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1 RESEARCH ARTICLE Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 황칠나무잎메탄올추출물및분획물의 Tyrosinase 저해및 Melanin 생성억제활성 모정희 1, 오수정 2 * 1 동신대학교뷰티미용학과, 2 조선이공대학교뷰티아트과 Tyrosinase Inhibitory Activity and Melanin Production Inhibitory Activity of the Methanol Extract and Fractions from Dendropanax morbifera Lev. Jeong-Hee Mo 1, Su-Jeong Oh 2 * 1 Department of Beauty Design, Dongshin University 2 Department of Beauty Arts, Chosun College of Science & Technology Abstract This study investigated tyrosinase inhibitory and melanin production inhibitory activity of methanol extract and fractions from Dendropanax morbifera Lev. to examine its activation for skin whitening and discovered that ethyl acetate and n-butanol fractions had high capacity of tyrosinase inhibitory. Also, as a result of measuring melanin production inhibitory in B16F10 cells which were stimulated by α-msh, it was discovered that ethyl acetate fractions within the range of concentration without cytotoxicity had higher repression effects. As ethyl acetate fractions had higher flavonoid contents and DPPH radical absorption capacity than those of other specimens and the ethyl acetate fractions in methanol extracts from Dendropanax morbifera Lev. had excellence in anti-oxidation, tyrosinase inhibitory, and melanin production inhibitory activity, this study suggested that they have potential as a functional material of skin whitening cosmetics. Keywords: Dendropanax morbifera Lev., Tyrosinase, Melanin, Whitening 자외선에노출된피부는멜라닌세포내의티로신 (tyrosine) 이티로시나아제 (tyrosinase) 의생합성작용으로산화반응을일으켜멜라닌을생성하여자외선, 건조, 극한온도등에대한피부의저항력을높여피부를보호한다. 과도한멜라닌생성은색소침착을유발하여기미, 주근깨, 검버섯, 반점, 오타모반, 밀크색반점, 염증후색소침착, 어루러기등의과색소성질환을나타낸다 (Chenm, 1991; 성기천과김기준, 2005). 기미는가임기여성에서흔히발생하고갈색의불규칙한경계선을가지고있는색소성질환으로자외선노출부위에다양한크기와 *Corresponding author: Su-Jeong Oh, Department of Beauty Arts, Chosun College of Science & Technology, 309-1, Pilmundaero, Dong-gu, Gwangju , Republic of Korea Tel.: , Fax: library3827@hanmail.net Received December 14, 2012; Revised April 4, 2013; Accepted April 9, 2013; Published April 30, 2013 불규칙한모양의갈색반점을나타난다. 