(51) Int. Cl. 6 A61K 39/12 A61K 35/14 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 특허공보 (B1) (45) 공고일자 1996년03월09일 (11) 공고번호 (21) 출원번호 특1987-0009286 (65) 공개번호 특1988-0002538 (22) 출원일자 1987년08월25일 (43) 공개일자 1988년05월09일 (30) 우선권주장 901,912 1986년08월28일미국 (US) (71) 출원인 일라이릴리앤드캄파니 메어리앤터커 미합중국인디아나인디아나폴리스릴리코포레이트센터 (72) 발명자케네스윌리엄바펀도미합중국인디아나 46220 인디아나폴리스포리스트레인 5893 토마스커크제퍼즈미합중국인디아나 46140 그린필드비터스위트드라이브 1303 (74) 대리인이병호 심사관 : 안소영 ( 책자공보제4371호 ) (54) 개선된콕시듐증예방법 요약 내용없음. 명세서 [ 발명의명칭 ] 개선된콕시듐증예방법 [ 발명의상세한설명 ] 본발명은개선된콕시듐증예방법에관한것이다. 낭포체 (oocyst) 를가금 (poultry) 에게연속적으로투여함으로써콕시듐증을예방하는방법이미합중국특허제4,544,548에기술되어있다. 이제본발명의발명자들은처음에낭포체를투여한다음화학요법을행함으로써유도될수있는개선된예방법을밝혀내었다. 따라서, 본발명은이오노포 (ionophore) 화학요법과결합하여사용될수있는면역학기법의발명에있다. 본발명은, (1) 동물에게그신생단계에서면역반응을일으키도록유효수의감염성콕시듐유기체를경구투여하고, (2) 동물을출생또는부화로부터단계 (1) 이후스포로조이트 (sporozoites) 가숙주세포에침투할때까지계속모든화학요법상의콕시듐증예방을하지않은상태로유지시킨다음, (3) 콕시듐증예방유효량의이오노포를동물의생존기간동안실질적으로계속투여함을특징으로하여, 콕시듐증에걸리기쉬운동물을콕시듐증으로부터보호하는방법에관한것이다. 콕시듐증에가장걸리기쉬운동물은각종조류이다. 따라서, 본발명의바람직한실시양태는상기방법을조류에게실시하는것이다. 극소수의에이머리아 (Eimeria : 콕시듐증을유발하는원생동물병원균 ) 균주가이오노포에대해감소된민감성및내성을나타내기때문에조류에게이오노포콕시듐증예방법의사용은매우성공적이었다. 그러나, 이러한제한된내성의발생조차도양금업에는문제가되고있다. 체중증가의감소, 낮은사료효율등에의한손실이외에도, 심지어경미한형태의콕시듐증에서도색소형성 (pigmentation) 이방해될수있다. 그결과, 외양에대한소비자의기대감을충족시키지못하는조류가된다. 따라서, 본발명은내성의에이머리아균주로콕시듐증억제에사용할수있는잇점이있다. 또한, 이러한내성균주의조절은이오노포-민감성이있는에이머리아균주를투여하여내성의확산위험을최소화함으로써달성될수있다. 따라서, 바람직한실시양태에서, 본발명은특히, (1) 조류에게부화 24시간내에이오노포-내성에이머리아균주에대해면역성을부여할수있는유효수의이오노포-민감성에이머리아균주의감염성유기체를경구투여하고, (2) 조류를부화로부터단계 (1) 이후스포로조이트가숙주세포에침투할때까지계속모든화학요법상의콕시듐증예방을하지않은상태로유지시킨다음, (3) 콕시듐증예방유효량의이오노포를조류의생존기간동안실질적으로계속투여함을특징으로하여, 이오노포-내성에이머리아균주로인한콕시듐증으로부터조류 11-1
를보호하는방법에관한것이다. 이오노포는착물구조의일종의항생물질이고, 다수의산소원자를포함하고있으므로폴리에테르로서또한공지되어있다. 이러한계열의많은물질이이미공지되어있으나다른것들도때때로발견된다. 상대적인콕시듐증예방활성은이오노포에따라변화하지만모든이오노포는콕시듐증예방활성을나타내며, 때때로특정이오노포는독성으로인해콕시듐증예방제로서실제로이용하는것이불가능할수있다. 콕시듐증예방을위해시판되는중요한이오노포중에모넨진 (monensin), 나라진 (narasin), 라살로시드 (lasalocid) 및살리노마이신 (salinomycin) 이있다. 이러한이오노포중어느것이나본발명에서사용할수있다. 