카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 정 윤 화 단국대학교 식품영양학과 1. 서론 1.1. 커피 커피는 꼭두서니과 (Rubiaceae family)에 속하며, 크게 아라비카(arabica)품종과 로부스타 (robusta)품종으로 구분된다. 아라비카 품종은 향미가 풍부하고 카페인 함량이 0.4 1.4%이다. 전 세계 커피 총 생산량의 약 76.4%를 차지하고 있으며, 주로 중/남미, 아프리카 인도네시아 등에서 재배되고 있다. 로부스타 품종은 전 세계 커피 총 생산량의 약 23.6%를 차지한다. 거칠고 쓴 향 미가 강하나 병충해에 강하고 생산량이 많고 아라비카 품종보다 가격이 저렴해서 저가의 인스턴트 커피 제조에 주로 사용되고 있다. 카페인 함량은 1.7-4.0%이며, 세계 최대 생산국은 베트남이며, 동남아시아, 인도, 중앙아프리카 등에서 주로 재배되고 있다. 커피는 오랜기간 많은 사람들이 음용 하는 대표적인 기호식품으로 전 세계적으로 하루에 25억 잔, 세계 인구의 70 80%가 음용하는 대 중적인 음료이다(International Coffee Organization, 2001; Borreli et al., 2002). 기록상으로 우리나라에 커피가 처음 들어온 것은 1875년 고종 임금이 러시아 공사관에 피신하 였을 때 처음으로 접해보았다고 알려져 있다. 비공식적으로는 우리나라에 들어온지 150년이 넘었 을 것이라 추정되며, 현재는 녹차를 대신하여 우리나라에서 가장 대표적인 기호 음료로 자리잡고 있다. 우리나라의 커피 시장 규모는 2012년 기준으로 총 4조 1,300억 원에 이르며, 그 중 커피전 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 93
문점이 차지하는 비중은 1조원을 넘고 있다. 한국의 커피 시장은 매년 10% 이상의 성장을 하였으 며, 지속적인 성장을 보일 것으로 전문가들은 전망하고 있다. 우리나라 국민 1인당 커피 소비량은 1975년 0.1 Kg에서 1988년 1 Kg 이상이라고 보고되었다(KCS, 2013). 2011년에는 하루 평균 300톤 이상의 커피가 소비되었으며, 이는 에스프레소 기준으로 3,700만잔 분량이다(KCS, 2013). 전통적으로 우리나라의 가장 큰 커피 시장은 세계 최초로 개발된 믹스커피이며, 이는 동결건조커 피, 설탕, 프림을 섞은 제품이다. 최근에는 에스프레소 커피를 기반으로 하는 카페 시장이 확대되 고 있으며, 점차적으로 커피 시장이 고급화 및 세분화 되고 있다. 커피는 기호성 식품으로 분류되고 있으나, 항산화 물질로 알려진 클로로제닉산의 가장 큰 공급 원으로 알려져 있다. 커피 연구에 대해서 커피의 기호성을 나타내는 향미 성분의 분석 뿐만 아니 라, 세계적으로 기능성 관련 연구도 다양하게 수행되고 있다. Hečimović 등(2011)은 로스팅 정도 에 따른 폴리페놀과 카페인 함량을 arabica 및 robusta 품종으로 나누어서 비교하였으며, Parras 등(2007)은 14종의 커피를 3가지 추출법을 이용하여 항산화 능력을 비교하였다. 또한 Vignoli 등(2011)은 인스턴트 커피의 로스팅 공정에서 항산화 능력과 총 폴리페놀 함량은 로스팅 시간에 반비례함을 밝혔다. 커피 생두와 로스팅한 원두의 항산화 능력을 로스팅 방법에 따라 비교한 연구 결과도 보고되었다(Nebesny and Budryn, 2003). 최근 국내 연구로는 Kim 등(2012)이 시판되 는 아메리카노 한잔에 페놀성 화합물이 63.83 110.12 mg gallic acid 상당량이 함유되어 있다 고 보고 하였다. 1.2. 카카오 카카오는 초콜렛의 원료가 되는 아욱묵에 속하는 열대성 식물이다. 카카오 열매 하나에 20 50 개의 씨앗이 들어있으며, 이것을 모아서 발효시킨 것을 카카오콩 이라 한다. 카카오콩은 갈색 빛 을 띠면서 독특한 향과 맛을 가지고 있다. 커피처럼 로스팅 과정을 거친 다음 분쇄 및 가공 처리 를 하여 코코아 음료 및 초콜렛 원료로 사용된다. 카카오콩은 멕시코 원주민들이 음료 또는 약용으로서 귀히 여기던 것으로, 15세기말에 콜럼버스 에 의해 최초로 유럽에 소개되었으며, 그 후 16세기 중반에 멕시코를 탐험한 코르테스가 에스파냐 의 귀족, 부유층에 소개하여 17세기 중반에 유럽 전역으로 전파되었다. 94 2014년 기초연구과제 총서
카카오의 단맛 및 쓴맛을 활용한 초콜렛은 카카오 콩으로부터 얻은 코코아버터, 코코아매스, 코 코아 분말 등에 식품 또는 식품 첨가물을 가하여 가공한 초콜렛, 스위트 초콜렛, 밀크초콜렛 등을 말하며, 전세계적으로 대표적인 기호 식품으로 자리 잡아 왔다. 그러나 초콜렛의 경우 웰빙이라는 현재의 식품 트랜드에 비추어 봤을때 고지방, 고열량, 고당질의 제품이라는 단점을 가지고 있다. 카카오는 다량의 폴리페놀을 함유하고 있다. 폴리페놀은 식품의 2차 대사 산물로서 2개 이상의 페놀성 히드록실기를 포함하고 있는 화합물을 통칭하며, 녹차에 든 카테킨, 포도주의 레스베라트롤, 사과 및 양파에 있는 쿼세틴 등이 식물에 함유되어 있는 것이 대표적인 폴리페놀이다(Othman et al., 2007). 폴리페놀은 뛰어난 항산화 작용을 가지고 있으며, 인체 내에서 생산되는 활성산소를 해가 없는 물질로 바꾸어 주는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Counet and Collin, 2003). 폴리페놀은 활성산소에 노출되어 손상되는 DNA의 보호나 세포구성 단백질 및 효소를 보호하는 항산화 능력이 커서 다양한 질병에 대한 위험도를 낮추어 준다고 보고되고 있다(Kono et al., 1995; Saliva et al., 1991; Ding et al., 2006). 또한 폴리페놀은 항암작용과 함께 심 장질환을 막아주는 것으로 알려져 있다. 카카오에는 카테킨이라는 폴리페놀성 화합물이 다량 함류 되어 있으며, 녹차보다 7배, 홍차보다 9배나 많은 폴리페놀이 함유되어 있다고 보고되었다(Kim and Keeney, 1984; Lee et al., 2003). 2. 연구 목적 중남미에서는 카카오콩도 커피와 같은 로스팅 과정을 거쳐 추출하여 음용한다는 것에 착안하여 카카오를 커피음료에 적용하기로 하였다. 현재까지 커피와 카카오를 침출하여 혼합한 기능성 음료는 개발되어 있지 않다. 따라서, 본 연구 에서는 커피 음료의 다양화, 고급화, 기능성 전달을 위하여 커피 추출액과 카카오 추출액을 혼합 하여 기호성뿐만 아니라 건강기능성을 함께 가진 카카오 커피 음료를 개발하고자 하였다. 세부적으로 (1)소비자 기호도가 높으며 다량의 항산화 성분을 가진 커피 원두의 선정, (2)항산화 능력과 폴리페놀 함량이 높게 유지되는 최적의 커피 로스팅 조건 확립, (3)항산화 능력과 폴리페놀 함량이 높게 유지되는 최적의 카카오 로스팅 조건 확립, (4)카카오 커피 음료 제품의 소비자 기호도 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 95
조사를 통하여 최적의 배합비를 설정하고자 하였다. 3. 커피 품종 선정 3.1. 연구 목적 항산화 능력이 높은 카카오-커피 음료를 개발하기 위하여, 국내에 수입되는 다양한 원산지의 커피를 로스팅하여 소비자가 선호하는 커피 중 항산화 능력이 높은 커피를 선정하고자 하였다. 3.2. 재료 및 방법 3.2.1. 재료 Folin ciocalteu reagent, Gallic acid, aluminum nitrate, potassium acetate, quercetin, 1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl, ascorbic acid, FeCl 3, FeSO 4 7H 2 O (Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate), trolox, 2,2' azobis (2 amidino propane) dihydrochloride, fluorescein sodium, ABTS (2,2 azinobis (3 ethylbenzo thiazoline 6 sulphonic acid)는 Sigma Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서, 2,4,6 Tri (2 Pyridyl) 1,3,5 triazine는 Tokyo Chemical Industry Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. Ethanol, dimethyl sulfoxide은 Junsei Chemical Co. (Tokyo, Japan)에서, sodium carbonate은 Showa Chemical Industry Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하 였다. 3.2.2. 커피 로스팅 및 추출 7종의 아라비카 커피는 생두를 Café Moi(Yongin si, Korea)에서 로스팅을 하였다(Table 3 1). 생두는 2013년에 수확하여 수입된 것을 사용하였다. 커피 생두(1000.0 g)는 7년 경력의 커피 로스팅 전문가가 후지로얄사의 상업용 커피 로스터(R 105, Fuji Royal Co., Ltd., Osaka, Japan)를 이용하여 로스팅을 하였다. 각각의 커피 생두의 상태에 따라 최적의 커피 원두를 생산 하고자 각각 다른 조건에서 로스팅을 진행하였다(Hečimović et al., 2011). 커피 로스팅 정도는 Agtron number 58±3으로 미디엄 로스팅보다 약간 낮은 수준으로 하였다(SCAA, 2009). 로스 96 2014년 기초연구과제 총서
