(52) CPC 특허분류 A61K 8/97 ( ) A61Q 19/00 ( ) A23V 2200/318 ( ) (72) 발명자 김효진 대전광역시유성구가정로 175 ( 주 )LG 생활건강기술연구소 이상화 대전광역시유성구가정로 175 ( 주

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/29 ( ) A23L 1/30 ( ) A61K 8/97 ( ) A61Q 19/00 ( ) (52) CPC 특허분류 A61K 36/29 ( ) A23L 33/105 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2015 년 08 월 28 일 심사청구일자 없음 전체청구항수 : 총 21 항 (54) 발명의명칭피부개선용조성물 (11) 공개번호 (43) 공개일자 2017년03월08일 (71) 출원인 주식회사엘지생활건강 서울특별시종로구새문안로 58 ( 신문로 2 가 ) (72) 발명자 여혜린 대전광역시유성구가정로 175 ( 주 )LG 생활건강기술연구소 김도형 대전광역시유성구가정로 175 ( 주 )LG 생활건강기술연구소 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인다나 (57) 요약 본발명은피부개선용조성물에관한것이다. 본발명에따른모황련추출물은피부줄기세포증식촉진효과, 피부섬유아세포의콜라겐합성촉진효과, 멜라닌합성촉진효과, 자유라디칼소거효과, NO 생성억제효과, PPAR 알파의활성우수효과, 필라그린발현증가효과, 피부밝기개선효과를통해, 피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선용의약, 화장료또는식품제조에사용할수있다. 또한, 피부줄기세포의증식을촉진하고, 줄기세포성유지효과를나타내고있어줄기세포활성촉진용화장료제조에사용할수있다

2 (52) CPC 특허분류 A61K 8/97 ( ) A61Q 19/00 ( ) A23V 2200/318 ( ) (72) 발명자 김효진 대전광역시유성구가정로 175 ( 주 )LG 생활건강기술연구소 이상화 대전광역시유성구가정로 175 ( 주 )LG 생활건강기술연구소 - 2 -

3 명세서청구범위청구항 1 모황련추출물을유효성분으로포함하는피부재생용조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 모황련추출물은모황련을물및유기용매로이루어진군에서선택된하나이상으로추출하여얻은추출물인피부재생용조성물. 청구항 3 제2항에있어서, 유기용매는탄소수 1 내지 5의저급알코올, 에틸아세테이트, 또는아세톤을포함하는극성용매 ; 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산또는디클로로헥산을포함하는비극성용매 ; 또는이들의혼합용매인피부재생용조성물. 청구항 4 제 1 항에있어서, 조성물은피부재생용의약, 화장료또는식품제조를위한것인, 피부재생용조성물. 청구항 5 모황련추출물을유효성분으로포함하는피부탄력증진또는주름개선용조성물. 청구항 6 제5항에있어서, 조성물은피부탄력증진또는주름개선용의약, 화장료또는식품제조를위한것인, 피부탄력증진또는주름개선용조성물. 청구항 7 모황련추출물을유효성분으로포함하는피부미백용조성물. 청구항 8 제 7 항에있어서, 조성물은피부미백용의약, 화장료또는식품제조를위한것인, 피부미백용조성물

4 청구항 9 모황련추출물을유효성분으로포함하는항산화용조성물. 청구항 10 제 9 항에있어서, 조성물은항산화용의약, 화장료또는식품제조를위한것인, 항산화용조성물. 청구항 11 모황련추출물을유효성분으로포함하는항염증용조성물. 청구항 12 제 11 항에있어서, 조성물은항염증용의약, 화장료또는식품제조를위한것인, 항염증용조성물. 청구항 13 모황련추출물을유효성분으로포함하는아토피개선용조성물. 청구항 14 제 13 항에있어서, 조성물은아토피개선용의약, 화장료또는식품제조를위한것인, 아토피개선용조성물. 청구항 15 모황련추출물을유효성분으로포함하는피부보습용조성물. 청구항 16 제 15 항에있어서, 조성물은피부보습용의약, 화장료또는식품제조를위한것인, 피부보습용조성물. 청구항 17 모황련추출물을유효성분으로포함하는피부결개선용조성물. 청구항 18 제 17 항에있어서, - 4 -

5 조성물은피부결개선용의약, 화장료또는식품제조를위한것인, 피부결개선용조성물. 청구항 19 모황련추출물을유효성분으로포함하는줄기세포활성촉진용조성물. 청구항 20 제 19 항에있어서, 조성물은줄기세포증식촉진또는줄기세포성유지를위한것인, 줄기세포활성촉진용조성물. 청구항 21 제 19 항에있어서, 조성물은줄기세포활성촉진용화장료제조를위한것인, 줄기세포활성촉진용조성물. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습, 피부결개 선, 줄기세포활성촉진효과를나타내는피부개선용조성물에관한것이다. [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술콜라겐은피부의섬유아세포에서생성되는주요기질단백질로서세포외간질에존재하고, 중요한기능으로는피부의기계적견고성, 결합조직의저항력과조직의결합력, 세포접착의지탱, 세포분할과분화 ( 유기체의성장혹은상처치유시 ) 의유도등이알려져있다. 이러한콜라겐은연령및자외선조사에의한광노화에의해감소하며, 이는피부의주름형성과밀접한연관이있다고알려져있다. 또한, 근래에들어피부노화에대한광범위한연구가발전되면서피부에서의콜라겐의중요한기능이밝혀지고있다. 콜라겐합성을촉진하여주름개선효과를나타내는유효성분들이알려져있다. 예를들어, 레티노산 (retinoic acid), TGF(transforming growth factor)[ 비특허문헌 1], 동물태반유래의단백질 [ 특허문헌 1], 베튤린산 (betulinic acid)[ 특허문헌 2], 클로렐라추출물 [ 특허문헌 3, 4] 등이콜라겐합성촉진물질로서알려져있다. 그러나, 상기유효성분들은피부적용시자극과발적등의안전성의문제로사용량의제한이있거나, 효과가미미하여실질적으로피부의콜라겐합성을촉진하여피부기능을개선하는효과를기대할수없는문제점이있다. 한편, 생체외부로부터유입되거나, 생체내에서발생하는활성산소는생체의노화를촉진시키거나, 암을발생시키는등많은문제의원인이된다. 따라서활성산소에의한산화를억제하는항산화물질에대한개발및연구가많이이루어지고있다. 항산화물질은동, 식물계에널리분포되어있으며과일과채소에많은페놀성화합물, 플라보노이드, 토코페롤, 비타민 C, 셀레늄등이알려져있다. 다만, 천연에존재하는항산화물질은피부적용시실질적으로충분한효과를기대할수없는실정이다. 따라서, 항산화력이뛰어나고가격이저렴한합성항산화제가많이사용되고있으나, 인체부작용등안전성에대한우려로그사용이제한된다. 또한, 염증은상처나질병에반응하는인체의면역반응으로, 자외선이나활성산소, 자유라디칼등의산화적스트레스등이염증성인자를활성화시켜각종질병및피부의노화를일으킨다. 혈관활성폴리펩타이드인키닌 (kinin), 플라스민 (plasmin), 보체 (complement) 등이혈관확장과수축및주화성 (chemotaxis) 작용을하고, 그외에인터루킨-6(IL-6) 등과같은림포카인과아라키돈산 (arachidonic acid) 등이염증반응을담당한다. 아라키돈산은싸이클로옥시게나아제 (cyclooxygenase) 혹은리포옥시게나아제 (lipooxygenase) 의 2가지경로를거 - 5 -