본발명에서사용될수있는기타대표적인이오노포에는라이들로마이신 (laidlomycin), 니게리신 (nigericin), 그리소릭신 (grisorixin), 디아네마이신 (dianemycin), 레노레마이신 (lenoremycin), 로노마이신 (lonomycin), 항생제 X206(antibiotic X206), 알보릭신 (alborixin), 셉타마이신 (Septamycin), 항생제 A204, 에테로마이신 (etheromycin), 이소라살로시드 (isolasalocid), 리소셀린 (lysocellin), 항생제 A23187, 마두라미신 (maduramicin), A80190 및 A80438이포함된다. 콕시듐증을예방하기위한본발명의개선된방법은콕시듐증에걸리기쉬운어떤동물에게도사용할수있다. 모든종류의온혈동물이콕시듐증에걸리기쉽지만, 조류가콕시듐증으로가장고통받고있다. 거의일반적으로이오노포중의하나로화학요법처리를받는다. 닭과칠면조는콕시듐증으로부터의보호를가장필요로하는종이고, 이들의경제적인중요성때문에, 본발명은이들종에대해가장유용하다. 그러나, 본발명을오리, 거위, 메추라기, 꿩등과같은다른종의조류에게실시할수있다. 조류외의온혈동물을때때로조류에게사용된동일한이오노포를이용하여콕시듐증으로부터보호한다. 따라서, 본발명의개선된방법은소, 양, 돼지등과같은다른종에게도사용할수있다. 본발명은감염성콕시듐유기체를콕시듐증에걸리기쉬운동물에게투여함으로써수행한다. 신생단계, 즉출생또는부화직후투여한다. 일반적으로, 출생또는부화로부터처음 24시간내에투여한다. 통상가금에게실시할경우, 각조류를부화직후, 통상부화후처음 6 내지 12시간내에처리한다. 처리시, 통상은조류의부리를제거하고, 각종질환, 특히, 마레크병 (Marek's disease), 감염성기관지염, 뉴우캣슬병 (Newcastle's disease) 등에대해예방접종한다. 다른가금종에있어서, 조류를개개로취급하거나부리를제거하지는않으나, 이러한신생단계에서동일질환에대해필요한백신을전달하는에어로졸 (aerosol) 에노출시킴으로써처리한다. 본발명은이러한표준방법의일부로서편리하게수행할수있고, 특정의시간관계를본발명의이익을수득하기위해준수해야함을밝혀내었다. 여러참조문헌에서갓부화한조류는완전한면역반응을할수없음을제시하고있다. 그러나, 본발명자들은신생단계에서예방접종이매우효과적이고, 면역과정에따라가능한한가장빠른이오노포의사용과결합하여사용할경우탁월한콕시듐증예방효과를제공함을밝혀내었다. 본발명에따라서, 감염성콕시듐유기체를동물에게투여하여콕시듐증으로부터동물을보호한다. 유기체의정확한형태는, 그형태가동물에의한면역반응을일으킬수있는형태라면, 중요하지는않다. 감염성콕시듐유기체의적합한형태에는포자형성된낭포체, 스포로조이트, 및스포로시스트 (sporocyst) 가포함된다. 스포로조이트및스포로시스트는추가의후처리를필요로하고, 스포로조이트는비교적불안정하다. 일반적으로, 바람직한형태는포자형성된낭포체이다. 여러형태의감염성콕시듐유기체의현탁액의제조는본분야의전문가에게널리공지되어있다. 포자형성된낭포체의대표적인제조는하기실시예 1에나타내었다. 감염성콕시듐유기체를경구투여하는것이중요하다. 더우기, 목적은동물에의한면역반응이고, 다른경로에의한투여는필요한면역반응을일으키는데에덜확실하다. 경구투여는또한감염성유기체의정확한수를조절할수있어서바람직하다. 이러한여러가지이유로, 본발명은일반적으로필요한콕시듐유기체를함유하는현탁액을동물의구강내로직접분무함으로써실시한다. 그러나, 상기한다른실례에따라서, 에어로졸전달에의해경구투여할수있다. 에어로졸전달은구강으로의간접적양식으로공지되어있다. 조류가눈또는비강으로에어로졸로부터흡수한물질은부분적으로구강내로유입되고, 또한에어로졸로부터조류의깃에침착된물질은조류가부리로깃털을다듬음에의해조류의구강에이르게된다. 따라서, 본발명은경구투여에관한것이지만, 이용어에는필연적으로경구투여가되는에어로졸전달도포함된다. 감염성유기체를 1회이상의용량으로투여할수있으나, 복수투여는잇점이전혀없고, 복수투여는이오노포요법을지연시키는효과가있다. 실제로 1회단일용량이훨씬바람직하다. 투여하는감염성콕시듐유기체의정확한수는, 그수가동물에의해면역반응을일으키는데효과적이어야하는것을제외하고는중요하지않다. 