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임상검사와 정도관리:제28권 제1호 2006 J Lab Med Qual Assur 2006:28:183-188 183 Dimension RxL을 이용한 NT-proBNP 검사의 평가 송상훈 1 박철민 1 전선희 2 박경운 1,2 김진규 1 송정한 1,2 서울대학교 의과대학 검사의학교실 1, 분당서울대학교병원 진단검사의학과 2 Evaluation of NT-proBNP assay Using Dimension RxL Sang Hoon Song 1, Chul Min Park 1, Sun Hee Chun 2, Kyoung Un Park 1,2, Jin Q Kim 1, and Junghan Song 1,2 Department of Laboratory Medicine, Seoul National University College of Medicine 1, Seoul; Department of Laboratory Medicine, Seoul National University Bundang Hospital 2, Sungnam, Korea Background:We evaluated the analytical performance of the recently introduced Dimension RxL NT-proBNP method (Dade Behring, Deerfield, IL). Methods:Within-run precision and total precision were assessed according to CLSI guideline EP5-A2 with control material of low and high level. Linearity was evaluated in the range of 30-32,420 pg/ml made by patient samples. Correlation with E170 (Roche Diagnositics, Mannheim, Germany) was evaluated using 49 patient samples in the range of 8.4-20754.5 pg/ml. Plasma concentrations in 241 healthy persons were measured and the distributions according to age and sex were obtained. Results:The CV of within-run precision was 3.3-4.8% and the CV of total precision was 4.4-8.1%. The linearity was R 2 =0.988. The correlation with E170 was excellent (R=0.996). NTproBNP values measured by Dimension RxL were higher than those by E170 (mean 282.0 pg/ml, 95% CI 130.6-433.4 pg/ml) in the range of 8.4-20,754.5 pg/ml. The 97.5% value from 241 healthy persons was 134.7 pg/ml, and 117.4 pg/ml in male and 156.4 pg/ml in female. It was higher in persons 50 years old than those < 50 years old (180.3 vs. 117.3 pg/ml). Conclusions:Dimension RxL NT-proBNP assay showed acceptable analytical performance. This assay may be used for early detection and follow up of patients with congestive heart failure. Key Words:NT-proBNP, Congestive heart failure, Dimension RxL, Analytical performance 서 B-type natriuretic peptide (BNP)는 atrial natriuretic peptide, C-type natriuretic peptide와 같은 natriuretic peptide의 일종이다. 심장의 BNP mrna의 약 77%가 심실에 분포하며 BNP는 주로 좌심실에서 분비된다 [1]. 프로호르몬 형태로 생산된 후 단백분해에 의해 해리되 이 논문은 분당서울대학교병원 위탁연구비(06-05-010) 지원에 의해 이루어진 것임. 교신저자:송정한 우) 463-707 경기도 성남시 분당구 구미동 300 분당 서울대학교병원 진단검사의학과 전화:031)787-7691, FAX:031)787-4015 E-mail:songjhcp@snu.ac.kr 론 어 생물학적 활성형인 BNP와 aminoterminal 부분의 NT -probnp가 같은 농도로 혈중에 분비된다[2]. BNP 또는 NT-proBNP는 심부전, 심근경색, 심비대와 같은 병적 상 황에서 심장벽의 스트레스가 자극이 되어 생산되고 분비되 는 것으로 알려져 있다[3]. 