6 쳐염증매개체인프로스타글란딘 (prostaglandin), 류코트리엔 (lukotriene) 들로대사되어다양한염증반응을 매개한다. [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] 한편, 염증을소실시키기위해염증원의제거, 생체반응및증상을감소시키는작용을하는것을항염제라한다. 현재까지항염의목적으로이용되고있는물질로는비스테로이드계로플루폐나믹산 (flufenamic acid), 이부프로펜 (ibuprofen), 벤지다민 (benzydamine), 인도메타신 (indomethacin) 등이있고스테로이드계통으로프레드니솔론 (prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone) 등이있다. 또한, 알란토인, 아즈엔, 하이드로코티손등이항염증에효과가있는것으로알려져있으나, 이들물질은피부에대한안전성의문제로사용량의제한이있거나, 효과가미미하여실질적으로염증완화효과를기대할수없는문제점이있다. 또한, 피부의최외각에위치하고있는표피 (epidermis) 는외부의다양한물리적, 화학적및기계적자극에대한방어와피부를통한체내수분의과도한발산을막는보호기능을수행하고있다. 이러한보호기능은각질형성세포로구성된각질층이정상적으로형성되고유지됨으로써가능하다. 각질형성세포는표피최하층 (stratum basale) 에서지속적으로증식하던기저세포 (basal cell) 가각질층 (stratum corneum) 으로이동하면서, 단계적으로형태및기능상의변화를거치며형성된세포이며, 일정기간이지나면오래된각질형성세포는피부에서탈락되고, 표피최하층으로부터올라온새로운각질형성세포가그기능을대신하는표피분화 (epidermis differentiation) 또는각화 (keratinization) 의과정을반복하게된다. 이러한각화과정에서각질형성세포는천연보습인자 (Natural Moisturizing Factor; NMF) 와세라마이드, 콜레스테롤및지방산과같은세포간지질을생성하여, 각질층이외부와의차단층역할을하게됨으로써피부장벽 (skin barrier) 로서의기능을보유하게된다. 또한, 현대사회의주요질환의하나로여겨지는피부건조증은피부장벽기능이상에의해야기되는증상의하나로, 최근, 환경오염, 아파트, 고층건물과같은건조한환경의증가, 사회적스트레스의증가, 우리나라특유의과도한목욕문화, 피부노화등과같은여러가지요인에의해점점더증가하고있으며, 증세가심하여치료를필요로하는경우또한지속적으로증가하고있다. 최근소아의 10% 에서발병하는아토피성피부염역시피부건조증, 보다근본적으로는피부장벽기능의이상을주요원인으로하는것으로알려져있다. 이러한아토피성피부염을치료하기위하여, 종래에는피부내적절한수분유지에중점을두어외부로부터수분을공급하거나체내로부터의수분손실을최소화하기위한연구가많이진행되어왔으며, 실제로수분보유능력이있는세라마이드 (ceramide) 또는그의유도체와같은보습제가개발되어제약또는화장품영역에서많이사용되고있다. 그러나, 이와같은보습제의사용은그대부분이근본적인치료이기보다는일시적인증상의완화에불과하여, 아토피성피부염을포함하는피부건조증및피부장벽기능이상의치료에대한충분한효과를나타내지못하고있다. 이에, 손상된피부장벽을근원적으로재생시켜주는물질의개발이시급한실정이다. 최근들어, 각질형성세포에존재하는 PPAR 알파 (Peroxisome Proliferator Activated Receptor-alpha) 가그리간드 (ligand) 와결합하여활성화되면, 각질형성세포의분화를촉진시켜손상된피부장벽을재구성하는효과가있다고알려졌다. 실제로공지된 PPAR 알파의작용제 (agonist) 인클로파이브레이트 (Clofibrate)[ 비특허문헌 2] 또는 WY14643[ 비특허문헌 3] 등을피부장벽이손상된피부에도포하는경우, 각질형성세포의분화가촉진되고피부장벽의회복이촉진됨이확인된바있다. 또한, 희고고운피부를갖고자하는것은모든사람의한결같은소망이다. 사람의피부내멜라닌 (melanin) 의농도와분포에따라유전적으로결정되나, 태양자외선이나피로, 스트레스등의환경적또는생리적조건에의해서도영향을받는다. 멜라닌은아미노산의일종인티로신 (tyrosine) 에티로시나제 (tyrosinase) 라는효소가작용하여도파 (DOPA), 도파퀴논 (dopaquinone) 으로바뀐후, 비효소적인산화반응을거쳐만들어진다. 이와같이멜라닌이만들어지는경로는알려져있으나, 티로시나제가작용하는이전단계인멜라닌합성을유도하는메커니즘이무엇인지에대해서는아직도자세히밝혀지지않고있다. 한편, 일반적인알려진미백성분으로서, 코지산 (Kojic acid), 알부틴 (Arbutin) 등과같은티로시나제효소활성을억제하는물질, 하이드로퀴논 (Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid) 및이들의유도체와각종식물추출물이있다. 이들은멜라닌색소의합성을저해함으로써, 피부톤을밝게하여피부미백을실현할수있을뿐만아니라, 자외선, 호르몬또는유전에기인한기미나주근깨등의피부과색소침착증의개선이가능하다. 그러나피부적용시, 자극과발적등의안전성의문제로사용량의제한이있거나, 효과가미미하여실질적인효과를기대할수없는문제점이있다. 또한, 피부표면의형태인피부결은미세한선에의해형성된 3차원미세구조를특징으로하며연령별 부위별 - 6 -

