한수지 50(4), 388-395, 2017 Original rticle Korean J Fish quat Sci 50(4),388-395,2017 아연및알루미늄용융도금처리된강판이북방전복 (Haliotis discus hannai) 의아가미와간췌장에미치는영향 이치훈 박준영 이영돈 * 제주대학교해양과학연구소 Effects of Zinc and luminum Hot-dip Galvanized Sheet Steel on the Gill and Hepatopancreas of the balone Haliotis discus hannai hi Hoon Lee, Jun Young Park and Young Don Lee* arine Science Institute, Jeju ational University, Jeju 63333, Korea We investigated the toxicity of zinc and aluminum hot-dip galvanized sheet steel to abalone Haliotis discus hannai via changes in the gill and hepatopancreas using histological and transmission electron microscopy analysis. Experimental groups were composed of one control and four exposure conditions (direct or indirect exposure to zinc and aluminum hot-dip galvanized sheet steel). In the control group, aluminum exposure groups (direct and indirect), and indirect zinc exposure group, abalone mortality was not observed until the end of the experiment, and no histopathological changes were observed in the gill and hepatopancreas. However, the direct zinc exposure group exhibited 100% mortality. Ultrastructural analysis of the cytoplasm of ciliated and microvilli-bearing epithelial cells from gill filaments revealed electron-dense vesicles near the cell membrane and disruption of the nuclear membrane. We also observed swollen mitochondria and a loss of mitochondrial cristae. The hepatopancreas showed similar changes, and we detected highly electron-dense particles within the vesicles. These results suggest that abalone exposed directly to zinc hot-dip galvanized sheet steel experience acute toxicity, causing damage to cell organelles in the gill and hepatopancreas and, finally, inducing mortality. Key words: Zinc, luminum, Hot-dip galvanized steel sheet, Toxicity, balone Haliotis discus hannai 서론., (ryan et al., 1985). (Zn),,, (hang et al., 1996), (Ibrahim et al., 2000). red abalone Haliotis rufescens (Hunt and nderson, 1989) (Liao and Lin, 2001) (Tsai et al., 2004; Liao and hou, 2005), (Seo et al., 1999). (ossy-wetzel et al., 2004; iacci et al., 2012; Guo et al., 2013; Yu et al., 2013). (rassostrea gigas) 24 48, (Trevisan et al., 2014). https://doi.org/10.5657/kfs.2017.0388 Korean J Fish quat Sci 50(4) 388-395, ugust 2017 This is an Open ccess article distributed under the terms of the reative ommons ttribution on-ommercial Licens (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Received 30 ay 2016; Revised 13 ugust 2016; ccepted 4 ugust 2017 *orresponding author: Tel: +82. 64. 783. 8281 Fax: +82. 64. 782. 8281 E-mail address: leemri@jejunu.ac.kr opyright 2017 The Korean Society of Fisheries and quatic Science 388 piss:0374-8111, eiss:2287-8815
아연및알루미늄용융도금강판이북방전복에미치는영향 389,,. 재료및방법 실험동물및사육환경 (Haliotis discus hannai) 7.0-8.0 cm, 55-65 g,,, 30. S (acronitrilebutadiene-styren resin), (Fig. 1). 2, 1 2014 8 6 15, 2 2014 22 31 10. (50 60 30 cm), 4-5 L/min, 21.8-25.0, 5.89-7.25 mg/l, 31.4-33.4 ppt, ph 8.22-8.38. 생존율및조직학적변화분석 24., ouin s fluid 24, 5-6 m, heamatoxylin 0.5% eosin (H-E ). 2.5% paraformaldehydeglutaraldehyde (phosphate buffer, ph 7.4) 2 1% OsO 4 (phosphate buffer, ph 7.4) 2. (SE) amyl acetate 20 3, O 2 1 SE (JS-7500F, Hitachi, Japan). (TE) Epon 812, LK-V ultramicrotome 1 m toluidine blue 80 nm. uranyl acetate lead citrate JEOL JE 1200 EX-II (60 Kv). 결과 전복의생존율. 1 96.7%. 96.7%, 96.7%. 2 53.3%, 5 30.0%, 7 16.7%, 10 (Fig. 2). 2 100%. 100%, 100%. 2 90%, 3 56.7%, 5 30.0%, 10 (Fig. 2). 아가미와간췌장의조직학적변화 Experimental tanks Zinc group luminum group Direct exposure group Zinc group luminum group Indirect exposure group Fig. 1. Sketch of the experimental tank containing aluminum and zinc hot-dip galvanized steel sheet.