팅 된 원두는 상온에서(23 ) 3일간 방치하여 커피 내의 CO 2가 방출되도록 하였다. 대조구로는 시판용 브라질산 아리비카 커피(Brazil Cerrado, E mart, Seoul, Kora)를 사용하였다. 커피 추출은 상업용 에스프레소머신(Faema E98, Faema, Milan, Italy)을 이용하였다. 원두를 분쇄하여 710 x 710 μm 표준체를 통해서 걸러지는 부분만을 추출에 사용하였다. 커피 (14.5 g)을 에스프레소 추출용 포터 필터에 넣고 약 3 Kg의 힘으로 탬핑을 하였다. 그후 9 atm 98 의 증기를 이용하여 60 ml의 커피를 추출하였다. 추출된 커피는 Sacchetti 등(2009)의 방법을 참고 하여 상온에서 Advantec No. 2 filter paper (pore size : 6 μm, Advantec MFS, Inc., Dublin, CA, USA)를 이용하여 여과하였다. 시료의 냉동 보관은 커피의 냉동 보관에 따른 항산화 능력에 영향을 끼치지 못한다는 연구결과(Nicoli et al., 1997)를 참고하여 30 에서 냉동 보관하여 추후 실험에 사용하였다. Table 3 1. Coffee bean samples and abbreviations of the samples Origin Mexico Yajalon Mexico Maragogype Guatemala Antigan Ethiopia Michile Kenya AA Colombia Supremo Peru Chanchamayo Brazil Cerrado Abbreviation MY MM GA EM KA CS PC BC 3.2.3. 소비자 조사 커피 8종의 소비자 기호도 조사는 단국대학교 학생 60명에 의해 수행되었다. 시료는 추출된 에스프레소에 뜨거운 물을 5배 가수하여 아메리카노를 제조하였다. 소비자 조사는 80명을 수용할 수 있는 강의실에서 진행되었다. 소비자 패널에게 명확하게 9점 척도에 대하여 교육을 진행하여 소비자 패널이 명확하게 9점 척도법(1=대단히싫다, 2=매우싫다, 3=보통싫다, 4=약간싫다, 5=보통 이다, 6=약간좋다, 7=보통좋다, 8=매우좋다, 9=대단히 좋다)을 이해하도록 하고 소비자 조사를 수행하였다. 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 97
패널은 전반 기호도, 색상 기호도, 향 기호도, 커피맛 기호도, 쓴맛 기호도, 신맛 기호도를 평가 하였다. 시료는 Wakeling과 MacFie(1995)의 incomplete balanced design 방법을 이용하여 패널 한 명에게 4개의 시료를 제공하여 평가를 진행하였다. 패널에게 시료를 제시하기 직전에 보온병에 있는 커피 추출액을 종이컵에 옮겨 제공하여 시료의 온도 변화를 최소화 하였다. 시료(20 ml)는 189 ml의 종이컵에 제공되었으며, 종이컵은 온도의 변화를 최소화 하고자 2겹으로 하였다. 패널은 실제 커피를 마시는 것과 동일하게 맛을 보고 삼키로록 하였다. 시료 취식 후 생수를 제공하여 제품 시식 후 입안을 헹구도록 하였다. 소비자 조사실의 온도는 24 로 유지되었으며, 조명은 형광등을 이용하였다. 3.2.4. DPPH radical 소거활성 측정 DPPH(1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl) radical 소거활성측정은 free radical을 갖는 안정한 화 합물인 DPPH를 기질로서 Blois(1958)방법을 변형하여 측정하였다. DPPH 용액 (1.5 10-4 M) 160 µl와 커피추출액 40 µl를 혼합한 후 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 microplate reader (Spectra max M2, Molecular Devices, LLC., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여, 아래의 식에 의하여 항산화 활성 능력을 나타내었다. DPPH radical scavenging activity (%) = [control Abs (Sample Abs Blank Abs) / Control Abs] 100 커피의 상대적인 항산화성을 비교하기 위해 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하였다. 3.2.5. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) 측정 FRAP 측정은 커피 추출물에 의해 ferric 2,4,6 tripyridyl s triazine[fe(Ⅲ) TPIZ]를 ferrous 2,4,6 tripyridyl s triazine[fe(Ⅱ) TPIZ] 혼합물로 환원되는 원리를 통하여 항산화 능력을 측정하는 방법으로 Benzie(1999)의 방법을 수정하여 측정하였다. 실험에 사용하기 위한 FRAP reagent를 만들기 위해 아래와 같이 A, B, C용액을 제조하였다. A: 300 mm sodium acetate buffer (ph 98 2014년 기초연구과제 총서
3.6), B: 10mM TPTZ(2,4,6 tripyridyls triazine)/40 mm HCl, C: 20 mm FeCl 3 용액을 실험 직전에 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합한 후 37 에서 반응시켜 FRAP reagent로 사용하였다. FRAP reagent 290 µl와 커피 추출물 10 µl을 넣은 후, 37 에서 15분간 반응시킨 후 593 nm 에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. FRAP 활성은 커피 1 g당 해당되는 환원력을 표준물질인 FeSO 4 7H 2O 표준곡선(R 2 =0.997)을 작성하여 1 g 커피 원두의 환원력 (mm Fe(II)/g)으로 나타내었다. 3.2.6. ABTS radical cation decolonization assay 측정 7 mm ABTS 용액과 2.45 mm potassium persulfate 용액을 16시간 암실에 방치하여 측정에 필요한 시약을 준비하였다. 준비된 ABTS 용액과 potassium persulfate 용액을 phosphate buffer saline으로 희석하여 734 nm에서 흡광도가 0.7이 되도록 하여 최종 ABTS 측정 용액을 제조하였다. 시료(0.1 ml)에 최종 ABTS 용액 3 ml를 넣고 3분간 방치하고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 0 1 mm의 trolox 용액의 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 만들었다. 결과 값은 커피 1 g당 원두의 trolox equivalent (mm TE/g)으로 나타내었다. 3.2.7. 총 페놀함량 측정 총 페놀함량(total polyphenol contnet, TPC)은 Folin Dennis 방법(AOAC, 1995)을 변형하여 측정하였다. 시료 2 μl에 증류수를 넣어 160 μl로 희석하여 만든 후 2N Folin Ciocalteu's phenol reagent 10 μl를 넣고 8분간 암실에서 반응시킨다. 반응시킨 용액에 20% Na 2 CO 3 수용액을 30 μl을 가한 후, 암실에서 2시간 정치한 후 microplate reader(spectra max M2, Molecular Devices)로 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 gallic acid를 0~1000 μg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 얻어진 검량곡선(R 2 =0.998)을 통해 시료의 총 페놀성 화합물 함량을 커피 1 g당 원두의 gallic acid equivalents (mg GAE/g)로 나타내었다. 3.2.8. 총 플라보노이드 함량 측정 총 플라보노이드 함량은 건강기능식품공전상의 방법(2011)을 이용하여 측정 하였다. 시료 40 μl에 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 99