주로 심근 세포에서 분비되며 활성형인 BNP는 나트륨배설을 촉진하고 혈관을 확장시키 며 레닌-안지오텐신-알도스테론계를 억제한다. 최근에는 심 장 섬유모세포에서도 분비되어 심장의 재형성에도 관여한다 는 사실이 밝혀졌다[4]. 따라서 심부전 또는 좌심실 기능부 전을 발견하는 유용한 표지자로 주로 사용되고 있으며 초기 에는 BNP를 주로 측정하였으나 NT-proBNP도 점차 사용 이 증가하고 있다. NT-proBNP의 생물학적 역할에 대해서 는 아직 알려진 바 없으나 혈중 반감기가 60-120분으로 BNP보다 초기의 좌심실 기능장애를 더 예민하게 발견할

184 송상훈 박철민 전선희 박경운 김진규 송정한 수 있다[2]. 저자들은 최근에 소개된 Dimension RxL (Dade Behring, Deerfield, IL) 자동생화학장비를 이용한 NT-pro- BNP 검사법의 성능을 평가하고 기존의 E170 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 방법과 비교하고자 하였다. 재료 및 방법 1. 기기 및 시약 NT-proBNP는 Dimension RxL (Dade Behring, Deerfield, IL)을 사용하여 측정하였다. 검체는 환자의 정 맥으로부터 리튬 헤파린 용기에 채집한 혈액을 사용하였다. 검사의 원리는 NT-proBNP의 N-말단부위(아미노산 1-2 1) epitope를 인식하는 다클론항체로 코팅된 chromium dioxide 입자, alkaline phosphatase (ALP)로 표지된 이차항체에 검체를 반응시켜 입자-NT-proBNP-ALP 샌드 위치가 형성되게 한 후 자기로 분리하고 세척을 한다. 여기 에 Flavin adenine dinucleotide phosphate (FADP) 를 첨가하면 ALP에 의해 flavin adenine dinucleotide (FAD)가 생성되며 FAD는 아포 D-아미노산산화효소와 결 합하여 홀로 D-아미노산산화효소가 생성된다. 각각의 홀로 D-아미노산산화효소는 다수의 과산화수소 분자를 만들고 당근과산화효소(horseradish peroxidase) 존재 하에서 3, 5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid (DCHBS) 와 4-aminoantipyrine (4-AAP)가 색깔이 있는 물질로 전환되는데 이 물질의 흡광도를 510 nm에서 측정한다. 정도관리는 Liquichek Cardiac Markers Plus Control Level 1, Level 3 (Bio-Rad, Hercules, CA)를 매 검사시마다 측정하여 제조사에서 제시하는 범위(각각 317-518, 7819-13270 pg/ml)를 벗어나지 않음을 확인하였 다. 2. 정밀도(Precision) 정밀도의 평가는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP5-A2에 준하여 상기의 정도관리물 질을 20일간 하루에 2회씩 매 검사마다 2회씩 반복 측정하 여 검사내정밀도와 총정밀도를 구하였다[5]. 3. 직선성(Linearity) 직선성의 평가는 CLSI EP6-A에 준하였다. 30.0 pg/ ml과 32419.5 pg/ml의 환자 검체를 선별한 후 각각 4:0, 3:1, 2:2, 1:3, 0:4의 비율로 혼합한 5가지 농도를 만든 후 각각의 농도에 대해 4회씩 반복 측정하여 제조사에 서 제시하는 직선성의 범위가 유지되는지 확인하였다[6]. 4. 상관성(Method Comparison) 상관성의 평가는 CLSI EP9-A에 준하였다. 기존 장비 인 E170 (Roche Diagnositics, Mannheim, Germany) 로 측정한 결과를 기준으로 8.4-20754.5 pg/ml 농도 범 위의 49개의 환자 검체를 수집하여 각각의 검체를 Dimension RxL과 E170에서 동시에 측정한 결과에 대해서 상관 성을 비교 검증하였다[7]. 5. 정상인에서의 혈장 농도 측정 2005년 9월부터 11월까지 건강 검진을 위해 분당서울 대학교병원을 방문한 사람들 중 무작위로 318명의 혈액을 리튬 헤파린 튜브에 채혈하여 NT-proBNP 농도를 측정한 후 차트리뷰를 통해 고혈압, 당뇨, 심혈관계 질환이 없는 건강한 성인 241명을 선정하여 성별, 연령대별 NT-pro- BNP 농도의 분포를 조사하였다. 6. 통계 처리 통계 처리는 SPSS 12.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL), Excel 2003 (Microsoft Corporation, Redmond, WA), MedCalc 8.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium) 프로그램을 이용하였다. 