390 이치훈ㆍ박준영ㆍ이영돈 Survival rate (%) Survival rate (%) 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 Fig. 2. hange of survival rate of abalone Haliotis discus hannai exposed to zinc and aluminum hot-dip galvanized steel sheet (, 1 st experiment;, 2 nd experiment).. 아가미 ontrol l-indir Zn-indir l-dir Zn-dir 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Exposure (days) ontrol l-indir Zn-indir l-dir Zn-dir,.,, (Fig. 3).,,. (Fig. 4 and ), (Fig. 4)., euchromatin heterochromatin heterochromatin, (Fig. 5).,, (Fig. 6).,, (Fig. 7). 간췌장, Lc Gf Gf Gf Lc 200μm Sc Sc 10 μm Fig. 3. SE micrographs of the gill of abalone Haliotis discus hannai., frontal view of gill;, gill filament;, secretory granules in the gill filament. Gf, gill filament; Lc, lateral cilia; Sc, secretory granules.
200μm 10 μm Sc Sc 아연 및 알루미늄 용융도금강판이 북방전복에 미치는 영향 391 10 μm Hc Fig. 4. Histological change of the gill filament of abalone Haliotis discus hannai in control group () and aluminum hot-dip galvanized steel sheet exposure group () and zinc hot-dip galvanized steel sheet exposure group (). and, normal morphology of gill filament with he, epidermal molymphs sinus and epidermal layer;, unusual morphology of gill filament with swollen and disrupted hemolymphs sinus. layer;, hemolymph sinus. Hc Hc Fig. 5. TE micrographs of ciliated and microvilli epithelial cell of gills filaments from abalone Haliotis discus hannai in control ( and ) and aluminum hot-dip galvanized steel sheet exposure group ()., normal morphology of nucleus with distinct nuclear envelope (arrowheads) and heterochromatin;, normal morphol ogy of mitochondria with distinct cristae (arrows)., normal morphology of nucleus with intact nuclear envelope (arrowheads) and mitochondrial cristae (arrows). Hc, heterochromatin;, mito chondria;, nucleus. 1.0μm Fig. 6. TE micrographs of the gills filaments from abalone Hali- otis discus hannai in zinc hot-dip galvanized steel sheet exposure group. to, presence of endocytic vesicles containing electron dense particles (arrows) and zinc nanoparticles., nucleus;, zinc nanoparticles. 태로 관찰되었다. 대조구와 알루미늄 및 아연 강판 직접 처리구 간 전복 간췌장의 광학현미경 조사 결과 형태적인 차이는 관찰 할 수가 없었다(Fig. 8). 대조구와 알루미늄 강판 직접 처리구 전