에탄올 120 μl, 10% aluminum nitrate 8 μl, 1.0 M potassium acetate 8 μl, 증류수 24 ul를 차례로 가하여 혼합하고, 실온에서 40분간 정치 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 사용하여 0-180 μg/ml의 농도 범위에서 얻어진 표준 검량선(R 2 =0.997)을 통해 총 플라보노이드 함량을 커피 1 g당 원두의 quercetin equivalents(mg QE/g)로 나타내었다. 3.2.9. 통계분석 소비자 조사 결과는 소비자 및 시료 를 독립변수로 하여 이원분산분석(2 way analysis of variance, ANOVA)를 실시하였다. 이화학 분석은 시료를 독립변수로 하여 일원분산분석(1 way ANOVA)를 실시하였다. 시료간의 유의차 정도를 구분하기 위하여 Fisher s least significant difference (LSD) test를 수행하였다 3.3. 결과 및 고찰 3.3.1. 소비자 기호도 조사 커피 8종에 대한 전반적인 품질, 향 및 향미 기호도는 Table 3 2와 같다. 전반적인 품질에 관 한 기호도는 9점 만점에 3.52이었으며, 통계적으로 시료간에 유의적인 차이이는 없었다(p>0.05). 대조구로 사용된 마트 시판 제품인 BC는 3.96으로 평가되었으며, MY(4.52), KA(4.32), MM(4.13)는 대조구 보다 높은 기호도를 보여 주었다. 향에 관한 기호도에서는 MY(5.36), MM(5.22), KA(5.14)의 순서이었으며, 대조구가 4.58로 가장 낮게 되었다. 커피를 마셨을때 느껴 지는 향미 기호도는 MY(4,48), GA(4.32), KA(4.27)가 대조구인 BC(4.21)보다 높았으며, EM(3.35)과 PC(3.39)는 타 품종에 비해서 0.5점 이상 낮았다. 100 2014년 기초연구과제 총서
Table 3 2. Consumer acceptance of overall quality, aroma and flavor for 8 coffee extract Sample Acceptance 1) Overall quality Aroma Flavor BC 3.96 4.58 4.21 CS 3.91 5.36 3.95 EM 3.26 4.91 3.35 GA 3.86 4.77 4.32 KA 4.32 5.14 4.27 MM 4.13 5.22 3.96 MY 4.52 5.39 4.48 PC 3.52 4.91 3.39 1) No significant difference (p<0.05) was found in acceptances. 3.3.2. 항산화 활성 DPPH, FRAP 및 ABTS 방법을 이용한 커피 추출액 8종의 항산화 활성은 Table 3 3과 같다. Free radical 소거능을 측정한 DPPH 분석은 커피 원두 1 g당 ascorbic acid 상당량(mg ascorbic acid equivalent (AAQ)/g)으로 표기하였다. 8종 시료의 ascorbic acid 상당량 범위는 MM에서 15.92 mg AAQ/g으로 가장 높았으며 GA에서 8.65 mg AAQ/g으로 가장 낮았다. 대조구인 BC의 항산화 활성은 12.86 mg AAQ/g이었으며, MM, KA(14.37 mg AAQ/g), EM(13.52 mg AAQ/g)는 대조구보다 높았다. 커피 원두 1 g당 철(II)의 산화력 상당량(mmol Fe(II) equivalent (EQ)/g)으로 분석한 FRAP 시험법에서는 0.24-0.41 mmol Fe(II) EQ/g의 항산화 활성을 보였다. KA가 0.41 mmol Fe(II) EQ/g로 가장 높았으며 PC가 0.24 mmol Fe(II) EQ/g로 가장 낮았다. KA, EM(0.39 mmol Fe(II) EQ/g)은 대조구인 BC(0.36 mmol Fe(II) EQ/g)보다 항산화 활성이 높았다. ABTS radical은 산화하는 능력을 측정한 ABTS 시험법에서는 커피 원두 1 g의 항산화 활성을 trolox equivalent (TE)/g로 표시하였다. 8종의 시료의 항산화 활성은 95.99-113.68 μmol TE/g이었으며, 시료간에 유의적인 차이는 없었다(p>0.05). CS는 113.68 μmol TE/g로 가장 높은 ABTS radical 소거능을 보였으며, MY는 85.99 μmol TE/g로 가장 낮았다. MM(108.38 μmol 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 101
TE/g)과 EM(104.60 μmol TE/g)는 CS와 더불어 100 μmol TE/g이 넘는 항산화 활성을 보여주 었다. Table 3 3. Antioxidant activities of 8 coffee extracts by DPPH radical scavenging activity (DPPH), ferric reducing antioxidant power (FRAP), and ABTS radical cation decolonization assay (ABTS) Sample DPPH (mg ascorbic acid EQ/g) 1) FRAP (mmol Fe(II) EQ/g) ABTS (μmol TE/g) BC 12.86±1.68 bcd 0.36±0.02 c 98.25±15.88 CS 12.61±0.75 cde 0.34±0.02 d 113.68±11.47 EM 13.52±0.96 bc 0.39±0.01 b 104.60±5.82 GA 8.65±0.86 f 0.36±0.36 c 94.78±10.86 KA 14.37±0.55 ab 0.41±0.01 a 99.27±18.70 MM 15.92±1.08 a 0.31±0.01 e 108.38±3.37 MY 11.48±1.12 de 0.35±0.00 cd 85.99±10.57 PC 11.10±0.45 de 0.24±0.00 f 93.19±5.77 1) EQ = equivalent, TE = trolox equivalent 3.3.3. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 커피 추출액 8종의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 Table 3 4와 같다. 총 폴리페놀 함량은 커피 원두 1 g당 gallic acid 상당량(mg gallic acid equivalent (GAE)/g)으로 표시하였다. 총 폴리페놀 함량은 19.03 mg GAE/g (BC)에서 21.99 mg GAE/g (EM)으로 시료간에 큰 차이가 없었다. 7종의 시료는 대조구(BC)보다 총 폴리페놀 함량이 높았다. 총 플라보노이드 함량은 커피 원두 1 g 당 quercetin 상당량(mg quercetin equivalent (QE)/g)으로 표시하였다. PC가 5.27 mg QE/g로 가장 높았으며, KA(4.34 mg QE/g)와 EM(4.25)가 그 뒤를 이었다. CS(3.76 mg QE/g), MM(3.69 mg QE/g), GA(3.65 mg QE/g)의 총 플라보노이드 함량은 대조구(3.37 mg QE/g)보다 높았다. 102 2014년 기초연구과제 총서
Table 3 4. Total polyphenol and total flavonoid contents of 8 coffee extracts Sample TPC (mg GAE/g) TFC (mg QE/g) BC 19.03±0.35 d 3.37±0.77 b CS 21.34±0.49 ab 3.76±0.33 b EM 21.99±0.33 a 4.25±0.13 ab GA 20.26±0.39 bc 3.65±0.66 b KA 20.00±0.38 cd 4.34±0.65 ab MM 19.70±1.16 cd 3.69±0.89 b MY 19.32±0.63 cd 3.22±0.98 b PC 20.18±0.81 c 5.27±0.53 a 3.3.4. 품종 선정 커피는 기호 식품으로 본 연구에서 초점을 두고 있는 기능성 커피 카카오 음료의 개발에 중요한 항산화 활성 뿐만아니라 소비자들의 기호성도 매우 중요하다. 대조구인 BC보다 전반적인 품질 기 호도가 높은 MM, KA, MY의 세 품종을 대상으로 항산화 능력 및 가격을 비교하고 품종을 선정 하였다(Table 3 5). 선정된 세 가지 품종은 소비자 조사, 항산화 능력, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량에서 유사하였다. 그러나 KA는 다른 두 품종보다 가격이 2배 가량 높기 때문에 제외 시켰다. MY와 MM 중 항산화 활성(DPPH, ABTS) 및 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 높은 MM을 기능성 커피 카카오 음료 개발을 위한 커피 품종으로 선정하였다. Table 3 5. Selecting coffee sample for developing a functional coffee cacao beverage Sample MY KA MM Overall quality (out of 9) 4.52 4.32 4.13 DPPH (mg ascorbic acid EQ/g 11.48 14.37 15.92 FRAP (mmol Fe(II) EQ/g) 0.35 0.41 0.31 ABTS (μmol TE/g) 85.99 99.27 108.38 TPC (mg GAE/g) 19.32 20.00 19.70 TFC (mg QE/g) 3.22 4.34 3.69 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 103
