한그램양성균에작용할수있는약물로서, 2006년도에는 bacterimia 증에도승인을받은 acidic lipopeptide 계열의항생제이다 (Fig. 11) [64,65]. 이미 1988년도에, 장차 daptomycin 내성균의출현에대비하여반합성 Fig. 12. Structure of antibiotic daptomycin produced from Streptomyces roseosporus [64].
효소를이용한아실화반응의최근동향과전망 723 Fig. 13. Chemical Structures of Pleuromutilin and Retapamulin [74]. 조를가진유도체의합성을가능하게하고있다. 비슷한방법으로, 항진균제인 Echinocandin B를 nucleus (scaffold) 로만드는방법의하나로, linoleyl기를제거하는과정에서 Actinoplanes utahensis 균주에서발견된 deacylase를사용하였다. Daptomycin과 echinocandin B에서볼수있듯이, scaffold를변형시키는것뿐아니라, scaffold를만드는과정에서도효소는기본구조를유지하면서변형시킬수있는 in vitro 에서유용하게사용할수있는도구이다 [70-73]. 즉 combinatorial biosynthesis에의해 scaffold를만드는과정에서 in vivo 반응과함께, in vitro에서다양한 analog를합성하는과정에서 deacylase를비롯하여 hydrolase, AT 등을사용할수있다. 5-5. Retapamulin Repapamulin는 GSK 사가개발한 pleuromutilin의반합성 (semisynthetic) 항생제로서, MRSA에대항하여 2007년도에승인을받았다 [74]. 다른항생제와는달리, 항생제의기제가달라서교차저항성의문제도없다. Pleuromutilin은곰팡이 Clitopilus passeckerianus에서유래한천연물인데, 분자내에 1개의 internal ester와 2개의 hydroxyl기가존재한다. 현재 retapamulin은크림형태나외용형태로승인이되었다. 여러제약회사에서이제품의유도체를경구형으로개발하려고노력하고있다 [75]. Pleuromutilin은세개의 ring으로구성된 diterpene으로서, 상업적으로는곰팡이 C. passeckerianus의발효에의해생산되나농도가그리높지않다. 현재경구형개발이성공한다면, 수요는급속히늘어날전망이다 [75]. Taxol의경구형개발을위해 lipase/protease의조합을통해용해도의개선이가능했듯이 [54], 그리고 pleuromutilin의구조상 internal ester 와 2개의 hydroxyl의선택적변형을위해 cetraxate의합성에서사용된 Microbacterium sp. 7-1W 유래의 esterase나 Acinetobacter calcoaceticus 유래의 hydrolase 등은이러한 peluromutilin 유도체의합성에유용한재료가될것이다 [76,77]. 5-6. Enzymatic Macrocyclization & Thioesterases (TE) PKS and NRPS로부터유도된많은천연물은 8개혹은그이상의원자를포함한 macrocyclic ring을가지는데유기합성으로는합성하기어려운구조를가지고있다. Macrocylic lactone, lactam을합성하는데는다단계의보호기의도입뿐아니라, 3차원적구조로인한엔트로피와엔탈피인자, 위치선택성, 분자간의 dimer/oligomer가형성등의문제가있다 [43]. TE는보통마지막 PKS 산물이 cyclization이나외부의 nucleophile의공격에의해서방출될때역할을담당하게된다. PKS의한부분에해당하는 thioesterase (TE) 또한 acyl 전이반응의후보생체촉매가될수있다. TE는보통 serine hydrolases 에서발견되는 serine, histidine, Fig. 14. TE-mediated macrocyclization; 1) transfer of final intermediate to TE active site serine 2) regioselective intramolecular cleavage of the acyl-enzyme intermediate by an internal nucleophile [43]. aspartate catalytic triad를갖고있다. 따라서 O-acyl 효소중간체를형성하고아민이나알콜에의한위치선택적공격으로 lactone 혹은 lactam을형성한다 (Fig. 14). TE는 macrocylization 반응뿐아니라 cross coupling이가능함이보고되고있다 [43,78]. Daptomycin의경우 TE는 NRPS의 C-terminal 영역에존재하는데, TE는 activated thioester의 macrocyclization을담당하는것으로알려져있다 [64]. Daptomycin과유사한구조의 CDA의합성에쓰이는 TE를재조합형태로만든뒤, daptomycin의유도체들을합성하였다 [70]. In vitro에서선형의 thioester들을 A54145나 daptomycin의 NRPS의 TE domain으로 cyclization을하여 hybrid 형태의분자를만들기도하였다 [71]. 이와같은기초연구뿐아니라 simvastatin의합성에서사용된 LovD가 TE의성격을가지고있다는것을볼때, 재조합 TE는효소화학적으로 macrocyclic 천연물의 scaffold를만들수있는유용한효소가될수있어서환경친화적이며유기합성에서보조적인도구가될수있을것이다 [77-80]. 7. Rational Design and Directed Evolution of Acylation-Related Enzymes 보통 PKS나 NRPS를통해합성되는천연물등의생합성경로에서관여되는유전자들을목표를가지고재설계하는것을일컬어보통 combinatorial biosynthesis라고한다 [81]. 