정밀도 평가를 위해서는 검사내정밀도와 총정밀도의 변이계수를 CLSI EP5-A2에서 제시한 방법으로 구하였다. 직선성의 평가에는 회귀방정식과 결정계수(R 2 )을 구하였고 상관성의 평가에는 상관방정식과 Pearson 상관계수(R)를 구하고 오 차도표를 그렸다. 정상인에서의 성별, 연령대별 NT-pro- BNP의 농도 분포의 차이는 Mann-Whitney U 검정을 이 용하였다. 결 1. 정밀도 낮은 농도의 정도관리물질의 평균 농도는 496.6 pg/ml 이었고 높은 농도는 11,233.7 pg/ml이었다. 검사내정밀 도의 변이계수는 낮은 농도는 4.8%, 높은 농도는 3.3%이 었고 총정밀도의 변이계수는 낮은 농도는 8.1%, 높은 농도 는 4.4%이었다. 2. 직선성 낮은 농도와 높은 농도의 검체로 조제한 5가지 농도의 검체로 측정한 결과 30-32,420 pg/ml의 범위에서 R 2 = 0.988의 직선성을 나타냈다(Fig. 1). 3. 상관성 Dimension RxL은 E170로 측정한 결과와 8.4-20, 754.5 pg/ml의 범위에서 우수한 상관성을 보였고(R= 0.996), 기울기는 0.962 (P<0.001) 절편은 -188.38 이 었다(Fig. 2). Dimension RxL에서 측정된 값은 Roche E170으로 측정한 값보다 평균 282.0 pg/ml (95% 신뢰 과

Dimension RxL NT-proBNP 185 35000 30000 y = 0.9622x 188.38 - R2 = 0.988 25000 Assay Value (pg/ml) 20000 15000 10000 5000 0 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 Concentration (pg/ml) Fig. 1. Linearity of Dade Berhing Dimension RxL NT-proBNP assay. Dimension (pg/ml) 25000 20000 15000 10000 5000 y = 1.057x + 182.07 R = 0.996 (Dimension-Roche)/Average % 30 20 10 0-10 0-20 0 5000 10000 15000 20000 25000 E170 (pg/ml) 0 5000 10000 15000 20000 Dimension (pg/ml) Fig. 2. Correlation between Roche E170 and Dimension RxL NT-proBNP assay and difference plot. 구간 130.6-433.4 pg/ml) 높았으며 평균 13.3% (95% 신뢰구간 8.8-17.8%) 높았다. 4. 정상인에서의 NT-proBNP 농도 분포 241명의 정상인의 연령의 중앙값은 47세(20-76세)이었

186 송상훈 박철민 전선희 박경운 김진규 송정한 Male <50 yr Female <50 yr Male 50 yr Female 50 yr (n=71) (n=72) (n=54) (n=44) Fig. 3. Scatter plot for NT-proBNP values in healthy persons divided into 4 groups according to sex and age. 고 50세 미만이 143명, 50세 이상이 98명이었다. 남자는 125명(51.9%), 여자는 116명(48.1%)이었고 연령의 중 앙값은 남자는 48세(23-72세), 여자는 46세(20-76세)이 었으며 통계적으로 유의한 차이는 없었다(P=0.226). 241 명의 NT-proBNP 농도의 중앙값은 24.9 (평균±표준편차, 40.0±49.8) pg/ml이었고 97.5백분위수는 134.7 pg/m L이었다. 남자의 경우 중앙값은 17.5 (평균±표준편차, 28. 7±42.3) pg/ml, 97.5백분위수는 117.4 pg/ml이었고 여자는 중앙값이 36.7 (평균±표준편차, 52.1±54.3) pg/ ml, 97.5백분위수 156.4 pg/ml로 여자가 남자보다 높 은 분포를 보였다(P<0.001). 50세 미만은 중앙값 24.6 (평균±표준편차, 35.3±41.2) pg/ml, 97.5백분위수 117. 3 pg/ml이었고 50세 이상은 중앙값 25.5 (평균±표준편 차, 46.8±59.7) pg/ml, 97.5백분위수 180.3 pg/ml로 50세 이상에서 50세 미만보다 높은 분포를 보였으나 통계 적으로 유의하지는 않았다(P=0.185). Fig. 3에 성별, 연 령대별로 분류한 NT-proBNP의 분포를 표시하였다. 고 찰 BNP와 NT-proBNP는 일반적으로 심부전 환자의 진단 및 치료의 반응을 추적하는데 사용된다. 