인천연안에서 분리 배양된 섬모충류의 형태 및 분자분류학적 연구

요약 인천연안에서 분리된 섬모충류 대상으로 총 5속 7종을 단종 배양을 시도 하여 QPS method를 이용하여 섬모구조를 기반으로 한 형태를 확인하였으며 이들의 18S rrna gene 의 염기서열을 분석 하였다. 섬모충류는 형태적 분 류에 있어 유사종과 유사한 섬모구조 및 생활사에 따른 외부 형태 변이 등 염색을 통한 분류의 어려움이 있다. 이러한 형태적 분류의 어려움을 보완하 고자 2003년 춘계, 하계, 추계, 동계에 걸쳐 인천연안에서 채집된 섬모충류 를 분리 배양하여 18S rdna 염기서열 분석을 이용한 분자적 분류를 시도하 였다. 염색을 통한 형태분류와 염기서열 데이터를 비교하기 위하여 여섯 종 의 섬모충류를 대상으로 실험하였으며 유종섬모충류의 속하는 Favella panamensis Kofoid & Campbell, 1929 와 Tintinnopsis sp. 를 포함하여 빈모류에 속하는 Strombidium sp., 하모류에 속하는 Euplotes vannus (Mϋ ller, 1786) Minkjewicz, 1901, Euplotes raikovi Agamaliev, 1966, 채찍 섬모충류에 속하는 Uronema marinum Dujardin, 1841 를 확인하였다. 6개 의 염기서열 중 Strombidium sp. 과 Tintinnopsis sp. 두 종의 염기서열이 기존의 보고되 종들과 다른 염기서열을 갖고 있음을 밝혔다. 이 두 종은 기 존의 빈섬모충류의 S. inclinatum과 96-97% 유사도를 보이고 Tintinnopsis sp.는 T. tubulosoides 와 96-97%의 유사도를 보여 다른 염기서열임을 확 인하였다. 이 연구를 통하여 18S rdna gene의 분석을 이용하여 섬모충류의 분자적 분류가 가능함을 확인하였다. - I -

Abstract Although ciliates are important component of pelagic food web, many ecologists however, have had difficulties in identification based on morphological and ecological criteria. In this study, methods of QPS and 18S rdna sequences comparison have been carried out to identify the ciliates collected from Incheon coastal water. Cultured ciliates were identified as six species in five genera of five families from QPS and 18S rdna sequence analyses : Euplotes vannus (Mϋller, 1786) Minkjewicz, 1901; Euplotes raikovi Agamaliev, 1966; Strombidium sp.; Favella panamensis Kofoid & Campbell, 1929; Tintinnopsis sp.; Uronema marinum Dujardin, 1841. Among them, the 18S rdna sequences of Tintinnopsis sp. and Strombidium sp. were newly identified. This study showed that analysis of 18S rdna gene was used for identified marine ciliates more easily. - II -

목 차 국문요약 ⅰ 영문요약 ⅱ 목차 ⅲ 그림목차 ⅴ 표목차 ⅵ 1. 서론 1 2. 재료 및 방법 3 2.1 연구지역 3 2.2 종의 분리와 배양 4 2.3 Quantitative Protargol Staining (QPS) 5 2.3.1 실험 재료 6 2.3.2 시약 7 2.3.3 실험방법 8 2.4 18S rdna의 분석 11 2.4.1 Genomic DNA의 추출 11 2.4.2 18S rdna 증폭 11 2.4.3 18S rdna Cloning 12 2.4.4 유전자 염기서열분석과 계통학적 분석 12 3. 형태학적 용어 설명 15 3.1 섬모충의 일반적 용어 설명 15 4. 결과 18 4.1 종목록 18 - III -

4.2 종의 기재 20 4.2.1 Euplotes vannus (Mϋller, 1786) Minkjewicz, 1901 20 4.2.2 Euplotes raikovi Agamaliev, 1966 21 4.2.3 Tintinnopsis sp. 22 4.2.4 Favella panamensis Kofoid & Campbell, 1929 23 4.2.5 Strombidium sp. 25 4.2.6 Uronema marinum Dujardin, 1841 26 5. 토의 27 6. 참고문헌 29 - IV -

List of Figure Fig. 1. Location map showing study area in the Incheon coastal area. 3 Fig. 2. Schematic figures of protargol-stained Euplotes vannus (Müller, 1786) Minkjewicz, 1901. 39 Fig. 3. Schematic figures of protargol-stained Euplotes raikovi Agmaliev, 1966 40 Fig. 4. Schematic figures of protargol-stained Tintinnopsis sp. 41 Fig. 5. Schematic figures of Favella panamensis Kofoid and Campbell, 1929. 42 Fig. 6. Schematic figures of protagol-stained Strombidium sp. 43 Fig. 7. Schematic figures of protagol-stained Uronema marinum Dujardin, 1841. 44 Fig. 8. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of the ciliates group. 45 Fig. 9. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of Euplotes. 46 Fig. 10. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of Tintinnids group. 47 Fig. 11. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of Strombidium. 48 Fig. 12. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of Uronema. 49 - V -

List of Table Table 1. List of species that isolated from Incheon coastal water 4 Table 2. Sequences of primers used for ciliate's 18S rdna analysis 14 Table 3. Morphometrics of investigated species 38 Table 4. Similarity values among 18S rdna sequences of Euplotes. 50 Table 5. Similarity values among 18S rdna sequences of Tintinnid group(%) 51 Table 6. Similarity values among 18S rdna sequences of Strombidium (%) 52 Table 7. Similarity values among 18S rdna sequences of Genus Uronema (%) 53 Appendix 1. Alignment of 18S rdna sequence for taxa used in the analysis. 54 - VI -

1. 서론 원생동물에 속하는 섬모충류는 해양에서 빈번하게 출현하며 해양의 부유 생태계에서 에너지 전달자로 그 중요성에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다(Burkill et al., 1987; Porter et al., 1985; Sherr and Sherr, 1987; James and Hall, 1995). 또한 높은 성장률과 약한 세포막을 가지고 있어 환경 변화에 즉각적이고 민감한 반응을 나타내어 오염모니터링에 이용하는 연구도 시도되고 있다(Cairns et al., 1972; Dale, 1991; Foissner, 1992; Pratt and Balczon, 1992; Xu et al, 2002). 해양의 미세생물 먹이망에 대한 개념이 제시된 1980년대 이후, 해양 생 태계내에서 섬모충류 역할이 중요시 되어 이에 대한 연구가 지속적으로 이 루어지고 있지만 섬모충류는 형태 관찰이 어렵고 유사종과 생활사에 따른 형태변이 등이 존재하기 때문에 형태 분류에 대한 연구는 미흡한 실정이다 (Montagnes and Lynn, 1991). 우리나라에서 해양 섬모충류의 분류에 대한 연구는 김(1986), 유 등 (1988), 유와 김(1990), 이와 김(2000)의 피갑구조에 의한 한국산 유종섬모 충류에 대한 분류학적 연구가 있었으며 이(2002)의 섬모구조에 의한 인천 연안에서 출현하는 빈섬모충류가 연구되었고 Lei et. al.(2002)에 의한 신속 과 신종 보고 등이 이루어졌다. 그러나 분류연구가 섬모충류의 일부 그룹 혹은 일부 지역에 한하여 제한적으로 이루어져있으며 이러한 분류연구의 부 족은 원생동물의 생태를 연구하는데 어려움을 준다(Montagnes and Lynn, 1991). 이와 같은 이유로 해양 부유생태계에서 생태연구를 위한 미소형 플랑크톤 - 1 -