일반적으로면역반응은 1내지 100,000개의낭포체를사용하는경우일어날수있다. 본분야의전문가들은단순한범위탐색실험을사용하여정확한수를측정할수있다. 정확한수는특정동물의종및크기를억제하고자하는특이균주의상대적인면역원성 (immunogenicity), 균주가야생균주냐감쇠균주냐및본분야의전문가에게공지된그밖의인자에따라변화한다. 많은경우에, 조류에게에이머리아맥시마 (Eimeria maxima) 또는에이머리아테넬라 (Eimeria tenella) 의낭포체약 10 내지약 5,000개를단일용량으로, 에이머리아아세르불리나 (Eimeria aservulina) 의낭포체약 50 내지약 20,000개를단일용량으로투여하여우수한결과를수득한다. 몇몇경우에는, 에이머리아맥시마및에이머리아테넬라의낭포체 1,000 내지 5,000개및에이머리아아세르불리나의낭포체 5,000 내지 10,000개의용량도충분하다. 바람직한실시양태에서, 본발명은이오노포에의해억제되지않는에이머리아균주로인한콕시듐증을예방하는데이용한다. 이러한실시양태에서, 본발명은이오노포를단독으로사용함으로써가능한것보다훨씬우수한콕시듐증예방법을제공하는것이다. 많은에이머리아균주가이오노포에대한감소된민감성또는심지어철저한내성을나타내는것으로공지되어있다. 그러한균주를억제하기위한본발명의이용에있어서, 감염성콕시듐유기체의면역화용량은억제하고자하는바 11-2
로그균주, 즉, 감소된민감성또는내성을보이는균주일수있다. 그러나, 이오노포-내성유기체의증식은일반적인에이머리아집단에서이오노포-내성유기체의발생을증가시킬위험이있다. 따라서, 이오노포-내성균주에대해면역성을부여할이오노포-민감성균주를사용하는것이바람직하다. 일반적으로동일종의상이한균주들은동일종의다른균주들에대해면역성을부여할것이다. 그러나, 이는보편적인사실이아니고, 따라서실제로는, 특정이오노포-민감성균주가사실상억제하고자하는이오노포-내성균주에대해면역성을부여할수있는지를측정하는것이적합할것이다. 이는간단한예비시험을통해통상의전문가에의해측정될수있다. 일반적으로, 후보이오노포-민감성균주를투여하고모든콕시듐예방화학요법을보류한직후 ( 예 : 5 내지 20일후 ), 조류에억제하고자하는이오노포-내성균주로감염시도 (challenge) 를수행한다. 이어서조류를희생시키고콕시듐증질환의일반적인지표들을평가한다. 그러나, 항체의수준을확인함으로써조류의면역반응을추적할수도있다. 이러한방법에의해, 소규모시험에서도특정이오노포-민감성에이머리아균주가억제하고자하는이오노포-내성균주에대해면역성을부여하는지의여부를측정할수있다. 감염성콕시듐유기체투여단계이후, 이오노포화학요법을시작할때까지지연기간을두는것이필요하다. 지연기간을두는이유는면역과정이방해받지않고진행되도록하는것이다. 따라서, 지연기간은감염성콕시듐유기체가장관 (intestinal tract) 의관련부위로이동하여숙주세포에침투할수있도록충분히길어야한다. 숙주세포에침투한숙주세포내의유기체는이오노포요법으로부터보호되기때문에면역과정이진행된다. 정확한지연시간은숙주의종류및위장관을통한이동속도및콕시듐의종및위장관의감염부위에따라상이해진다. 여러가지콕시듐종들의위장관을통한통상적인이동속도및감염부위에관해서본분야의전문가들은많이알고있다. 닭에있어서, 지연시간은일반적으로 1 내지 4시간이어야좋다. 소에있어서, 지연시간은 4 내지 8시간일것이다. 화학요법을시작하는것을더욱더장기간, 예를들어 24시간까지지연시킬수있다. 그러나, 추가적인지연기간은동물이면역과정에의한보호외에는콕시듐증으로부터보호받지못하는상태로방치되게되므로바람직하지않다. 그러므로, 본발명의바람직한실시에있어서는, 스포로조이트가숙주세포에침투하는데요구되는시간만큼만이오노포요법의시작을지연시킨다. 이러한지연기간이후에, 이오노포요법을시작하고동물의생존기간동안거의계속사용한다. 상기에서주지한바와같이, 다수의이오노포가콕시듐증예방용으로시판되고있다. 따라서, 본분야의전문가들은이의사용법, 콕시듐증예방에효과적인이의양등에익숙하므로상세한논고는필요하지않다. 사료중의농도적측면에서제시되어있는여러이오노포의콕시듐증예방유효량은하기와같다 : 모넨진 80 내지 125ppm, 나라진 50 내지 80ppm, 라살로시드 75 내지 125ppm, 살리노마이신 40 내지 70ppm, 마두라미신 4 내지 8ppm, A80190 10 내지 40ppm, 이오노포를동물의생존기간동안거의계속적으로투여하지만, 때때로의중단및도살전중단이본발명의잇점을변경하지는않는다. 