또한주근깨는백인들에게주로나타나며유전적인요인에의해흔히발생되고, 환경적인요인, 자외선노출부위에황색, 흑색, 갈색의색소성반점이불규칙한모양으로나타난다 (Reenstra et al., 1993). 검버섯은멜라닌색소의방어기전이약화되고, 신진대사기능이저하되어기저층세포내멜라닌증가에기인한다 (Miyamura et al., 2006; Sulaimon, 2003). 피부미백에효과적인미백제개발은멜라노사이트내에서의멜라닌생성억제, 멜라노사이트자극물질조절, 그리고멜라닌배설을촉진시키는것으로크게 3가지방향으로이루어지고있다. 피부내의멜라닌세포는수지상의가지돌기를통하여인접한각질형성세포와연결하여표피-멜라닌단위 (epidermal melanin unit) 를형성하는데, 이는멜라노좀 (melanosome) 의수송에중요한역할을한다. 멜라닌은표피기저층의멜라닌형성세포내멜라노좀에서효소의연속적산화반응으로합성된다. 멜라닌합성의출발물질은아미노산의일종인티로신이며, 티로신이티로시나아제에의해 L-3,4- dihydroxyl-l-phenylalanine (L-DOPA) 으로, 이것이다 275

2 Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 시 DOPA quinone으로산화되고 DOPA quinone이 DOPA chrome, 5,6-dihydroxyin-dole, indole 5,6-quinone이되어최종적으로멜라닌이합성된다 (Prota, 1992; Lopez et al., 1992). 지금까지알려진 tyrosinase inhibitor로는 resorcinol, hydroquinone, 4-hydroxyanisole, ascorbic acid와그유도체, kojic acid, arbutin, glucosamine, oxyreseveratrol, viniferin, ferulic acid 등이있으나피부안전성, 제형안정성등의문제로인해 arbutin과 kojic acid가미백첨가제로제한된양만사용되고있다 (Ando et al., 1993; Imokawa et al., 1982). 그러므로최근천연물에서유래된기능성제품의개발이나연구가지속적으로진행되고있다 ( 임도연, 2012). 미백기능성을가지면서도부작용이나독성등의문제가없는새로운소재에대한연구가필요한실정이다. 이와관련하여색소침착방지를위해한방또는민간요법에서이용되는약용식물을이용하여멜라닌색소의생합성을효과적으로억제하는물질을탐색하고분리하기위한연구가제약업계, 화장품업계를중심으로활발하게이루어지고있다 ( 진종언, 2002). 이러한선행연구를바탕으로화장품혹은의약부외품의원료공급원으로천연식물을이용한피부미백활성검증에관한연구가활발히진행되고있다. 멜라닌생성을억제하는천연물질연구는계피 ( 정희옥등, 2008), 차전자 ( 오준석등, 2008), 효모 ( 이승선, 2004), 천궁 ( 이윤경, 2004), 소목 ( 천현자등, 2002) 등이있다. 그리고 tyrosinase 저해활성연구로노근 ( 오수정, 2011; 박화영, 2008), 치자열매 ( 곽정훈등, 2004), 감초 ( 이주상등, 2003), 녹차 (No et al., 1999), 오배자 (Kim et al., 1998), 석이 ( 장성근과박영현, 1997), 상백피 (Seok et al., 1996) 등이보고되어있다. 황칠나무는드룹나무과에속하며, 아열대성상록교목으로완도, 보길도및해남등전라남도의서남해안지역과제주도의한라산일대에자생하고있는것으로보고되어있다 ( 조종수, 1990; 최병욱, 2002). 현재까지황칠나무와관련하여알려진바로는공예품에사용하는도료의원료로서의용도가개시된바있으며, 황칠나무의잎추출물분획에서항암작용이있으며황칠추출분획물에서 α-토코페롤보다다소약한항산화작용이있다고한다. 그리고황칠나무방향성분이신경계에대한진정작용과강장작용이있으며, 황칠나무의항산효능측정결과잎이줄기보다항산화효과가높다고보고된바있다 ( 문창곤, 2006). 항산화활성은피부미백효과와연관성이높은것으로알려져있으므로, 황칠나무잎도피부미백활성이높을것으로사료된다. 따라서본연구에서는황칠나무잎메탄올추출물과그용매별분획물의 tyrosinase 저해및 melanin 생성억제활성등을조사하여미백화장품소재로서의가능성을확인하고자한다. 1. 실험재료본실험에사용한황칠나무잎은 2011년 6월전라남도장흥군지역에서채취한것으로이물질을제거하고음건을실시한후실험에사용하였다. 2. 추출및분획시료 200 g 을잘게부순후메탄올 2 L를추출용매로하여상온에서 24시간씩 3회반복하여추출을실시하였다. 