에 대한 분자적 분류가 Lim(1996) 등에 의해 시도되었고 최근 섬모충류에 대해서도 분자학적 접근이 시도가 되었다(Bernhard, 2001; Chen and Song, 2002; Strüder-Kypke and Lynn, 2003). 우리나라에서의 섬모충류 의 분자적 연구는 담수에서의 하모류에 대한 계통분류 및 분자진화연구 (Shim, 1988)와 연안수에서 분리된 Strombidinopsis jeokjo 의 염기서열 분석과 섬모충류의 프라이머 제작 등의 연구가 이루어진 바 있다(Jeong et al., 2004). 본 연구에서는 섬모충류에 대한 분자적분류 연구의 하나로 인천연안에서 출현한 섬모충류에서 종을 분리하여 프로타골(protargol) 염색과 18S rdna 염기서열 분석을 시도하였다. 연구에 사용된 18S rdna 염기서열은 단백질 합성에 관여하는 물질로 보존성이 높아 진핵생물의 모든 그룹에 대 하여 분자적 분류에 널리 쓰이고 있다(Lim, 1996). 따라서 18S rdna 분석 을 통해 섬모충류에 대한 분자분류학의 가능성을 확인하고자 하였으며 섬모 충류의 염기서열 분석을 통하여 분류를 용이하게 하고 보다 정확한 종 동정 을 통하여 생태연구의 기초자료로서 활용하고자 하였다. - 2 -

2. 재료 및 방법 2.1 연구지역 시료를 채집한 인천 연안은 대조일 때 9 m의 조차를 갖는 조석영향이 우 세한 지역으로서 얕은 수심과 담수의 영향으로 수온과 염분의 범위가 계절 과 조석에 따라 크게 변하며 한강으로부터 직접적인 담수의 영향을 받으나 조석에 의한 수직적인 혼합이 강하게 일어나 수괴가 잘 혼합되어있다. 담수 와 인간활동 등에 의한 영양염류의 유입이 큰 지역으로 인천연안은 부영양 화된 수괴를 나타낸다(Choi and Shim, 1988). Fig. 1 Location map showing study area in the Incheon coastal area. - 3 -

2.2 종의 분리와 배양 인천연안수에서 BPFU(Xu et al, 2002) 혹은 net 또는 자연해수에서 채 집한 섬모충류를 실험실로 옮겨와 해부현미경 하에서 파스퇴르 피펫을 이용 하여 분리하였다. 분리된 개체를 멸균된 해수에 여러 번 옮겨 이물질을 제 거시켰다. 배양은 수온 20, 염분 31 psu, 광주기 명:암(12:12)의 조건하 에서 이루어졌다. 실험에 사용된 섬모충류 중 Tintinopsis 속은 실험실내에서 분리 배양 없 이 20um net를 이용하여 채집하여 해부현미경하에서 피갑의 모양을 가지 고 분리하여 시료를 확보하였다. Table 1. List of species that isolated from Incheon coastal water. Date Prey Euplotes 2003 spring (BPFU method) bacteria Uronema 2003 Spring (BPFU method) bacteria Strombidium 2003 Autumn (Natural Sea Water) flagellates Favella 2003 Summer (Netting sample) flagellates Tintinnopsis 2003 Winter (Netting sample) - - 4 -

2.3 Quantitative Protargol Staining (QPS) 형태관찰을 위해 배양된 시료를 일정량 Bouin's solution에 고정한다. 섬모충류의 관찰을 위해서 live, methyl green-pyronin, dry silver nitrate, wet silver nitrate, silver carbonate, protargol staining 그리고 SEM(Foissner, 1991) 등 많은 방법이 이용되고 있다. 프로타골(protargol) 을 이용한 염색방법은 개체의 세포 구조를 관찰하는데 널리 쓰이고 있으며 슬라이드를 이용하여 보존할 수 있는 장점이 있다(Foissner, 1991). 프로타골(protargol) 염색방법은 프로타골(protargol)에 포함되어있는 은 성분이 섬모충의 섬모나 섬모근, 핵과 같은 구조의 단백질에 결합되는 원리 를 이용한 것이며 때문에 일반적으로 silver protein staining이라고 불린 다. 염색의 과정은 현상(developed) 과정을 통해 색의 대비를 높히고 은을 환원시킴으로서 구조들이 검게 보이게 된다. Quantitive Protagol Staining(QPS) 는 프로타골(protargol) 염색방법의 하나이다(Montagnes and Lynn, 1987). QPS 염색방법의 장점은 세포구조 (섬모근, 핵 등)를 염색시켜 관찰이 가능하다는 장점과 자연해수시료에서 섬 모충류의 동정이 가능하여 정량적이 분석이 이루어질 수 있으며 작은 크기 의 섬모충류도 쉽게 염색할 수 있다는 장점이 있다. 이 연구에서는 수정된 QPS 방법을 사용하였다. - 5 -

2.3.1 실험 재료 Alcohol lamp Columbia staining jars (Thomas Scientific, Catalog # 8542-C32): Screwcap 이 필요함. 각각의 시약에 따라 개별적으로 jar를 준비하여 jar 하나에 여러 시약을 담지 않는다. 구리조각 - 22 22 mm Cover slip - 22 22 mm Cover slip - 25 25 mm Filters (Millipore, Cat. #HAWP02500, 0.45 μm pore size, 25 mm diameter) Heating plate Gas torch Glasses square : 필터 후에 필터지 위에 agar를 코팅할 때 사용한다. Glass pasteur pipette : agar를 coverslip 위에 떨어뜨릴 때 사용한다. Plastic pipette Razor blade Stainless steel forceps Vacuum pump Vacuum flask, Milipore filter holder Weight : 슬라이드를 굳힐 때 사용하며 이 실험에서는 80g 의 볼트를 사용하였다. - 6 -