전형적으로본발명에의해요구되는이오노포요법은유일한콕시듐증예방제로서단일이오노포를사용함으로써달성될것이다. 그러나, 2개의이오노포혼합물을사용하는것이전적으로가능하고, 이경우각각의양이감소될것이다. 상기교시모두는동물사육을위한현재의통상적인실시, 특히콕시듐증으로가장고생하는가금사육을위한통상적인실시를근거로한것이다. 그러나, 본발명은또한새롭게출현하는가금의배면역 (embryonic immunization) 기술과함께사용하도록적용시킬수있다 [ 참조 : 미합중국특허제4,458,630호및 Avian Diseases 26(1) : 134-149, 1982]. 배면역에서, 면역물질을조류의난 (egg) 에주사한다. 본발명은배면역과함께사용하도록적용시킬수있다. 이러한적용에서, 본발명에필요한면역은낭포체를양막또는난황낭에주사하는것이본발명에는불필요한것으로생각되어짐을제외하고는미합중국특허제4,458,630호에따라서수행한다. 오히려, 콕시듐증에대한배면역은또한장요막강내로주사함으로써도달성될수있는것으로여겨진다. 부화후, 본발명의실시는동일하며, 즉, 콕시듐예방유효량의이오노포를조류의생존기간동안거의계속투여한다. 그러나, 배면역에대한정확한면역반응시간은확실히공지되어있지않으나, 반응은사실상난황낭이흡수되어조류의장관의일부가될때인부화때까지지연될수있다. 또한, 면역반응은주사의정확한부위에따라난마다다소다양할수있다. 따라서, 배면역에대한최대반응을보장하기위해, 본발명의주요양태에서와같이바람직하게는이오노포요법을지연시킨다. 배면역에있어서, 지연시간은상기한동일인자들에의해결정되어야하나, 부화시점이감염성콕시듐유기체에의노출시점인것처럼하여계산해야한다. 따라서, 이러한적용에서, 본발명은 (1) 배 (embryo) 를포함하는조류난의최종 1/4부화기 (incubation period) 중에면역반응을일으키도록유효수의감염성콕시듐유기체를난에주사하고, (2) 부화후, 콕시듐증예방유효량의이오노포를조류의생존기간동안실질적으로계속투여함을특징으로하여콕시듐증으로부터조류를보호하는방법에관한것이다. 본발명의일반적인실시에서와같이본발명의이러한적용에있어서, 다른바람직한실시양태는에이머리아의이오노포민감성균주를사용하여에이머리아의이오노포내성균주로부터보호하는것이다. 본발명은하기비제한적실시예에의해예증적으로설명된다. [ 실시예 1] 포자형성된낭포체현탁액의제조 [ 공급원 ] 본발명을수행하기에적합한포자형성된낭포체의현탁액은하기와같이제조한다. 11-3
사용하는콕시듐균주는 1974년퍼듀팜즈인코포레이티드 (Perdue Farms, Inc., Salisbury, MD) 에서최초로분리한에이머리아맥시마 (Eimeria maxima) FS-177이다. 이는분리이래로, 닭을통해배양유지되어왔다. 이균주는이오노포민감성이있다. 이균주는 ATCC[Amerian Type Culture Collection ; 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA] 에 ATCC 지정번호제40357호 (1987. 8. 7. 기탁 ) 로기탁되어있으며이로부터제한없이입수가능하다. 상기에이머리아맥시마는 1988년 2월 13일한국종균협회 (KFCC) 에수탁번호 KFCC-10539로기탁되었다. [ 낭포체의제조 ] 감염성접종물은수도물을사용하여포자형성된낭포체의스톡현탁액을적절한농도 (15,000 내지 50,000 낭포체 /ml) 로희석시킴으로써제조한다. 조류에주사기를사용하여크롭 (crop) 삽관법으로배양물을접종시킨다. 15,000 내지 50,000개의에이머리아맥시마낭포체용액 1ml 이하로각조류에게투여한다. 조류를감염후 8일동안증기-멸균배터리케이지 (steam-sterilized battery cages) 에수용한다. 기타특별한예방조치를한다. 조류를 8일간의잠복기동안탐지한다. 분변을현미경으로조사하여에이머리아맥시마균주이외의낭포체존재여부를확인한다. 