대한한방소아과학회지제 32 권제 3 호 (2018 년 8 월 ) J Pediatr Korean Med. August, 2018;32(3):16-25 ISSN 1226-8038(Print), 2287-9463(Online), https://doi.org/10.7778/jpkm.2018.32.3.0016 항염증조절을통한금은화 - 감초복합추출물의 DSS 유도궤양성대장염완화효과 이연우 1 안상현 2 김호현 3 김기봉 1,4 1 부산대학교한의학전문대학원, 2 세명대학교한의과대학해부학교실, 3 세명대학교한의과대학생리학교실, 4 부산대학교한방병원한방소아과 Abstract The Anti-Inflammatory Effect of Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis Decoction on Ulcerative Colitis Induced by DSS in Mice Lee Yeon Woo 1 Ahn Sang Hyun 2 Kim Ho Hyun 3 Kim Kibong 1,4 1 School of Korean Medicine, Pusan National University, 2 Department of Anatomy, College of Korean Medicine, Semyung University, 3 Department of Physiology, College of Korean Medicine, Semyung University, 4 Department of Korean Pediatrics, Pusan National University Hospital Objectives The purpose of this study is to investigate the anti-inflammatory effect of Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis decoction extracts (LGE) on ulcerative colitis in children and adolescents. Methods Colitis was induced by DSS (Dextran Sulfate Sodium) in C57BL/6 mice. The sample mice were divided into group of four. The mice in the control group were not inflammation-induced. The control group was composed of untreated ulcerative colitis elicited mice. The mice in the experimental group were administered with Pentasa and another experimental group mice were treated with LGE after colitis elicitation. The effects on ulcerative colitis were evaluated by the morphological changes of colonic mucosa, decrease in the effect of pro-inflammatory cytokines (TNF-α and NF-κB) and inflammatory cytokines (inos and COX-2) in the mucosa. Results LGE showed protective effects in DSS induced ulcerative colitis. LGE inhibited shortening of colon length and relieved the hemorrhagic erosion in colonic mucosa. LGE decreased pro-inflammatory cytokines (TNF-α and NF-κB) and inflammatory cytokines (inos and COX-2). According to the GC/MS analysis, N-methyl pyrrolidone (NMP) was identified. Conclusions The result shows the clinical efficacy of LGE and demonstrates possible treatment options for ulcerative colitis. Further investigations for biological activity and chemical analysis of LGE will be needed. Key words: Lonicera japonica, Glycyrrhiza uralensis, Ulcerative colitis, Anti-inflammation Received: July 24, 2018 Revised: August 10, 2018 Accepted: August 10, 2018 Corresponding Author: Kibong Kim Department of Korean Pediatrics, Pusan National University Korean Medicine Hospital, Geumo-ro 20, Mulgeum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do, 50612, Republic of Korea Tel: +82-55-360-5952 / Fax: +82-55-360-5952 E-mail: kkb2630@gmail.com c The Association of Pediatrics of Korean Medicine. All rights reserved. This is an open-access article distributed under the tenus of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