2.3.2 시약 Protargol powder (Polysciences, Inc., Cat. #01070; Merk): 제조사에 따라 다른 결과를 얻을 수 있다(Foissner et al., 1999). 2.5% (w/w)agar in distilled water 0.5% potassium permanganate, (KMnO 4 ) 5% Oxalic acid, (COOH) 2 2H 2 O 2% Oxalic acid, (COOH) 2 2H 2 O 4% sodium sulfite, Na 2 SO 3 /5% sodium carbonate, Na 2 CO 3 solution. Hydroquinone, C 6 H 6 O 2 1% gold chloride, AgCl 4 5% sodium thiosulfate, Na 2 S 2 O 3 5H 2 O Isoprophyl alcohol, CH 3 CHOHCH 3 : 30%, 50%, 70%, 95%, 100% Xylen, C 6 H 6 (CH 3 ) 2 Permount mounting media (Fishery Scientific) - 7 -

2.3.3 실험방법 1 day 1. 본래의 QPS 방법(Montagnes and Lynn, 1987)과 동일하게 단계를 준 비한다. 60 정도의 물에 2.5% Agar를 중탕하여 녹이거나 전자렌지를 이용한 다. Agar는 반드시 완전히 녹아야한다. 2. hotplate 위에 유리판과 커버슬립(coverslip:22 22 mm)을 올려놓는다. 3. Protargol solution을 준비한다. 0.2g 의 프로타골(protargol)을 jar에 준비된 10ml 증류수에 담는다. 프로타골(protargol)의 상태에 따라 염 색결과가 크게 영향을 받기 때문에 두개의 제품에서 각각 0.1g 씩 취했 다. 이때 휘저어 섞지 않고 그대로 용해시킨다. 4. 사용할 filter paper를 증류수에 적셔 놓는다. 5. 필터 세트를 이용하여 시료를 여과시킨다. 6. 해수가 제거되면 즉시 필터지(filter paper)를 hot plate 위에 올려놓은 데워진 유리판(약 60 )에 옮긴 뒤, 커버슬립위에 녹인 agar를 한 방울 떨어뜨려 필터지 위에 덮는다. agar 층이 고르게 굳기 위하여 필터지가 놓인 유리판을 hotplate 위에서 내려 커버슬립위로 핀셋 등으로 살짝 눌러 놓는다. 이 단계는 가능한 빨리 이루어지도록 한다. 7. agar가 굳으면 커버슬립으로 덮힌 나머지 가장자리를 칼로 제거한다. 한쪽 면을 제외한 3개의 면을 칼로 잘라낸다. 나머지 한 면은 핀셋으로 으로 필터지를 옮길 때 잡을 수 있도록 제거하지 않는다. agar로 코팅 된 필터지에서 커버슬립을 떼어낸 후 분리하여 증류수가 채워진 jar에 - 8 -

agar로 코팅된 쪽이 왼쪽에 오도록 담는다. 상온에서 1-5분정도 그대로 두어 agar 가 단단해지고 Bouin's solution의 색을 제거한다. 7. jar에 담긴 필터지를 (4장의 필터지를 jar에 담아 1세트를 준비함) 0.5% potassium permanganate가 담긴 jar에 5분간 둔다. 8. 증류수에 담긴 jar에 옮겨 담으며 시약을 제거한다. 이 과정을 10회 반 복한다. 9. 5% oxalic acid가 담긴 jar에 5분간 둔다. 10. 증류수에 담긴 jar에 옮겨 담으며 시약을 제거한다. 이 과정을 10회 반 복한다. 11. 위의 3에 준비한 protargol solution에 필터지를 담아 15-17시간 실온 에 둔다. 이 때 프로타골(protargol)은 완전히 녹아있어야 한다. 12. jar의 바닥과 필터지 사이 필터지 위에 모두 6개의 100% 에탄올에 보 관된 구리조각을 증류수로 세척하여 담는다(구리조각은 알콜램프등을 이용하여 산화시켜 100%에탄올에 보관하여 놓는다). 14. jar의 뚜껑을 닫는다. 2 day 1. Hydroquinone solution을 준비한다. 준비된 jar에 0.1 g의 hydroquinone을 10 ml의 5% (w/v) sodium sulfite/4%(w/v) anhydrous sodium carbonate solution에 녹인다. 유리막대를 이용하여 저으면 빨리 용해시킬 수 있다. 2. hydroquinone solution에 전날 준비된 필터지를 세척 없이 바로 옮겨 5분 동안 둔다. - 9 -

3. 증류수가 담긴 jar에 옮기면서 시약을 세척한다. 이 과정을 5회 반복한 다. 4. 1% gold chloride solution 이 담긴 jar 에 1분 동안 둔다. 5. 증류수가 담긴 jar에 옮기면서 시약을 세척한다. 이 과정을 10회 반복 한다. 6. 2% oxalic acid solution에 5분 동안 둔다. 7. 증류수가 담긴 jar에 옮기면서 시약을 세척한다. 이 과정을 10회 반복 한다. 8. 5% sodium thiosulfate solution에 5분 둔다. 9. 증류수가 담긴 jar에 옮기면서 시약을 세척한다. 이 과정을 5회 반복한 다. 10. isopropanol series를 이용하여 탈수시킨다. isopropanol alcohol 단계 는 30-50-70-95-100-100%을 준비하여 jar에 채운 뒤 5분씩 둔다. 11. xylen 으로 채운 jar에 5분 씩 둔다. 두 번 반복한다. 12. 50% xylen : 50% permount solution 으로 채운 jar에 30분 둔다. 13. permount를 slide에 한 방울 떨어뜨린 후 필터지를 놓고 커버슬립 (coverslip:25 25 mm)에도 한 방울 떨어뜨린 후 필터지 위를 덮는다. weight(80g)를 이용하여 눌러주면서 건조시킨다. permount가 완전히 굳기까지 수일에서 1주일정도 그대로 둔다. - 10 -

2.4 18S rdna의 분석 2.4.1 Genomic DNA의 추출 1. 배양된 생시료 혹은 netting 생시료를 해부현미경 하에서 파스퇴르 피펫 을 이용하여 50-100 개체를 1.5 ml microcentrifuge tube에 담는다. 가능한 해수를 제거하여 cell만 남도록 하며 고정시료가 아닌 생시료를 사용한다. 손이나 주위에 1.5 ml tube에 옮겨 담은 시료는 분석 전까지 영 하 80 에 보관한다. 2. DNeasy Tissue kit(qiagene, Stanford, USA)를 사용하여 제조사 방법 대로 DNA를 추출한다. 추출한 DNA는 영하 80 에 보관한다. 2.4.2 18S rdna 증폭 추출된 전체 핵산에서 섬모충류의 18S rdna를 증폭시키기 위하여 primer EuK A(5'-CTG GTT GAT CCT GCC AG-3')와 EuK B(5'-TGA TCC TTC YGC AGG TTC-3')를 사용하였다(Table 2). 반응 부피 50 μl 용량으로 핵산 증폭기 모델 2400 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA 94404)을 이용하여 95 에서 2분간 반응 후, (94 에서 15초, 60 에 서 30초, 72 3분으로 15회 반복) 반응시킨 후 다시 (95 에서 15초, 5 2 에서 30초, 72 3분으로 20회 반복) 반응시켰다. PCR 산물을 분석하 - 11 -