7 로유의하게다르다. 피부결은선의깊이에따라 1 차 ( 약 μm), 2 차 ( 약 5-40 μm), 3 차 ( 약 0.5 μm) 라인 으로구분되며, 좋은피부일수록각라인들이그물형태의네트워크구조를이루며선들이만나서생기는다각형 과별모양 (star formation) 이뚜렷하다는특징을지니고있다 [ 비특허문헌 4]. [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] 그러나나이가들어감에따라또는피부가손상됨에따라촘촘하던미세라인의네트워크구조가무너져미세라인 (2차, 3차등 ) 은사라지고 1차라인은더욱깊어져주름이생성되는것으로알려져있다 [ 비특허문헌 5,6]. 즉, 피부가노화됨에따라나타나는대표적인징후인주름은이미장기간에걸쳐일어나는미세한변화의축적이다. 발생학적으로사람피부의모든구성성분은외배엽이나중배엽에서유래되는것으로알려져있다. 표피, 모낭, 피지선및땀샘선등은외배엽에서기원하며, 멜라닌세포, 신경및특수감각수용체는신경외배엽에서유래된다. 발생학적시기에따라배아의줄기세포는분화를거듭하여각각의조직기능에맞는특성의세포가되고, 성체가된후에도일정수의줄기세포는조직에남게되는데피부에서는주로두곳에줄기세포들이존재한다. 첫째는모낭 (hair follicle) 에존재한다. 이곳은세포분화가일어나기전의세포로표피의재생과관련해중요한역할을담당하는것으로알려져있으며, 털의재생과성장에도중요한역할을수행하고있다. 둘째는표피의기저층 (the basal layer of epidermis) 이다. 이곳에자리하고있는줄기세포는표피는물론진피층의섬유아세포까지관장하여피부건강을지키는중요한역할을수행하고있음이밝혀졌다. 이곳의줄기세포는상대적으로양이많고쉽게얻을수있다는장점이있어피부줄기세포연구에널리사용되고있다. 피부는지속적으로재생 (renew) 되며, 피부의상피에존재하는줄기세포즉, 피부의상피줄기세포 (epidermal stem cells) 는상처후상피의복구에관여한다 [ 비특허문헌 7]. 상기피부의상피줄기세포는피부줄기세포 (skin stem cells) 로도칭해지며, 상기피부줄기세포를활성화시킬경우, 외상등의피부상처를치료하거나상처치료를촉진할수있으며피부의주름완화또한기대할수있다. 피부줄기세포의지표로는인테그린β1(integrin β1) 및인테그린 α 6(integrin α6) 이사용되고있고, 상피형태형성및분화에필요한피부줄기세포의유지는 p63 단백질에의해조절된다고보고되고있다. 피부줄기세포는피부의건강과생리학적및생화학적인항상성을유지하는데중요한역할을수행한다. 피부에존재하는줄기세포도노화의영향으로인하여기능에이상이발생하게되고, 이에따라피부의항상성이깨지면서여러가지문제가발생된다. 따라서이러한줄기세포의활성을통하여피부노화의여러현상을개선할수있을것이다 [ 비특허문헌 8]. 또한, 생체에안전하고, 유효성분이안정하며, 무엇보다도기존의피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선효과가있는물질보다효과가우수한피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선활성을지닌성분의개발이절실히요망되고있다. 한편, 모황련 ( 선황련또는깽깽이풀 ) 은학명이 Jeffersonia dubia Benth. et Hook. 또는 Plagiorhegma dubium Maxim인매자나무과 (Berberidaceae) 식물로서, 뿌리부위가약재로사용되며, 우리나라중부, 북부지방및중국의동북부지역에분포한다. 주성분으로는알칼로이드와사포닌등을함유하며, 대표적인알칼로이드로는베르베린 (Berberin), 팔마틴 (Palmatine) 등을언급할수있다. 모황련은오래전부터한방에서사용해오던재료로서체내섭취에따른인체안전성이이미확인되어있으며, 피부및점막에대한자극도거의없는극히안전한식물이다. 또한, 동의치료에서모황련은염증약, 진정약으로신경불안, 충혈및염증등에효과를나타내며, 고미건위약으로소화불량증, 위염에도효과가있을뿐아니라, 강한억균작용도나타내는것으로알려져있다 ( 참조 : " 약초의성분과이용 ", 일월서각 ). 선행기술문헌 [0021] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 일본특개평 호 ( 특허문헌 0002) 일본특개평 호 ( 특허문헌 0003) 일본특개평 호 ( 특허문헌 0004) 일본특개평 호 - 7 -

8 [0022] 비특허문헌 ( 비특허문헌 0001) Cardinale G. et al, Adv. Enzymol., 41, p. 425, 1974 ( 비특허문헌 0002) Feingold 외, J. Invest. Dermatol., 110, pp , ( 비특허문헌 0003) Feingold 외, J. Invest. Dermatol., 115, pp , ( 비특허문헌 0004) Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 12: , 1999 ( 비특허문헌 0005) The British journal of dermatology. 110: , 1984 ( 비특허문헌 0006) Skin research and technology.5: , 1999 ( 비특허문헌 0007) Epidermal Stem Cells of the Skin, Cedric Blanpain, Elaine Fuchs, Annual Review of Cell and Developmental Biology, November 2006, Vol. 22, Pages ( 비특허문헌 0008) Human skin stem cells and the ageing process, Catherin Niemann, Stem Cell Aging and Regenerative Medicine, November 2008, Pages 발명의내용 [0023] [0024] [0025] 해결하려는과제이에, 본발명자들은모황련추출물이피부줄기세포의증식을촉진하여피부재생을촉진시키고, 피부의섬유아세포의콜라겐합성을촉진하여주름을개선하며탄력을증진시키고, 멜라닌합성을억제하여미백효과를나타내고, 자유라디칼을소거하여항산화효과를나타내며, NO 생성을억제하여항염증효과가있으며, PPAR 알파의활성도우수하여아토피개선효과가있으며, 필라그린발현증가로인한피부보습개선효과를나타내며, 피부밝기개선으로인한피부결개선효과와더불어, 피부줄기세포의증식을촉진하고, 줄기세포성유지효과를나타내고있어줄기세포활성촉진효과를확인함으로써본발명을완성하게되었다. 따라서, 본발명의목적은모황련추출물을유효성분으로포함하는피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선용조성물을제공하는데있다. 또한, 본발명의다른목적은하기모황련추출물을유효성분으로포함하는줄기세포활성촉진용조성물을제공하는데있다. [0027] 과제의해결수단상기과제를해결하기위한수단으로서, 본발명은의약, 화장료또는식품제조를위한, 모황련추출물을유효성분으로포함하는피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선용조성물을제공한다. [0029] 상기과제를해결하기위한다른수단으로서, 본발명은화장료제형제조를위한, 모황련추출물을유효성분으 로포함하는줄기세포활성촉진용조성물을제공한다. [0031] 발명의효과본발명에따른모황련추출물은피부줄기세포의증식을촉진하여피부의재생을촉진시키고피부의섬유아세포의콜라겐합성을촉진하여주름을개선하며탄력을증진시키고, 멜라닌합성을억제하여미백효과를나타내고, 자유라디칼을소거하여항산화효과를나타내며, NO 생성을억제하여항염증효과가있으며, PPAR 알파의활성도우수하여아토피개선효과가있으며, 필라그린발현증가로인한피부보습개선효과와더불어, 피부밝기개선으로인한피부결개선효과를나타냄으로써, 의약, 화장료또는식품제조에사용할수 - 8 -