항염증조절을통한금은화 - 감초복합추출물의 DSS 유도궤양성대장염완화효과 17 Ⅰ. Introduction 염증성장질환 (inflammatory bowel disease) 은특정원인에의한장염이외의원인불명의만성반복성장내염증병으로크론병 (Crohn s disease) 과궤양성대장염 (ulcerative colitis) 이대표적이다. 염증성장질환의명확한발병기전은아직밝혀지지않았으며, 환자의유전적, 면역학적이상및환경적요인, 미생물감염, 스트레스나약물등복합적인병인기전이관여한것으로추정된다 1,2). 국내염증성장질환의발병률은서구보다낮은편이지만, 최근발표된역학조사에따르면궤양성대장염의발병률이급격하게증가하고있다 3-5). 궤양성대장염은크론병과달리염증또는궤양이직장에서시작하여병변이연속적이며, 대장에국한되어있는표재성염증을특징으로한다 6,7). 특히, 소아 청소년기에전체염증성장질환증상의 20~30% 가시작되며 8), 10~15% 가소아 청소년기에진단된다 2). 기존의소아 청소년대상연구에서염증성장질환은중학생의약 8%, 고등학생의약 17% 가경험하는것으로나타났는데 9,10), 학업성적에스트레스를받는고등학생들의생활상을고려하면, 학년이올라갈수록우리나라청소년의염증성장질환의유병률이높을것으로예상한다 10). 궤양성대장염의약물치료에는 5-aminosalicylic acid (5-ASA) 제제, 부신피질호르몬제, 면역조절약물등을사용한다. 환자의 20~40% 는약물치료효과가없거나, 부작용으로대장절제술을받게되는데 11,12), 수술방법이복잡하고수술로인한후유증이크다. 최근연구동향은한약을포함한천연물질에서부작용을최소화하고궤양성대장염에효과적인후보약제개발에주력하고있다 12,13). 국내실험연구에서금은화가 Dextran Sulfate Sodium (DSS) 로유발된궤양성대장염생쥐의표면상피의재생속도를촉진하고대장의길이회복과대장점막의조직학적소견을호전시키며, 전염증효소 (pro-inflammatory cytokine) 인 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 활성억제와염증효소전사인자인 nuclear factor-kappa B (NF-κB) 의발현조절에따른염증효소 (inflammatory cytokine) COX-2와 inos 생성억제의결과로대장조직에서염증세포의침식과침윤감소를보고했다 13). 금은화 -감초복합추출물은 醫方集解 에서금은화주 ( 金銀花酒 ) 로소개되는데, 金銀花酒는婦人乳癰, 一切癰疽, 背癰, 癰疽惡瘡에사용하고특히, 腸癰에그효과가뛰어나다. 東醫治療經驗集成 에서는금은화-감초복합추출물이활력징후, 신장및간기능은정상으로유지하면서, 대장의미란과궤양을호전시켜만성궤양성대장염치료제의임상적가능성을제시하였다. 금은화 (Lonicera japonica) 는淸熱解毒, 涼散風熱, 凉血止痢의효능이있어丹毒, 癰腫疔瘡, 痔漏, 疥癬, 瘰癧, 熱毒血痢, 溫病發熱을치료 14,15) 하고, 류머티즘성관절염 16), 세균감염의치료와면역조절, 항암효과등의실험을통해항균, 항염증효능 15) 이입증되었다. 감초 (Glycyrrhiza uralensis) 는解毒, 和中緩急, 潤肺, 調和諸藥등의효능이있으며, 脾胃虛弱, 癰疽瘡瘍, 消化性潰瘍, 腹痛便溏, 食少, 心悸, 解藥毒등을치료 17) 하고, 항염증, 세포사멸, 세포주기억제및전이억제효능이있어화학적으로암을예방하거나치료제로사용할수있다는연구가최근발표되었다 18,19). 이에근거하여금은화 -감초복합추출물은설사와만성복통이주증상인궤양성대장염에효과가있을것으로생각된다. 금은화는항산화, 항염증효과로궤양성대장염치료제개발을위한연구가꾸준히진행중이며, 감초는점액분비를증가시켜점막을보호하는역할을할것으로기대된다. 이러한이유로금은화- 감초복합추출물을이용하여궤양성대장염에서항염증효과와점막장벽개선효과를확인하고자하였다. 본연구에서는궤양성대장염치료제개발을목적으로금은화- 감초복합추출물을사용하여 DSS로궤양성대장염을유도한생쥐에투여한결과금은화- 감초복합추출물이항염증조절을통한궤양성대장염완화에유의한효과가있기에보고하고자한다. Ⅱ. Materials and Methods 1. 실험재료 1) 실험동물 4주령의 C57BL/6 수컷생쥐 ( 오리엔트, 한국 ) 를 2주동안무균사육장치에서적응시킨후체중 20 g 된생쥐를선택하여사용하였다. 대조군 (Ctrl군), DSS 유도궤양성대장염유발군 (UE군), DSS 유도궤양성대장염펜타사처리군 (PT군 ), 그리고 DSS 유도궤양성대장염금은화 -감초복합추출물처리군 (LGT군) 으로나누었