그러나, coorindated tuning 과만족할만한수준의생산량을위해서는앞으로서많은연구가필요할것이다. 이러한 in vivo의목적을달성하기위해서뿐아니라, hybrid 천연물을만들기위해서는목표반응에있어서의기질에대한반응성이향상된효소가필요할것이다. 이를위해서뿐아니라, in vitro에서 enzymatic acylation과관련된효소 (hyrolases, AT, TE) 들은여러가지특성면에서개선의필요성이있다. 이러한개선을위해최근콤퓨터를이용한계산화학을통한 rational design [82] 과 HTS를통한 directed evolution 방법은, 기존의단일반응의선택성을개선하는단계를넘어서, 필수적인단계가될것이다 [83]. 개선된 acylation 관련효소는다시 combinatorial synthesis 조립라인에투입되어, hybrid 천연물의제조에사용되게될것이다.
724 박오진 8. 전망 효소를이용한 acylation 연구는 90년대의간단한 chiral intermediate 의합성을넘어, 구조가훨씬복잡한기능성구조물질, 고분자의합성에도쓰이고있다. 특별히천연물의변형에서그응용을찾아가고있는중이다. 또다른한편으로 in vivo에서 PKS나 NRPS를통해천연물의조립라인을최적화하는연구가계속되고있는데, 천연물의기본단위들을 in vitro에서합성하기어렵기때문에 combinatorial biosynthesis를통해 scaffold를만들고, combinatorial biocatalysis가혼합된형태가앞으로점점더많아질것으로전망된다 [64]. 또한, PKS나 NRPS에서밝혀지는다양한 AT들은, bioinformatics나 metagenomics를통해서얻어지는 AT들의후보군을더확장하게될것이며, 이를바탕으로구조와아미노산서열분석을통해 AT, TE 효소들의특성에대한이해가더늘어나게될것이다. 이러한이해의증가를바탕으로, 계산화학에의한또는 irrational approach인 in vitro protein engineering의기본적인정보를제공하게될것이다. 머지않아서시약제조판매회사에서 AT library 제공할날도멀지않을것으로예상된다. Combinatorial biosynthesis에서얻어지는 acylation 관련효소들의최적화를위해 directed evolution은많은잠재력을가지고있다. 기존의가수분해효소, AT, TE의조합적인사용에의한 in vitro combinatorial biocatalysis와 combinatorial biosynthesis의서로유용한보조도구가될것이다. 또한 in vitro에서천연물의아실화반응을위해서는, simvastatin 에서처럼, 생체내에서 acyl donor로사용되는 CoA ester 대신에 in vitro에서간단한 acyl donor로대치할수있는연구와반응시스템에대한연구도필요할것이다. Daptomycin과 Simvastatin의예에서보았듯이, 가수분해효소와 AT 및 TE의응용은, 구조-약효관계 (SAR) 를조사하기위한연구단계에서뿐아니라, 기존약의변형에의한항생제내성을방지하기위한신약창제 [84], 그리고 generic 의약의경제적생산을위한도구로서도, 앞으로기대가되는방법이라고할수있다. 또한 modular combinatorial biosynthesis를위해 in vitro에서효소의최적화를통해서, 단백질공학과대사공학을결합하여, 화학적으로얻기에는어려운 compound library를방선균이나다른적절한균주를통해얻게될것이다 [85]. References 1. Faber, K., Biotransformations in Organic Chemistry, Springer, 1997. 2. Roberts, S. M., Preparative Biotransformations : the Employment of Enzymes and Whole-cells in Synthetic Organic Chemistry, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 157-170(1998). 3. Turner, N. J. and O'Reilly, E., Biocatalytic Retrosynthesis, Nature Chem. Biol., 9, 285-8(2013). 4. Liese, A., Seelback, K. and Wandrey, C., Industrial Biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim, 2006. 5. Strohmeier, G. A., Pichler, H., May, O. and Gruber-Khadjawi, M., Application of Designed Enzymes in Organic Synthesis, Chem. Rev., 111, 4141-4164(2011). 6. Schmid, A., Dordick, J. S., Hauer, B., Kiener, Wubbolts, A. M. and Witholt, B., Industrial Biocatalysis Today and Tomorrow, Nature, 409, 258-268(2001). 7. Bornscheuer, U. T., Huisman, G. W., Kazlauskas, R. J., Lutz, S., Moore, J. C. and Robins, K., Engineering the Third Wave of Biocatalysis, Nature, 485, 185-194(2012). 8. Park, D. and Lee, J., Biological Conversion of Methane to Methanol, Korean J. Chem. Eng., 30(5), 977-987(2013). 