9 있다. [0032] 또한, 모황련추출물은피부줄기세포의증식을촉진하고, 줄기세포성유지효과를나타내고있어줄기세포활성 촉진용화장료제형제조에사용할수있다. [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명의구성을구체적으로설명한다. 피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선성분이실제피부에적용시우수한효과를발휘하기위해서는저농도에서고활성의피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선활성을나타내고, 피부를투과하여흡수되는능력이우수하고, 피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선효과를나타내기에충분한시간동안머무를수있도록휘발성이낮고, 조성물이나피부상에서활성성분이안정하게유지되고, 의약, 화장료또는식품등으로의제조가용이하며, 또한피부에안전한것이바람직하다. 그러나, 공지의성분중상기특성을모두만족시키는성분은흔치않다. 예를들어, 몇몇피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선성분들은시험관내실험시저농도에서도피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선활성은우수하나, 피부를투과하여흡수되는능력이떨어져실제피부에적용하기엔어렵다. 또다른활성성분들은친수성이낮아의약이나화장품, 식품으로제형화가어렵다. 또한, 몇몇피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선성분들은열, 광, 또는산소에노출되었을때상기활성성분이분해되거나다른화합물로변형되어피부에적용하기전에이미효과가사라지는경우도있다. 하기실시예에서확인할수있는바와같이, 모황련추출물은저농도에서월등히우수한피부줄기세포의증식촉진효과, 콜라겐합성촉진효과, 멜라닌생성저해효과, 항산화효과, 항염증효과, PPAR 알파활성효과, 필라그린발현효과, 피부밝기개선효과를나타내므로피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선을위한의약, 화장료또는식품조성물의유효성분으로사용할수있다. 따라서, 본발명은모황련추출물을유효성분으로포함하는피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선용조성물을제공한다. 본발명에서모황련은학명이 Jeffersonia dubia Benth. et Hook. 또는 Plagiorhegma dubium Maxim인매자나무과 (Berberidaceae) 식물로서, 선황련또는깽깽이풀로도불리운다상기모황련추출물은당업계에공지된방법에의해추출될수있으며, 그방법은특별히한정되지않는다. 또는, 시판되고있는추출물을이용할수있다. 바람직하기로는상기모황련추출물은모황련을물및 / 또는유기용매로추출하여수득한추출물을사용할수있으며, 상기유기용매는극성유기용매, 비극성유기용매또는이들의혼합용매일수있다. 상기극성유기용매는탄소수 1 내지 5의저급알코올, 에틸아세테이트또는아세톤일수있으며, 비극성유기용매는에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산또는디클로로메탄일수있다. 예를들어, 상기탄소수 1 내지 5의저급알코올은메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올또는이소프로판올일수있다. 한구체예에서상기모황련추출물은전술한추출용매를이용하여추출된 1차추출물을극성이다른추출용매를이용하여분획한분획물을포함할수있다. 예를들어, 모황련추출물은탄소수 1 내지 5의알코올로추출한후, 에테르, 벤젠, 헥산등의극성이다른용매로다시분획한분획물일수있다. 상기분획시용매는 2종이상사용할수있으며, 용매의극성에따라순차적으로사용하거나혼합하여사용하여, 각용매추출물을제조할수있다. 본발명에서, 상기제조된추출물또는상기분획과정을수행하여수득한분획물에대해여과하거나농축또는건조과정을수행하여용매를제거할수있으며, 상기여과, 농축및건조를모두수행할수있다. 구체적으로상기여과는여과지를이용하거나감압여과기를이용할수있고, 농축은감압농축기등을이용하여감압농축할수있으며, 건조는동결건조법을수행할수있다

10 [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] 또한, 상기제조된추출물또는상기분획과정을수행하여수득한분획물에대해실리카겔컬럼크로마토그래피 (silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피 (thin layer chromatography) 또는고성능액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography) 등의다양한크로마토그래피를이용하여정제함으로써추가로정제된분획을얻을수있다. 본발명의조성물은의약제형제조를위해사용할수있다. 상기의약제형은오일또는수성매질중의용액, 현탁액또는유화액의형태이거나, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제또는캅셀제의형태일수있다. 또한, 상기조성물은추가로동일또는유사한기능을나타내는유효성분을 1종이상함유할수있다. 예컨대, 공지의피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선성분을포함할수있을것이다. 추가적인피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선성분을포함하게되면본발명의조성물의피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선효과는더욱증진될수있을것이다. 상기성분추가시에는복합사용에따른피부안전성, 제형화의용이성, 유효성분들의안정성을고려할수있다. 본발명의한구체예에서, 상기조성물은당업계에공지된피부재생성분으로서, 레티노산, TGF, 동물태반유래의단백질, 베튤린산및클로렐라추출물, 당업계에공지된항산화성분으로서, 토코페롤, 셀레늄, 비타민 C 및페놀성화합물, 당업계에공지된미백성분으로서, 코지산 (Kojic acid), 알부틴 (Arbutin) 등과같은티로시나제효소활성을억제하는물질, 하이드로퀴논 (Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid) 및이들의유도체와각종식물추출물로구성되는군으로부터선택되는 1종또는 2종이상의성분을추가로포함할수있다. 추가의성분은전체조성물중량에대하여 중량 % 내지 10 중량 % 로포함될수있을것이며, 상기함량범위는피부안전성, 상기모황련추출물의제형화시의용이성등의요건에따라조절될수있을것이다. 또한, 본발명의조성물은약학적으로허용가능한담체를더포함할수있다. 약학적으로허용가능한담체는완충액, 주사용멸균수, 일반식염수또는인산염완충식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염및폴리솔베이트등과같은여러성분을함유할수있다. 본발명의조성물은경구또는비경구로투여할수있으며, 일반약학제제의형태, 예를들어, 임상투여시경구및비경구의여러가지제형으로투여될수있는데, 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제될수있다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는본발명의의약조성물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는락토오스 (Lactose), 젤라틴등을섞어조제될수있다. 단순한부형제이외에마그네슘스티레이트탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴등이사용될수있다. 본발명에있어서, ' 피부재생효과 ' 라함은피부줄기세포의활성이촉진됨에따라, 피부외부및내부원인에의한손상에대하여피부조직이회복되는것을말한다. 이때, 상기외부원인에의한손상은자외선, 외부오염물질, 창상또는외상등을들수있으며, 상기내부원인에의한손상은스트레스등을들수있다. 본발명에있어서, ' 주름개선효과 ' 라함은피부에주름이생성되는것을억제또는저해하거나, 이미생성된주름을완화시키는것을말한다. 본발명에있어서, ' 탄력증진효과 ' 라함은피부에대한탄력성이증가되는것으로, 피부탄력의손실을억제또는저해하거나, 이미감소된탄력을완화시키는것을말한다. 본발명에있어서, ' 미백효과 ' 라함은멜라닌색소의합성을저해함으로써피부톤을밝게할뿐만아니라, 자외선, 호르몬또는유전에기인한기미나주근깨등의피부과색소침착을개선하는것을말한다

