Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 이기록되어있다. 특히, 새송이버섯 ( 큰느타리버섯, Pleurotus eryngii) 은분류학적으로담자균아문 (Basidiomycotina), 주름버섯목 (Agaricales), 느타리버섯과 (Pleurotaceae),

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윤아 기
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1 RESEARCH ARTICLE Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 새송이버섯 (Pleurotus eringii) 추출물의미백효능평가 권혜진숭실대학교화학공학과 Anti-melanogenesis Activity of Pleurotus eringii Extracts Hye-Jin Kwon Department of Chemical Engineering, Soongsil University Abstract As our contemporaries increase the demand to maintain their youth for a long time, the number of researches on finding natural substances for anti-aging or whitening effect has been increased as well. While mushroom has been well-known for its various types and outstanding effects, since the research of mushroom as an ingredient of cosmetics has not been active, this study is to find the natural whitening substance by using the extract of Pleurotus eringii, which is being spotlighted as health food. The ingredient used in this study is pesticidefree mushroom harvested in December 2014 at Munsan-eup, Jinju, Gyeongsangnam-do Province, and it was extracted at the atmospheric temperature by using 80% MeOH and concentrated. Prior to the whitening test, the cellulotoxic evaluation against melanin-α cell, and as the in vitro cellulotoxicity relies on activation of mitochondria of cell, the in vitro cellulotoxicity was measured with WST-1 reaction solution to determine the survival of cell. The result indicated that the survival rate of cell under the concentration below 200 ppm was over 80%, and based on this result, the concentration without cellulotoxicity was set to perform the main test. The whitening effect was confirmed through the tyrosinase deactivation test and the melanin synthesis inhibition test. As a result, the IC 50 value of tyrosinase activation by the extract of Pleurotus eringii was measured to be mg/ml, and the IC 50 value of Vitamin C used as a positive comparison group was measured to be μg /ml. In the melanin synthesis inhibition test, the melanin synthesis was reduced concentration-dependently. Especially in the test concentration, the melanin synthesis inhibition was statistically similar to the inhibition with Arbutin, which has been used as a positive comparison group. In conclusion, the whitening effect by the extract of Pleurotus eringii shows outstanding result as it leads to the concentration-dependent inhibition of tyrosinase activation and melanin synthesis. Therefore, the extract of Pleurotus eringii has not only the fair possibility to be used as an ingredient of cosmetics but also the possibility to be used as natural ingredient for internal and external beauty, through the prospect and continuous researches on correlation with health food. Keywords: Pleurotus eringii, Anti-melanogenesis, Tyrosinase, Whitening effects, Extracts 현대인들의건강에대한관심, 그중젊음과아름다워지고자 하는욕구가점점커져가고있는가운데노화방지나미백효과 가있는천연물소재를찾는연구들이증가되고있다 ( 황원정, Corresponding author: Hye-Jin Kwon, Department of Chemical & Environmental Engineering Soongsil University, Seoul 06978, Republic of Korea Fax: , dbstn912@naver.com Received September 15, 2015; Revised October 8, 2015; Accepted October 14, 2015; Published October 30, ). 