추출액은여과와농축및동결건조를실시하여추출물 21.8 g ( 수율 10.9%) 을얻었으며, 이중 15 g을증류수 300 ml에분산시킨후동량의 n-hexane, ethylacetate, n-butanol을사용하여순차적으로 3회반복하여용매분획을실시하였다. 분획된시료는여과와농축및동결건조후추출물과함께냉장보관하면서실험에사용하였는데, n-hexane, ethylacetate, n-butanol 및 aqueous 분획수율은각각 12.7%, 14.2%, 29.6% 및 43.5% 이었다. 3. 세포주배양 B16F10 세포는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin 을혼합한 phenol-red가포함되지않은 DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium) 배지를사용하여 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 4. 총 flavonoid 함량측정페놀성화합물중특히여러가지기능성을나타내는것으로알려진 flavonoid 함량을알아보기위해 Moreno 등의방법을변형하여다음과같이측정하였다 (Moreno et al., 2000). Methanol에용해시킨시료액 100 μl와 10% aluminium nitrate 20 μl, 1M potassium acetate 20 μl, methanol 860 μl를차례로혼합하여 40분간반응시킨후 415 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로 rutin μg/ml의농도로제조하여시료와동일한방법으로표준검량선을작성하고총 flavonoid 함량을 mg/g으로나타내었다. 5. MTT assay에의한세포독성측정황칠나무잎추출물및분획물의세포에대한독성은 MTT assay 방법에의해측정하였다 (Shin et al., 2003). 배양된 B16F10 세포를 96well plate에 cells/well의농도로분주하여 24시간배양하여부착및안정화시킨후, 농도별로희석한시료를처리하여 24시간동안배양하였다. PBS에 5 mg/ ml의농도로용해시켜제조한 MTT용액을각 well에 10 μl 씩가하고, 37, 5% CO 2 조건에서 4시간동안반응시켜 MTT 276

3 황칠나무잎의멜라닌생성억제활성 가환원되도록하였다. 배지를제거한후, 각 well에 100 μl 의 DMSO를첨가하여생성된 formazan 결정을용해시켜 540 nm에서흡광도를측정하였으며, 시료액대신 PBS를사용한 blank의흡광도를기준으로세포생존율산출하였다. 6. DPPH radical 소거능측정황칠나무잎메탄올추출물과분획물의항산화활성을비교하기위해 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 을사용하여 radical 소거능을측정하였다 (Blois, 1958). 농도별시료액 20 μl와 200 μm DPPH 용액 180 μl를혼합하여 15분간암실에서반응시킨후 517 nm에서흡광도를측정하였다. 50% 의 DPPH radical을소거하는데필요한농도 (SC 50 ) 를계산하였으며, 대조군으로 L-ascorbic acid (vitamin C) 를사용하였다. 7. Tyrosinase 저해활성측정 Tyrosinase 저해활성은 tyrosinase에의해생성되는 DOPA chrome을비색법에의해측정하는방법으로측정하였다 (Jung et al., 1995). 0.1M phosphate buffer (ph 6.9) 100 μl와농도별시료액 20 μl를혼합하여 5분간실온에서반응시켰다. 반응액에 0.1M phosphate buffer에용해시킨 tyrosinase (1K unit/ml, mushroom) 30 μl와 1.5 mm tyrosine 30 μl를혼합하여 37 에서 10분간반응시켰다. 반응이완료되면 490 nm에서흡광도를측정하였으며, 대조군으로 arbutin을사용하였다. 8. Melanin 생성억제활성측정 B16F10 세포주는한국세포주은행 (KCLB, 서울 ) 에서분양받아사용하였다. B16F10 세포를 48-well plate에 cells/ well의농도로분주하여 24시간배양하여부착및안정화시킨후, 농도별로희석한시료와 α-melanocyte stimulating hormone (α-msh) 를처리하여 72시간동안배양한후세포가떨어지지않도록조심스럽게배지액을제거하고 PBS를가하여 washing한후 10% DMSO가혼합된 1N NaOH 300 μl를가하여 60 에서 1시간동안유지하여생성된 melanin을용해시켰다. 