기 위해 1% 아가로즈 젤에 전기영동 (TAE 완충용액, 100 V/cm)하여, EtBr (0.5 μg/ml)에 10분간 염색하고 15분간 탈색시킨 후 UV Illuminator 로 관찰하였다. 전기영동 하여 확인한 PCR 산물을 정제하기 위해 AccuPrep R PCR Purification kit (BIONEER Corp.)을 이용하였다. 2.4.3 18S rdna Cloning 증폭된 1.8 kb 크기의 18S rdna를 pgem-t Easy vector (Promega Corp.)에 제조사 방법대로 ligation 하였다. 이를 E. coli. DH501에 형질전 환시켜 ampicillin (50 μg/μl)이 포함된 LB 평판배지에서 blue-white colony 선별법에 의해 100개의 클론을 선별하였다. 2.4.4 18S rdna 염기서열분석과 계통학적 분석 무작위로 선별된 클론들을 주형으로 하여 primer T7 (5'-TAA ATC CAA GAA TTT CAC C-3 )과 SP6 (5 -TAT TTA GT GAC ACT ATA G-3 )(Table 2)를 이용하여 vector 내의 insert부분을 증폭한 후 정제하여 이를 염기서열 분석을 위한 주형으로 이용하였다. 염기서열 분석을 위한 PCR 조건은 Big-Dye Cycle Sequencing kit V.3.1을 이용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. 분석은 자동염기서열 결정 장치 (ABI 3100 Automated sequencer; Applied Biosystems Instrument)를 이용하여 유전 자 염기서열분석을 실시하였다. 이를 위해 먼저 T7(5 -TAA ATC CAA GAA TTT CAC C-3 )을 이용하여 부분염기서열을 읽어 NCBI (National - 12 -

Center for Biotechnology Information)의 BLAST 검색 프로그램을 통해 GeneBank의 데이터베이스와 비교하여 섬모충류의 염기서열임을 확인한 뒤 다시 10개의 clone을 선별해 C No. 로 표시하고 9개의 primer (Table 2) 를 사용하여 18S rdna의 전체부위에 대하여 염기서열 분석을 실시하였다. 염기서열의 편집과 정렬은 PHYDIT (developed by Dr. Chun, version 3.2) 을 이용하였고, Evolutionary distance matrices들은 Jukes and Cantor (1969)의 algorithm으로 계산하였으며, 계통도는 동일한 프로그램 내에서 Neighbor-Joining method를 이용하였다. 계통도내 분지의 안정도 를 조사하기 위하여 1000번의 bootstrap resampling 분석을 실시하여 500 이상의 값을 계통 분석도에 나타내었다(Fig. 8-11). - 13 -

Table 2. Sequences of primers used for ciliate's 18S rdna analysis. Primer Sequence(5' - 3') Usage EuK A EuK B CTG GTT GAT CCT GCC AG TGA TCC TTC YGC AGG TTC PCR, Sequencing PCR Sequencing cili+340 GCT YTC GAW GGT AGT GTA TTG GAC WAC AM Sequencing cili-1300 TAA GTT TCA GHC TTG CGA CCA TAC Sequencing Gas 18s+600 CGG TAA TKC CAG CTC CAA TAG CG Sequencing Gas 18s-1220 CCT GGT GGT GCC CTT CCG TC Sequencing 18S+2030 TGA AAC TTA AAG RAA TTG ACG GAA-3 Sequencing T7 SP6 TAA ATC CAA GAA TTT CAC C TAT TTA GT GAC ACT ATA G Sequencing vector primer Sequencing vector primer - 14 -

3 형태학적 용어 설명 섬모충류 형태학적 특징을 기술하는데 사용된 국문용어는 김영옥(1986), 신만균(1988), 문은영(2002)를 참고하였다. 3.1 섬모충의 일반적 용어 설명 전방부위(anterior part): 세포가 전진하는 방향을 일컬으며 세포 절반의 앞부분 후방부위(posterior part): 전방부위의 반대쪽을 일컬으며 세포 절반의 아래 부분 전단 (anterior end): 전방부위의 앞쪽 끝부분 후단 (posterior end): 후방부위의 아래쪽 끝부분 좌측 (left side): 복면에서 볼 때 오른쪽 부분 우측 (right side): 복면에서 볼 때 왼쪽 부분 복면(ventral view): 입의 구조가 있는 부분이 복면이 되지만 입구조가 정단 (apical)에 있을 경우는 제외함 배면(dorsal view): 복면의 반대방향으로 세포의 입구조가 정단에 있는 경우는 제외함 대핵(macronucleus): 영양핵으로 크기가 크고 원형, 타원형, C형, 염주 형의 다양한 형태를 지니며 검색 형질로 사용됨 섬모열(kinety): 섬모근이 열을 지어 배열되어있는 형태. 섬모가 관찰되 기도 하고 관찰되지 않기도 한다. 섬모근을 기저부로 하여 섬모가 배열 - 15 -

된다. 소핵(micronucleus): 생식핵 이라고 불리며 대핵보다 작고 원형 또는 난 형의 형태로, 대핵에 근접하여 위치하고 있으며 소핵의 개수는 검색형질 로 사용됨 피갑(lorica): 원충(soft body)이 분비하는 물질과 외부의 이물질이 부착 함에 의해 형성되며 형태에 따라서 동정시에 중요한 검색형질 사용되며 유종섬모충(Order Tintinnida)에 잘 발달되어 있음 원충 (soft body): 유종류에서 피갑을 제외한 원추형의 단세포 부분으로 후단 (posterior end)이 피갑의 내부에 부착되어 있다. 전방부위는 넓은 개구부를 이루며 입 주변 막판이 피갑 밖으로 돌출하여 포식과 유영함. 입섬모열(Adoral zone of membranelle, AZM): 입섬모가 일률적으로 나열 합체되어 판 모양을 하는 입섬모열(adoral membranelle, AM)을 이루고 있는 구역이다. 입섬모열의 입체적 배열 상태, 국소해부적 위치, 길이, 막판의 수 등이 중요하다. 전방복극모(frontoventral cirri): 복면의 앞 중간 뒤에 걸쳐 나타나는 것 으로 전방극모와 복극모가 구분하기 곤란한 점이 있기 때문에 이들 둘을 합쳐 전방복극모로 하는 경우이다. 미극모(cadual cirri): 몸의 후단 등쪽에 나 있는 극모로서 3-5개의 극모 로 되어있다. 배섬모열(dorsal kineties): Hypotrichs의 특징적 기관으로 등에 발달되 어 있으며 최근에는 분류의 중요한 검색형질로 사용. 환대섬모열(girdle kinety): 세포의 측면에서 볼때 중간 부위를 감싸며 배열되어있는 섬모근이며 짧은 섬모(cilia)가 관찰되기도 한다. 분류형질 - 16 -