특히, 천연물을이용한화장품과건강기능식품, 항암제등의개발이활발하게이루어지고있는실정이다. 농업기술실용화재단이 2014에발표한 국내외천연화장품산업동향 에따르면국내천연화장품시장은연평균 9% 씩확대되어 2014년시장규모는 2조 7000억원에달하였다. 많은천연물들중에서버섯은예로부터로마인들이신의식품이라고극찬했으며항암효과, 항산화효과, 면역증강효과등이알려져있다 ( 황원정, 2013). 우리나라문헌에버섯이처음기록된것은김부식의삼국사기로성덕왕 3년 (704년) 정월에웅천주 ( 공주 ) 에서금지 ( 金芝 영지버섯 ) 를왕에게진상물로올렸다는것이시초이다. 허준의동의보감에는 19종류이상의버섯 695

2 Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 이기록되어있다. 특히, 새송이버섯 ( 큰느타리버섯, Pleurotus eryngii) 은분류학적으로담자균아문 (Basidiomycotina), 주름버섯목 (Agaricales), 느타리버섯과 (Pleurotaceae), 느타리버섯속 (Pleurotus) 에속하는식용버섯이다. 새송이버섯은육질이치밀하여씹는맛이자연송이와비슷하고일반느타리버섯에비해대가굵고길며저장성이좋아예부터유럽에서도 초원의꿀맛버섯 이라하여대중적인기가높았다. 우리나라에서는 1975년송이과로분류되었다가 1986년느타리버섯과로재분류되어큰느타리버섯으로명명되었으며 1997년경부터인공재배된것이 새송이버섯 이라는상품명으로시판되고있다 ( 김현정, 2005). 일반적으로버섯에는유용성분들이다양하게함유되어있으며그중에서도대표적인생리활성성분이 β-glucan 과같은다당류 (polysaccharide) 와단백질또는펩타이드가다당류에결합된 peptide-bound polysaccharide 또는 protein -bound polysaccharide이다 (Chang, 1993). 또버섯의성분중에서근래관심을끌고있는것은제6의영양소라불리는식이섬유 (dietary fiber) 도다량함유되어있다. 이러한버섯의특징때문에새송이버섯에관한연구는미백기능성제품제조방법 ( 유형욱, 2003), 새송이버섯추출물의기능성검색및분리동정에관한연구 ( 김현정, 2005), 새송이버섯추출물의생리활성효과, 새송이버섯의항산화성추출물제조를위한마이크로웨이브추출조건설정 ( 김영중, 2007) 등의대부분식품분야의연구가활발히이루어지고있는현실이다. 그러나새송이버섯의대표적인생리활성성분인 β-glucan과같은다당류 (polysaccharide) 와펩타이드물질은화장품유효성분으로활용가능하며, 현재시판되는화장품의원료이기도하다. 특히 β-glucan은면역기능을활성화시켜항암효과가우수할뿐아니라피부재생기능을높이는중요한역할을한다. 최근피부가산소와접촉하고태양광에노출되면서수분손실과피부노화가촉진되고, 자외선이강해지면서멜라닌색소가침착되어기미와주근깨같은피부질환을증가시키고있다 ( 전민, 2009). Melanin은자연계에널리분포하는페놀류의생체고분자물질로물과대부분의유기용매에는녹지않으며, 화학적으로는극히비활성을나타낸다. 검은색소와단백질의복합체이며사람의머리카락과피부색을이루는색소중하나로그양이많으면피부색이황갈색에서흑갈색을띠고, 적을수록색이엷어진다. Melanin은자외선등에의한피부의노화나일광각화증을억제하여피부를보호하는긍정적인기능을가지고있다. 그러나과잉생성되면피부색소침착에의해기미, 주근깨를형성하며 melanin 전구물질들에의한독성으로세포사멸을촉진하거나피부노화촉진, 피부암유발등에관여하는것으로알려져있다 ( 서장원, 2006). 멜라닌은 tyrosinase라는효소의작용에의해생합성되고이효소의작용으로 L-tyrosine을기질로하여표피기저층에존재하는멜 라노사이트 (melanocyte) 라는색소세포내의소기관인멜라노좀 (melanosome) 에서생합성되며멜라닌의생합성은 tyrosinase related porotein-1, tyrosinase related protein-2 등의멜 라닌생성효소들에의해이루어진다 ( 이영상, 2010). 멜라닌 의구조는기본적으로 tyrosine 에서생기는 indole 화합물이 3 차원방향에결합된 polymer 이고멜라노좀효소단백질이나 선형으로된거대분자의멜라닌단백복합체 (melanin protein complex) 로서존재하며이복합체가멜라닌과립으로되고이 것이표피세포로전달되어표피세포의각화과정과함께피부의 상층으로이동하여각질층의탈락과함께피부밖으로배출되 며멜라노사이트는나뭇가지모양의수지상세포이고그수지 상돌기는생성된멜라닌이주변의인지질이나단백질과결합 하여피부밖으로용이하게배출되도록해준다 ( 전민, 2008). 화 장품은이러한생리적요인과환경적요인으로인한피부의색 소침착을예방하기위하여많은미백기능성성분이함유되어 사용되었지만합성물질의경우에는과량도포시독성작용을 일으키는것으로보고되었다 ( 오수정, 2011). 따라서천연소재로부터노화및색소침착반응을억제하는 미백물질을찾는연구가지속적으로요구되므로천연물과한 방에서생리활성이우수한약용작물의연구가진행되어야할 필요가있다. 이에본연구에서는건강식품으로각광받고있 는새송이버섯추출물을이용하여, 선행연구의추출방법과차 별화를두어천연미백효능물질을찾아내어화장품소재로서 의가능성뿐아니라, 향후식품분야와의연관성에관한지속적 인연구를통하여내적, 외적아름다움을위한천연원료를개 발하고자하였다. 