18 The Anti-Inflammatory Effect of Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis Decoction on Ulcerative Colitis Induced by DSS in Mice 고, 각군에생쥐 10마리씩분배하였다. 본연구는부산대학교 IACUC 승인을받아시행되었으며 (IACUC number: PNU-2017-1707), 실험실동물의사용과관리는 NIH 가이드라인에따라시행하였다. 2) 금은화-감초복합추출물의제조금은화- 감초복합물 (Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis decoction) 240 g을증류수 100 ml에넣고 3시간동안전탕후여과하였다. 그여과액을 rotary evaporator 를이용하여감압및농축하여동결건조후에추출물 28 g ( 수득률 11.7%) 을얻었다. 3) 금은화-감초복합추출물 GC/MS 분석금은화- 감초복합추출물의염증조절성분분석에 GC/MS는 6890N GC/ 5975i MS (Agilent, USA) 를사용하였다. GC/MS 분석에사용한컬럼은 DB-5MS UI (30 m, 0.25 mm, 0.25 mm) 이다. 오븐온도는처음 80 에서 2분간예열한후 1분당 10 만큼올려 300 까지올리고 5분동안지속하였다. 2 μl의시료를분할 (split) 주입법으로주입하였으며, 유속은 1.0 ml/min로설정하였다. 시료주입구, 연결부위, 이온원의온도는각 280, 230, 150 로맞추었다. 질량분석범위 50 800 m/z에해당하는이온들을순차적인반복검출방법 (scan monitoring) 을사용하여분석하였다. 금은화 - 감초복합추출물을분석할때 retention time (RT) 을 Wiley 7 library의기준에맞게 library 검색하였다. 2. 실험방법 1) DSS를통한궤양성대장염유발궤양성대장염을인위적으로유발하기위해 5% (wt/vol) DSS (with a molecular weight of 40,000, ICN, Aurora, OH) 를 5일간 voluntary administration 하였다. 2) 금은화-감초복합추출물과펜타사투여생리식염수에희석한펜타사 (Pentasa SR Tab, 한국페링제약 ) 를 PT군에 5일동안 40 mg / kg /day 양으로 100 μl구강투여하였다. 생리식염수에희석된금은화- 감초복합추출물은 醫方集解 에근거하여 LGT군에 5일동안 466 mg / kg /day 양으로 100 μl구강투여하였으며, 대조군과 UE군에생리식염수 100 μl /day 양으로구강투여하였다. 3) 조직표본제작 5일동안 DSS 처리후 sodium pentobarbital로마취하여 vascular rinse와 10% 중성포르말린용액 (neutral buffered formalin, NBF) 을고정액으로사용하여심장의관류를고정하였다. 내림결장만따로분리하여실온에서 24시간동안 10% NBF로고정하였다. 고정한조직은 paraffin에포매하여 5 μm두께의연속절편으로제작하였다. 4) 조직화학점막장벽보호및개선효과를알아보고자 Masson trichrome 염색으로점막손상변화를관찰하였다. 50-60 Bouin 용액을사용해 1시간동안매염처리하여 70% 에탄올로 picric acid를제거하였다. 10분동안 Weigert iron hematoxylin에반응시켜핵을염색하고, 각 15분동안 Biebrich scalet-acid fuchsin과 phosphomolybdic-phosphotungstic acid에, 5분간 aniline blue에처리한후관찰하였다. 중성점액질 (neutral mucin) 을분비하여점액장벽을형성하는점액분비세포의변화를관찰하기위해 periodic acid-schiff reaction (PAS) stain 을실시하였다. 첫 5분동안 periodic acid에서반응시킨후 15분동안 Schiff reagent에서처리한뒤 sulfurous rinse 에서각 2분씩 3회세척후 hematoxylin에서 1분동안대조염색을하였다. 5) 면역조직화학내림결장점막내염증변화를관찰하기위해결장조직을 5분동안 proteinase K (20 μg / ml ) 에 proteolysis 를진행한후 4시간동안실온에서 blocking serum으로써 10% normal goat serum에반응시켰다. 또한 4 humidified chamber 에서 72시간동안 1차항체인 mouse anti-tnf-α (1:100, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti-inos (1:250, Santa Cruz Biotec), mouse anti-p-iκb (1:500, Santa Cruz Biotec, USA), 그리고 mouse anti- COX-2 (1:100, Santa Cruz Biotec) 를반응시켰다. 이후상온에서 24시간동안 2차항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG1 (1:100, Santa Cruz Biotec) 를반응시켰고, 1시간동안상온에서 avidin biotin complex kit (Vector Lab, USA) 를이용하여반응시켰다. 0.05% 3,3'-diaminobenzidine 과 0.01% HCl 포함 0.05 M tris-hcl 완충용액 (ph 7.4) 에발색하여 hematoxylin으로대조염색을하였다.