에 이용된다. 횡극모(Transverse cirri, TC; anal cirri, AC ): 복면 후방의 5개 정도 의 크고 뚜렷한 극모군으로 기부의 배열상이 갈고리 모양으로 세로축에 비스듬이 나 있거나 가로로 나있다. - 17 -

4. 결과 섬모충류의 분류체계는 Lynn and Small(2000)의 분류체계를 따랐다. 4.1 종목록 Phylum CILIOPHORA Doflein, 1901 Subphylum INTRAMACRONUCLEATA Lynn, 1996 Class SPIROTRICHEA Subclass Hypotrichia Stein, 1859 Order Euplotida Small & Lynn, 1985 Family Euplotidae Ehrenberg, 1838 Genus Euplotes Ehrenberg, 1830 Euplotes vannus (Mϋller, 1786) Minkjewicz, 1901 Euplotes raikovi Agamaliev, 1966 Subclass Choreotrichia, Small & Lynn, 1985 Order Tintinnida Kofoid & Campbell, 1929 Family Codonellidae Kent, 1881 Genus Tintinnopsis Stein, 1867 Tintinnopsis sp. Family Xystonellidae Kofoid and Campbell, 1929 Genus Favella Jörgensen, 1924 Favella panamensis Kofoid & Campbell, 1929-18 -

Subclass Oligotrichia Bütschli, 1887 Order Halteriida Petz & Foissner, 1992 Order Strombidiida Petz & Foissner, 1992 Family Strombidiidae Fauré-Fremiet, 1961 Genus Strombidium Claparède and Lachmann, 1858 Strombidium sp. Class OLIGOHYMENOPHOREA de Puytorac et al., 1974 Subclass Scuticociliate Small, 1967 Order Philasterida Small, 1967 Family Uronematidae Thompson, 1964 Genus Uronema Dujardin, 1841 Uronema marinum Dujardin, 1841-19 -

4.2 종의 기재 4.2.1 Euplotes vannus (Mϋller, 1786) Minkjewicz, 1901(Fig. 2) Minkjewicz 1901 Tuffrau, 1960 Euplotes 속의 특징 Euplotes (Ehrenberg, 1830)속은 하모류에 속하며 잘 발달된 입섬모열, 극모 등이 잘 발달되어있다. 다양한 크기와 빠른 성장으로 먹이생물로서의 연구된 바 있다. 다른 섬모충류에 비하여 실험실내에서의 배양에 용이하여 비교적 연구가 많이 이루어진 그룹이나 변이가 많아 분류에 있어서는 아직 모호한 점이 많이 있다. 몸은 등배로 납작한 형태이며 배 쪽에 발달 되어있 는 극모로 기어가는 형태로 움직인다. 종의 기재(Fig. 2, Table 3.) 모양은 등배로 납작한 형태로 길쭉한 타원형이다. 체장은 64-82 μm 이 고 체폭은 35-45 μm 이다. 잘 발달된 막판구대를 가지며 C 자모양의 큰 대핵을 가지며 C자 모양 아래에 꼬리형태의 모양을 한다. 본 연구에서 소핵 은 대핵에 인접해 위치하나 극모 등에 의해 가리어 형태가 뚜렷이 관찰되지 않았다. 배 쪽에 잘 발달된 극모를 이용하여 바닥을 날쌔게 기어가는데 이 용한다. 10개의 전방복극모를 가지며 5개의 횡극모와 5개의 미극모를 가진 다. - 20 -

생태학적 특징 이 종은 항만에서 채집한 시료에서 배양하였으며 저서성이나 조석에 의한 수직혼합이 활발하고 수심이 낮은 인천연안에서 흔하게 출현한다. 18S rdna 분석(Fig.9, Table 4) 분석결과(C12, C15) 기존의 GenBank에 등록되어있는 E. vannus(chen and Song 2002; Accession No. AY004772)의 염기서열과 99% 이상의 유사도를 보였다. 4.2.2 Euplotes raikovi Agamaliev, 1966 (Fig. 3) Agamaliey, 1966 종의 기재(Fig. 3, Table 3.) 모양은 등배로 납작하며 체장은 35-40 μm이며 체폭은 20-22.5 μm 로 작은 종이다. 잘 발달된 막판구대와 C자 모양의 대핵을 가진다. 7개의 전방복극모와 5개의 횡극모 3개의 미극모를 가진다. 18S rdna 염기서열 분석(Fig. 9, Table 4) Euplotes raikovi 는 우리나라에서 처음으로 기재되는 종이다. 18S rdna 분석결과(C32) GenBank에 E. raikovi(petroni et al., 2002; Accession No. AJ305251)와 99% 이상의 높은 유사도를 보였다(Table 3). - 21 -

4.2.3 Tintinnopsis sp.(fig. 4) 종의 기재(Fig. 4, Table 3.) 원충을 둘러싼 피갑의 모양은 피갑의 겉이 이물질이 부착되어 있어 불투 명하며 총알모양을 하고 있다. 피갑의 길이는 48-55 μm, 넓이는 30-35 μm 이다. 두개의 대핵을 가진다. 피갑안의 원충의 체장은 38-45 μm, 체폭 은 15-17 μm 이다. Tintinnopsis 속 중에서 본 연구에 사용된 종과 유사하게 피갑의 모양이 총알모양이며 피갑의 길이는 50-60 μm, 피갑의 넓이는 25-35 μm 크기를 가지는 유사종이 다수 존재하며 피갑구조에 의한 분류는 외부 환경에 따라 피갑의 모양이 조금씩 바뀌는 유종섬모충류의 형태적 분류에 있어 오류가 있을 것으로 생각되어 속단위까지 동정하였다. 생태학적 특징과 18S rdna 염기서열 분석(Fig. 10, Table 5) Tintinopsis 속은 유종섬모충류에 속하며 경기만에서 겨울과 봄에 주로 출현한다. 18S rdna 염기서열 분석결과 기존의 GenBank에 올려지지 않은 새로운 염기서열이였으며 C76과 C80은 기존의 보고되어진 GenBanK 내의 자료에 서 같은 Tintinnopsis 속의 염기서열에서 92-96%의 유사도를 보였다 (Table 4). Tintinnopsis 속은 Genbank에 총 5종이 올려져 있어(2004년 11월 기준) 연구가 매우 부족하여 비교할 수 있는 데이터가 부족하였다. - 22 -