1. 실험재료및추출 경상남도진주시문산읍에서 2014 년 12 월에수확한무농약 재배새송이버섯 (Pleurotus eringii) 을구입하여사용하였다. 일 Table 1. Experiment equipment Solution Maker Catago No. Nation Dullbercco s Modified Eagle s Medium (DMEM) RPMI 1640 Sodium hydroxide (NaOH) WELGENE LM LM ML well plate SPL 96 well plate Korea Cell proliferation reagent WST-1 Roche Switzerland DC protein assay kit Bio-Rad Ascorbic acid (Vitamin C) SIGMA A7506 U.S.A 696

3 새송이버섯추출물의독성평가및미백효과 반적으로원료의생리활성물질은용매의특성에따라다르게분석되며, 용매의극성이낮은순서부터점차적으로극성이높은순서대로추출하는계통적추출법 (Chung, 2001) 을응용하여본연구에서는 80% MeOH로상온에서추출한후감압농축하였다. 대조군으로사용된 Ascorbic acids는 SIGMA에서, DC protein assay kit는 Bio-Rad에서, Dullbercco s Modified Eagle s Medium (DMEM) 은 WELGENE에서구입하여사용하였고, 그외실험에사용된시약및재료는 Table 1에제시하였다. 2. 세포주배양미백효능평가에서사용되는 Melanin-α 세포는 C57BL/6 (black, a/a) mouse에서유래한 immortalized cell line으로서 (Bennett DC, 1987) Dr. Dorothy C Benette (St George s Hospital, London, UK) 로부터제공받아사용하였다. 세포는 RPMI 1640 medium에 fetal bovin serum 10%, 50 U/ ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin, 200 nm phobol 12-myristate 13-acetate (PMA) 를첨가한배지로 37 C, 10% CO₂조건하에서배양하였다. 3. 세포독성시험 1) 검액조제시료는 DMSO를사용하여 200 mg/ml로용해시켰으며, 세포배지에알맞은농도로희석하여제조하였다. 또한, WST-1 assay를통하여예비실험을진행한후세포독성을나타내지않는농도를설정하여새송이버섯추출물의피부관련효능을평가하였다. 대조군역시세포배양배지로희석하여처리하였다. reader를이용하여 490 nm에서흡광도를측정하였다. 공시료액으로시료액대신 0.1 M 인산염완충액 (ph 6.5) 를넣었다. 활성저해율이 50% 일때의시료의농도 (IC 50 ) 를적절한프로그램을이용하여산출하였다. b - b (%) = a - b a: 공시료액의반응후의흡광도 b: 시료액의반응후의흡광도 a, b : 타이로시나제대신완충액으로대체하여측정한흡광도 5. 멜라닌합성저해시험 Melanin-α 세포를 3 10⁴ cells/well이되도록 24 well plate에깐후, 24 h 동안세포가 plate에잘붙도록세포배양기에방치한뒤, 각 well당다양한농도로희석된시험물질이들어있는배지를넣어주었다. 실험시료는원하는농도대로녹여사용한다. 위와같은방법으로실험시료를 3일에한번씩, 6일동안처리하였다. 세포내의멜라닌은광학현미경 (brightfield microscope) 으로확인하였다. 이후세포는 cell lysis buffer로녹인후원심분리를통해상층액은분리하여단백질을정량하고 melanin은 1 N NaOH를첨가하여 405 nm에서흡광도를측정하여측정한단백질양에대한멜라닌양으로환산하였다. 6. 통계처리모든자료는 mean±sd 로나타내었고, 통계처리는 Student s t-test를사용하였으며유의확률 p<.005, 양측검정을사용하였다. 2) 세포독성시험추출물의독성을확인하기위해, melanin-α cell의세포독성을측정하였다. Melanin-a cell 을 96 well plate에 5 10³ cells/well로분주한다음세포배양조건에서 24 h 배양하였다. 배양후, 12 h의기아상태를유지한뒤, 추출물및새로운배지 (FBS 제외 ) 를넣고, 24 h동안배양하였다. 24 h 후세포의생존율을측정하기위해 WST-1 반응액을 supplement가제외된배지에 1/10로희석하고이를각 well당 100 µl씩처리하여 1 h동안반응시킨후, 450 nm에서흡광도를측정하였다. 1. 세포독성시험새송이버섯추출물 (PE) 의 in vitro 세포독성은세포의미토콘드리아활성에의존하여, 세포의생존을결정할수있는 WST-1 반응액에의해측정되어졌다. 세포생존율은 melanin-α세포에서평가하였으며, 시료를제외한배양배지만처리한값 (control) 에대한백분율로나타내었다. 4. Tyrosinase 활성저해시험시료를에탄올이나적당한용매에녹여타이로시나제활성을억제하기위한적당한농도범위로희석한것을시료액으로하였다. 시험관에 0.1 M인산염완충액 220 µl와 20 µl 그리고머쉬룸타이로시나제 (1500 U/mL-2000 U/mL) 액 20 µl를순서대로넣고, 이용액에 1.5 mm 타이로신액 40 µl를넣고 37 에서 min 동안반응시켰다. 그리고이것을 ELSA Table 2. Cell viability assay_melan-α cell Sample Concetration % control Control ppm PE 50 ppm ppm ppm

Kor. J. Aesthet. Cosmetol., (a) control (b) arburin (c) PE 50 ppm (d) PE (e) PE Figure 2. Melanin Synthesis (x200). Figure 1. Tyrosinase inhibition activity assay of Pleurotus eringii extracts.