생성된 melanin양을 405 nm에서흡광도를측정하여비교하였으며, 시료액대신 PBS를사용한 blank의흡광도를기준으로 melanin 생성억제율을산출하였다 (Hosoi et al., 1985). Tyrosinase inhibitory activity (%) DM-Ex DM-H DM-E DM-B DM-A AB 1. 총 flavonoid 함량황칠나무잎추출물과분획물의총 flavonoid 함량측정결과를 Table 1에나타내었다. 추출물의 flavonoid 함량이 mg/g으로측정되었으며, 분획물중에서는 ethyl acetate 분획의 flavonoid 함량이 mg/g으로나타나가장높은함량을보였다. 다음으로는 butanol 분획에서 mg/ g로나타나 ethyl acetate 분획과 butanol 분획이추출물보다 flavonoid 함량이높게나타난것을확인할수있었다. 다른천연물이 flavonoid의함량은선학초에탄올추출물 32.8 mg/g, 미나리에탄올추출물 26.5 mg/g으로황칠나무잎추출물의 flavonoid 함량이더높게나타났다 ( 유민정과정은숙, 2012; 황초롱등, 2011). 또한김형량 (1997) 의황칠나무잎의화학성분분석연구에서는 75.07% 의높은수분함량과 mg/100g vitamin C와 mg/100g 수용성 Tanmin 함량도비교적높게함유하고있다고보고한바있다. 2. MTT assay 에의한세포독성 Sample concentration (mg/ml) Figure 1. B16F10 cell viabilities of the extract and fractions from D. morbifera lev. DM-Ex: methanol extract, DM- H: n-hexane fraction, DM-E: ethyl acetate fraction, DM-B: n-butanol fraction, DM-A: aqueous fraction. 황칠나무잎추출물및분획물의세포에대한독성을측정한 결과 Figure 1과같은세포생존율을나타내었다 μ g/ml 농도구간에서 n-hexane과 ethyl acetate 분획시료가 Table 1. Total flavonoid content in the extract and fractions from D. morbifera lev. DM-Ex DM-H DM-E DM-B DM-A Flavonoid (mg/g RE 1) ) ) ) RE : rutin equivalent. 2) Values are mean SD (n=6). DM-Ex: methanol extract, DM-H: n-hexane fraction, DM-E: ethyl acetate fraction, DM-B: n-butanol fraction, DM-A: aqueous fraction

4 Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 다른시료보다높은세포독성을나타냄이확인되었다. 세포독성에대한선행연구에서는보골지, 목향, 구절초추출물의세포생존율이 85% 이상나타나세포생존율이좋은것으로보고되어있다 ( 이웅지등, 2010). 노근 chloroform 분획물은 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 mg/ml 시료농도로적용한결과 1.25 mg/ ml에서 88.29±5.18%, 2.5 mg/ml에서 88.24±1.19%, 5.0 mg/ml에서 72.73±0.55%, 10.0 mg/ml에서 57.54±2.97% 로나타났다 ( 모정희와오수정, 2011). 따라서본연구에서는 B16F10 세포에대한 n-hexane과 ethyl acetate 분획의세포독성을감안하여 100 μg/ml이하의농도에서 melanin 생성억제활성실험을진행하였다. B16F10 cell viability (%) DM-H DM-E DM-B DM-A DM-Ex Sample concentration (μg/ml) 3. DPPH radical 소거능황칠나무잎추출물과분획물의항산화활성을비교하기위해실시한 DPPH radical 소거능측정결과를 50% 의 DPPH radical을소거하는데필요한시료농도를나타내는 SC 50 으로 Table 2에나타내었다. Ethyl acetate 분획이 μg/ml 의 SC 50 으로대조군으로사용된 ascorbic acid의활성보다는낮았지만다른시료조건에비해서상대적으로높게나타났다. 