4.2.4 Favella panamensis Kofoid & Campbell, 1929(Fig. 5) Cyttarocylis serrata var. Van Breeman, 1905, pp. 51-52, fig.14. Cyttarocylis eherenbergii, partim, Brandt, 1907, pp. 3,11,16,18, 20, 22, 23, 27, 30, 32-34, 38, 42, 143-185, 188, 203-205, 208-213, 216, 217, 254, 259, 260, 277, 366, 375, 444, 447, 459, 463, 464, 470 Favella panamensis Marshall, 1969, plate VI, fig. 15 Favella arcuata Gold and Morales 1975, p.527, fig. 25 Favella panamensis Coats et al, 1994, p.108, fig. 1-12 Favella arcuata Pierce and Turner, 1994 Favella panamensis Pierce, 1996 종의 기재(Fig. 5, Table 3) 피갑은 종모양이며 투명한 hyaline lorica를 가진다. 피갑의 길이는 100-360 μm, 넓이는 60-150 μm 이다. 원충의 체장은 70-260 μm, 체폭은 50-150 μm이다. 생활사에 따라 다양한 피갑의 변형을 보여 생활사에 따라 다른 종으로 분 류되기도 하였다. 우리나라에서는 F. panmensis 에 대한 기재는 없었으며 형태적으로 유사한 F. ehrenbergii 가 김(1986)에 의해 처음 기재 되었다. Kofoid and Campbell(1929)에 의하면 F. panmensis 는 F. ehernbergii와 좀더 원통형에 가까운 bowl을 지니고 있으며 좀더 넓은 oral region을 지 닌 차이를 가지는 다른 종으로 기술하였다. 그러나 Laval-Peuto(1981)은 생활주기에 따른 F. ehernbergii의 피갑의 변형과 형성에 대하여 기술하였 으며 본 실험에서도 현장시료를 고정했을 때 관찰한 피갑의 모양은 배양과 정에서 매우 다른 피갑의 모양을 형성하여(Fig. 5C) 그 차이를 이용하여 분 - 23 -

류에 적용하기 부족하였다. F. ehrenbergii 와 F. panamensis 에 대한 각 각의 생태연구에 관한 연구는 있으나 두 종의 형태분류학적 차이에 대한 명 확한 자료가 부족하여 각각의 형태학적 비교연구가 요구된다. 생태학적 특징과 18S rdna 염기서열 분석(Fig. 10, Table 5) Favella 속은 유종섬모충류에 속하며 경기만에서 비교적 수온이 높은 하 계에 주로 출현한다. 시료에서 18S rrna gene 추출하여 clone C50과 C60을 염기서열 분석 하여 NCBI GenBank에 있는 자료와 비교한 결과 F. panamensis (Strüder-Kypke and Lynn, 2003; Accession No. AY143571)와 99% 이 상의 높은 유사도를 보였다. 또한 형태적으로 유사한 GenBank에 등록되어 있는 F. ehrenbergii 의 18S rdna 염기서열(Urrutxurtu, 2004; Accession No. AF39916)과는 92%의 유사도를 보였다. 그러나 GenBank 의 F. ehrenbergii의 18S rdna 염기서열이 같은 속인 F. panamensis (92%)보다 오히려 Tintinnopsis 그룹과 높은 유사도(96%)를 보이는 것은 (Table 4) 어 기존에 보고된 F. ehrenbergii 에 대한 18S rdna 염기서열 분석과 기존의 형태적 기술에 대한 문헌의 비교연구가 더욱 필요함을 보여 준다. 이 연구에서는 NCBI GenBank에 등록된 18S rdna 염기서열 분석을 바 탕으로 F. panamensis(strüder-kypke and Lynn, 2003; Accession No. AY143571)로 동정하였다. - 24 -

4.2.5 Strombidium sp.(fig. 6) 종의 기재(Fig. 6, Table 3) 모양은 둥근 난형이며 체장은 35-40 μm, 체폭은 25-35 μm이다. APK(anterior polykinetids)는 14-17개, VPK(ventral polykinetids)의 수는 10-12개, GK(girdle kinety)는 48-55개, VK(ventral kinety)는 10-14개를 가진다. 세포의 후단 복면에 환섬모열 아래로 투명한 막에 의 해 세포가 쌓여있다. 이 연구에서 나타난 Strombidium sp. 는 유사종인 Strombidium inclinatum (Modeo et al., 2003)과 Strombidium sulcatum (Weibo and Mei, 1996)과 매우 흡사하다. 18S rdna 염기서열 분석(Fig. 11, Table 6) 18S rdna 염기서열 분석결과 Strombidium incliatum(modeo et al., 2003; Accession No. AJ488911)과 96%로 가장 유사도가 높았으며 염기 서열에 대한 연구는 Strombidium 속에서 단 3종이 연구되어져 있다(Table 5). - 25 -

4.2.6 Uronema marinum Dujardin, 1841(Fig. 7) 종의 기재(Fig. 7, Table 3) 모양은 길쭉한 난형이며 체장은 15-20μm의 길이이며 체폭은 7-10 μm이며 대핵과 소핵이 각각 1개씩 가지고 있다. 1개의 꼬리를 가진다. 생태학적 특징과 18S rdna 염기서열 분석(Fig. 12, Table 7) Uronema 속은 부영양화가 심하게 진행된 오염된 수역에서 매우 높은 밀 도를 가지고 출현하기도 한다. 매우 소형이고 어류에 있어서 병원균으로도 보고되었다. 18S rdna 염기서열 분석결과 기존의 GenBank에 등록되어있는 염기서 열과 97%의 유사도를 보였다. - 26 -

5. 토의 인천연안에서 분리 배양한 종을 대상으로 프로타골 염색과 18S rdna를 분석한 결과 5속 6종에 대하여 확인하였으며 염색을 통한 형태 확인이 된 개체는 유전자 분석결과 기존의 GenBank 에 등록되어 있는 그룹에 대하여 같은 속 내에 정확히 위치함을 유전자 트리에서 보여주어 염기서열 분석을 이용한 종 동정의 가능성을 보여주었다(Fig. 8). 현재 섬모충류에 대한 분자적 접근은 종수에 비하여 일부 그룹에 한해서 소수의 연구가 이루어졌을 뿐이며 특히 부유성 섬모충류에 대한 연구는 극 히 일부에 대해서 이루어져있다. 우리나에서의 해양 섬모충에 대하여 분자 적 분류는 처음으로 시도되었으며 분석결과 실험에 사용된 6종 가운데 4종 에 대해서는 기존의 GenBank 에 등록되어있는 염기서열과 99%이상의 유 사도를 보였으나 Tintinnopsis sp.와 Strombidium sp. 에 대하여 종이 등 록되어있지 않은 2개의 새로운 염기서열을 얻었다. 연구결과 섬모충류의 분자적 분류가 종 동정의 가능성은 보여주었으나 분자적 분류가 형태연구에 대한 자료가 부족하고 기존의 염기서열 분석이 이루어지지 않은 종에 있어서는 종 단위까지 분류가 명확히 이루어지기 어 려웠다. 본 연구에서 형태 연구에 대한 자료가 부족한 경우는 Favella ehrenbergii와 F. panamensis의 경우처럼 생활사에 따라 피갑의 형태가 다 양한 변이를 보였으나 기존의 분류가 피갑 형태에 의한 분류로 그 기준이 모호하여 본 연구에서는 C50과 C60 에 대하여 기존의 GenBank 염기서열 데이터를 참고하여 F. panamensis 로 동정하였다. 또한 기존의 염기서열에 대한 연구가 이루어진 F. ehernbergii (Iñaki, 2004; Accession No. - 27 -