4 Kor. J. Aesthet. Cosmetol., (a) control (b) arburin (c) PE 50 ppm (d) PE (e) PE Figure 2. Melanin Synthesis (x200). Figure 1. Tyrosinase inhibition activity assay of Pleurotus eringii extracts. 그결과, Table 2 에서보는바와같이 melanin-α 세포역시 200 ppm 이하에서 80% 이상의세포생존율을보였다. 따라서 melanin-α 를이용한추후시험에서사용되는시료의최고농 도는 200 ppm 으로선택하였다. 2. Tyrosinase 활성저해시험 본시험은시료새송이버섯추출물을이용하여 tyrosinase 억제효능을확인함으로서미백효능을평가하고자하였다. 시 험은기질인타이로신과효소인타이로시나아제를반응시킨후 Table 3. Tyrosinase assay Sample PE Vit.C IC mg/ml µg/ml Table 4. Melanin assay Sample Concentration % control Control Arbutin 200 M PE 50 ppm ppm ppm 타이로시나아제효소활성억제를 IC 50 값으로측정하였다. Figure 1과 Table 3에서보는바와같이 200 mg/ml농도부터타이로시나아제효소활성억제율을측정한결과, 새송이버섯추출물의 IC 50 값은 mg/ml로측정되었으며, 양성대조군으로사용한 Vitamin C의 IC 50 값은 µg/ml로측정되었다. Tyrosinase 저해제는미백을위한화장품의주요기능성성분으로서임상적으로피부암과과색소침착에관련되는피부병치료에유용하다 (Yanget et al., 2008). 현재사용되고있는 tyrosinase 활성저해측정은효소반응계를이용하는것이며유용한평가방법으로인정되고있다. 이방법은일반적으로수용성물질을조사한것으로 20여종의지방산을포함하는삼릉과같은지용성물질에대한연구는미미한실정이다. 지용성저해제나수용성인 tyrosinase 활성저해를분석하기위해역미셀계를도입하여지용성물질과수용성인 tyrosinase 효소를단일상에분리시키는반응계에관한보고가있다 (Han et al., 2000). 우리나라한약재중천연미백원료로활용되는율피, 백작약, 승마, 산초나무등이비교적강한활성을나타내는물질로 100 mg/ml 농도에서 50% 정도의저해율을나타내는데, 새송이버섯또한비교적높은활성을나타냄을확인할수있다. 3. 멜라닌합성저해시험본시험은 immortalized mouse melanocyte cell line인 melanin-α cell을이용하여멜라닌합성억제효능을측정함으로써시료의미백효능을평가하고자하였다. 세포독성시험을통해독성이없는농도로처리한후멜라닌합성억제효능을평가한결과시료새송이버섯추출물은시료를처리하지않은대조군 (control) 에비해멜라닌합성이농도의존적으로억제되었으며, 특히시험농도세농도에서통계적으로유의하게감소하였다. 또한, 양성대조군으로사용한 Arbutin 역시통계적 698

5 새송이버섯추출물의독성평가및미백효과 으로유의하게멜라닌합성억제효능을나타내었다 (Table 4). 세포의형태변화를관찰하기위해배양된 Melan-a 세포를새배지로교환후도립현미경을이용하여 200배율에서관찰하여 Figure 2에나타내었다. 이결과는이재성 (2012) 의연구와유사한결과를나타내었으며, 티로시나아제활성과멜라닌합성저해효과가있는것으로나타난것은티로시나아제가멜라닌합성에관여하는중추적작용을한다는연구의보고와일치하는것으로사료된다. 본연구에서는건강식품으로각광받고있는새송이버섯추출물을이용하여미백에대한피부생리활성을평가하고자하였다. 효능시험을수행하기앞서새송이버섯추출물의 melanin-α 세포에대한세포독성을평가하였다. 추출물 200 ppm, 농도이하에서세포생존율 80% 이상을보였고, 이결과를바탕으로세포독성이없는농도를설정하여본시험을수행하였다. 