4. 커피 로스팅을 위한 최적의 온도, 시간, 공기유입 조건 설정 4.1. 연구 목적 온도, 시간 및 공기 유입을 조건으로 하며 반응표면 분석법(response surface methodology, RSM)을 시행하여 커피 로스팅 후 항산화 활성이 가장 높은 조건을 찾아 본 연구의 카카오 커피 개발을 위한 커피 로스팅에 적용하고자 하였다. 4.2. 재료 및 방법 4.2.1. 실험 재료 커피는 2013년 수확된 멕시코산 maragogype를 사용하였다. Folin ciocalteu reagent, gallic acid, 1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl는 Sigma Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, ethanol 은 Junsei Chemical Co. (Tokyo, Japan)에서, sodium carbonate은 Showa Chemical Industry Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 4.2.2. 커피 로스팅 및 추출 커피 로스팅은 상업용 직화식 로스터(최대 5,000 g, R 105, Fuji Royal Co., Ltd., Osaka, Japan)를 이용하여 1회 2,000 g의 생두를 투입하여 진행하였다. 예비 실험을 통해서 반응표면분 석법(response surface methodology, RSM)을 실시하기 위한 중심점의 온도(190 ), 시간(15 min), 공기흐름(0 m3/hr)을 설정하였다. RSM은 Box Behnken design을 사용하여 총 15조건에 서 로스팅을 실시하였으며, 중심점에서는 3회 반복 로스팅을 하였다(Table 4 1). 로스팅된 원두의 추출은 solid liquid extraction 방법을 이용하였다. 커피와 정수된 물(98 )을 1:10 (w:v)으로 플라스크에 넣은 후 98 의 항온 수조에서 100 rpm의 속도로 교반하여 10분간 추출하였다. 추출물은 추출 후 상온에서 6500xg force로 원심분리하여 상등액을 Advantec No. 2 filter paper (pore size : 6 μm) (Advantec MFS, Inc., Dublin, CA, USA)를 이용하여 감압 여과한 후 부피를 측정하였다. 여과된 시료는 30 에서 보관하면서 분석에 사용하였다. 104 2014년 기초연구과제 총서
Table 4 1. Experimental design by Box Behnken design in conducting response surface methodology for coffee roasting Experimental number Temperature ( ) Time (min) Air flow (m 3 /hr) 1) 1 180 13 0 2 180 15 3.91 3 180 15 3.91 4 180 17 0 5 190 13 3.91 6 190 13 3.91 7 190 15 0 8 190 15 0 9 190 15 0 10 190 17 3.91 11 190 17 3.91 12 200 13 0 13 200 15 3.91 14 200 15 3.91 15 200 17 0 1) Open damper for positive air flow and close damper for negative air flow. 4.2.3. DPPH radical 소거활성 측정 DPPH(1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl) radical 소거활성 측정은 free radical을 갖는 안정한 화합물인 DPPH를 기질로서 Blois(1958)방법을 변형하여 사용하였다. DPPH 용액 (1.5 10-4 M) 160 µl와 커피추출액 40 µl를 혼합한 후 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 microplate reader (Spectra max M2, Molecular Devices, LLC., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 517 nm에 서 흡광도를 측정하였고, 아래와 같이 황산화 활성을 나타내었다. DPPH radical scavenging activity (%) = [control Abs (sample Abs blank Abs) / control Abs] 100 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 105
4.2.4. 총 페놀 함량 측정 총 페놀 함량(total polyphenol contnet, TPC)은 Folin Dennis 방법(AOAC, 1995)을 변형하여 사용하였다. 시료 2 μl에 증류수를 넣어 160 μl로 희석하여 만든 후 2N Folin Ciocalteu's phenol reagent 10 μl를 넣고 8분간 암실에서 반응시켰다. 반응시킨 용액에 20% Na 2 CO 3 수용액을 30 μl을 가하고, 암실에서 2시간 정치한 후 microplate reader(spectra max M2, Molecular Devices)로 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 gallic acid를 0-1000 μg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 얻어진 검량곡선(R 2 =0.998)을 통해 시료의 총 페놀 함량을 gallic acid equivalents (mg GAE/g)로 나타내었다. 4.2.5. 통계분석 Minitab 16(Minitab, College Station, PA, USA)을 이용하여 분산분석(Analysis of variance, ANOVA)를 실시하여 p<0.05의 유의적인 수준에서 RSM 결과를 도출하였다. 4.3. 결과 및 고찰 4.3.1. 온도, 시간, 공기 흐름에 따른 커피 로스팅 시 항산화 활성의 변화 로스팅 온도, 시간, 공기흐름에 따른 Box Behnken design을 이용한 반응표면 분석법의 DPPH 실험법에 의한 항산화 활성의 통계 분석은 Table 4 2와 같다. ANOVA 분석결과 모델은 p=0.012 및 F value(9.29)를 가지는 것으로 나타나 제안된 모델의 유의성을 확인시켜주었다. Coefficient of determination(r 2 )은 94.36%이었으며, adjusted coefficient of determination (R 2 84.21%로 수정 모델의 R 2 값이 약간 하락함을 보여주었다. 적합성 결여(Lack of fit)는 p=0. 543 으로 모델에 적합하다고 나타났다. 이러한 결과값들은 본 RSM모델의 유의함을 증명해준다. 독립 변수인 온도(A), 시간(B), 공기흐름(C) 은 모델 분석결과 p value가 각각 0.001, 0.010, 0.032로 분석되어 모든 항목에서 유의적인 차이가 없었다. 제곱항의 p value는 각각 0.778, 0.818, 0.142로 유의차가 없었다. 교호작용에서는 온도 시간, 온도 공기, 시간 공기에서 p value가 각각 0.941, 0.143. 0.600로 모든 항목에서 유의차가 없었다. adj)은 106 2014년 기초연구과제 총서
Table 4 2. Analysis of variance and model fitting for the response and variables antioxidant activity by DPPH radical scavenging activity assay 1) Source df Seq SS Adj SS Adj MS F value P value Model 9 390.962 390.962 43.440 9.29 0.012 A temperature 1 241.370 241.370 241.370 51.64 0.001 B time 1 77.919 77.919 77.919 16.67 0.010 C air flow 1 40.445 40.445 40.445 8.65 0.032 A 2 1 0.772 0.412 0.412 0.09 0.778 B 2 1 0.665 0.274 0.274 0.06 0.818 C 2 1 14.186 14.186 14.186 3.04 0.142 AB 1 0.029 0.029 0.029 0.01 0.941 AC 1 14.117 14.117 14.117 3.02 0.143 BC 1 1.459 1.459 1.459 0.31 0.600 Residual 5 23.368 23.368 4.674 Lack of fit 3 13.859 13.859 4.620 0.97 0.543 Pure error 2 9.509 9.509 4.755 Total 14 414.330 R 2 0.9436 Adj R 2 0.8421 1) Seq SS =sequential sum of square, Adj SS = adjusted sum of square, Adj MS = adjusted mean square. 이와 같은 결과를 이용하여 유의차가 없는 항을 제거한 reduced model을 적용하여 온도, 시간, 공기흐름 에 따른 커피의 항산화 활성의 예측 식은 선형 방적식으로 아래와 같다. DPPH (%) = 59.1096 5.4928A 3.1209B + 0.3450C (A:온도, B: 시간, C: 공기흐름) ANOVA 분석결과를 바탕으로 온도, 시간, 공기흐름 에 따른 항산화 활성의 변화를 나타내는 등고선도는 Figure 4 1과 같다. 온도 및 시간 과 항산화 활성은 반비례 관계를 보여주었다. 로스팅 시간이 길어지고 로스팅 온도가 높아질수록 항산화 활성이 감소하였다. 온도 와 공기흐름 및 온도 와 시간 에 있어서는 2차 함수 모양의 등고선이 관측되었다. 유의차가 발견되지 않았지만 공기흐름 의 제곱항(p=0.124)이 등고선도에 영향을 주었다고 할 수 있다. 공기의 흐름이 없을 때 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 107
