(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2016-0119439 (43) 공개일자 2016년10월13일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 8/97 (2006.01) A61K 45/06 (2006.01) A61Q 19/00 (2006.01) A61Q 19/08 (2006.01) (52) CPC 특허분류 A61K 8/97 (2013.01) A61K 45/06 (2013.01) (21) 출원번호 10-2016-0128077( 분할 ) (22) 출원일자 2016 년 10 월 05 일 심사청구일자 2016 년 10 월 05 일 (62) 원출원특허 10-2014-0082870 원출원일자 심사청구일자 전체청구항수 : 총 1 항 2014 년 07 월 03 일 2014 년 07 월 03 일 (71) 출원인 주식회사더가든오브내추럴솔루션 경기도오산시가장산업서로 12-24( 가장동 ) (72) 발명자 장문식 경기도수원시장안구금당로 39 번길 34, 조원주공아파트 214 동 804 호 ( 조원동 ) 정욱순 서울특별시송파구올림픽로 435 312 동 2003 호 ( 신천동, 파크리오아파트 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이덕록 (54) 발명의명칭항염증효과가있는별꽃이끼초음파추출물제조방법 (57) 요약 본발명은항염증효과가있는별꽃이끼초음파추출물의제조방법에관한것으로별꽃이끼초음파추출물을제조하는단계와 ; 상기추출물의항산화활성, 항염증활성및주름개선활성을확인하는단계로구성되며본발명에따라제조된별꽃이끼초음파추출물은항산화와항염효능이우수하며, 주름또한상승적으로개선된뛰어난효과가있다. 대표도 - 도 4-1 -
(52) CPC 특허분류 A61Q 19/00 (2013.01) A61Q 19/08 (2013.01) C12N 2310/3183 (2013.01) (72) 발명자 엄선영 경기도수원시권선구동수원로 145 번길 24 201 동 1201 호 ( 권선동, 수원아이파크시티 2 단지아파트 ) 김영훈 서울특별시서초구서초중앙로 24 길 43 104 동 801 호 ( 서초동, 유원아파트 ) 박송아 경기도수원시영통구봉영로 1517 번길 27 906 동 201 호 ( 영통동, 벽적골 9 단지아파트 ) 이하연 경기도성남시중원구금빛로 59 번길 17 401 호 ( 금광동, 와이드빌 ) 문미연 제주특별자치도제주시진군 3 길 15-34 301 호 ( 노형동 ) 임준환 제주특별자치도제주시비룡 1 길 5 ( 용담일동 ) 김영헌 서울특별시구로구가마산로 20 다길 14-2 301 호 ( 구로동 ) - 2 -
명세서청구범위청구항 1 음건한벌꽃이끼 2~3g에프로판디올을 40 ~ 60mL 첨가하여 35 ~ 40 온도에서 1시간동안초음파처리하는것이특징인항염증기능성벌꽃이끼추출물의제조방법. 발명의설명 [0001] 기술분야 항염증효과가있는별꽃이끼 (Star Reindeer Lichen) 초음파추출물의제조방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술이끼는이끼류또는선류 ( 蘚類 ) 에속하는작고부드러운식물로서보통 1 ~ 10 cm 정도되지만훨씬큰것도있다. 이끼는보통축축하고그늘진곳에엉켜집단을이루어자라며꽃이나씨앗을갖지않으나때에따라서는포자낭을만들기도한다. 또한이끼는우주공간에서도생존할수있는강한생명력을가진것으로알려져있다 (Goffinet, B. et al., Morphology and Classification of the Bryophyta, ryophyte Biology, Cambridge University Press, 55 ~ 138, 2008). 