11 [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] 본발명에있어서, ' 항산화효과 ' 라함은세포내대사또는자외선의영향으로인한산화적스트레스에따라반응성이높은자유라디칼 (free radical) 또는활성산소종 (reactive oxygen species;ros) 에의한세포의산화를억제하는것을말하며, 자유라디칼또는활성산소종을제거하여이로인한세포의손상이감소되는것을포함한다. 본발명에있어서, ' 항염증효과 ' 라함은염증을억제하는것을말하며, 상기염증은어떤자극에대한생체조직의방어반응의하나로, 조직변질, 순환장애와삼출, 조직증식의세가지를병발하는복잡한병변을말한다. 보다구체적으로염증은선천성면역의일부이며다른동물에서처럼인간의선천성면역은병원체에특이적으로존재하는세포표면의패턴을인식한다. 식세포는그런표면을가진세포를비자기로인식하고병원체를공격한다. 만일병원균이신체의물리적장벽을깨고들어온다면염증반응이일어난다. 염증반응은상처부위에침입한미생물들에대한적대환경을만드는비특이적인방어작용이다. 염증반응에서, 상처가나거나외부감염체가체내로들어왔을때, 초기단계면역반응을맡고있는백혈구들이몰려들어사이토카인을발현한다. 따라서세포내사이토카인의발현양이염증반응활성화의지표가된다. 염증과관련된피부질환의예로는아토피피부염, 건선, 방사선, 화학물질, 화상등에의해촉발되는홍반성질환, 산화상, 수포성피부병, 태선모양종류질환, 알레르기에기한가려움증, 지루성습진, 장미여드름, 심상성천포창, 다형삼출성홍반, 결절홍반, 귀두염, 음문염, 원형탈모증과같은염증성모발손실, 피부 T-세포림프종등이있으나이에제한되는것은아니다. 본발명에있어서, ' 아토피개선효과 ' 라함은아토피, 피부건조증과같은피부질환예방및치료효과를나타내는것으로, 아토피증상을억제또는저해하거나, 완화시키는것을말한다. 본발명에있어서, ' 보습효과 ' 라함은피부의수분이감소되는것을저해또는억제하거나피부의수분함유량을증가시켜피부표면을매끄럽게하며, 윤기를부여하는것을말한다. 본발명에있어서, ' 피부결개선효과 ' 라함은노화, 스트레스등의영향으로피부표면이거칠어지는것을억제또는저해함으로써피부표면을매끄럽게하고, 광택을부여하며, 피부톤을밝게개선하는것을말한다. 본발명에있어서, ' 유효량 ' 이라함은손상된피부의재생을촉진하거나, 주름을개선하거나, 탄력을증진시키거나, 미백효과를나타내거나, 세포의산화를억제또는완화하거나, 염증을억제하거나, 아토피와같은피부건조증을개선하거나, 보습효과나, 피부결을개선할수있는추출물의양을의미한다. 본발명의조성물이유효량의상기모황련추출물을포함할때바람직한피부재생효과, 주름개선효과, 탄력증진효과, 피부미백효과, 항산화효과, 항염증효과, 아토피개선효과, 보습효과및피부결개선효과를제공할수있다. 본발명의조성물에포함되는상기모황련추출물의유효량은조성물이제품화되는형태, 상기화합물이피부에적용되는방법및피부에머무르는시간등에따라달라질것이다. 예컨대, 상기조성물이약학제형으로제품화되는경우에는일상적으로피부에적용하게되는화장품으로제품화되는경우에비해높은농도로상기모황련추출물을포함할수있을것이다. 따라서, 일일투여량은상기모황련추출물의양을기준으로 0.1 내지 100 mg / kg이고, 바람직하게는 30 내지 80 mg / kg이고, 더욱바람직하게는 50 내지 60 mg/kg이며, 하루 1 6 회투여될수있다. 본발명의조성물은단독으로, 또는수술, 방사선치료, 호르몬치료, 화학치료및생물학적반응조절제를사용하는방법들과병용하여사용할수있다. 본발명의의약제형은피부외용제제형을포함할수있다. 상기모황련추출물을피부외용제로사용하는경우, 추가로지방물질, 유기용매, 용해제, 농축제및겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형또는비이온형유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제및킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성또는친유성활성제, 지질소낭또는피부용외용제에통상적으로사용되는임의의다른성분과같은피부과학분야에서통상적으로사용되는보조제를함유할수있다. 또한상기성분들은피부과학분야에서일반적으로사용되는양으로도입될수있다. 상기모황련추출물이피부외용제제형으로제공될경우, 이에제한되는것은아니나, 연고, 패취, 겔, 크림또는분무제와같은제형을가질수있다. 또한, 본발명의피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선용조성물은화장료제형제조를위해사용될수있다

12 [0068] [0069] [0070] 상기화장료제형은일반적인유화제형및가용화제형의형태일수있다. 예컨대, 유연화장수또는영양화장수등과같은화장수, 훼이셜로션, 바디로션등과같은유액, 영양크림, 수분크림, 아이크림등과같은크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선스크린, 메이크업베이스, 액체타입, 고체타입또는스프레이타입등의파운데이션, 파우더, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징오일과같은메이크업제거제, 클렌징폼, 비누, 바디워쉬등과같은세정제등의제형을가질수있다. 또한, 상기화장품은모황련추출물에추가로지방물질, 유기용매, 용해제, 농축제및겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형또는비이온형유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제및킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성또는친유성활성제, 지질소낭또는화장품에통상적으로사용되는임의의다른성분과같은화장품학분야에서통상적으로사용되는보조제를함유할수있다. 상기화장료제형은유효성분이단기간내에피부에머무르게되는메이크업제거제, 세정제등과같은워쉬-오프 (wash-off) 타입의화장품의경우에는비교적높은농도의상기모황련추출물을포함할수있을것이다. 반면, 유효성분이장기간동안피부에머무르게되는화장수, 유액, 크림, 에센스등의리브-온 (leave-on) 타입의화장품의경우에는워쉬-오프타입의화장품에비해낮은농도의상기모황련추출물을포함해도무방할것이다. 이에제한되는것은아니나, 본발명의한구체예에서, 상기조성물은상기모황련추출물을전체조성물중량에대하여 중량 % 내지 10 중량 %( 바람직하게는 중량 % 내지 1 중량 %) 로포함할수있다. 본발명의조성물이상기모황련추출물을 중량 % 미만으로포함할경우에는충분한피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선효과를기대할수없고, 10 중량 % 를초과하여포함할경우에는알러지등원치않는반응이발생하거나피부안전성에문제가있을수있으므로이를방지하기위한것이다. [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] 또한, 본발명의피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선용조성물은식품제형제조를위해사용될수있다. 상기식품제형은상기모황련추출물을음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류등의식품소재에첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액등으로제조한식품을의미한다. 상기식품제형은일상적으로섭취하는것이가능하기때문에높은피부재생, 주름개선, 탄력증진, 피부미백, 항산화, 항염증, 아토피개선, 피부보습및피부결개선효과를기대할수있어매우유용하다. 상기모황련추출물을식품첨가물로사용하는경우, 상기모황련추출물을그대로첨가하거나다른식품또는식품성분과함께사용될수있고, 통상적인방법에따라적절하게사용될수있다. 유효성분의혼합양은그의사용목적 ( 예방, 건강또는치료적처치 ) 에따라적합하게결정될수있다. 일반적으로, 식품또는음료의제조시에본발명의조성물은원료에대하여 15 중량부이하, 바람직하게는 10 중량부이하의양으로첨가된다. 그러나, 건강및위생을목적으로하거나또는건강조절을목적으로하는장기간의섭취의경우에는상기양은상기범위이하일수있으며, 안전성면에서아무런문제가없기때문에유효성분은상기범위이상의양으로도사용될수있다. 상기식품의종류에는특별한제한은없다. 상기물질을첨가할수있는식품의예로는육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를포함한낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료및비타민복합제등이있으며, 통상적인의미에서의건강식품을모두포함한다. 식품제형이음료인경우, 통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물은포도당, 과당과같은모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와같은디사카라이드, 및덱스트린, 사이클로덱스트린과같은폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알코올이다. 감미제로서는타우마틴, 스테비아추출물과같은천연감미제나, 사카린, 아스파르탐과같은합성감미제등을사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 g, 바람직하게는약 g 이다. 상기외에식품제형은여러가지영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에사용되