또한, 모든조류의장관을후에조사하여기타콕시듐종에의해생성된병변의존재여부를확인한다또한, 모든조류의장관을후에조사하여기타콕시듐종에의해생성된병변의존재여부를확인한다 [ 참조 : Johnson and Reid, 1970]. 감염후제7일내지 8일에이들조류로부터분변을수집하고혼합하여낭포체의균질현탁액을수득한다. [ 후처리 ] 이러한현탁액을미세망사체 (fine mesh screen) 로걸려모든미립물질을제거한다. 이어서수득된현탁액을등용적의포화 NaCl에가하여낭포체를잔류분변잔사로부터분리한다 (NaCl을이러한후처리에사용하지만, 고점도용액을생성하는기타첨가제모두를 NaCl 대신사용할수있고 ; 통상사용하는기타첨가제는자당과 ZnSO 4 이다 ). NaCl 용액표면에부유된낭포체를흡인해수집한다. 이어서낭포체를세척하고저속원심분리를반복하여포화염을제거한다 [ 다량의정제된낭포체가연속유동원심분리를통해수득될수있다 ( 참조 : Vetterling, J.M., J. Parasitol. 55 : 412-417, 1969)]. 상기한바와같이제조된농축낭포체집합체를 2% K 2 Cr 2 O 7 ( 칼륨디크로메이트 ) 중으로혼합하여낭포체의포자형성을유발한다. 용액중의포자형성된낭포체수는현미경을통해혈구계수기의격자상에나타난감염성유기체의수를계수함으로써결정한다. ml 부피당포자형성된낭포체의수를결정했으면 2% K 2 Cr 2 O 7 로희석하여목적하는농도의포자형성된낭포체 /ml 의희석액들을제조한다. 순도및효력측정은낭포체형태를현미경으로검경하여수행한다. 각분량 (lot) 중의포자형성된낭포체 /ml 수를확인한다. [ 실시예 2] 생후 10일에감염시도 (challenge infection) 에대한반응에있어서에이머리아맥시마를사용한수일경과면역 (Day-Old Immunization) 의효과닭장 (battery) 실험을후바드병아리 (Hubbard chick) 에게실시하여생후 10일에동일종및균주에의한감염에대한반응에있어서에이머리아맥시마 (FS-177균주) 를사용한수일경과면역의효과를평가한다. 본실험에서는이오노포를전혀사용하지않는다. 후바드-화이트마운틴숫병아리 (Hubbard-White Mountain cockerel) 을실험에서사용한다. 부화한직후체중을측정하고처리그룹으로활당한다. 각처리를 4마리의병아리에대해 5회반복한다. 실험기간동안병아리표준브로일러배합사료 (standard broiler starter ration) 를공급한다. 연구에서사용한처리는하기와같다 : 1. 비면역화 (nonimmunized), 감염시도안함 (nonchallenged). 2. 비면역화, 제10일에감염시도 (challenged). 3. 제0일에면역화 (immunized), 제10일에감염시도. 면역화된조류에게제0일에 2,000개의에이머리아맥시마낭포체를경구접종시킨다. 실시예 1에서기술한바와같이제조한포자형성된낭포체의현탁액으로접종한다. 감염된그룹에게제10일에조류 1마리당 50,000개의에이머리아맥시마 (FS-177균주) 낭포체를경구투여한다. 감염접종물투여 7일후, 체중을측정하고심장천자 (Cardiac puncture) 를통해혈액을채취하고병변을계산한다.[ 참조 : J. Johnson and W.M. Reid, Exp. Parasitol. 28 : 30-36, 1970]. 혈청을각혈액샘플로부터준비하고 β-카로티노이드당량에비해분석한다 [ 참조 : Ruff et al., Poultry sci. 53 : 1801-1809, 1974]. 또한, 모든그룹으로부터분변을감염후제6 내지 7일에수집한다. 이물질로부터, 조류 1마리당평균낭포체생산을확인한다. 이러한시험의결과를표 1에나타내었다. 제10일에투여된감염시도물을제0일의면역화에의해보호되지않은조류의 β-카로티노이드당량및성능에서상당한감소를가져왔다. 이는높은평균장병변치및조류 1마리당 4천개이상의낭포체배출량을초래한다. 그러나, 제0일에 2,000개의에이머리아맥시마로면역화시킨조류는비면역화 / 감염시도된조류와비교할경우사료전환의상당한향상및체중증가의숫적증가를보여주었다. 마찬가지로, 병변치 11-4