또한 급성관상동맥 증후군(acute coronary syndrome)에서 예후와 관련이 있고[8] 선천성 심장 질환에서 증가하며 좌심실 유출로의 폐쇄정도와 상관관계가 있으며[9] 만성신장질환이 있는 환 자에서 심기능과 체액 과부하의 정도를 평가하는데 사용될 수 있다[10]. BNP의 측정법은 초기에 면역방사측정법 (IRMA)이 사용되다가[11] 이후 형광면역측정법을 이용한 Triage BNP (Biosite, San Diego, CA) 검사와 같은 현 장검사법이 사용되어 왔으나 연속검사에 한계가 있고 다량 의 검체를 처리하는데 적합하지 않은 단점이 있다[12]. 최 근에는 BNP와 NT-proBNP에 대한 관심이 커지면서 효소 면역법(EIA) 또는 효소화학발광면역법(ECLIA)을 이용한 자동화장비를 통한 방법들이 개발되어 사용되고 있다[13-16]. NT-proBNP의 측정에는 Roche사의 Elecsys 101 0/2010, E170 장비를 이용한 방법이 주로 사용되고 있는 데 최근에 Dade Behring사의 Dimension RxL 장비를 이용하여 측정할 수 있는 방법이 개발되었다. 본 연구에서는 Dimension RxL을 이용할 경우의 총정 밀도의 변이계수가 4.8-8.1%로 계산되었는데 이는 최근에 Di Serio 등이 본 연구와 같은 장비와 정도관리물질을 이 용하여 평가한 결과(2.6-3.6%)에[17] 비해 다소 높은 결 과이나 정규검사로 사용하기에는 무리가 없다고 여겨진다. 본 연구에서 상기의 연구보다 높은 변이계수를 나타낸 이유 는 명확하지는 않으나 다른 lot의 정도관리물질을 사용한 것이 원인이 될 수 있다고 추정할 수 있다. E170과의 상관 관계는 R 2 =0.988로 우수한 상관관계를 보였으며 8.4-20, 754.5 pg/ml의 농도범위에서 Dimension RxL이 E170

Dimension RxL NT-proBNP 187 에 비해 평균 13.3% 높게 측정되었는데 이는 Di Serio 등 이 Roche Elecsys 2010과 비교했을 때의 15%에 비해서 는 약간 낮은 결과이다. Dimension RxL과 E170의 시약 은 Roche사에서 제공하는 같은 항체를 사용하며 표준화되 어 있다. 이러한 차이는 표준화된 시약을 사용했다고 하더 라도 Dimension RxL은 효소면역법, E170은 화학발광법 으로 서로 다른 측정법을 사용하기 때문일 것으로 여겨진 다. 정상인의 혈중 농도의 경우 본 연구에서는 97.5백분위수 가 134.7 pg/ml이었는데 이는 제조사에서 제시하는 cutoff인 125 pg/ml보다 약간 높은 결과인데 이는 환자를 대 상으로 한 연구 결과이기 때문에 본 연구의 결과와 차이가 있는 것으로 생각된다. 여성에서 남성보다 높은 분포를 보 이고 50세 이상에서 50세 미만보다 높은 분포를 보이는 점 은 다른 연구들과 유사한 결과이나 포함한 정상인의 전체적 인 연령대와 그룹화한 방법 등이 다르므로 직접적인 비교는 어렵다고 할 수 있다. 따라서 심부전 환자를 대상으로 한 연구를 통해 임상적인 cutoff를 확인할 필요가 있다. 호흡 곤란을 주소로 응급실을 방문한 환자를 대상으로 한 대규모 의 연구 결과[18-20]가 최근에 발표된 바 있는데, 연령에 구분없이 모든 환자에게 300 pg/ml을 cutoff로 사용할 경우 급성심부전의 진단에 99%의 민감도와 음성예측치를 갖는다고 하였다. 또한 50세 미만에서는 450 pg/ml, 50 세 이상에서는 900 pg/ml을 cutoff로 사용할 경우 급성 심부전 진단에 각각 93%, 91%의 민감도와 95%, 80%의 특이도를 보이므로 연령대별로 구분한 접근법을 제시하기도 하였다[19,20]. 따라서 본 연구에서도 50대 전후의 참고범 위를 구했으며 NT-proBNP는 BNP와는 달리 연령이 증가 할수록 혈중 농도가 증가하므로 정규검사로 사용하기 위해 서는 연령을 좀더 세분화하여 성별 참고범위를 설정하는 것 이 이상적인데 이를 위해서는 본 연구보다 대규모의 연구가 필요하다. NT-proBNP의 경우 EDTA 혈장에서 리튬 헤파린 혈장 에서보다 낮게 측정되는 것으로 알려져 있다[16]. Dimension RxL을 이용하는 경우에도 비슷한 결과를 나타내어 평균 13% 낮게 측정되었다고 보고되었으나 그 원인은 분 명하지 않다[17]. 혈청을 사용할 경우 리튬 헤파린 혈장과 비교할 때 상존 편재(constant bias)와 비례 편재(proportional bias)가 동시에 있는 것으로 알려져 있어 권장되지 않고 있다[17]. 검사 시간은 첫 결과가 나오기까지 19분 정도 소요되어 E170의 18분과 비슷하였다. 결론적으로 Dimension RxL을 이용한 NT-proBNP 측 정법은 Roche E170을 이용한 방법과 우수한 상관관계를 보이고 정밀하므로 정규 검사로 사용이 가능하다. 향후 연 령대별, 성별 참고범위를 설정하기 위해서는 추가적인 대규 모의 연구가 필요하다고 사료된다. 요 약 배경 : 저자들은 최군에 소개된 Dimension RxL을 이 용한 NT-proBNP 측정법(Dade Behring, Deerfield, IL)의 분석능을 평가하였다. 방법 : 검사내정밀도와 총정밀도는 낮은 농도와 높은 농 도의 정도관리 물질을 이용하여 CLSI EP5-A2에 따라 평 가했다. 