미백효능은 tyrosinase 활성저해시험과 melanin 합성저해시험을통해확인하였다. 그결과새송이버섯추출물의 tyrosinase 활성 IC 50 값은 mg/ml 으로측정되었으며, melanin 합성저해시험에서도농도의존적으로 melanin 합성을감소시켰다. 특히, 시험농도에서대조군대비통계적으로유의하게 melanin 합성을억제시켰다. 이에새송이버섯추출물은 tyrosinase 활성과 melanin 합성을농도의존적으로저해시킴으로서미백효능이있는것으로사료되며향후티로시나아제및멜라닌생성에관련된효소인 TRP-1, TRP-2의유전자발현에대한실험이필요할것으로판단된다. 또화장품소재로서의가능성뿐아니라, 향후식품분야와의연관성에관한지속적인연구를통하여내적, 외적아름다움을위한천연원료로의활용가능한소재라판단되어진다. 김영중. 식용가능한자원식물의항산화활성과 Tyrosinase 억제활성탐색. 충북대학교석사학위논문, 김현정. 새송이버섯추출물의기능성검색및분리동정에관한연구. 성신여자대학교박사학위논문, 김혜정. 미백화장품의사용실태및구매행동에관한연구. 숙명여자대학교석사학위논문, 박장순. 아카시아 (Robinia pseudo acacia) 부위별추출물의항산화및항균활성과 Tyrosinase활성저해효과. 숭실대학 교석사학위논문, 박지원. 벚나무의부위별항산화활성및미백효과. 경남대학교석사학위논문, 백인희. 토복령 (Smilacis glabrae Rhizoma) 추출물의항산화활성및피부개선효과. 서경대학교석사학위논문, 서장원. 초임계이산화탄소를이용한토복령추출물의항산화및미백효과에대한연구. 아주대학교석사학위논문, 손명수, 송지혜, 김종식, 장해동, 김교남. 홍삼에서추출한오일의항산화및보습활성. 대한피부미용학회지, 11: , 오수정. 노근추출물의생리활성물질탐색및피부미백개선효과. 광주여자대학교박사학위논문, 유동현. 구아바의부위별항산화활성및 tyrosinase 저해활성. 경남대학교석사학위논문, 유형욱. 천연물질로부터추출한항산화제효과. 전북대학교석사학위논문, 이영상. 대두발효추출물에서분리된글리세올린의피부미백효능. 경북대학교박사학위논문, 이윤경. 자외선노출이피부노화에미치는영향. 숙명여자대학교석사학위논문, 이재성. 버섯과해조류에서추출한물질의항산화및미백효과에대한연구. 인천대학교석사학위논문 전영숙. 골담초추출물의생리활성탐색과기능성식품및기능성화장품으로활용. 경북대학교석사학위논문, 조윤희. 피부, 건강, 그리고건강기능식품. 식품과학과산업, 38, 8-15, 황형칠. 식물성및동물성한약의 Tyrosinase 활성저해효과. 순천대학교석사학위논문, 전민. Rhapontigenin의효소적생산과피부미백제로서의적용연구. 한국산업기술대학교석사학위논문, 황원정. 노루궁뎅이버섯추출물의멜라닌합성저해효과. 동덕여자대학교석사학위논문, Bhore SJ, Ravichantar N, Loh CY. Screening of endophytic bacteria isolated from leaves of Sambung Nyawa [Gynura procumbens (Lour.) Merr.] for cytokinin-like compounds. Bioinformation, 5: 191, Chung HS. Isolation of New Bioactive Phytochemicals from Natural Products. Food Industry and Nutr., 6: 53-59, Chang ST, Buswell JA, Chiu SW. Mushroom biology and mushroom product, 3-17, The Chinese University Press, Hong Kong,

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Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,