AF39916) 로 등록되어 있는 염기서열이 같은 속내에 위치하는 F. panamensis (Strüder-Kypke and Lynn, 2003; Accession No. AY143571) 와 본 연구의 C50, C60 과도 92%의 낮은 유사도를 보이는 반 면 오히려 Tintinnopsis 그룹과 96%에 높은 유사도를 나타내는 결과는 분 자적 접근에 오류로 판단되어 분자적 분류에 어려움을 주었다. 형태연구와 분자적 접근의 오류는 현장에서 분리된 순수 배양 시료의 염기서열 분석과 정확한 종의 형태적 기재가 많은 종에 대하여 이루어진다면 해결될 수 있을 것이다. 또한 섬모충류에 대한 분자적 분류에 사용되는 보존성이 높은 18S rdna 염기서열분석이 실험에 사용된 섬모충류가 어느 그룹에 속하는지를 정확히 보여주어 분자 분류학의 가능성은 보여주었으나 속(genus)이하에서 종 특이성이 약하여 종을 분리할 수 있도록 18S rdna 염기서열 내의 종 특이적인 부위에 대한 연구가 필요하다고 판단된다. 분자적 분류에 기초자료로 활용할 수 있는 기존의 등록된 염기서열이 부 족함은 앞으로 이와 같은 연구를 지속적으로 수행하여 형태 확인과 유전자 염기서열데이터를 확보함으로서 개선될 수 있을 것으로 사료된다. 앞으로 종의 형태적 분류에 까다로운 섬모충류에 대한 동정을 보다 쉽게 할 수 있 고 probe 제작 등을 이용하여 생태학에 기초자료로 활용할 수 있기 위하여 섬모충류에 대한 염기서열 데이터의 확보와 연구방법의 개선 등을 통하여 다양한 분자적 연구의 필요성을 제시하는 바이다. - 28 -

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Table 3. Morphometrics of investigated species. Species name L W FVC TC CC Ma Mi Euplotes vannus 64-82μm 35-45μm 10EA 5EA 5EA 1 1 Euplotes raikovi 30-40μm 20-22.5μm 7EA 5EA 3EA 1 1 Species name L(lorica lenth) W(lorica width) EPK Ma Mi - - Tintinnopsis sp. (48-55μm) 38-45μm (30-35μm) 15-17μm 18EA 2 - - - Favella panamensis (100-360μm) 70-260μm (60-150μm) 50-150μm 16EA 2 - - - Species name L W APK VPK G VK Ma Mi Strombidium sp. 35-40μm 25-35μm 14-17EA 10-12EA 48-55EA 10-14EA 1 - Species name L W CC Ma Mi - - - Uronema marinum 15-20μm 7-10μm 1 1 1 - - - : APK, adoral polykinetids; CC, cadual cirri; EPK, external polykinetids; FVC, fontoventral cirri; G, girdle kinety; L, length; Ma, macronucleus; Mi, micronucleus TC, transverse cirri; VK, ventral kinety; VPk, ventral polykinetid; W, width - : not observed or absent - 38 -

(A) AZM FVC Ma TC DK 20μm CC (B) (C) Fig. 2. Schematic figures of protargol-stained Euplotes vannus (Mϋller, 1786) Minkjewicz, 1901. (A) picture of protagol stained (B) ventral view (C) dorsal view : CC, cadual cirri; DK, dorsal kinety; FVC, fontoventral cirri; Ma, macronucleus ; TC, transverse cirri - 39 -

10μm (A) (B) FVC TC AZM Ma DK CC 10μm (B) (C) Fig. 3. Schematic figures of protargol-stained Euplotes raikovi Agmaliev, 1966. (A) picture of protargol stained (B) ventral view (C) dorsal view : CC, cadual cirri; DK, dorsal kinety; FVC, fontoventral cirri; Ma, macronucleus; TC, transverse cirri - 40 -

10μm (A) EPK L Ma 10μm 10μm (B) (C) Fig. 4. Schematic figures of protargol-stained Tintinnopsis sp. (A) picture of protargol stained (B)figure of lorica (C) figure of soft body : EPK, external polykinetids; L, lorica; Ma, macronucleus - 41 -

EPK L Ma 50μm 50μm 50μm (A) (B) (C) (D) Fig. 5. Figures of Favella panamensis Kofoid and Campbell, 1929. (A) live cell, (B) picture of protargol-stained (C) figure of soft body (D) lorica form of culture sample. : EPK, external polykinetids; L, lorica; Ma, macronucleus - 42 -

10μm (A) APK VPK Ma 10μm G VK (B) (C) Fig. 6. Figures of protagol-stained Strombidium sp. (A) picture of protargol stained (B) ventral view (C) dorsal view : APK, adoral polykinetids; G, girdle kinety; Ma, macronucleus; VK, ventral kinety; VPK, ventral polykinetid - 43 -

10μm (A) Mi Ma CC 10μm (B) Fig. 7. Figures of protagol-stained Uronema marinum Dujardin, 1841. (A) Picture of QPS stained (B) Dorsal view : CC, cadual cirri; Ma, macronucleus; Mi, micronucleus - 44 -

99 100 100 100 92 0.1 96 100 100 100 88 100 Uronema marinum(ay551905) C12 100 C15 C22 49 Euplotes vannus(ay004772) 67 Moneuplotes crassus(aj305239) 100 C32 Euplotes raikovi(aj305251) Strom bidium inclinatum (AJ488911) S3 C44 C37 Favella panamensis(ay143572) C60 C50 Tintinnopsis tubulosoides(af399111) Tintinnopsis tocatinensis(ay143561) C80 C76 Fig. 8. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of the ciliates group. Numbers on the branches showed the bootstrapping values. - 45 -

100 100 Euplotes rariseta (AF492706) C32 Euplotes raikovi (AJ305251) 99 99 98 100 100 78 100 40 94 Euplotes harpa(aj811016) Euplotes eurystomus (AJ310491) Euplotes aediculatus(aj305253) Euplotes woodruffi (AF492707) Euplotes charon (AF492705) Euplotes minuta (AJ305245) Moneuplotes crassus (AJ310492) C22 C15 Euplotes vannus (AY004772) 0.1 Fig. 9. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of Euplotes. Numbers on the branches showed the bootstrapping values. - 46 -