이끼는지의류라고도하며지의류중클라도니아속스텔라리스 (Cladonia stellaris) 는스타레인디아리천 (Star Reindeer Lichen) 이끼라불리며우리나라말로별꽃이끼라한다 ( 식품의약품안전처식품원재료, 이하별꽃이끼라한다 ). Cladonia속지의류는전세계적으로 400여종이분포하고, 남극의킹조지섬에는 30여종이존재하나그연구는미비한실정이다 (Lee, J. S. et al., Diversity of the Lichenized Fungi in King George Island, Antarctica, Revealed by Phylogenetic Analysis of Partial Large Subunit rdna Sequences. Journal of Microbiology and Biotechnology, 18, 1016-1023, 2008). 피부노화는내적노화 (intrinsic aging) 와외적노화 (extrinsic aging) 로구분되며내적노화는나이를먹으면서피부의구조와생리적기능이쇠퇴하는것이고외적노화는태양광선등외부에의해노화현상이나타나는것이다 (Gilchrest B. A. Skin aging and photoaging. Dermatol Nurs 2, 79-82, 1990). 자외선에의한피부노화는피부세포가자외선흡수에의한손상을방어하기위한목적으로멜라닌색소를생성하고그결과기미, 주름등으로나타나는것이다 (Wang K. H. et al., Cosmetic applications of selected traditional Chinese herbal medicines, J. Ethnopharmacol, 353-359, 2006). 이러한피부트러블은활성산소와도관련이있음을수많은연구에의해알려져있다. 활성산소는진피의결합조직인콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산등을파괴하여피부의주름을일으키며세포막의지질부분을산화시켜세포의파괴현상을일으켜피부염, 여드름, 피부암등의질병을유발한다. 또한이활성산소는멜라닌형성과정중자발적인산화반응에관여하여기미, 주근깨등의원인및주름생성의원인이되기도한다 ( 대한화장품학회지 23권, 1호, 75-132). 피부노화과진행될수록피부를구성하는물질인 collagen, elastin, hyaluronic acid 등구조단백질을생성하는능력이감소하고 collagenase의생합성이증가하여 matrix metall oproteinases (MMPs) 의발현이증가되면진피내교원섬유, 탄력섬유, fibronectin 및 laminin과같은기질단백질분해를유도하여피부탄력을떨어뜨리고피부주름생성을야기한다 (Brenneisen P, et al., Ultraviolet-B irradiation and matrix metall oproteinases:from induction via signaling to initial events, Ann. N. Y. Acad. Sci. 31-43, 2002). 피부노화개선에효과가있는다양한소재로 vitamin C, arbutin, ascorbic acid, kojic acid, hydroquinone, retinol 콜라겐등이사용되나제품안전성에서끊임없이문제가제기되고있다. 이끼추출물을함유하는화장료조성물로서, 사슴지의속이끼 (Cladonia stellaris) 의헥산 (n-hexane) 의추출물또는그유효성분인뎁시돈또는뎁시돈유도체를함유하는항노화피부외용제조성물이대한민국공개특허제 10-2009-0052096호에개시된바있고, 산초, 백두옹, 이끼, 팔각회향, 에키나시아및프로폴리스의혼합추출물을유효성분으로하는피부개선용화장료조성물이대한민국등록특허제10-1176521호에개시되어있다. 또이끼추출물을이용한아토피피부염의개선또는치료용약학적조성물이대한민국등록특허제10-1083347호가개시되어있다. 그러나상기문헌어디에도이끼류 ( 지의류 ) 중별꽃이끼 (Star Reindeer Lichen) 에극성용매를가 - 3 -