13 는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에식품제형은천연과일주스, 과일주스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는혼합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은크게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] 본발명은또한, 상기모황련추출물을유효성분으로포함하는줄기세포활성촉진용조성물을제공한다. 본발명에서용어 줄기세포 는스스로세포분열을할수있고, 매우다양한형태의특이세포타입 (specific cell type) 으로분화할수있는능력을갖는세포이다. 이러한줄기세포의종류는특별히제한되지않으며, 한구체예에서, 상기줄기세포는피부줄기세포일수있다. 상기 피부줄기세포 는피부 ( 표피, 진피및피하지방층 ) 를이루는세포로분화될수있는줄기세포를의미한다. 상기피부를이루는세포는표피에존재하는케라티노사이트 (keratinocyte), 멜라노사이트 (melanocyte) 및진피에존재하는섬유아세포 ( 콜라겐및엘라스틴의생합성을주로담당 ) 를포함한다. 상기피부줄기세포의종류는특별히제한되지않는다. 본발명에서사용되는피부줄기세포는그것이어디로부터유래한것인지관계없이이용될수있다. 예를들어, 피부줄기세포는공지의피부줄기세포공급원, 예를들어, 모낭또는표피의기저층에서얻을수있으며, 채취대상인동물은포유동물일수있다. 한구체예에서, 포유동물은인간, 마우스, 랫트, 기니어피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개또는고양이를포함할수있지만, 이에한정되는것은아니다. 바람직하게포유동물은인간일수있다. 이러한, 피부줄기세포공급원으로부터피부줄기세포를수득하는방법에대해서는당업계에서잘알려져있다. 본발명에있어서, ' 줄기세포활성촉진효과 ' 라함은줄기세포증식촉진효과, 및 / 또는줄기세포의특이적지표분자및자가분열적성질인줄기세포성을유지하는효과를포함하는것을말한다. 또한, 본발명의조성물은화장료제형제조를위해사용될수있다. 이러한화장료제형에대해서는앞서모황련추출물을포함하는화장료제형에관한설명에기재된내용과동일하다. [0086] 이하, 본발명을실시예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의 내용이하기실시예에한정되는것은아니다. [0088] [0089] 제조예 1: 모황련추출물의제조모황련을세척하고, 분말화한뒤, 10 배량의에탄올용매에서 5일간냉침한후추출원액을여과, 농축한엑기스를얻었다. 여기에정제수및에탄올의혼합용액을첨가하여용해시킨다음여과하여최종추출물을제조하였다. [0091] [0092] 제조예 2: 무혈청배지조건에서피부줄기세포의배양 Cellntec 사에서구입한인간피부줄기세포 (Human epidermal stem cell) 를 48-웰플레이트 ( cells/well) 에, 소태아혈청 (fetal bovine serum) 과유사한 BPE(Bovine pituitary extract) 가첨가된 CNT-57 배지 (Cellntec 사 ) 를이용하여 24 시간동안 5% CO 2 및 37 조건에서배양하였다. 그후, 배양액을흡입관을통하여제거한 다음, PBS 용액 (GibcoBRL 사 ) 을이용하여배지성분을제거하고, BPE 가포함되지않은 CNT-57 배지에모황련추 출물 5ug/ml 을처리하여 5% CO 2 및 37 조건에서 72 시간동안배양하였다. [0094] [0095] 실험예 1: CCK-8 평가법을통한피부줄기세포증식촉진효과상기제조예 2에서배양된피부줄기세포에 CCK-8(Cell counting kit-8) 평가를실시하였다. CCK-8 평가는세포내전자전달계내의탈수소효소 (Dehydrogenase) 가테트라졸리움염 (Tetrazolium Salt) 를분해하여생성하는포르마잔 (Formazan) 의흡광도를측정하여살아있는세포의밀도를간접적으로나타내는분석방법이다

14 [0096] [0097] [0098] 세포에 CCK-8 용액 ( 배지부피의 1/10을처리 ) 을 37 에서 2 시간동안처리한후, 파장 450 nm에서의흡광도를측정함으로써분광학적으로측정하였다. 모황련추출물의피부줄기세포의증식촉진효과는측정된흡광도값으로부터대조군 (BPE 첨가한 CNT-57 배지 ) 대비하기수학식 1에따라증식율 (%) 을구하고, 그값을하기표 1에나타냈다. [ 수학식 1] 증식율 (%) = ( 시료처리군의흡광도 / 대조군의흡광도 ) 100 [0099] 표 1 피부줄기세포의증식촉진효과 첨가시료 농도 대조군대비세포증식율 (%) 모황련추출물 5ug/ml 139% 대조군 - 100% [0100] 표 1 에나타난바와같이, 모황련추출물을처리한배지조건에서의피부줄기세포는우수한증식촉진효과를나 타내었다. [0102] [0103] [0104] 실험예 2: 피부줄기세포의줄기세포성 (stemness) 유지효과확인상기제조예 2에서배양된피부줄기세포의줄기세포성유지효과확인을위해 p63 발현정도를평가하였다. p63 은세포내전사인자로서피부줄기세포의유지마커로잘알려져있다. 세포의 RNA를분리하여 cdna를합성한다음, Taqman 염색액으로실시간-PCR을수행하여 p63의발현정도를측정하였다. 본실험에서 RNA의농도는 S16 리보솜 RNA로표준화하였다. 상기실험결과는하기표 2에나타내었다. 하기표 2에서 p63 증가배수의수치는대조군 (BPE 첨가한 CNT-57 배지 ) 대비배수를의미한다. [0105] 표 2 줄기세포성 (stemness) 유지효과 ( 반복수 = 3) 첨가시료 농도 p63 증가배수 ( 배 ) 모황련추출물 5 μg /ml 2.41 대조군 [0106] 표 2 에나타난바와같이, 모황련추출물을처리한배지조건은피부줄기세포의 p63 발현을촉진하여줄기세포 성유지효과가우수하다. [0108] [0109] [0110] 실시예 1: 콜라겐합성촉진효과모황련추출물을인간유래의섬유아세포의배양액에첨가하여세포수준에서콜라겐합성촉진효과를실험하였다. 생합성된콜라겐의측정은 PICP EIA kit (Procollagen Type I C-Peptide Enzyme ImmunoAssay KIT) 를이용하여정량하였다. 모황련추출물을최종농도 10 μg /ml, 20 μg /ml가되도록하여비타민 C와대조군 ( 무첨가 ) 과함께각각인간유래의섬유아세포 ( cells/cm 2 ) 의배양배지에첨가하여 1일간배양한후, 배양액을취하여 PICP EIA Kit로각농도에서콜라겐생합성정도를분광광도계를이용하여 450 nm에서측정하였다. 콜라겐생합성능은대조군에대한상대적인합성능으로증가율을계산하고결과를하기표 3에정리하였다. 표