9. Min, E.-J. and Lee, E.-S., Energy Consumption of Biodiesel Production Process by Supercritical and Immobilized Lipase Method, Korean Chem. Eng. Res.(HWAHAK KONGHAK), 50(2), 257-263(2012). 10. McLachlan, M. J., Sullivan, R. P. and Zhao, H., Directed Enzyme Evolution and High-Throughput Screening in Directed Enzyme Evolution and High-Throughput Screening, in Biocatalysis for the Pharmaceutical Industry : Discovery, Development, and Manufacturing, eds. Tao, G.-Q. Lin, and A. L., Ch. 3, 45-64 John Wiley & Sons(2009). 11. Boersma, Y. L., Dröge, M. J. and Quax, W. J., Selection Strategies for Improved Biocatalysts, FEBS J., 274, 2181-2195(2007). 12. Wang, M., Si, T. and Huimin, Z., Biocatalyst Development by Directed Evolution, Biores. Technol., 115, 117-125(2012). 13. Quin, M. B. and Schmidt-Dannert, C., "Engineering of Biocatalysts: from Evolution to Creation, ACS Catal., 11017-1021(2011). 14. Patel, R. N., Synthesis of Chiral Pharmaceutical Intermediates by Biocatalysis, Coord. Chem. Rev., 252, 659-701(2008). 15. Zaks, A. and Klibanov, A. M., Enzymatic Catalysis in Organic Media at 100 o C, Science, 224, 1249-1251(1984). 16. Zaks, A. and Klibanov, A. M., Enzyme Catalyzed Processes in Organic Solvents, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3192-3196 (1985). 17. Riva, S., Chopineau, J., Kieboom, A. P. G. and Klibanov, A. M., Protease-catalyzed Regioselective Esterification of Sugars and Related Compounds in Anhydrous Dimethylformamide, J. Am. Chem. Soc., 110, 584-589(1988). 18. Takashi Kobayashi, Lipase-catalyzed syntheses of sugar esters in non-aqueous media, Biotechnol. Lett., 33(10), 1911-1919(2011). 19. Paravidino, M. and Hanefeld, U., Enzymatic Acylation: Assessing the Greenness of Different Acyl Donors, Green Chem., 2651-2657(2011). 20. Sheldon, R. A., The E Factor: Fifteen Years on, Green Chem., 9, 1273-1283(2007). 21. Barbayianni, E. and Kokotos, G., Biocatalyzed Regio- and Chemoselective Ester Cleavage: Synthesis of Bioactive Molecules, ChemCatChem, 4, 592-608(2012). 22. Schoevaart, R. et al., Chiral Technology: Industrial Biocatalysis with Standard Hydrolytic Bulk Enzymes, Spec. Chem. Mag., 27(8), 38(2007). 23. Miyazawa, K. and Yoshida, N., Process for Producing Optically Active α-hydroxyesters Using Lipase PS, UP 5248610 (Chisso, Japan) (1993). 24. Kobayashi, S., Enzymatic Polymerization, Encyc. Polym. Sci. Tech., 2011. 25. Kobayashi, S., Recent Developments in Lipase-catalyzed Synthesis of Polyesters, Macromol. Rapid Comm., 30, 237-266(2009). 26. OECD Primer, The Application of Biotechnology to Industrial Sustainability-a Primer, Organization for Economic Co-operation and Development (OECD), 2001. 27. Binns, F. and Taylor, A., Enzymatic Synthesis, WO 1994012652
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