하고초음파추출하여항염증효과가있는별꽃이끼추출물을제조하는방법에관하여는개시된바없다. 발명의내용 [0005] 해결하려는과제 따라서본발명의목적은항염증효과가있는별꽃이끼 (Star Reindeer Lichen) 의초음파추출물의제조방법을 제공하는데있다. [0006] 과제의해결수단 본발명의상기목적은본발명별꽃이끼물또는유기용매가첨가된초음파추출물을제조하는단계와 ; 상기 추출물의항산화활성, 항염증활성및콜라겐합성능을비교확인하고평가함으로써달성하였다. [0007] 발명의효과 본발명은별꽃이끼 (Star Reindeer Lichen) 추출물의제조시물, 유기용매혼합물에초음파추출법을병행함으 로써항산화활성및항염증활성이증대될뿐만아니라주름개선에뛰어난효과가있다. [0008] 도면의간단한설명 도 1 는본발명별꽃이끼 (Star Reindeer Lichen) 초음파용매추출물의시간에따른항산화효과를나타낸그래 프이다. 도 2는본발명별꽃이끼 (Star Reindeer Lichen) 초음파용매추출물 0.5%, 1.0%, 2.0% 의항산화효과를나타낸그래프이다. 도 3은본발명별꽃이끼 (Star Reindeer Lichen) 용매추출물 0.5%, 1.0%, 2.0% 의항산화효과를나타낸그래프이다. 도 4은본발명별꽃이끼초음파추출물 0.5%, 1.0%, 2.0% 의항염증효과를나타낸그래프이다. 도 5는본발명별꽃이끼초음파추출물 0.5%, 1.0%, 2.0% 의콜라겐합성능을나타낸그래프이다. [0009] [0010] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은항염증활성이있는별꽃이끼 (Star Reindeer Lichen) 초음파추출물의제조방법을제공한다. 본발명의추출물은물, 유기용매또는이들의혼합용매추출만으로도가능하다. 이때사용하는유기용매는에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 프로판디올등이다. 또, 상기추출물에의해수득되는추출액, 추출액의희석액또는농축액, 추출액을건조하여수득되는건조물또는추출액의조정제물또는정제물일수있다. 그러나, 본발명에있어서가장바람직하기는상기별꽃이끼추출물은음건한시료에프로판디올을가하고 ultrasonificator를사용하여추출하되온도를 40 로고정한후초음파처리하여제조하는것을특징으로한다. [0011] [0012] 본발명에있어서상기제조된별꽃이끼초음파추출물은화장료조성물총중량의 0.1 ~ 5중량 % 로바람직하게는 2중량 % 를함유하는것을특징으로한다. 0.1중량 % 이하에서는본발명의활성산소종저해효과가미흡하게나타나며, 5중량 % 이상사용하는경우최종제품에서고유풍미에따른고유취와색상이강하게나타나제품적용에어려움이있다. 본발명에따르면이끼류세포조직이단단하여초음파처리에의한세포막의붕괴 (rupture) 가반드시필요하였다. 또, 본발명과같이노화된피부손상에의한주름개선을위해서는세포물질중에서유효성분을추출하되별 - 4 -
도의용매제거가필요없으면서도극성용매의선택이필요하였다. [0013] [0014] [0015] [0016] 극성용매중에서가장바람직하기로는별도의용매제거공정없이세포물질의추출효율을극대화할수있는프로판디올 (propandiol) 을선택하였다. 본발명에따르면상기유기용매를첨가하고초음파를처리함에있어서플라보노이드물질이나폴리페놀성분의추출을극대화하고나아가단백질효소의열변성이없는온도 35 ~ 40 가가장바람직하였다. 본발명에따른피부보호효과를가지는화장료조성물은통상의제형을가질수있으며, 예를들어수용성리퀴드, 로션, 크림, 젤, 팩, 에센스, 수중유 (O/W), 유중수 (W/O) 형또는실리콘중수 (W/Si) 형의파우더로제형화될수있다. 이들각제형의조성물은그제형의제제화에필요하고적절한각종의기제와첨가물을함유할수있으며, 이들성분의종류와양은당업자에의해용이하게선정될수있다. 또한본발명에따른항산화효과, 함염증효과및주름개선효과를가지는별꽃이끼초음파용매추출물을함유한화장료조성물은통상적인사용방법에따라사용될수있으며, 사용자의피부상태또는취향에따라그사용횟수를달리할수있다. [0017] 이하, 본발명을실시예에의해보다상세하게설명한다. 그러나하기실시예는본발명을예시하기위한것에 불과하며, 본발명의범위를한정하는것으로의도되지않는다. [0018] [0019] < 실시예 > 본발명별꽃이끼프로판디올초음파추출물의제조음건된별꽃이끼 2 ~ 3 g에 40% 프로판디올 (propandiol) 40 ~ 60 ml를첨가한후 ultrasolificator(jac 4020, Jinwoo, Korea) 를이용하여온도를 35 ~ 40 이하로고정한후추출하여본발명별꽃이끼초음파추출물을얻었다. 모든과정은 1시간씩 3회반복하여실시하였으며상기추출한시료는 0.45 μm 막필터로여과한후효능시험을진행하였다. [0020] [0021] < 비교예 > 별꽃이끼프로판디올추출물의제조건조된별꽃이끼 2 ~ 3 g에 40% 프로판디올 (propandiol) 40 ~ 60 ml를첨가한후 40 에서추출여과하여유기용매추출물을얻었다. 