같은 온도 또는 시간에서 항산화 활성이 낮게 나타났다. 따라서, 항산화 활성이 높은 커피의 로스팅 에는 공기의 유입 또는 유출이 있는 방향으로 로스팅을 진행하는 것이 커피 추출물의 항산화 능력을 높일 수 있다고 판단된다. 17 16 15 14 13 180 3.0 time*temperature 185 190 195 air*time 200 3.0 1.5 0.0-1.5-3.0 180 air*temperature 185 190 195 200 DPPH (%) < 50.0 50.0 51.5 51.5 53.0 53.0 54.5 54.5 56.0 56.0 57.5 57.5 59.0 59.0 60.5 60.5 62.0 62.0 63.5 63.5 > 65.0 65.0 1.5 0.0-1.5 Hold v alue temperature 190 time 15 air 0-3.0 13 14 15 16 17 Figure 4 1. Contour plot of DPPH free radical scavenging activity of coffee extracts based on roasting condition (temperature ( ), time (min) and air flow (m 3 /hr)). 4.3.2. 온도, 시간, 공기 흐름에 따른 커피 로스팅 시 총 페놀 함량의 변화 로스팅 온도, 시간, 공기흐름에 따른 Box Behnken design을 이용한 반응표면 분석법의 통계 분석결과는 Table 4 3과 같다. ANOVA 분석결과 모델은 p<0.001 및 높은 F value(42.12)를 가지는 것으로 나타나 제안된 모델의 유의성을 확인시켜주었다. Coefficient of determination(r 2 )은 98.70% 이었으며, adjusted coefficient of determination(r 2 adj)은 96.35%로 모델 유의성의 근거가 되었다. 적합성 결여(Lack of fit)가 p=0.401으로 모델에 적합하였다. 이와 같은 모델 유의성 검증에서 매우 높은 정확도를 보여주었다. 독립변수인 온도(A), 시간(B), 공기흐름(C) 는 모델 108 2014년 기초연구과제 총서
분석결과 p value가 각각 0.015, 0.008, 0.280로 나와, 공기흐름은 유의차가 없는 것으로 타나났다. 제곱항의 p value는 각각 0.021, 0.034, 0.041로 유의차가 있었다. 또한 교호작용에서는 온도 시간에서 p=0.018로 유의차가 있었다. Table 4 3. Analysis of variance and model fitting for the response and variables for total polyphenol content 1) Source df Seq SS Adj SS Adj MS F value P value Model 9 143.309 143.309 15.923 42.12 <0.001 A temperature 1 76.880 5.028 5.023 13.30 0.015 B time 1 23.393 6.968 6.968 18.43 0.008 C air flow 1 28.275 0.556 0.556 1.47 0.280 A 2 1 3.226 4.136 4.136 10.94 0.021 B 2 1 2.720 3.148 3.148 8.36 0.034 C 2 1 2.849 2.849 2.849 7.53 0.041 AB 1 4.580 4.580 4.580 12.11 0.018 AC 1 1.277 1.277 1.277 3.38 0.125 BC 1 0.109 0.109 0.109 0.29 0.614 Residual 5 1.890 1.890 0.378 Lack of fit 3 1.343 1.343 0.448 1.64 0.401 Pure error 2 0.547 0.547 0.273 Total 14 R 2 0.9870 Adj R 2 0.9635 1) Seq SS =sequential sum of square, Adj SS = adjusted sum of square, Adj MS = adjusted mean square. 이와 같은 결과를 이용하여 유의차가 없는 항을 제거한 reduced model을 적용한 온도, 시간, 공기흐름 에 따른 커피의 총 페놀 화합물의 함량 예측 식은 아래와 같다. Total polyphenol content (mg GAE/g) = 489.979 + 4.514A + 16.235B + 0.481C 0.011A2 0.231B2 0.057C2 0.054AB (A:온도, B: 시간, C: 공기흐름) 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 109
ANOVA 분석결과를 바탕으로 온도, 시간, 공기흐름 에 따른 총 페놀 함량의 변화를 나타내는 등고선도는 Figure 4 2와 같다. 온도가 높아지고, 시간이 오래 될수록 총 페놀 함량은 감소하는 경향성을 보여 주었다. 그림의 좌측 하단인 낮은 온도, 짧은 시간 에서 가장 높은 총 페놀 함량을 나타내며, 그림의 우측 상단인 높은 온도, 긴 시간 의 로스팅 조건에서 총 페놀 함량이 낮은 것을 나타낸다. 온도 와 공기흐름 및 시간 과 공기흐름 은 유사한 경향성을 있었다. 공기흐름 은 공기가 로스터 안으로 들어가는 좌측 위 부분에서 높은 총 페놀 함량을 보였으며, 공기가 나가면서 온도 또는 시간이 증가하는 우측 하단으로 갈 수록 총 페놀의 함량이 곡선 모양으로 감소하는 경향을 보였다. 곡선 모양의 등고선이 나오는 것은 온도, 시간, 공기흐름 모두 RSM 모델에서 제곱항이 유의차를 보이는 것에 기인한다고 판단된다 17 16 15 14 13 180 Time*Temperature 185 190 195 Air*Time 200 3.0 1.5 0.0-1.5-3.0 180 Air*Temperature 185 190 195 200 TPC < 17.5 17.5 18.5 18.5 19.5 19.5 20.5 20.5 21.5 21.5 22.5 22.5 23.5 23.5 24.5 24.5 25.5 25.5 > 26.5 26.5 3.0 1.5 0.0 Hold v alues Temperature 190 Time 15 Air 0-1.5-3.0 13 14 15 16 17 Figure 4 2. Contour plot of total polyphenol content of coffee extracts based on roasting condition (temperature, time and air flow). 110 2014년 기초연구과제 총서
4.3.3. 최적 커피 로스팅 조건 설정 로스팅 조건(온도, 시간, 공기흐름)에 따른 DPPH radical scavenging activity와 총 페놀 함 량의 변화는 로스팅 온도가 낮고, 로스팅 시간이 짧고, 공기의 유입이 있을수록 항산화 활성이 높 고 총 페놀 함량이 높은 것으로 나타났다. 이는 항산화 활성을 가진 물질과 페놀이 열에 파괴되기 쉽다는 기존의 연구 결과와 일치한다. 공기의 흐름에 대해서는 상온의 공기가 로스팅기 안쪽으로 유입되면서 커피 표면의 온도을 낮추는데 영향을 주었을 것이라 판단된다. 본 연구의 결과에서 가 장 높은 항산화 활성과 총 페놀 함량을 얻을 수 있는 로스팅 조건은 실제 커피 로스팅에 주로 사 용되는 온도 및 시간이 아닌 관계로, 카카오 커피에 적합한 품질의 로스팅을 설정하고자 최적 로 스팅 조건에 사용된 최적의 조건은 DPPH와 총 페놀 값의 70% 지점으로 설정하였고, 하한선으로 50%를 설정하여 최적화를 진행하였다. 로스팅 최적 조건은 온도 187, 로스팅 시간 15.5분, 공 기흐름 3.91 m 3 /h에서 최적값(70%)에 100%로 만족하는 것으로 분석되었다(Figure 4 3). Figure 4 3. Optimization of temperature, time and airflow for coffee roasting. Optimization was set up from 70% of antioxidant activity and total polyphenol content. 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 111