및낭포체배출양은면역화에의해현저하게감소하였으며, 그결과, 혈청색소형성은통계학상비면역화, 감염시도하지않은대조군과동일하였다. 본연구의결과는수일경과한병아리가 2,000개의포자형성된에이머리아맥시마낭포체의용량으로초기면역화된후보호면역반응을개시할수있음을나타내는것이다. 이러한보호효과는심한감염시도접종 7일후성능, 병변치, 낭포체배출량및혈청 β-카로티노이드당량에서관찰되었다. [ 표 1] 콕시듐증의지표 1 1/ 윗첨자가공통문자가아닌열에서평균은매우상이함 (P<0.05) [ 실시예 3] 생후 21일에감염시도에대한반응에있어서모넨진투여와결합한에이머리아맥시마를사용한수일경과면역화효과바닥우리 (floor pen) 연구를후바드스테레이트-런 (Hubbard straight-run) 닭에게실시하여생후 21 일에에이머리아맥시마 FS-410( 이오노포내성균주 ) 에의한감염시도에대한반응에관한에이머리아맥시마균주 FS-177을사용한수일경과면역의효과를평가한다. 또한, 이러한면역체계의모넨진 (100ppm) 효과를완전 2 2 계승디자인 (factorial design) 으로측정한다. 상기실험결과는병변치와혈청색소형성을평가했을때경구면역화 (2,000개의에이머리아맥시마균주 FS-177 낭포체 ) 가제21일에서의에이머리아맥시마균주 FS-410의감염시도로부터조류를보호하는것으로나타났다. 이러한현상은모넨진의존재및부재시모두발생한다. 후바드-화이트마운틴스트레이트-런닭을본시험에사용하였다. 부화직후그룹으로무작위할당한다. 각처리는 4회반복하고각각의수행시 50마리에실시한다. 병아리에게실험기간동안모넨진 0 또는 100ppm을함유하는표준브로일러배합사료를먹인다. 연구에서사용한처리는하기와같다 : 1. 약물처리하지않음 (nonmedicated), 비면역화. 2. 약물처리하지않음, 면역화 (2,000개의에이머리아맥시마균주 FS-177 낭포체 ). 3 및 4. 100ppm 모넨진을브로일러사료에혼합함을제외하고 1 내지 2와동일하게. 면역화된조류에게약물처리하지않거나약물처리한사료를공급하기약 4시간전에 2,000개의에이머리아맥시마 (FS-177) 낭포체를경구접종한다. 실시예 1에서기술한바와같이제조한포자형성된낭포체의현탁액을사용하여접종한다. 제21일에우리바닥에존재하는오물상에에이머리아맥시마 (FS-410) 의낭포체를함유하는감염성오물을뿌림으로써모든조류에게감염시도를한다. 감염시도 7일후모든조류의체중을측정하고희생시킨후각회당 15마리의조류를무작위로선택해병변치및혈청색소형성분석을행한다. 존슨및레이드 (Johnson and Reid) 법 [ 참조 : Exp. Parasitol. 28 : 30-36, 1970] 을사용하여병변치를계산하고, 루프 (Ruff) 등의방법 [ 참조 Poultry Sci., 53 : 1801-1809, 1974] 을사용하여색소형성을분석한다. 데이타는분산분석 (ANOVA) 법을사용하여분석하고 ; 경우에따라처리평균간의차이는스튜우던트 -뉴만-쿨시험 (Student-Newman-Keul's test) 을사용하여평가한다 (P<0.05). 연구결과를표 2에나타내었다. 2,000개의에이머리아맥시마낭포체로면역시킨조류는병변치및혈청색소형성을평가한결과제21일에서의감염시도 (FS-410) 으로부터보호되었다. 모넨진을공급한면역화된조류에서도유사한경향이관찰되었다. 본실험결과는바닥우리에서사육된면역화된병아리는제21일에서의이오노포내성감염시도의악영향으로부터이들을보호할수있는면역반응을개시하는것을보여준다. 병변치및혈청색소형성에있어서의상당한개선은생후 1일에서의경구면역화된보호효과를설명해주는것이다. [ 표 2] 바닥우리 (Floor Pens) 에서생후 21일에에이머리아맥시마 FS-410에의한감염시도에대한반응에관한에이머리아맥시마 FS-177를사용한수일경과면역화의효과 11-5