100 100 Favella panamensis(ay143572) C50 C60 Tintinnopsis dadayi(ay143562) 100 82 99 49 100 Tintinnopsis tocatinensis(ay143561) Tintinnopsis tubulosoides(af399111) Favella ehrenbergii(af399161) C76 C80 0.1 Fig. 10. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of Tintinnids group. Numbers on the branches showed the bootstrapping values. - 47 -

99 Strombidinopsis shimii (AJ786648) Strombidinopsis jeokjo (AJ628250) Strombidium purpureum (U97112) 100 Strombidium Narragansett Bay (AY143564) 100 46 Strombidium inclinatum (AJ488911) C37 100 C44 0.1 Fig. 11. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of Strombidium. Numbers on the branches showed the bootstrapping values. - 48 -

Parauronema virginianum(ay392128) Uronema acuminata(u83128) Uronema marinum(ay551905) 96 C12 0.1 Fig. 12. 18S rdna tree constructed by Neighbor-Joining distance method and showing position of Uronema. Numbers on the branches showed the bootstrapping values. - 49 -

Table 4. Similarity values among 18S rdna sequences of Euplotes(%). Euplotes aediculatus Euplotes charon (AJ305253) (AF492707) Euplotes crassus (AJ310492) Euplotes Euplotes eurystomus woodruffi (AJ310491) (AF492705) Euplotes harpa (AJ811016) Euplotes minuta (AJ305245) Euplotes raikovi (AJ305251) Euplotes rariseta (AF492706) Euplotes vannus (AY004772) C15 91.75 94.09 99.46 92.24 92.16 94.44 97.04 89.33 88.80 99.46 C22 91.81 94.04 99.51 92.30 92.11 94.50 97.10 89.56 89.02 99.51 C32 88.00 89.90 89.44 87.93 87.64 89.94 89.54 99.57 96.01 89.46-50 -

Table 5. Similarity values among 18S rdna sequences of Tintinnid group(%). Favella Favella Tintinnopsis Tintinnopsis Tintinnopsis ehrenbergii panamensis dadayi tocantinensis tubulosoides (AF39916) (AY143572) (AY143562) (AY143561) (AF399111) C50 92.72 99.77 90.82 92.89 93.36 C60 92.61 99.54 90.70 92.77 93.25 C76 96.61 92.57 92.75 95.81 96.55 C80 96.79 92.40 93.06 95.69 96.67-51 -

Table 6. Similarity values among 18S rdna sequences of Strombidium(%). Strombidium inclinatum (SIN488911) Strombidium narragansett (AY143564) Strombidium purpureum (SPU97112) C37 96.93 95.90 93.86 C44 97.05 96.02 93.98-52 -

Table 7. Similarity values among 18S rdna sequences of Genus Uronema(%). Uronema marium (AY551905) Uronema acuminata (UAU83128) Parauronema virginianum (AY392128) C12 97.42 78.97 41.25-53 -

Appendix 1. Alignment of 18S rdna sequence for taxa used in the analysis. The letter '-' and 's' indicate the alignment gap and missing data. C15 C22: Euplotes vannus, C32: Euplotes raikovi, C76 C80: Tintinnopsis sp., C50 C60: Favella panamensis, C37 C44: Strombidium sp., C12: Uronema marinum. - 54 -

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감사의 글 해양학을 공부할 수 있도록 지도해주신 최중기교수님께 진심으로 감사를 드립니 다. 부족한 논문을 세심하게 검토해주신 홍재상교수님과 분자실험에 많은 조언과 도움을 주신 민기식 교수님께도 감사드립니다. 학부 때부터 지금까지 해양학에 많 은 관심을 갖게 해주시고 가르쳐주신 오재경교수님, 승영호교수님, 박용철교수님, 한명우교수님, 한경남교수님, 박경교수님, 우승범교수님께도 감사드립니다. 2년이라는 시간동안 많은 것을 가르쳐주시고 논문을 쓸 수 있게 도와주신 분들 께 감사드립니다. 제가 열심히 하도록 챙겨주셨던 선생님 은진언니, 다정다감하신 승민언니, 연구실 큰 형님 석현오빠, 세 분께 제게 해주신 많은 가르침에 감사드립 니다. 회사에 다니시면서도 부족한 후배 때문에 주말마다 어려운 시간을 내어주셨 던 규철오빠께도 감사드립니다. 자상하게 다독거려주시던 정규오빠, 바쁘신 가운데 서도 항상 관심을 가져주시는 현표오빠, 반쪽 휴창오빠, 항상 밝으신 형철오빠,처음 부터 지금까지 한결같은 모범을 보여주시는 영주언니, 어려운 일을 같이 고민해주 던 만호오빠, 실험을 완성할 수 있도록 결정적 역할을 해주고 늘 아껴주시는 혜연 언니께도 감사드립니다. 멀리계신 Ma 박사님께도 친철하신 가르침에 감사드립니다. 분자실험에 많은 도움을 주신 진화유전학 연구실에 세주언니, 진아언니, 동하오빠, 민석오빠, 미현이에게도 감사드립니다. 바쁘신 가운데서도 연구실 후배에게 많은 관심을 가져주신 신문보 선배님, 명철수 선배님, 강연식 선배님, 이원제 선배님, 현 정호 선배님, 윤원득 선배님, 김미옥 선배님, 송태윤 선배님, 미애언니께도 감사드 립니다. 학교에서 늘 마주치면 즐거움을 주신 재욱오빠, 세심한 마음으로 배려해주신 경 희언니, 전화 친구 진용오빠, 자상한 회인오빠와 어려운 일이 있을 때마다 많은 도 움을 주신 선숙언니께도 감사드립니다. 학부생활을 거쳐 석사생활동안 많은 도움을 주신 여러 선배님들께도 감사 말씀드 립니다. 순영선배님, 건탁선배님, 규희선배님, 상필 선배님, 인서선배님, 평중 선배 님, 효진오빠, 동화오빠, 태하오빠, 정원오빠께도 감사드립니다. 특히 입학동기 모두 함께 졸업하게 되어 기쁜 진형오빠, 영하오빠, 영기오빠 종대오빠, 미연언니, 정진 언니, 형진오빠, 은진에게도 그동안의 많은 도움에 감사드립니다. 이제 곧 졸업을 하게되는 재영오빠와 지호오빠, 공부를 시작하게 된 성한오빠께도 좋은 결과가 있 기 바랍니다. 생각하는 것만으로도 맘이 든든해지는 친구들에게도 고맙다는 말을 전합니다. 수 진, 은진, 진주, 미애, 민재, 민정이, 지혜 모두 바라는 일 이뤄지길 바랍니다. 마지막으로 절 믿어주시고 아껴주시는 아버지, 어머니께 감사드리고 내 반쪽인 동생 진영이에게도 고맙다는 말을 전하며 힘든 일마다 늘 함께 해주고 격려해 주는 지호오빠에게도 고맙다는 말을 전합니다.