항염증조절을통한금은화 - 감초복합추출물의 DSS 유도궤양성대장염완화효과 19 6) 영상처리 Image Pro Plus (Media cybernetics, USA) 를이용해서면역조직화학의결과를영상분석하여수치화 (means ± standard error) 하였다. 임의로선정한각군의표본점막을 x400 배율에서촬영하여 positive pixels/20,000,000 pixels로영상분석하였다. 7) 통계통계프로그램은 SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc., USA) 를사용하였으며, one-way ANOVA를시행하여유의성 (P<0.05) 을검증하고, Least significant difference (LSD) 로최종검증하였다. Ⅲ. Results 1. GC/MS 결과염증억제능이있는 N-methyl pyrrolidone (NMP) (RT 12.927/Area 4.61%) 을확인하였다 (Fig. 1). 2. 큰창자길이회복 Ctrl군의맹장부터내림주름창자까지의길이는 102 ± 1.2 mm이었지만, UE군에서는 Ctrl군에비해 29% 감소한 72 ± 1.2 mm로측정되었다. PT군은 UE군에비해 13% 증가하여 82 ± 0.5 mm로측정되었다. LGT군은 UE 군보다 22% 증가한 88 ± 0.9 mm로측정되었다 (Fig. 2). Fig. 1. The GC/MS of components in Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis decoction extracts Fig. 2. The recovery of colonic length by Pentasa and Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis decoction extracts Left: a photograph of colons, Right: a graph for changes in colonic length. Ctrl: no treated mouse, UE: ulcerative colitis elicited mouse, PT: Pentasa treated mouse after ulcerative colitis elicitation, LGT: Lonicera Japonica- Glycyrrhiza Uralensis decoction extracts treated mouse after ulcerative colitis elicitation, *: P<0.05 compared with UE, #: P<0.05 compared with PT.
20 The Anti-Inflammatory Effect of Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis Decoction on Ulcerative Colitis Induced by DSS in Mice 3. 점막 손상 회복 Masson trichrome 염색에서는 UE군의 점막 넓은 부 을 보였다. UE군은 Ctrl군보다 양성반응이 541% 증가 하였으며, PT군에서는 UE군보다 양성반응이 29%, 분에서 창자세포와 창자샘이 소실된 출혈성 침식 LGT군에서는 UE군에 비해 양성반응이 62% 감소되었 (hemorrhagic erosion)이 관찰되었고, 점막고유층에서 다 (Fig. 4). 다수의 림프구, 섬유모세포, 과립백혈구와 같은 염증 p-iκb의 양성반응은 UE군에서 점막고유층에 증가 관여세포의 침윤 (infiltration)이 관찰되었다. 일부 창자 하였고, 양성반응세포의 핵막 가장자리에서 강한 양성 점막에서 발생한 출혈성 침식은 점막근층 (muscularis 반응을 보였다. UE군은 대조군보다 양성반응이 388% mucosae)을 넘어 점막밑층 (submucosa)까지 확장된 것 증가되었으며, PT군에서는 UE군보다 양성반응이 이 확인되었다. 이에 비해 PT군과 LGT군에서는 UE군 23%, LGT군에서는 UE군에 비해 양성반응이 51% 감 과 비교해 완화된 출혈성 침식을 확인하였으며, 점막 소되었다 (Fig. 4). 고유층에서도 염증관여세포의 침식 감소가 확인되었 다 (Fig. 3). PAS 염색에서는 UE군의 표면상피 상층부 (apical surface)에 있는 PAS 양성반응의 창자세포는 대부분 손 inos 양성반응은 UE군에서는 점막고유층에서 증 가하였고, 양성반응세포의 세포질에서 강한 양성반응 을 보였다. UE군은 대조군보다 양성반응이 331% 증가 되었으며, PT군에서는 UE군보다 양성반응이 28%, 상된 형태를 보였고, 솔모양가장자리는 관찰할 수 없 LGT군에서는 UE군보다 양성반응이 54% 감소되었다 었다. PT군과 LGT군의 표면상피 상층부 일부분을 제 (Fig. 4). 외하고 정상적인 창자세포의 배열과 솔모양가장자리 가 관찰되었다 (Fig. 3). COX-2 양성반응은 UE군의 점막고유층에서 증가하 였고, 양성반응세포의 세포질에서 강한 양성반응을 보 였다. UE군은 대조군에 비해 양성반응이 279% 증가되 4. 항염증 작용 TNF-α 양성반응은 UE군에서는 점막고유층에서 증 가하였고, 양성반응세포의 세포질에서 강한 양성반응 었으며, PT군에서는 UE군보다 양성반응이 27%, LGT 군에서는 UE군에 비해 양성반응이 51% 감소되었다 (Fig. 4). Fig. 3. The mitigation effects of Pentasa and Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis decoction extracts on ulcerative colitis in mice M/T: Masson trichrome stain, PAS: periodic acid-schiff reaction stain. Bar size: 100, arrow: hemorrhagic erosion.