모든과정은 1시간씩 3회반복하여실시하였으며상기추출한시료는 0.45 μm 막필터로여과한후효능시험을진행하였다. [0022] [0023] < 실험예 1> 별꽃이끼추출물의항산화활성실험 본실험예에서는피부섬유아세포 (HDFn) 를 DMEM(10% 혈청첨가, 1% 항생제포함 ) 배지에현탁하여 37, 5% CO 2 배양기에서배양한후대수기에서성장하는세포를실험에사용하였다. [0024] Well 당약 1 10 5 세포수가되도록 96 well 에각각접종한후상기실시예에따라제조된별꽃이끼초음파추 출물과비교예에따라제조된별꽃이끼열수추출물시료를 0.5%, 1% 및 2% 로처리한다음 37, 5% CO 2 배양기 에서 20분동안배양하였다. 산화스트레스유발물질인 H 2 O 2 1 mm을첨가하고 DCFH-DA (stock 20 mm) 20 μm를가한후 spectrofluorophotometer(excitation 485 nm, emission 535 nm) 로측정하여 37 에서 90분동안반응을관찰하였다. 시료를넣지않고활성산소종 (Reactive oxygen species) 의형성만측정한것을대조군으로정하고, 시료를넣어활성산소종을소거시키는시료처치군과비교하여활성산소종저해율을구하였다. 모든실험은 3번반복하였다. - 5 -
수학식 1 [0025] [0026] 실험결과, 도 1에나타낸바와같이본발명별꽃이끼의초음파추출물의항산화활성은시간이경과함에따라증가하였다. 또한, 도 2에나타낸바와같이별꽃이끼에유기용매를첨가하고초음파추출시최고농도 2% 일때 29% 저해하였으며, 이에비하여도 3에나타낸바와같이별꽃이끼유기용매추출시최고농도 2% 일때 19% 저해하였다. 따라서유기용매추출보다유기용매를첨가한초음파추출시약 10% 효능이더높게나타내었다. [0027] [0028] [0029] < 실험예 2> 본발명별꽃이끼초음파추출물의 Nitric Oxide 저해능실험본실험예에서는 Mouse macrophage cell인 RAW 264.7 cell에염증유발물질인 LPS(Lipopolysaccharide) 를인위적으로처리한후염증억제효과가있는지를평가하였다. 96 well plate에 well 당 2 10 5 cell이되도록분주한다음, 24시간동안 37, 5% CO 2 incubator에서배양하 였다. Overnight 하고새로운배지로교환한후 LPS(1ug/mL) 와추출물을농도별로투여하여 24 시간동안배양하 였다. 배양후, 배지상층액을취해 13,000 rpm 에서 3 분동안원심분리하여상등액만모아서 Griess 시약과 1:1 로반응시키고 570nm 에서흡광도를측정하였다. [0030] 실험결과, 도 4 에서나타낸바와같이본발명별꽃이끼초음파추출물은그농도가높을수록 Nitric Oxide 저 해활성이높았고특히추출물 2% 처리시대조군에비하여 10% 가저해되었다. [0031] [0032] < 실험예 3> 본발명별꽃이끼초음파추출물의콜라겐합성능실험 본실험예에서는피부섬유아세포 (HDFn) 를 48 well plate 에 5 10 4 cells/well 의농도로들어가도록배양배지 0.3 ml 로접종하여 37, 5% CO 2 에서 24 시간동안배양하였다. 그리고본발명별꽃이끼초음파추출물을농도 별로포함한새로운배지에서 24 시간동안더배양하였다. 배양액을모아서 enzymes-linked immunoassay kit(takara 사 ) 를이용하여콜라겐전구체의 C- 말단의양을측정하고콜라겐용액 (640 ng/ml) 을이용하여콜라 겐농도 0 ng 640 ng 사이의 standard curve 를얻어배지에있는콜라겐양을계산하였다. [0033] 실험결과, 도 5 에서나타난바와같이본발명별꽃이끼초음파추출물은그농도가증가할수록콜라겐합성능 도증가하였고특히초음파추출물 2% 처리시콜라겐합성능은 128% 증가하였다. [0034] 산업상이용가능성 이상설명한바와같이본발명은항염증효과가있는별꽃이끼유래의초음파추출물을제공하는효과가있으 므로화장품산업상매우유용한발명인것이다. - 6 -
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