다음으로는 n-butanol 분획이 μg/ml로나타났으나 n-hexane과 aqueous 분획의소거능은현저하게낮은것으로나타났다. 문창곤 (2006) 의항산화연구에서는항산화능이높다고알려진녹차와보이차가물추출의경우 50.53±0.44% 와 48.63±3.94% 이며, 메탄올추출물은녹차가 80.81±3.65%, 보이차가 43.43±2.42로황칠나무잎의항산화효과가녹차와보이차못지않게높다고보고된바있다. 4. Tyrosinase 저해활성미백과관련하여 tyrosinase는아미노산인 tyrosine을산화시켜 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 DOPA quinone을만드는효소로서작용함과동시에 DOPA chrome 에서유도된 5,6-dihydroxyindole (DHI) 이 indole-5,6- quinone으로변환되는과정에관여하여 melanin 중합체를합성하는데중요한효소로작용한다 (Marmol & Beermann, 1996). Figure 2에나타낸바와같이실험이실시된농도에서 ethyl acetate와 n-butanol 분획의 tyrosinase 저해활성이높은수준임이확인되었다. 특히, 대조군으로사용된 arbutin의활성과비교해서도유사한활성을나타낸농도구간도있는것 Figure 2. Tyrosinase inhibitory activities of the extract and fractions from D. morbifera Lev. Values are mean±sd (n=3). DM-Ex: methanol extract, DM-H: n-hexane fraction, DM-E: ethyl acetate fraction, DM-B: n-butanol fraction, DM-A: aqueous fraction, AB: arbutin (positive control). 으로나타남으로써미백기능성을가지는 tyrosinase 저해제로서가능성이높음을알수있었다. 반면다른분획들은 arbutin 뿐만이아니라추출물의저해활성에비해서도낮은활성을가지는것으로나타났다. 다른천연물질의 tyrosinase 저해활성과비교해보면, 함초의경우 2.5 mg/ml 농도로건초함초에탄올추출물 20%, 발효함초에탄올추출물 41% 로나타났다 ( 오수정과모정희, 2011). 흰민들레는에탄올추출물이 58%, 열수추출물이 63% 로나타났다. 이러한결과로볼때황칠나무잎 ethyl acetate와 n-butanol 분획의 tyrosinase 저해활성이다른천연물질보다높은것을알수있었다. 5. Melanin 생성억제활성 황칠나무잎추출물과분획물의 melanin 생성억제활성을 측정한결과를 Figure 3에나타내었다. 50 μg/ml 농도에서 ethyl acetate 분획의 melanin 생성량이가장낮은수준으로측정됨으로써 melanin 생성활성이가장높은활성을나타내었다. 특히 MTT assay에의한 B16F10 세포생존율에서세포독성을나타내지않은농도에서의 melanin 생성억제활성으로 ethyl acetate 분획물이 melanin 생합성과정을억제시켜생성량을감소시키는것으로판단할수있었다. 다만, tyrosinase 저해활성을나타낸농도보다낮은농도에서 melanin 생성을 Table 2. DPPH radical scavenging ability of the extract and fractions from D. morbifera lev. DM-Ex DM-H DM-E DM-B DM-A VC SC 50 ( /ml) 1) ) > ) SC 50 : concentration of each samples for scavenging 50% of DPPH radical. 2) Values are mean SD (n=6). DM-Ex: methanol extract, DM-H: n-hexane fraction, DM-E: ethyl acetate fraction, DM-B: n-butanol fraction, DM-A: aqueous fraction, VC: L-ascorbic acid (vitamin-c, positive control)

$황칠나무잎의멜라닌생성억제활성 Melanin production (%, extra-cellular) control MSH DM-Ex DM-H DM-E DM-B DM-A α-msh (2μM) Figure 3. Melanin production inhibitory activities of the extract and fractions from D.$