항염증조절을 통한 금은화-감초 복합 추출물의 DSS 유도 궤양성 대장염 완화 효과 21 Fig. 4. The anti-inflammation effects of ulcerative colitis in mice by Pentasa and Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis decoction extracts TNF-α: tumor necrosis factor-α, p-iκb: phospho-iκb, inos: inducible nitric oxide synthase, COX-2: cyclo-oxygenase, MU: colonic mucosa, SM: submucosa. Bar size: 100, arrow: positive reaction, *: P<0.05 compared with UE, #: P<0.05 compared with PT. Ⅳ. Discussion 방까지 기대할 수 있다21-23). 궤양성 대장염 환자는 대체로 점액이 섞인 혈변 또 한국인의 식습관 서구화로 장에서 흡수하는 물질이 장 속의 미생물과 부조화를 이루어 염증 반응을 일으 키는 염증성 장 질환이 증가하고 있다. 염증성 장 질환 은 장에 염증을 보이는 질환 모두 해당하며 특히 만성 으로 진행하여 완치가 어려운 궤양성 대장염과 크론병 이 대표적이다1,2). 특히 과중한 학업 스트레스를 받으 면서 적극적 신체활동 시간이 절대적으로 부족한 소 아 청소년에서 궤양성 대장염의 발병률이 최근에 급증 하고 있다10,20). 잘못된 식습관과 학업 스트레스 등으로 인한 염증성 장 질환은 소아 청소년의 성장부진과 섭 식장애까지 가져올 수 있어 이를 해결하기 위한 다양 한 치료법이 연구 중이다. 최근 분자유전학의 발전으 로 전염증효소, 염증효소 등 염증반응을 조절하는 생 물학적 제제가 연구되어 빠른 치료 효과 및 합병증 예 는 설사가 하루에 여러 차례 나오고 열 또는 복통을 앓고, 대장의 염증과 궤양을 보이며, 직장의 길이가 감 소하고, 대장의 상처 부위에 염증세포가 침윤한다24,25). 궤양성 대장염의 원인이 규명되지 않아 근본적인 치료 법이 아직 없기에26), aminosalicylic acid와 스테로이드 제제를 사용하여 증상을 완화해 관해상태를 유지하는 치료방법이 현재까지의 치료법이다. 그러나 이러한 치 료법은 완치 및 장기적인 합병증을 예방하는 데 한계 가 있으며, 약물을 장기적으로 투여하면 구토 및 구역, 소화불량과 식욕부진, 두통과 같은 부작용이 발생할 수 있으며, 내성이 생길 수 있다27). 높은 유효성과 안전 성의 궤양성 대장염 치료제 개발이 요구되는 시점에서 한약이 새로운 치료제로서 관심을 받고 있다28). 금은화-감초 복합 추출물은 醫方集解 에 金銀花
22 The Anti-Inflammatory Effect of Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis Decoction on Ulcerative Colitis Induced by DSS in Mice 酒라기재되어있으며, 癰疽惡瘡에사용하고, 특히腸癰치료에효과가뛰어나다. 금은화 (Lonicera japonica) 는인동과에속한인동덩굴의꽃으로서한방에서淸熱解毒, 涼散風熱, 凉血止痢의효능이있어강한항균작용으로염증성질환과외과의부스럼, 감기로인한발열등에사용한다 14,15,29). 바이러스억제작용이있어유행성감기나호흡기질병, 매독, 고열로인한의식불명이나수족마비가일어났을때사용한다. 그리고인후통, 인두염, 편도선염, 기관지염, 대장염, 위궤양, 방광염, 결막염및부스럼, 화농성감염증등을치료한다 15,30). 감초 (Glycyrrhiza uralensis) 는콩과의뿌리줄기와뿌리로, 解毒, 和中緩急, 潤肺, 調和諸藥등의효능이있으며, 食慾不振, 脾胃虛弱, 便溏, 勞倦으로인한發熱, 肺結核으로인한咳嗽, 心悸를치료한다 17). 또한, 소화성궤양을치료하며약물중독, 식중독을해독한다 31,32). 