5. 카카오 로스팅을 위한 최적 온도 및 시간 설정 5.1. 연구 목적 온도 및 시간을 반응표면 분석법(response surface methodology, RSM)으로 카카오 로스팅 후 항산화 활성이 가장 높은 지점을 찾아 본 연구의 카카오 로스팅에 적용하고자 하였다. 5.2. 재료 및 방법 5.2.1. 실험 재료 카카오 생두는 페루산 유기농 카카오로 로스팅하우스(Paju si, Korea)에서 수입한 2013년 산을 사용하였다. 카카오 생두는 국내 재료 수급의 문제로 일시에 25 Kg을 구입하여 냉장보관하면서 사용하였다. Folin ciocalteu reagent, gallic acid, 1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl는 Sigma Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, ethanol 은 Junsei Chemical Co. (Tokyo, Japan)에서, sodium carbonate은 Showa Chemical Industry Co.(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 5.2.2. 실험 디지인, 카카오 로스팅 및 추출 카카오 로스팅은 소형 직화식 로스터(최대 250 g, KN 8828P 2K, Hottop USA, Cranston, RI, USA)를 이용하여 1회 150 g의 카카오를 투입하여 진행하였다. 예비 실험을 통해서 반응표면분석법 (response surface methodology, RSM)을 실시하기 위한 중심 온도(170 ) 및 시간(10 min)을 설정하였다. RSM은 중심합성법(central composition design)을 사용하여 총 9조건에서 로스팅을 실시하였으며, 중심점에서는 5회 반복 로스팅을 하였다(Table 5 1). 로스팅된 카카오의 추출은 solid liquid extraction 방법을 이용하였다. 카카오와 정수된 물을 1:10(w/v)으로 플라스크에 넣은 후 25 의 항온 수조에서 150 rpm의 속도로 교반하여 15분간 추출하였다. 추출 후 상온에서 Advantec No. 2 filter paper (pore size : 6 μm) (Advantec MFS, Inc., Dublin, CA, USA)를 이용하여 감압여과하였다. 여과된 시료는 30 에서 보관하면서 분석에 사용하였다. 112 2014년 기초연구과제 총서
Table 5 1. Experimental design by central composite design in conducting response surface methodology for cacao roasting Experimental number Temperature ( ) Roasting time (min) 1 150 10 2 156 6.46 3 156 13.54 4 170 5 5 170 10 6 170 10 7 170 10 8 170 10 9 170 10 10 170 15 11 184 6.46 12 184 13.54 13 190 10 5.2.3. DPPH radical 소거활성 측정 DPPH(1,1 diphenyl 2 picrylhydrazyl) radical 소거활성측정은 free radical을 갖는 안정한 화 합물인 DPPH를 기질로서 Blois(1958)방법을 변형하여 사용하였다. DPPH용액(1.5 10-4 M) 160 µl와 카카오추출액 40 µl를 혼합한 후 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 microplate reader(spectra max M2, Molecular Devices, LLC.)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였고, 아래의 식 에 의하여 항산화 활성을 나타내었다. DPPH radical scavenging activity (%) = [control Abs (sample Abs blank Abs) / control Abs] 100 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 113
5.2.4. 총 페놀 함량 측정 총 페놀 함량(total polyphenol contnet, TPC)은 Folin Dennis 방법(AOAC, 1995)은 변형하여 사용하였다. 시료 2 μl에 증류수를 넣어 160 μl로 희석하여 만든 후 2N Folin Ciocalteu's phenol reagent 10 μl를 넣고 8분간 암실에서 반응시켰다. 반응시킨 용액에 20% Na 2 CO 3 수용액을 30 μl을 가한 후, 암실에서 2시간 정치한 후 microplate reader(spectra max M2, Molecular Devices)로 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 gallic acid를 0-1000 μg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 얻어진 검량곡선(R 2 =0.998)을 통해 시료의 총 페놀 함량을 커피 원두 1 g당 gallic acid equivalents (mg GAE/g)로 나타내었다. 5.2.5. 통계분석 Minitab 16 (Minitab, College Station, PA, USA)을 이용하여 분산분석(Analysis of variance, ANOVA)를 실시하여 p<0.05의 유의적인 수준에서 RSM 결과를 도출하였다. 5.3. 결과 및 고찰 5.3.1. 온도와 시간에 따른 카카오 로스팅시 항산화 활성의 변화 온도와 시간에 따른 CCS design을 이용한 DPPH free radical 소거능의 반응표면 분석법 통계 분석결과는 Table 5 2 과 같다. ANOVA 분석결과 모델은 p<0.001 및 높은 F value(40.45)를 가 지는 것으로 나타나 제안된 모델의 유의성을 확인시켜주었다. Coefficient of determination(r 2 ) 은 96.65%이며, adjusted coefficient of determination(r 2 adj)은 94.27%로 모델 유의성의 근 거가 되었다. 적합성 결여(Lack of fit)이 p=0.160으로 모델에 적합하다고 나타났다. 이와 같은 모 델 유의성 검증에서 매우 높은 정확도를 보여주었다. 독립변수인 온도(A) 와 시간(B) 은 p<0.001 로 유의차가 나타난 것으로 분석되었다. 제곱항에서 온도(A 2 ) 는 p=0.970로 유의차가 없으며, 시 간(B 2 ) 은 0.014로 유의차가 발견되었다. 교호작용향에서 온도x시간(AB) 은 0.103로 유의차가 없 었다. 114 2014년 기초연구과제 총서
Table 5 2. Analysis of variance and model fitting for the response and variables for DPPH free radical scavenging activity 1) Source df Seq SS Adj SS Adj MS F value P value Model 5 1329.78 1329.78 265.96 40.45 <0.001 A temperature 1 257.44 257.44 257.44 39.15 <0.001 B time 1 978.14 978.14 978.14 148.77 <0.001 A 2 1 100 0.01 0.01 0 0.97 B 2 1 70.05 70.05 70.05 10.65 0.014 AB 1 23.14 23.14 23.14 3.52 0.103 Residual 7 46.02 46.02 6.575 Lack of fit 3 31.77 31.77 10.59 2.97 0.16 Pure error 4 14.25 14.25 3.56 Total 12 1375.8 R 2 0.9665 Adj R 2 0.9427 1) Seq SS =sequential sum of square, Adj SS = adjusted sum of square, Adj MS = adjusted mean ANOVA분석결과를 바탕으로 온도 와 시간 에 따른 DPPH radical 소거능의 변화를 나타내는 등고선도는 Figure 5 1과 같다. 온도가 높아지고, 시간이 길어질수록 DPPH radical 소거능이 감소 하는 경향성을 보여주었다. 그림의 좌측 하단인 낮은 온도, 짧은 시간 로스팅 조건에서 가장 높은 DPPH radical 소거능을 보여주었고, 그림의 우측 상단인 높은 온도, 긴 시간 의 로스팅 조건에서 낮은 DPPH radical 소거능을 보여주었다. ANOVA 분석의 온도 및 시간 항이 p<0.001로 모델에 높은 영향력을 끼쳐서 이러한 결과가 도출되었으며, 온도 가 높아지고 시간 이 길어질 수록 시간의 제곱항에 영향을 받아 등고선이 곡선으로 나타난 것으로 판단된다. 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 115