1/ 윗첨자가공통문자가아닌열에서평균은매우상이하다 (P<0.05). 분산분석 (ANOVA)-일방 ( 체중증가, 병변치및 β-카로텐당량에대한평균의집단표준오차는각각 12.6, 0.26 및 0.31이다 ). [ 실시예 4] 연속감염시도에대한반응에있어서모넨진투여와결합한에이머리아맥시마를사용한수일경과면역화의효과바닥우리실험을후바드스트레이트-런닭에게실시하여면역후곧시작하는에이머리아맥시마 FS- 410에의한감염시도에대한반응에관한에이머리아맥시마 FS-177을사용한수일경과면역화의효과를평가한다. 실시예 3에서보고된실험에서의동일한바닥우리와오물을재활용하여감염시킨다. 또한, 음료수중의레바미솔 (levamisole) (5mg/ 체중 (kg)) 및사료중의모넨진 (100ppm) 의효과는또한 3 2 계승실험디자인으로측정한다. 본실험결과는체중증가를분석한결과, 에이머리아맥시마를사용한수일경과면역화는생후 1일에서의감염시도로부터조류를보호함을보여준다. 병변치및혈청색소형성에서의일치되지않는결과는오물중에서의감염시도가병변치및혈청색소형성에관한면역화효과를완전히평가하기에는불충분할수있음을나타낸다. 후바드-화이트마운틴스트레이트-런브로일러닭을본실험에서사용하였다. 부화직후, 조류를처리그룹으로무작위로할당하고, 각처리를 4회반복하되, 1회반복당 50마리에실시한다. 병아리에게시험기간동안표준배합사료를공급한다. 본연구에서사용한처리는하기와같다 : 1. 약물처리하지않음 (nonmedicated), 비면역화. 2. 약물처리하지않음, 면역화 (2,000개의에이머리아맥시마 FS-177 낭포체 ). 3. 약물처리하지않음, 면역화 (2,000개의에이머리아맥시마 FS-177 낭포체 )+4, 5 및 6일째음료수중의레바미솔 (5mg/kg( 체중 )). 4 및 6. 100ppm 모넨진을사료에혼합함을제외하고 1 내지 3과동일하게. 면역화된조류에게약물처리하거나처리하지않은사료를공급하기약 4시간전에 2,000개의에이머리아맥시마 (FS-177) 를경구접종한다. 실시예 1에서기술한바와같이제조한포자형성된낭포체의현탁액을사용하여접종한다. 면역반응을향상시키는것으로보고된물질인레바미솔을 4, 5 및 6일동안체중 1kg당 5mg 농도로음료수내로혼합한다. 제1일에, 모든조류가놓여진오물에는에이머리아맥시마 FS-410의낭포체가함유되어있다. 제21일에, 존슨및레이드법에따라서각우리로부터 15마리의조류를무작위로선택하여심장천자를통해출혈시키고병변치를계산한다 [ 참조 : Exp. Parasitol. 28 : 30-36, 1970]. 혈청을준비하여 β-카로티노이드당량에대해분석한다 [ 참조 : Ruff et al., Poultry Sci. 53 : 1801-1809, 1974]. 제28일에실험을완결하고성능지표들을측정한다. 데이타는분산분석 (ANOVA) 을사용하여분석하고 ; 경우에따라처리평균간의차이는스튜우던트-뉴만-쿨시험을사용하여평가한다 (P<0.05). 결과는표 3에나타내었고, 면역화로비면역화, 약물처리하지않은대조군과비교하는경우성능면에서우수한향상을초래하는것으로나타났다. 일반적으로, 병변치는제21일에심하지않다 : 불충분한콕시듐감염시도로인하여혈청색소형성치는일치하지않으며처리효과가전혀나타나지않았다. [ 표 3] 바닥우리에서의연속감염에대한반응에있어서에이머리아맥시마를사용한수일경과면역화의효과 11-6
1. 윗첨자가공통문자가아닌열에서평균은매우상이하다. 각처리는 50마리의스트레이트런-병아리로 4회반복한것이다. 병변치및혈액변수는제21일에수집한다. 2. β-카로티노이드당량 ( μg /ml) 3. 경구면역화는제0일에 2,000개의에이머리아맥시마낭포체로실시한다. 4. 경구 + 레바미솔처리된조류를제0일에 2,000개의에이머리아맥시마낭포체를면역시키고실험 4, 5 및 6일에음료수중에레바미솔 (5mg/kg( 체중 )) 을공급한다. 분산분석 (ANOVA)-일방 ( 체중증가, 병변치및 β-카로텐당량에대한평균의집단표준오차는각각 27.7, 0.24 및 0.27이다 ) [ 실시예 5] 대규모의바닥우리연구대규모의바닥우리연구를우리당 130마리의조류로, 8개의우리로구성된각처리군으로수행한다. 4가지처리는하기와같이의도된다 : 비면역화, 약물처리하지않음. 면역화, 약물처리하지않음. 비면역화, 모넨진 120ppm으로약물처리. 면역화, 모넨진 120ppm으로약물처리. 그러나, 혼합착오로인해시험처음 21일동안모든조류에게약물처리 ( 모넨진 120ppm) 하였다. 그후, 조류를상기기재한바와같이동일하게처리한다. 시험은전성장기간 (47일) 에걸쳐수행한다. 본연구는모넨진에대해내성인에이머리아맥시마균주로일반적으로오염된장소에서수행한다. 