금은화 -감초복합추출물의 GC/MS 검사결과염증억제능이있는 NMP (RT 12.927/ Area 4.61%) 를확인했다. NMP 는활성산소, 유도성산화질소합성효소및다양한사이토카인과같은염증전단계의유전자발현조절을통해소염효과가있는것으로알려져있다 33,34). 금은화 -감초복합추출물에 NMP가구성되어있다는것은금은화- 감초복합추출물이궤양성대장염의염증을억제시킬수있는가능성을제시한다. 본연구에서 DSS를처리하여인위적으로대장점막내염증반응을유도하여 UE군이 Ctrl군보다맹장부터내림주름창자까지길이가감소하였으나, PT군은 UE 군에비해 13%, LGT군에서는 22% 길이가증가했다. 이러한결과는금은화- 감초복합추출물이궤양성대장염으로축소된창자의길이를회복하는데효과가있음을보여준다. 또한창자점막의형태변화를관찰한결과 UE군의넓은부위에서창자세포와창자샘이소실된출혈성침식 (hemorrhagic erosion) 이관찰됐으며, 다수의림프구, 섬유모세포, 과립백혈구와같은염증관여세포의침윤 (infiltration) 이점막고유층에서관찰되었다. 반면, PT 군과 LGT군에서출혈성침식완화와점막고유층의염증관여세포침식감소가확인되었다. 아울러 PAS 염색으로점액분비세포분포변화가관찰됐다. UE군의표면상피상층부 (apical surface) 에있는 PAS 양성반응의창자세포는대부분손상된형태를보였고, 솔모양가장자리는관찰할수없었다. 반면에 PT군과 LGT군의표면상피상층부일부분을제외하고정상적인창자세포 의배열과솔모양가장자리가관찰되었다. 다양한자극에방어작용을하는소화기점막상피에 DSS를처리하면점액상피세포사이의폐쇄띠 (zonula occuldens) 가손상되어세포간연접장치인 zonula occudin (ZO)-1 분포가감소한다. 폐쇄띠손상시 intestinal permeability가증가하여장내염증반응을유도하여궤양성대장염이발생한다 35). 또한 DSS는점액조직에과립백혈구를과도하게침윤시키고, 비대하게하며, 표피주위에궤양을형성하고, 조직벽에심각한부종을일으킨다 36). 따라서금은화- 감초복합추출물이폐쇄띠손상을억제하여장내투과성을감소하고, 출혈성침식및염증관여세포의침윤을완화시키는것으로생각한다. 궤양성대장염은 TNF-α와 NF-κB 의활성을조절하여 COX-2와 inos 생성을증가시켜염증을유발한다. TNF는염증, 감염등생체를위해하는인자로발현하여세포분열, 세포분화, 세포자연사 (apoptosis) 를유도한다. TNF는 nuclear factor interleukin-6, fos/jun (AP-1), CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP), NF-κB와같은전사인자를조절하여 inos와 COX-2를유도한다 37,38). 특히 NF-κB 는염증성장질환의산화스트레스로인한염증과발암조절유전자발현을조절한다. 장내산화스트레스가증가하면 IκB kinase인 IKK (IKKα, β) 를활성화해염증효소전사인자인 NF-κB 발현을유도한다 38-40). 염증효소인 inos는과도하게 nitric oxide (NO) 를생산해장내항산화방어체계가균형이깨지고, 산화스트레스로인해장내조직손상을일으키는염증성장질환을유발한다. 또한 COX-2는중추신경계와염증세포에서 prostaglandin 생합성을유도하여만성염증을유발한다 38,41,42). 본연구에서 UE군은 TNF-α 양성반응이점막고유층에서증가하였고, 양성반응세포의세포질에서강한양성반응을보였다. 반면, PT군에서는 UE군보다양성반응이 29%, LGT군에서는 62% 감소하였다. p-iκb 의양성반응역시 UE군은점막고유층에서증가하였고, 양성반응세포의핵막가장자리에서강한양성반응을보인반면, PT군에서는 UE군보다양성반응이 23%, LGT 군에서는 51% 감소하였다. inos 양성반응은 UE군은증가하였고, PT군에서는 UE군보다양성반응이 28%, LGT군에서는 UE군보다양성반응이 54% 감소하였다. COX-2 양성반응도 UE군은점막고유층에서증가하였고, PT군에서는 UE군보다양성반응이 27%, LGT군에서는 51% 감소하였다.