15 [0111] 농도에따른콜라겐합성촉진효과 ( 반복수 = 3) 첨가시료 적용농도 ( μg /ml) 대조군대비콜라겐합성증가율 (%) 모황련추출물 10 μg /ml 32.4% 모황련추출물 20 μg /ml 55.3% 비타민 C 50 μg /ml 36.5% [0112] 표 3 에나타난바와같이, 모황련추출물은인간유래의섬유아세포에대하여우수한콜라겐합성능이있으며, 일반적으로콜라겐합성능력이있는것으로알려진비타민 C 를적용한경우보다적은농도로더우수한콜라겐 합성효과를얻을수있음을알수있다. [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] 실시예 2: 미백효과-멜라닌생성저해효과확인모황련추출물을쥐의멜라노마세포 (B-16 mouse melanoma cell) 의배양액에첨가하여세포수준에서의미백효과를실험하였다 (Lotan R., Lotan D. Cancer Res. 40: , 1980). 이때, 실험전쥐의멜라노마세포에대하여독성을평가하여독성이없는농도를선정하여미백평가를수행하였다. 모황련추출물을배양액에최종농도가 10 μg /ml, 20 μg /ml이되도록하여실험하였으며, 대조군인알부틴은 200 μg /ml가되도록배지에첨가하여각각 B-16 멜라노마세포에처리하여 3일간배양하였다. 이후, 세포들을트립신 (trypsin) 처리하여배양용기로부터떼어내원심분리한후멜라닌을추출하였다. 떼어낸세포는수산화나트륨용액 (1N) 1 ml를가하여 10분간끓여멜라닌을녹이고분광광도계를이용하여, 400 nm에서흡광도를측정하여생성된멜라닌의양을측정하였다. 상기멜라닌양은단위세포수당 (10 6 cell) 의흡광도로나타내는방법으로측정하였으며, 대조군에대한상대적인멜라닌생성량을저해율 (%) 로계산하고결과를하기표 4에정리하였다. [0119] 표 4 농도에따른세포수준에서의멜라닌생성저해효과 ( 반복수 = 3) 시료 저해율 (%) 대조군 ( 무첨가 ) - 대조군 1: 알부틴 (200 μg /ml) 36.4 모황련추출물 (20 μg /ml) 46.8 모황련추출물 (10 μg /ml) 37.7 [0120] 표 4 에나타난바와같이, 모황련추출물은기존에알려진미백물질인알부틴과비교할때배양된쥐의멜라노 마세포에대하여월등히우수한멜라닌생성억제능이있음을알수있다. [0122] [0123] [0124] 실시예 3: 항산화효과- 자유라디칼소거율모황련추출물의항산화작용을확인하기위해자유라디칼소거활성을측정하였다. 자유라디칼소거활성은 DPPH를이용하여측정하였다. DPPH는시그마사 (Sigma Co., Ltd, 미국 ) 에서구입하여사용하였다. 먼저, 1.5 mm(0.06 mg/ml) 의표준 DPPH 에탄올용액을만들었다. 그리고, 모황련추출물과기준물질로항산화제인아스코르빈산에각각에탄올을가하여 50 μg /ml, 25 μg /ml, 12.5 μg /ml, 6.25 μg /ml, μg /ml의농도로시료를만들었다. 그다음, 상기시료와표준 DPPH 용액을같은비율로첨가하여잘교반한후, 37 에서 30 분간반응시키고 520 nm에서흡광도를측정하였다. 이때, 상기시료대신에탄올을첨가한것을대조군으로하였다. 자유라디칼소거능은 half maximal inhibitory concentration( 억제중간값 ) 인 IC 50 을구하여그결과를 하기표 5 에나타내었다. IC 50 은무첨가대조군의자유라디칼을 50% 제거하는데필요한아스코르빈산및모황련 추출물의농도로서자유라디칼소거능을표현하는일반적인방법이다

16 [0125] 표 5 자유라디칼소거율 (IC 50 ) 시료 자유라디칼소거율 ( μg /ml) 아스코르빈산 4.5 모황련추출물 5.5 [0126] 표 5 에나타난바와같이, 모황련추출물은기존에알려진항산화물질인아스코르빈산과비교할때높은활성 을보이므로항산화효과가있음을알수있다. [0128] [0129] [0130] 실시예 4: 항염증효과-NO 생성억제효과모황련추출물의항염증효과및피부트러블완화효과를확인하기위하여, RAW264.7 세포주 (ATCC number: CRL- 2278) 를이용한 GRIESS 법으로 nitric oxide(no) 형성억제력실험을실시하였다. 구체적으로, 생쥐의대식세포인 RAW264.7 세포를수차례계대배양하고, 웰하나에 개씩들어가도록 24-웰프레이트에넣은후, 24 시간동안배양시켰다. 이어서, 하기표 6에나타난농도로모황련추출물을희석하여함유한세포배지로교체하였다. 이때, NO-생성억제물질인 L-NMMA(L-NG-Monomethylarginine) 20 μg /ml을양성대조군으로함께처리하여 30분동안배양하였고, 자극원으로 LPS(Lipopolysaccharide) 를 1 μg씩처리하여 24시간동안배양하였다. 상층액을 100 μl씩취해 96-웰프레이트에옮기고, GRIESS 용액을 100 μl씩가해상온에서 10분간반응시키고, 540 nm에서의흡광도를측정함으로써화합물 1의 NO 억제효과를판단하고, 그결과를하기표 6에나타내었다. [0131] 표 6 NO 생성억제효과 시료 NO 생성억제율 (%) L-NMMA ( 양성대조군 ) 모황련추출물 (0.1 %) 모황련추출물 (1 %) [0132] 표 6 에나타난바와같이, 모황련추출물은기존에알려진항염물질인 L-NMMA 와동등수준의 NO 생성억제능이 있음을알수있다. [0134] [0135] [0136] 실시예 5: PPAR 알파활성화촉진효과검증모황련추출물의 PPAR 알파활성화촉진효과를확인하기위하여, 모황련추출물을이용하여하기와같은실험을수행하였다. 마우스유래의근아세포 (myoblast) 세포주인 C2C12 세포 (ATCC CRL-1772) 를 10% 우태아혈청을포함하는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에계대배양하였다. 여기서사용된벡터로는, 1) pzeo 벡터 (Invitrogen) 의 SV40 프로모터에효모의전사인자인 GAL4-DBD(DNA Binding Domain) 과인간 PPAR 알파 LBD(Ligand Binding Domain) 에서 Ser 167 내지 Tyr 468 을암호화하는 DNA 단편 ( 유전자은행정보, NM ) 을포함하는벡터 ; [0137] [0138] 2) GAL4 응답서열을루시퍼라이제 (Luciferase) 를발현하는 pgl3 벡터 (Promega) 의다중제한효소인지부위에삽입된벡터, 및 3) 트랜스팩션대조군 (transfection internal control) 으로 β-갈락토시다아제 (βgalactodisase) 를발현하는벡터를사용하였다. 상기배양한세포를 의농도로 24웰플레이트에도말한후, 12 시간동안배양하고, 상기세종류의플라스미드유전자를일시적인리포팩타민 (Lipopectamine) 을이용하여트랜스팩션 (transient transfection) 하였다. 8시간후, 모황련추출물을처리하고 12 시간동안배양한다음, 1 PBS로세척하고 1 리포터용해버퍼