5 황칠나무잎의멜라닌생성억제활성 Melanin production (%, extra-cellular) control MSH DM-Ex DM-H DM-E DM-B DM-A α-msh (2μM) Figure 3. Melanin production inhibitory activities of the extract and fractions from D. morbifera lev. in α-msh stimulated B16F10 cell. Values are mean±sd (n=3). MSH: α-melanocyte stimulating hormone, DM-Ex: methanol extract, DM-H: n-hexane fraction, DM-E: ethyl acetate fraction, DM-B: n-butanol fraction, DM-A: aqueous fraction. 억제하는것으로나타남에따라 tyrosinase의활성을억제하는것보다는 melanin 합성경로중에작용하는 tyrosinaserelated protein (TRP)-I이나 II의작용억제를통한 melanin 생성억제효과일가능성이높을것으로판단된다. 한편, 노근의 melanin 생성억제활성은열수와에탄올추출물 mg/ml 농도에서열수추출은 44%, 에탄올추출물은 41% 로나타나황칠나무잎의 ethyl acetate 분획이노근추출물보다멜라닌저해활성효과가높은것을알수있었다 ( 오수정, 2011). 따라서 tyrosinase 저해활성과 melanin 생성억제활성이가장높은활성을보인 ethyl acetate 분획물을미백화장품소재로사용하는것이바람직할것으로사료된다. 피부미백과관련된황칠나무잎의활성을탐색하기위해메탄올추출물과용매별분획물의생리활성검색결과는다음과같다. Flavonoid 함량은메탄올추출물 mg/g, 분획물중에서는 ethyl acetate 분획의 flavonoid 함량이 mg/g으로나타나가장높은함량을보였다. DPPH radical 소거능측정결과에서도 Ethyl acetate 분획의경우다른시료보다높은함량과활성을나타내었다. tyrosinase 저해활성과 melanin 생성억제활성등을조사한결과, 황칠나무잎추출물의 ethyl acetate 와 n-butanol 분획에서높은수준의 tyrosinase 저해활성이나타났다. 또한 α-msh로자극된 B16F10 세포를대상으로실시한 melanin 생성억제활성측정결과, 세포독성을 나타내지않는농도범위에서 ethyl acetate 분획이다른시료에비해상대적으로높은생성억제활성을나타내었다. 따라서황칠나무잎메탄올추출물의 ethyl acetate 분획은항산화및 tyrosinase 저해활성, melanin 생성억제활성이뛰어난것으로나타나피부미백화장품의기능성소재로서가능성을확인하였다. 곽정훈, 김용해, 장해룡, 박철우, 한영환. 치자열매추출물의 Tyrosinase 효소활성저해및 Melanogenesis 억제효과. KSBB Journal, 19: , 김형량. 황칠나무잎의화학성분및항미생물활성. 전남대학교석사학위논문, 문창곤. 황칠나무추출물의항산화기능성에관한연구. 인제대학교석사학위논문, 모정희, 오수정. 노근추출물의항균력및세포독성관한연구. 대한피부미용학회지, 9: , 박화영. 노근에센스를 20-30대여성의피부관리의만족도. 중앙대학교석사학위논문, 성기천, 김기준. 솔잎추출물의티로시나아제활성억제효과및분석. 한국유화학회지, 22: 71-76, 이승선, 정호권, 오철, 최태부. 효모에서분리한멜라닌생성억제물질의작용기전. KSBB Journal, 19: , 이윤경. 자외선노출이피부노화에미치는영향. 숙명여자대학교석사학위논문, 이웅지, 배성윤, 남궁우, 이용화. 천연약용식물추출물의여드름원인균에대한항균및항염증효과. 한국화장품과학회지, 36: 57-63, 이주상, 김정아, 조세훈, 손애량, 장태수, 소명숙, 정시련, 이승호. 감초의 Tyrosinase 활성억제성분. 생약학회지, 34: 33-39, 임도연. 건조된흰민들레에서추출한에센셜오일의방향성분분석. 대한피부미용학회지, 10: , 오수정. 노근추출물의생리활성탐색및피부미백개선효과. 광주여자대학교박사학위논문, 오수정, 모정희. 함초와발효함초추출물의화장품소재로서생리활성비교연구. 대한피부미용학회지, 9: , 오준석, 이종구, 정희옥, 최지영, 최은향, 김동춘, 김정아, 손중근, 이승호. 차전자로부터멜라닌생성억제물질의분리. 연구업적집, 18: ,

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,