환자의 검체로 30-32,420 pg/ml의 농도 범위를 만들어 직선성을 평가했다. E170 (Roche Diagnositics, Mannheim, Germany)과의 상관관계는 8.4-20754.5 p g/ml의 농도 범위에 있는 49개의 환자 검체를 이용해서 평가했다. 241명의 건강한 사람의 혈장 농도를 측정하였고 연령별, 성별로 구분하여 분포를 구했다. 결과 : 검사내정밀도의 변이계수는 3.3-4.8%, 총정밀도 의 변이계수는 4.4-8.1%이었다. 직선성은 R 2 =0.988 이 었다. E170과의 상관성은 우수하였으며(R=0.996), Dimension RxL에서 측정된 값은 8.4-20,754.5 pg/ml의 농도범위에서 E170으로 측정한 값보다 높은 결과를 보였 다(평균 282.0 pg/ml, 95% 신뢰구간 130.6-433.4 pg /ml). 241명의 건강한 사람의 97.5백분위수는 134.7 pg /ml이었고 남성은 117.4 pg/ml, 여성은 156.4 pg/ml 이었다. 50세 이상에서 50세 미만보다(180.3 대 117.3 pg/ml) 높았다. 결론 : Dimension RxL NT-proBNP 검사는 수용할만 한 분석능을 보였다. 이 측정법은 심부전 환자의 조기 진단 과 추적관찰을 위한 검사로 사용될 수 있다. 참 고 문 헌 1. Hosoda K, Nakao K, Mukoyama M, Saito Y, Jougasaki M, Shirakami G, et al. Expression of brain natriuretic peptide gene in human heart. Production in the ventricle. Hypertension 1991;17:1152-5. 2. Hunt PJ, Yandle TG, Nicholls MG, Richards AM, Espiner EA. The amino-terminal portion of pro-brain natriuretic peptide (Pro-BNP) circulates in human plasma. Biochem Biophys Res Commun 1995;214:1175-83. 3. Magga J, Marttila M, Mantymaa P, Vuolteenaho O, Ruskoaho H. Brain natriuretic peptide in plasma, atria, and ventricles of vasopressin- and phenylephrine-infused conscious rats. Endocrinology 1994;134:2505-15. 4. Tsuruda T, Boerrigter G, Huntley BK, Noser JA, Cataliotti A, Costello-Boerrigter LC, et al. Brain natriuretic Peptide is produced in cardiac fibroblasts and induces matrix metalloproteinases. Circ Res 2002;91:1127-34. 5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of precision performance of quantitative measurement methods;

188 송상훈 박철민 전선희 박경운 김진규 송정한 approved guideline. CLSI document EP5-A2. Wayne, PA: CLSI, 2004. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: a statistical approach; approved guideline. CLSI document EP6- A. Wayne, PA: CLSI, 2003. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute. Method comparison and bias estimation using patient samples; approved guideline. CLSI document EP9-A. Wayne, PA: CLSI, 1995. 8. de Lemos JA, Morrow DA, Bentley JH, Omland T, Sabatine MS, McCabe CH, et al. The prognostic value of B- type natriuretic peptide in patients with acute coronary syndromes. N Engl J Med 2001;345:1014-21. 9. Cowley CG, Bradley JD, Shaddy RE. B-type natriuretic peptide levels in congenital heart disease. Pediatr Cardiol 2004;25:336-40. 