392 1.0μm 이치훈ㆍ박준영ㆍ이영돈 Fig. 7. TE micrographs of ciliated and microvilli epithelial cell of the gills filaments from abalone Haliotis discus hannai in zinc hot-dip galvanized steel sheet exposure group., nucleus with disrupted nuclear envelope (arrowheads);, disrupted mitochondrial cristae (arrows) and showing swollen mitochondria., mitochondria;, nucleus. Fig. 8. Histological change of the hepatopancreas of abalone Haliotis discus hannai in control and treatment groups., control group;, aluminum hot-dip galvanized steel sheet exposure group;, zinc hot-dip galvanized steel sheet exposure group., digestive gland. 복 간췌장의 소화선 상피세포를 투과전자현미경으로 관찰한 결 과, 난형의 핵은 염색질이 균일하게 분포하고 있으며 뚜렷한 핵 막을 따라 염색질이 분포하고 있고, 정상적인 조면소포체와 크 리스테가 뚜렷한 미토콘드리아가 관찰되었다(Fig. 9). 아연 강 판 직접 처리구 전복의 간췌장을 투과전자현미경으로 관찰한 결과, 아연 미세입자들이 존재하였고, 전자밀도가 높은 아연 미 RER 세입자들이 세포 내 유입되는 현상이 관찰되었다(Fig. 10). 또 한 소화선을 구성하는 상피세포를 관찰한 결과, 아가미 미세융 모 상피세포와 마찬가지로 핵들은 핵막이 붕괴되었으며, 미토 콘드리아는 크리스테가 손실되거나 부풀어 지고 붕괴되는 현상 이 관찰되었다(Fig. 11). 고 찰 산업화 및 도시화에 따른 유해 독성물질의 증가는 생태계에 RER 서식하는 동 식물의 생존 및 번식, 성장 등에 위해요인으로 작 용한다. 특히 해양생태계는 외부에서 유입된 중금속 등이 쉽게 분해되지않고 수서생물의 생체 내에 축적되어 형태적, 생리적, 생화학적 변화를 초래하여 수서생물에 미치는 생태독성에 대 한 많은 연구가 진행되고 있다(Viarengo, 1985; Dautremepuits et al., 2004; Ju et al., 2006; Son et al., 2015). 미량금속중 하나 인 아연은 생명현상 유지에 필수적인 미량원소로 효소의 보결 분자단으로서 작용하여 면역조절, 성장, 세포보호, 항산화 및 항염증 작용 등 각종 대사과정을 관장한다(erg, 1990; aity et al., 2008). 아연은 생활용품, 의학 관련 제품, 산업용 제품 등 에 광범위하게 사용되며, 산업용 활용은 철이나 강철의 부식을 막기 위한 용융도금으로 해수 취배수 관 및 패류 종묘생산 채묘 기 등에 많이 사용되고 있다. 하지만 적정 농도 이상 노출하게 급성 또는 만성 독성으로 작용하게 된다(cGeer 되면 아연은 et al., 2000; Ho, 2004; Kamaruzzaman et al., 2010; Hwang et
393 아연 및 알루미늄 용융도금강판이 북방전복에 미치는 영향 RER D D Fig. 9. TE micrographs of microvilli epithelial cell of the hepatopancreas from abalone Haliotis discus hannai in control ( and ) and aluminum exposure group ( and D)., normal morphology of nucleus and rough endoplasmic reticulum with ribosomes attached;, intact mitochondrial cristae (arrows); and D, normal morphology of nucleus with intact nuclear envelope (arrowheads) and mitochondrial cristae (arrows)., mitochondria;, nucleus; RER, rough endoplasmic reticulum. D Fig. 10. TE micrographs of the hepatopancreas from abalone Haliotis discus hannai of zinc hot-dip galvanized steel sheet exposure group. to D, presence of endocytic vesicles containing electron-dense zinc nanoparticles., zinc nanoparticles.