항염증조절을통한금은화 - 감초복합추출물의 DSS 유도궤양성대장염완화효과 23 이러한결과를통하여금은화- 감초복합추출물은전염증효소인 TNF-α 활성억제와염증효소전사인자인 NF-κB의발현조절에따른염증효소 COX-2와 inos 생성억제로항염증효과가있음을확인하였고, 궤양성대장염치료제로시판중인펜타사보다도치료효과가높았다. 대조약물인펜타사는 5-ASA 계열중부작용이적은메살라진 (mesalazine) 제제로서, 궤양성대장염환자의관해유도와재발예방을위한유지치료에첫번째로고려된다. 한국을포함한각국의궤양성대장염치료가이드라인에서궤양성대장염환자에 5-ASA계열의항염증제중메살라진제형을 1차치료제로사용할것을권고한다 43). 5-ASA제제에효과가없으면스테로이드를사용하고, 스테로이드의존성또는불응성이생겼을경우면역억제제또는생물학적제제를처방하는데 44), 궤양성대장염은재발률이높은편으로, 치료를통해 1년이상관해를성공적으로유도한환자의 62% 에서 1회이상재발한다는실험결과 45) 가있다. 최근부작용을개선하고, 정제개수와복용횟수를줄인치료제들이출시되고있으나, 염증을억제하거나완화하는효과만있어, 완치를위한치료제가될수없다. 관해유지상태를오랜기간보인환자여도, 치료를중단할경우질환이재발할수밖에없다. 그러나금은화- 감초복합추출물은항염증효과와창자점막의보호가가능하며, 궤양성대장염치료제인펜타사보다높은치료효과를보이므로, 부작용과재발률을최소화하고치료효과를높여소아 청소년의궤양성대장염치료법개발에응용할수있을것으로기대된다. 본연구는궤양성대장염을유발한동물모델에서얻은결과로, 실제궤양성대장염환자의임상치료에적용하기에인간대상임상연구의자료가부족하다. 향후금은화- 감초복합추출물의항염증기전과성분을분석하는후속연구와임상연구가추가적으로필요할것으로생각된다. Ⅴ. Conclusion 항염증조절을통한금은화- 감초복합추출물의 DSS 유도궤양성대장염완화효과를알아보기위한본연구는항염증효과를지닌금은화 -감초복합추출물의 구성성분을확인하고, 궤양성대장염을유발한생쥐의창자의염증변화를관찰하여다음과같은결과를얻었다. 1. 금은화 -감초복합추출물을 GC/MS로성분분석한결과항염증효과가있는성분 NMP를확인하였다. 2. 금은화- 감초복합추출물을투여한생쥐 (LGT군 ) 의주름창자길이가 DSS 처리군 (UE군), 대조약물인펜타사처리군 (PT군) 보다증가하였다 (P<0.05). 3. 금은화- 감초복합추출물을투여한생쥐 (LGT군 ) 의주름창자점막에서 DSS 처리군 (UE군), 대조약물인펜타사처리군 (PT군) 보다출혈성침식이완화되었고, 점막고유층에서도염증관여세포침식이감소하였다. 4. 금은화- 감초복합추출물을투여한생쥐 (LGT군 ) 에서 TNF-α, NF-κB, inos, COX-2의양성반응이 DSS 처리군 (UE군), 대조약물인펜타사처리군 (PT군) 보다감소하였다 (P<0.05). Ⅵ. Acknowledgement 본연구는 2018년도부산대학교병원임상연구비지원으로이루어졌음. References 1. Xavier RJ, Podolsky DK. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 2007;448(7152): 427-34. 2. Lee JH. Inflammatory bowel disease in pediatric age. Korean J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2011;14(Suppl 1):S34-S41. 3. Yang SK, Hong WS, Min YI, Kim HY, Yoo JY, Rhee PL, Rhee JC, Chang DK, Song IS, Jung SA, Park EB, Yoo HM, Lee DK, Kim YK. Incidence and prevalence of ulcerative colitis in the Songpa-Kangdong district, Seoul, Korea, 1986-1997. J Gastroenterol Hepatol. 2000;
24 The Anti-Inflammatory Effect of Lonicera Japonica-Glycyrrhiza Uralensis Decoction on Ulcerative Colitis Induced by DSS in Mice 15(9):1037-42. 4. Yang SK, Yun S, Kim JH, Park JY, Kim HY, Kim YH, Chang DK, Kim JS, Song IS, Park JB, Park ER, Kim KJ, Moon G, Yang SH. Epidemiology of inflammatory bowel disease in the Songpa-Kangdong district, Seoul, Korea, 1986-2005: a KASID study. Inflamm Bowel Dis. 2008;14(4):542-9. 5. Kim YM, Park SH, Yang SK, Choe JW, Kim SH, Byeon JS, Myung SJ, Cho YK, Yu CS, Choi KS, Chung JW, Kim B, Choi KD, Kim JH. Clinical characteristics and long-term course of ulcerative colitis in Korea. Intest Res. 2006;4(1):12-21. 6. Katz J. The course of inflammatory bowel disease. Med Clin North Am. 1994;78(6):1275-80. 7. Yang DH, Yang SK. Trends in the incidence of ulcerative colitis in Korea. Korean J Med. 2009;76(6):637-42. 8. Baldassano RN, Piccoli DA. Inflammatory bowel disease in pediatric and adolescent patients. Gastroenterol Clin North Am. 1999;28(2):445-58. 9. Hickie I, Koschera A, Hadzi-Pavlovic D, Bennett B, Lloyd A. The temporal stability and co-morbidity of prolonged fatigue: a longitudinal study in primary care. Psychol Med. 1999;29(4):855-61. 