면역낭포체는상기실시예 1에서기술한바와같이제조한에이머리아맥시마 FS-177이다. 낭포체는조류에게사료를공급하기약 2시간전에비이크-0-바트 (Beak-0-Vac) 기계 [P.O.Box 715, Gainesville, GA 30501 소재의 Beak-0-Vac Inc. 에의해시판됨 ] 로경구투여한다. 콕시듐증예방효능의다양한변수를평가한다 : (1) 제16일에우리당 10마리의조류를분리하여에이머리아맥시마 FS-410의 50,000개낭포체로감염시키고 ; 7일후 ( 제23일 ) 출혈시켜희생시킨다. 병변치및혈청 β-카로티노이드당량을측정한다. (2) 제21일에나머지조류의체중및사료전환율을측정한다. (3) 제27, 34, 41, 및 47일에각각, 우리당 5마리의조류로부터혈액을채취하여혈청 β-카로티노이드당량을측정한다. (4) 47일기간말엽에, 체중, 최종사료전환율및가공및사체 (carcass) 특성을나머지모든조류에대해측정한다. 결과및통계학적분석은하기 4개의표에정리하였다. 병변치는 0 내지 4등급으로평가했으며, 0은병변무이고 4는병변의최대치이다. 표에서, ' 혈청 β-카로티노이드당량 ' 은 ' 혈청 β-ce' 로, ' 분산분석 ' 통계학적분석은 'ANOVA' 로, ' 평균의집단표준오차 ' 는 'PSEM' 으로표시한다. [ 표 4] 11-7
제 16 일에감염제 23 일에희생시킨조류에대한데이타 * 평균은혼합오류발견전에 4개의그룹각각에대해계산되었다. ANOVA( 병변치 ) ANOVA ( 혈청 β-ce) [ 표 5] 제21일에나머지 ( 감염시도하지않은 ) 조류에대한성능데이타 ANOVA( 체중 21 일 ) 11-8
ANOVA( 사료전환율 21 일 ) [ 표 6] 주단위로측정한 β-카로티노이드당량 ( μg /ml) ANOVA( 제 27 일 ) ANOVA( 제 34 일 ) ANOVA( 제 41 일 ) 11-9
ANOVA( 제 47 일 ) [ 표 7] 최종성능데이타 (47일)* * 윗첨자가공통문자가아닌열내의평균은매우상이하다. ** 각각의가공처리된조류를색상및완제품에대해 1 내지 5의등급으로평가하는데 1 내지 2는매우우수내지최우수이고 3 내지 4는양호내지우수이다. ANOVA( 최종체중 ) ANOVA( 최종사료전환율 ) (57) 청구의범위 청구항 1 (1) 출생부화직후의인간을제외한동물에게, 면역반응을일으키도록유효수의이오노포-내성에이머리아 (Eimeria) 균주에대해면역성을부여할수있는이오노포-민감성에이머리아균주의감염 11-10
성콕시듐유기체를경구투여하고, (2) 상기동물을단계 (1) 이후스포로조이트 (sporozoites) 가숙주세포에침투할때까지계속, 모든화학요법상의콕시듐증예방을하지않은상태로유지시킨다음, (3) 콕시듐증예방유효량의이오노포 (ionophore) 를동물의생존시간동안실질적으로계속투여함을특징으로하여, 콕시듐증에걸리기쉬운동물을콕시듐증으로부터보호하는방법. 청구항 2 제1항에있어서, (1) 조류에게부화 24시간내에, 이오노포-내성에이머리아 (Eimeria) 균주에대해면역성을부여할수있는, 유효수의이오노포-민감성 (sensitive) 에이머리아균주의감염성유기체를경구투여하고, (2) 조류를부화로부터단계 (1) 이후스포로조이트가숙주세포에침투할때까지계속, 모든화학요법상의콕시듐증예방을하지않은상태로유지시킨다음, (3) 콕시듐증예방유효량의이오노포를조류의생존기간동안실질적으로계속투여함을특징으로하여, 이오노포-내성에이머리아균주로인한콕시듐증으로부터조류를보호하는방법. 청구항 3 제1항또는제2항에있어서, 이오노포가모넨진 (monensin) 인방법. 청구항 4 제1항또는제2항에있어서, 이오노포가라살로시드 (lasalocid) 인방법. 청구항 5 제1항또는제2항에있어서, 이오노포가나라진 (narasin) 인방법. 청구항 6 제1항또는제2항에있어서, 이오노포가살리노마이신 (Salinomycin) 인방법. 청구항 7 제1항또는제2항에있어서, 이오노포가마두라미신 (maduramicin) 인방법. 청구항 8 제1항또는제2항에있어서, 보호되는동물이닭또는칠면조인방법. 11-11