Figure 5 1. Contour plot of DPPH free radical scavenging activities of cacao extracts based on roasting condition (temperature and time). 이와 같은 결과를 이용하여 reduced model을 적용한 온도 와 시간에 따른 카카오의 DPPH free radical 소거능 예측 식은 아래와 같다. DPPH (%) = 19.506 5.673A 11.057B + 3.168B 2 (A: 온도, B: 시간) 5.3.2. 온도와 시간에 따른 카카오 로스팅시 총 폴리페놀 함량의 변화 온도와 시간에 따른 CCS design을 이용한 반응표면 분석법의 통계 분석결과는 Table 5 3 과 같다. ANOVA 분석결과 모델은 p<0.001 및 높은 F value(36.18)를 가지는 것으로 나타나 제안된 모델의 유의성을 확인시켜주었다. Coefficient of determination(r 2 )은 96.27%이며, adjusted coefficient of determination(r 2 adj)은 93.61%로 모델 유의성의 근거가 되었다. 적합성 결여 (Lack of fit)이 p=0.566으로 모델은 적합하였다. 이와 같은 모델 유의성 검증에서 매우 높은 정확도를 보여주었다. 독립변수인 온도(A) 와 시간(B) 은 p<0.001로 유의차가 나타난 것으로 분석 되었다. 제곱항에서 온도(A 2 ) 는 p=0.515로 유의차가 없으며, 시간(B 2 ) 은 0.039로 유의차가 발견 되었다. 교조작용항에서 온도 시간(AB) 은 0.179로 유의차가 없었다. 116 2014년 기초연구과제 총서
Table 5 3. Analysis of variance and model fitting for the response and variables for total polyphenol content Source df Seq SS Adj SS Adj MS F value P value Model 5 33.223 33.223 6.645 36.18 <0.001 A temperature 1 6.974 6.974 6.974 37.97 <0.001 B time 1 24.472 24.472 24.472 133.25 <0.001 A 2 1 0.193 0.086 0.086 0.47 0.515 B 2 1 1.177 1.177 1.177 6.41 0.039 AB 1 0.409 0.409 0.409 2.23 0.179 Residual 7 1.286 1.286 0.184 Lack of fit 3 0.472 0.472 0.158 0.77 0.566 Pure error 4 0.813 0.813 0.203 Total 12 34.509 R 2 0.9627 Adj R 2 0.9361 1) Seq SS =sequential sum of square, Adj SS = adjusted sum of square, Adj MS = adjusted mean ANOVA분석결과를 바탕으로 온도 와 시간 에 따른 총 페놀 함량의 변화를 나타내는 등고선도는 Figure 5 2와 같다. 온도가 높아지고, 시간이 오래 될 수록 총 페놀 함량은 감소하는 경향성을 보여 준다. 그림의 좌측 하단인 낮은 온도, 짧은 시간 로스팅 조건에서 가장 높은 총 페놀 함량을 보여 주고, 그림의 우측 상단인 높은 온도, 긴 시간 의 로스팅 조건에서 낮은 총 페놀 함량을 보여주었다. ANOVA 분석의 온도 및 시간 항이 p<0.001로 모델에 높은 영향력을 끼쳐서 이러한 결과가 도출 되었으며, 온도 가 높아지고 시간 이 길어질 수록 시간의 제곱항에 영향을 받아 등고선이 곡선으로 나타난 것으로 판단된다. 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 117
Figure 5 2. Contour plot of total polyphenol contents of cacao extracts based on roasting condition (temperature and time). Total polyphenol content was presented as mg gallic acid equivalent/g of roasted coffee. 이와 같은 결과를 이용하여 reduced model을 적용한 온도 와 시간에 따른 카카오의 총 페놀 화합물의 함량 예측 식은 아래와 같다. Total polyphenol content (mg GA/g of coffee) = 3.5764 0.9337A 1.7490B + 0.4258B 2 (A: 온도, B: 시간) 5.3.3. 최적의 로스팅 조건 도출 로스팅 조건(온도, 시간)에 따른 DPPH free radical scavenging activity와 총 페놀 함량의 변화는 로스팅 온도가 낮고, 로스팅 시간이 짧을 수록 항산화 활성이 높고 총 페놀 함량이 높은 것으로 나타났다. 이는 항산화 활성을 가진 물질과 페놀성화합물이 열에 파괴되기 쉽다는 기존의 연구 결과와 일치한다. 본 연구의 결과에서 가장 높은 항산화 능력과 총 페놀 함량을 얻을 수 있는 로스팅 지점은 150.0 에서 5.0분으로 나타났다. 그러나 이 지점에서 카카오 로스팅은 통상적인 118 2014년 기초연구과제 총서
로스팅 조건보다 낮은 온도, 짧은 시간이다. 적합한 품질의 로스팅을 도출하고자 최종 로스팅 조건에 사용된 최적의 조건은 DPPH와 총 페놀 값의 80% 지점으로 설정하였고, 하한선으로 50% 를 설정하여 RSM분석을 진행하였다. 로스팅 온도 172, 로스팅 시간 6.4분에서 최적값(80%)에 98.51%로 만족하는 것으로 분석되었다(Figure 5 3). Figure 5 3. Optimization of temperature and time for cacao roasting. Optimization was set up from 70% of antioxidant activity and total polyphenol content. 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 119
6. 카카오 커피 음료 제조 및 평가 6.1. 연구 목적 앞의 연구에서 설정된 커피 및 카카오 로스팅 조건으로 로스팅된 커피와 카카오를 이용하여 카카오 커피 음료를 개발하고, 소비자 조사를 진행하여 최적의 커피 및 카카오 추출액의 비율을 결정하고자 하였다. 6.2. 재료 및 방법 6.2.1. 실험 재료 커피는 2013년 산 멕시고 myragogype를 이용하여 로스팅 하였으며, 카카오는 2013년 페루산 유기농 카카오를 사용하여 로스팅 하였다. 6.2.2. 카카오 커피 음료 제조 카카오는 172 에서 6.4분간 소형 직화식 로스터(최대용량 250 g, KN 8828P 2K, Hottop USA, Cranston, RI, USA)를 이용하여 150 g씩 로스팅을 진행하였다. 로스팅이 완료된 카카오는 껍질을 제거하고 분쇄하였다. 분쇄된 카카오는 1 mm x 1 mm 표준체를 이용하여, 체를 통과한 카카오만을 추출에 이용하였다. 추출은 solid liquid extraction방법으로 카카오:물의 비율이 1:10(w/v)이 되도록하여 상온에서 추출을 하였다. 추출은 150 rpm의 속도로 15분간 교반하였다. 그 후 #2 커피 거름종이를 이용하여 추출액을 카카오에서 분리하였다. 액상 부분은 4 의 냉장고 에서 보관하였다. 커피는 상업용 커피 로스터(R 105, Fuji Royal Co., Ltd., Osaka, Japan)를 이용하여 로스팅을 하였다. 2 Kg을 투입하여 187 에서 15분간 댐퍼를 열어 외부 공기가 안으로 들어오도록 로스팅을 하였다. 로스팅이 완료된 커피는 15 에서 7일간 보관 후 추출에 이용하였다. 커피는 에스프레소 추출을 위한 크기로 상업용 커피 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄된 커피 14.0 g을 포터필터 에 넣고, 3 Kg의 힘으로 탬핑을 한후 상업용 에스프레소 추출기(Faema E98, Faema, Milan, 120 2014년 기초연구과제 총서
Italy)를 이용하여 2잔(60 ml)으로 설정된 옵션을 통해서 추출하였다. 추출은 9 atm에서 98 의 수증기를 이용하였다. 카카오 커피 시료는 아메리카노(에스프레소 30 ml + 물 180 ml) 제조 방 법에서 물을 카카오 추출액으로 일정부분 대체하였다. 아메리카노를 대조구로 하여, 물 180 ml에 서 카카오 추출액으로 25, 50, 75, 100% 대체하여(C25, C50, C75, C100) 카카오 커피를 제조 하였다. 제조된 카카오 커피는 4 의 냉장고에서 보관하였다. 6.2.3. 이화학 분석 ph는 여과된 시료를 잘 섞은 후 ph meter(thermo Electron Co., Beverly, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 총산은 여과된 시료 10 ml에 ph meter(thermo Electron Co.)를 넣고 0.1N NaOH용액을 넣어주면서 ph가 8.3이 될때의 0.1N NaOH용액의 양을 구하여 측정하였으며, 0.1N 아세트산(%)으로 표기하였다. 가용성 고형분 함량은 전자식 refractometer(hi 96801, Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA)를 이용하여 측정하였다. 6.2.4. 소비자 기호도 조사 소비자 기호도 조사는 단국대학교 학생 및 교직원 78명을 대상으로 진행하였다. 아메리카노 커피를 대조구로 아메리카노 제조에 들어간 물을 25~100% 카카오 추출액으로 대체한 카카오 커피 4종을 소비자 기호도 조사의 시료로 사용하였다. 카카오 커피는 여름철 시원하게 소비자에게 제공 하는 것을 목적으로 하여, 시료는 조사 전날 제조하여 4 의 냉장고에서 보관하였다. 패널은 9점 척도를 이용하여 시료의 전반적인 기호도, 색상기호도, 향기호도, 향미기호도, 커피향미 기호도, 카카오 향미 기호도에 대해서 평가하였다. 카카오 향미 기호도 평가는 카카오 추출액이 들어간 시료에 대해서만 진행하였다. 9점 척도는 왼쪽부터 1=대단히싫다, 2=매우싫다, 3=보통싫다, 4= 약간싫다, 5=보통이다, 6=약간좋다, 7=보통좋다, 8=매우좋다, 9=대단히 좋다 로 표기되어 패널의 평가에 도움을 주도록 하였으며, 종이평가지를 이용하였다. 시료는 189 ml 종이컵에 20 ml가 제공되었으며, 냉장고에 저장된 시료를 바로 컵에 옮겨 패널에게 제공되었다. 시료는 mutually orthogonal Latin square design을 이용하여 시료의 제시 순서에 따른 carry over 효과를 최소화 하였다(Wakeling and MacFie, 1995). 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 121