17 (reporter lysis buffer) 로세포를용해시킨후, 루시퍼라아제분석키트 (Promega) 및 β- 갈락토시다아제분석 키트 (Promega) 를사용하여루시퍼라아제의활성을측정하였다. 즉, PPAR 알파활성도는 ' 루시퍼라아제활성 /β- 갈락토오스활성 ' 으로측정하였다. [0139] [0140] 본실험에서양성대조군으로는 PPAR 알파의리간드중가장강력한것으로알려진 Wy-14,643(Calbiochem) 을사용하였고, 음성대조군으로는시료를녹일때사용한 DMSO 0.05% 를사용하였다. 상기실험방법에따라, 모황련추출물을 C2C12 세포에처리하여농도변화에따른 PPAR 알파의활성을측정하였으며, 그결과를하기표 7에나타내었다. 하기표 7에서 PPAR 알파활성도의수치는음성대조군 (DMSO 0.05%) 대비백분율을의미한다. [0141] 표 7 PPAR 알파의활성 시료 PPAR 알파활성도 (%) DMSO(0.05%) 100 Wy-14,643(0.5 μm) 375 Wy-14,643(1 μm) 933 모황련추출물 (0.05%) 529 모황련추출물 (0.5%) 973 [0142] 표 7 에나타난바와같이, 양성대조군과비교하여, 모황련추출물은매우강력한 PPAR 알파활성능을나타낸다 는것을확인할수있었다. [0144] [0145] 실시예 6: 필라그린 (Filaggrin) 의발현촉진효과모황련추출물을 5 μg /ml, 10 μg /ml가되도록하여각각인간각질세포주 HaCaT 세포의배양배지에첨가하여 1 일간배양한후, 세포의 RNA를분리하고 cdna를합성한뒤 Taqman 염색액으로 Real-time PCR을수행하였다. RNA 농도는 S16 리보솜 RNA로표준화시켰다. [0146] 표 8 농도에따른필라그린발현효과 ( 반복수 = 3) 첨가시료 대조군대비필라그린증가배수 대조군 ( 무첨가 ) 1.00 모황련추출물 (5 μg /ml) 32.3 모황련추출물 (10 μg /ml) 45.9 [0147] 표 8 에나타난바와같이, 모황련추출물은인간각질세포주 HaCaT 세포의필라그린발현촉진능이있다. [0149] [0150] [0151] 실시예 7: 각질박리 (turn-over) 개선에대한효능성하기제제예 2의영양크림에대해서건강한 20대에서 50대의여성을대상으로각질박리개선효과를다음과같이시험하였다. 20세에서 50세까지의여성 20명의시험부위에 DHA(Dihydroxyacetone, Sigma Aldrich, USA) 1.5% 용액을 8시간동안폐쇄첩포하여침착시킨후제조예영양크림을매일 2회시험부위에도포하였다. 도포 4일후, 도포 8일후, 도포 12일후에 Chromameter CR-400(Minolta, Japan) 을이용하여침착부위의피부밝기에대한기기측정과 DSLR을이용하여사진촬영을실시하였다. 측정값은최대값과최소값을제외한 3회의평균값을구하여평가하였으며, 침착부위의피부밝기개선이높을수록각질박리개선효과가있음을나타낸다. 결과는하기표 9 에나타내었다. 표

18 [0152] 피부밝기개선효과 구분 도포 4일후 도포 8일후 도포 12일후 개선율 (%) [0153] 표 9 에나타난바와같이, 본발명에따른영양크림을사용한경우각질박리개선효과가있는것으로나타났 다. [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] 제제예 1: 의약제제의제조 1. 정제의제조모황련추출물 0.2mg옥수수전분 100mg유당 100mg스테아린산마그네슘 2mg상기의성분을혼합한후, 통상의정제의제조방법에따라서타정하여정제를제조하였다. [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] [0168] [0169] [0170] [0171] [0172] [0173] [0174] [0175] [0176] [0177] [0178] [0179] [0180] [0181] [0182] 제제예 2: 화장품의제조 1. 영양크림의제조하기조성과같이, 모황련추출물을유효성분으로포함하는영양크림을통상의방법에따라제조하였다. 모황련추출물 0.2중량 % 베타-1,3-글루칸 5.0 중량 % 밀납 10.0 중량 % 폴리솔베이트 중량 % 피이지 60 경화피마자유 2.0 중량 % 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량 % 유동파라핀 10.0 중량 % 스쿠알란 5.0 중량 % 카프릴릭 / 카프릭트리글리세라이드 5.0 중량 % 글리세린 5.0 중량 % 부틸렌글리콜 3.0 중량 % 프로필렌글리콜 3.0 중량 % 트리에탄올아민 0.2 중량 % 방부제 0.05 중량 % 색소 0.05 중량 % 향료 0.05 중량 % 정제수 to 100 중량 % [0184] 제제예 3: 피부외용제의제조

19 [0185] [0186] [0187] [0188] [0189] [0190] [0191] [0192] [0193] [0194] [0195] [0196] [0197] [0198] [0199] [0200] [0201] [0202] [0203] [0204] 1. 연고의제조하기조성과같이, 모황련추출물을유효성분으로포함하는연고를통상의방법에따라제조하였다. 모황련추출물 0.5 중량 % 베타-1,3-글루칸 10.0 중량 % 밀납 10.0 중량 % 폴리솔베이트 중량 % 피이지 60 경화피마자유 2.0 중량 % 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량 % 바셀린 5.0 중량 % 유동파라핀 10.0 중량 % 스쿠알란 5.0 중량 % 쉐어버터 3.0 중량 % 카프릴릭 / 카프릭트리글리세라이드 5.0 중량 % 글리세린 10.0 중량 % 프로필렌글리콜 10.2 중량 % 트리에탄올아민 0.2 중량 % 방부제 0.05 중량 % 색소 0.05 중량 % 향료 0.05 중량 % 정제수 to 100 중량 %