10. McCullough PA, Kuncheria J, Mathur VS. Diagnostic and therapeutic utility of B-type natriuretic peptide in patients with renal insufficiency and decompensated heart failure. R- ev Cardiovasc Med 2003;4 Suppl 7:S3-S12. 11. Ry SD, Clerico A, Giannessi D, Andreassi MG, Caprioli R, Iascone MR, et al. Measurement of brain natriuretic peptide in plasma samples and cardiac tissue extracts by means of an immunoradiometric assay method. Scand J Clin Lab Invest 2000;60:81-90. 12. 윤갑준, 오기진, 임성자. Bayer Advia Centaur BNP assay 와 Biosite Triage BNP assay의 비교. 임상검사와 정도관리 2005;27:189-93. 13. Wu AH, Packer M, Smith A, Bijou R, Fink D, Mair J, et al. Analytical and clinical evaluation of the Bayer ADVIA Centaur automated B-type natriuretic peptide assay in patients with heart failure: a multisite study. Clin Chem 2004; 50:867-73. 14. Wians FH Jr, Wilson BA, Grant A, Bailey J, Gheorghiu I, Conarpe C, et al. Evaluation of the analytical performance characteristics of the Bayer ACS:180 B-type natriuretic peptide (BNP) assay. Clin Chim Acta 2005;353:147-55. 15. Mueller T, Gegenhuber A, Poelz W, Haltmayer M. Preliminary evaluation of the AxSYM B-type natriuretic peptide (BNP) assay and comparison with the ADVIA Centaur BNP assay. Clin Chem 2004;50:1104-6. 16. Sokoll LJ, Baum H, Collinson PO, Gurr E, Haass M, Luthe H, et al. Multicenter analytical performance evaluation of the Elecsys probnp assay. Clin Chem Lab Med 2004;42: 965-72. 17. Di Serio F, Ruggieri V, Varraso L, De Sario R, Mastrorilli A, Pansini N. Analytical evaluation of the Dade Behring Dimension RxL automated N-Terminal probnp (NT-pro- BNP) method and comparison with the Roche Elecsys 2010. Clin Chem Lab Med 2005;43:1263-73. 18. Januzzi JL Jr, Camargo CA, Anwaruddin S, Baggish AL, Chen AA, Krauser DG, et al. The N-terminal Pro-BNP investigation of dyspnea in the emergency department (PRIDE) study. Am J Cardiol 2005;95:948-54. 19. Baggish AL, Cameron R, Anwaruddin S, Chen AA, Krauser DG, Tung R, et al. A clinical and biochemical critical pathway for the evaluation of patients with suspected acute congestive heart failure. The ProBNP investigation of dyspnea in the emergency department (PRIDE) algorithm. Crit Pathways in Cardiol 2004;3:171-6. 20. Baggish AL, Siebert U, Lainchbury JG, Cameron R, Anwaruddin S, Chen A, et al. A validated clinical and biochemical score for the diagnosis of acute heart failure: the ProBNP Investigation of Dyspnea in the Emergency Department (PRIDE) Acute Heart Failure Score. Am Heart J 2006;151:48-54.