6.2.6. 통계분석 XLSTAT (versin 2012, Addinsoft, Paris, France)를 이용하여 이원분산분석(2 way analysis of variance, ANOVA)를 p<0.05의 유의적인 수준에서 실시하고, 시료간의 유의적인 차이를 확인 하고자 Fisher s least significant difference test를 실시하였다. 6.3. 결과 및 고찰 6.3.1. 이화학 분석 카카오 커피 및 대조구의 ph, 총산, 가용성 고형분 함량은 Table 6 1과 같다. ph는 대조구가 5.24로 가장 높았으며, 카카오 추출물로 점점 대체됨에 따라서 ph가 낮아지는 경향을 보였다. ph가 낮아짐에 따라 총산 함량은 대조구가 0.022%에서 C100이 0.049% 0.1N 아세트산 상당량 으로 점점 증가하는 경향을 보였다. 가용성 고형분 함량도 카카오 추출액의 대체량이 증가함에 따 라서 증가하는 경향을 보였다. Table 6 1. ph, total acidity and soluble solid content of cacao coffee beverage 1) Control C25 C50 C75 C100 ph 5.24 a 5.23 a 5.22 a 5.19 b 5.16 c Total acidity (%) 2) 0.022 e 0.029 d 0.031 c 0.047 b 0.049 a Soluble solid content ( Brix) 0.93 c 1.00 c 1.20 b 1.43 a 1.47 a 1) 2) C25, C50, C75 and C100 meant substitutin ratio (%) of cacao extract in 180 ml water part. Total acidity was presented as 0.1N acetic acid. 6.3.2. 소비자 기호도 총 78명의 소비자에 대한 전반기호도, 색상, 향, 향미, 목넘김, 커피향 및 카카오 향미 기호도 는 Table 6 2와 같다. 대조구인 아메리카노는 전반기호도가 5.08로 가장 높게 평가되었으며, 카카 오 커피 중 C25가 5.04의 기호도를 나타냈다. 대조구와 C25는 통계적으로 유의차가 없었다 (p>0.05). 카카오 커피의 기호도는 카카오 추출액의 함량이 높아질수록 기호도가 감소하였다. 카카 오 C50, C75 및 C100의 기호도는 4.35, 3.99, 3.90으로 나타났으며, 대조구 및 C25의 기호도 122 2014년 기초연구과제 총서
와 비교해서 유의적으로 낮았다(p<0.05). 색상기호도(5.31~5.58)와 향기호도(5.04~5.23)는 모든 시료에서 통계적인 유의차가 없었다. 향미 기호도는 대조구가 5.27로 가장 높았으며, C25가 5.21 로 카카오 커피 시료중에서 가장 높은 기호도를 가지는 것으로 나타났다. 대조구와 C25 사이에 통 계적인 유의차는 없었다(p>0.05). 카카오 추출액의 함량이 높아질수록 향미기호도가 낮아지는 경 향을 보였다. 카카오 추출액이 높아질수록 커피의 향미가 약해져서 카카오 커피로 인식하는 대신에 카카오 추출액으로 인식되어졌기 때문으로 보여진다. 통계적으로 유의차가 있는 시료에서는 카카 오 추출액의 함량이 높아질수록 기호도가 떨어지는 경향이 나타났다. 카카오 추출 시 쓴맛과 떫은 맛이 기호도 평가에 부정적인 영향을 주었을 것이라 보여진다. 부드러움 기호도도 카카오 추출액 의 비율이 높아질 수록 감소하는 경향을 보였다. C50, C75, C100의 기호도는 대조구와 유의적인 차이가 있었다(p<0.05). 카카오 추출액의 떫음이 목넘김에 부정적인 영향을 끼쳤을 것이라 생각된 다. 커피 향미 기호도는 카카오 추출액이 증가할수록 감소되었으며, 이는 카카오 추출액의 비율이 높아지면서 강해지는 카카오 향미가 커피 향미의 인식에 방해를 했기 때문으로 사료된다. 카카오 커피 시료만을 대상으로 평가한 카카오 향미 기호도는 C25에서 가장 높았으며 C100에서 가장 낮 았다. 카카오 함량이 높아지면서 기호도가 낮아지는 결과는 너무 강한 카카오 향미는 소비자들에 게 거부감을 줄 수 있다고 판단된다. 또한, 카카오:물 추출비율이 높아서 카카오 추출액의 향이 너무 강했기 때문에 C25에서 가낭 높은 카카오 향미 기호도를 가진것으로 판된된다. 위의 결과를 종합해볼때, 카카오 추출액이 25% 들어있는 C25에서 대조구와 유사한 기호도를 가지면서 소비자 들에게 가장 높은 카카오 향미 기호도를 전달할 수 있다고 판단된다. Table 6 2. Consumer acceptance of cacao coffee beverage Sample 1) Overall Coffee Cacao quality 2) Color Aroma Flavor Smoothness flavor flavor Control 5.08 a 5.55 5.21 5.27 a 5.76 a 5.49 a n/a C25 5.0 4a 5.58 5.51 5.21 ab 5.40 ab 5.17 ab 5.08 a C50 4.35 b 5.33 5.21 4.76 bc 5.13 bc 4.94 bc 4.62 b C75 3.99 b 5.31 5.23 4.47 c 4.91 c 4.59 cd 4.54b c C100 3.90 b 5.35 5.04 4.32 c 4.78 c 4.50 d 4.19 c p value <0.001 0.490 0.393 <0.001 <0.001 <0.001 0.001 1) 2) Control was 30 ml espresso and 180 ml water. C25, C50, C75 and C100 meant substitutin ratio (%) of cacao extract in 180 ml water part. Different letters in the same column meant signidicant differences at p<0.05 by Fisher s least significant difference test. 카카오와 커피를 이용한 기능성 음료 개발 123
5. 요약 및 결론 본 연구에서는 항산화 활성이 높고 총 페놀 함량이 높은 최적의 커피 및 카카오의 로스팅 조건을 확립하고, 각각의 추출물을 배합하여 기능성 음료인 카카오 커피를 제조하였다. 커피 로스팅에서의 항산화 능력은 온도가 낮고 시간이 짧으며 공기의 유입이 있는 조건에서 항산화 활성과 총 페놀 함량이 높은 것으로 나타났다. 카카오의 로스팅에서도 낮은 온도와 시간이 높은 항산화 활성 및 총 페놀 함량을 유지하는 조건으로 설정되었다. 커피와 카카오가 높은 항산화 활성과 총 페놀 함량을 가질 수 있도록 저온에서 짧은 시간 로스팅을 하여, 음료 개발에 사용하였다. 카카오 커피의 제조는 아메리카노를 기본으로 하여, 아메리카노 제조 시 들어가는 물을 카카오 추출액으로 대체하여 카카오 커피 음료를 제조하였다. 카카오의 추출액 함량이 높아질수록 소비자 기호도는 감소하는 것으로 나타났으며, 25%의 물을 카카오 추출액으로 대체한 시료에서 대조구인 아메리카노와 유사한 기호도를 보여주었다. 카카오 추출액의 대체 비율이 높아질수록 커피와 맛의 부조화를 이루는 것으로 판단된다. 또한 소비자들이 카카오 커피를 마실 때 카카오 추출액의 함량이 높아질수록 카카오의 쓴맛과 떫은 느낌이 강하게 전달되어 카카오 커피에 부정적인 영향을 미쳤을 것이라 보여진다. 카카오 추출액 25%의 경우 아메리카노와 대비하여 유사한 소비자 기호도를 가지므로 이것을 베이스로 하여 소비자들에게 새로운 컨셉의 기능성 음료를 제공할 수 있을 것이라 판단된다. 커피는 기호성 식품으로 널리 알려져 있으나, 커피가 가지고 있는 항산화 활성은 아직 소비자들에게 널리 알려져 있지 않다. 커피의 기능적인 측면을 강조하기 위해서는 커피에 기능적인 성분을 더하여 커피 음료를 제조하는 것이 대표적이나, 그 동안의 다양한 시도는 커피와 추가적인 재료의 부조화로 크게 성공하지 못하였다. 본 연구는 커피의 베이스 상태인 아메리카노 형태의 음료에 대한 연구를 진행 하여 카카오 커피의 기초적인 자료를 제공하였다. 이를 발전시켜 다양한 커피 음료에 카카오 추출 액을 더하여 카카오와 커피의 건강기능적인 측면을 강조하면서, 카카오와 커피 특유의 조화된 맛을 소비자들에게 전달할 수 있을 것이라 판단된다. 124 2014년 기초연구과제 총서
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