10. Han YJ, Lee SH, Lee JY. A study on the influence of irritable bowel syndrome on dietary habits and fatigue in children and adolescents. J Pediatr Korean Med. 2017;31(3):1-13. 11. Jeen YT, Kim J. Advances in ulcerative colitis therapy. Korean J Med. 2009;76(6):654-60. 12. Cha HY, Jeong AR, Cheon JH, Ahn SH, Park SY, Kim KB. The anti-oxidative and anti-inflammatory effect of Lonicera Japonica on ulcerative colitis induced by dextran sulfate sodium in mice. J Pediatr Korean Med. 2015; 29(3):54-64. 13. Kim SY, Park JW, Ryu BH. Effects of Auklandia Lappa on dextran sulfate sodium-induced murine colitis. Korean J Orient Int Med. 2013;34(2):134-46. 14. Kim Y, Yang SY, Oh YS, Lee JW, Lee YK, Park YC. Research trends of Lonicera Japonica over the last 10 year. J Daejeon Orient Med. 2010;19(1):17-23. 15. Joo JS, Kim JS, Jeong JG, Kim BK. Study of efficacy of Foeniculi Fructus & Lonicerae Flos extract on acute pancreatitis. Kor J Herbology. 2010;25(4):39-45. 16. Ahn SH, Kim HH. Lonicerae Flos inhibited COX-2 and MMP-9 in LPS induced arthritis of mouse through regulation of MIF. Korean J Orient Physiol Pathol. 2010; 24(2):242-8. 17. Bak JP, Son JH, Kim YM, Lee EY, Leem KH, Kim EH. Suppression of inflammatory macrophage response by Glycyrrhiza Uralensis herbal acupuncture extract. Korean J Acupunct. 2011;28(4):49-58. 18. Park CH, Kim JH, Choi SH, Shin YS, Lee SW, Cho EJ. Protective effects of Glycyrrhiza Uralensis Radix extract and its active compounds on H2O2-induced apoptosis of C6 glial cells. Korean J Med Crop Sci. 2017;25(5):315-21. 19. Asl MN, Hosseinzadeh H. Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza sp. and its bioactive compounds. Phytother Res. 2008;22(6):709-24. 20. Kim BJ, Song SM, Kim KM, Lee YJ, Rhee KW, Jang JY, Park SJ, Yoon CH. Characteristics and trends in the incidence of inflammatory bowel disease in Korean children: a single-center experience. Dig Dis Sci. 2010; 55(7):1989-95. 21. Itzkowitz SH, Yio X. Inflammation and cancer IV. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: the role of inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004;287(1):G7-17. 22. Fazio V. Current status of surgery for inflammatory bowel disease. Digestion. 1998;59(5):470-80. 23. Surh YJ, Chun KS, Cha HH, Han SS, Keum YS, Park KK, Lee SS. Molecular mechanisms underlying chemopreventive activities of anti-inflammatory phytochemicals: down-regulation of COX-2 and inos through suppression of NF-kappa B activation. Mutat Res. 2001; 480-481:243-68. 24. Hendrickson BA, Gokhale R, Cho JH. Clinical aspects and pathophysiology of inflammatory bowel disease. Clin Microbiol Rev. 2002;15(1):79-94. 25. Lichtenstein GR, Rutgeerts P. Importance of mucosal healing in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 2010; 16(2):338-46. 26. Danese S, Sans M, Fiocchi C. Inflammatory bowel disease: the role of environmental factors. Autoimmun Rev. 2004;3(5):394-400. 27. Ishiguro K, Ando T, Maeda O, Hasegawa M, Kadomatsu K, Ohmiya N, Niwa Y, Xavier R, Goto H. Paeonol
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