394 D 이치훈ㆍ박준영ㆍ이영돈 1.0 μm Fig. 11. TE micrographs of epithelial cell from abalone Haliotis discus hannai of 0.5zinc μm hot-dip galvanized steel sheet exposure group., 0.5 μm mitochondrial cristae (arrows) nucleus with disrupted nuclear envelope (arrowheads); and, disrupted and showing swollen mitochondria., mitochondria;, nucleus. al., 2012). 아연 독성에 대한 연구결과를 보면, 대복(Gomphina veneriformis)과 북방전복(Haliotis discus hannai), 담수어류인 yellow tail lambari (styanax aff. bimaculatus)의 아연 노출 후 아가미의 혈림프동이 확장되고, 새엽 상피세포의 섬모들이 탈 락 및 융합, 상피층 박리와 괴사가 나타났으며, 대복과 북방전 복의 경우 소화기관인 중장선에 지방갈색소가 침적되거나 상 피세포의 공포화 또는 괴사가 일어났다(Ju et al., 2006; Santos et al., 2011; Son et al., 2015). 또한 적정 농도 이상의 아연에 노출된 대복의 경우 17일 경과하면서 100% 폐사하였고(Ju et al., 2006), 담수어류인 yellow tail lambari도 노출 후 24시간 째 50-100% 폐사율을 보였다(Santos et al., 2011). 이 연구에서 도 아연 용융도금 강판에 직접 사육한 전복의 경우 아가미 새 엽 혈림프동이 확장되거나 붕괴되었으며, 노출 후 10일 째 모 두 폐사하였다. 중금속 및 100 nm이하의 제조 나노입자들을 포함한 오염원 의 생물체내 유입은 생물의 기관계 세포손상 및 구조 변화를 일 으켜 생리학적 장애를 초래한다. Guo et al. (2013)은 쥐의 산화 아연 미세입자 노출 후 피부 세포와 망막신경절 세포의 활성산 소가 증가하여 미토콘드리아 장애 및 세포괴사가 일어났으며, iacci et al. (2012)의 담치를 대상으로 한 실험에서도 활성산 소 증가와 함께 미토콘드리아의 수가 감소하는 경향을 보였다. 또한 산화아연 미세입자에 노출된 굴의 경우도 미세입자의 세 포내 유입이 관찰되었고, 활성산소 증가와 산화스트레스와 함 께 아가미와 소화관의 미토콘드리아 손상이 일어났다(Trevisan et al., 2014). 이 연구에서도 아연 용융도금 강판에 직접 사육한 처리구 전복의 아가미의 미세융모와 간췌장의 상피세포를 관 찰 결과, 아연 미세입자들의 세포 내 유입이 관찰되었으며, 핵 막 붕괴와 미토콘드리아의 크리스테가 손실되거나 붕괴되는 현 상이 관찰되었다. 연안에 서식하는 복족류를 포함한 무척추동물은 주위 환경으 로부터 노출이 쉬워 중금속을 포함한 오염원 축적률이 높아 연 안환경오염의 생물 지표종으로 많이 이용된다. 이 연구에 사용 된 아연 및 알루미늄 용융도금 처리된 강판은 연안에서 해수 취 배수 도관으로 많이 이용된다. Seo et al. (1999)은 아연도관을 통해 유입된 사육수의 아연 농도와 아연성분이 북방전복의 유 생 발생 및 채묘에 미치는 영향을 조사한 결과, 아연농도는 7개 월 동안 98.0±2.5 μg/l에서 15.2±2.8 μg/l로 현저하게 감소 하였으나, 20 μg/l의 아연농도에서 북방전복의 정상유생 발생 율, 생존율, 부착률이 급격하게 감소하였다. 이 연구에서 알루 미늄 용융도금 강판의 직, 간접 노출과 아연 용융도금 강판의 간접 노출에서는 전복 폐사가 일어나지 않았지만, 아연 용융도 금 강판의 직접 노출구에서의 전복은 아연 미세입자들이 세포 유입(endocytosis) 작용을 통해 아가미와 소화관 등 내분비기관 을 구성하는 조직 및 세포의 핵막을 붕괴하거나 미토콘드리아 의 크리스테 손상 및 사멸에 의해 대사활성 장애를 유발하여 전 복의 폐사가 일어난 것으로 생각된다. 따라서 이상의 결과를 종 합해 볼 때, 아연 용융도금 도관보다 알루미늄 용융도금 도관사 용이 연안 자원 관리 보호의 효율성이 높을 것으로 사료된다. References erg J. 1990. Zinc fingers and other metal-binding domains. ements for interactions between macromolecules. J iol hem 265, 6513-6516. ossy-wetzel E, Talantova V, Lee WD, Schölzke, Harrop, athews E, Götz T, Han J, lisman H, Perkins G and Lipton S. 2014. rosstalk between nitric oxide and zinc pathways to neuronal cell death involving mitochon-
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