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기현 송
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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(3): (2014) ISSN / eissn 연구논문 차전초뿌리추출물이항산화활성및피부미백작용에미치는영향 윤미연 *, 한영숙 Effect of Anti-oxidant Activity and the Skin Whitening Action on Plantago asiatica L. Root Extract Yoon Mi Yun* and Han Young Sook 접수 : 2014 년 5 월 12 일 / 게재승인 : 2014 년 6 월 25 일 2014 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: To investigate the effect of Plantago asiatica L. Root extract on skin care, we measured anti-oxidant activity and whitening action. As a result of measuring DPPH radical scavenging activity to examine independent anti-oxidation of PRE, there was slight scavenging activity. Fluorescent materials DHE, DCF-DA and DHR were each used to measure superoxide anion, hydrogen peroxide, and hydroperoxide created in RAW cells, all concentrations were found to dependently prevent ROS production. Tyrosinase activation was found to be blocked dose-dependant. Melanin production was also prevented dose-dependant, but the effects were slight. Therefore, it is expected to be used effectively in development of functional cosmetic materials. Keywords: Plantago asiatica L., Anti-oxidant, ROS, Melanin, Whitening, Cosmetic 1. INTRODUCTION 차전초 (Plantago asiatica L.) 는한국, 일본, 타이완, 중국등지에분포하며 생명력이질기다 하여질경이라고도불린다. 풀밭이나길가또는빈터에서잘자라며줄기는없고, 잎은뿌리에서뭉쳐져나오며잎의모양은타원또는달걀모양이고길이가 4~15 cm, 폭이 3~8 cm 이며가장자리에물결모양 동남보건대학교피부미용과 Department of Cosmetology, Dongnam Health College, Suwon , Korea Tel: , Fax: ymy@dongnam.ac.kr 의톱니가있다. 한방에서는잎을차전 ( 車車 ), 종자를차전자 ( 車車車 ) 라는약재로쓰고, 차전자는민간요법에서이뇨작용, 지사작용으로사용되었으며간기능을활성화하여어지럼증과두통에효능이있고, 폐열로인한해수에도효능이있다. 차전초는 flavonoid 를비롯하여 tannin, aucubin, plantaginin, ursolic acid 등의성분을포함하고있으며이뇨작용이있어신우신염, 방광염, 요로염등염증성질환에사용된다 [1]. 최근노인인구가빠르게증가하면서고령화사회가현실화되고있다 [2]. 이에항노화 (anti-aging) 와웰니스 (Wellness) 에대한관심이높아지고있으며며신체적, 정신적, 사회적으로만족할수있는노년기를보내기위한각종프로그램이개발되고있다. 노화는복잡한과정을거쳐유전적요인과환경적요인이주는다양한영향에의해진행되고있으며세포의노화와세포증식능력감소 [3], 세포의 DNA 재생능력감소 [4], 산화적스트레스증가 [5] 등의원인으로노화가가속화되고있다. 인체세포노화는세포의산화를의미하는데인체의호흡을통해발생하는 hydroxyl radical 과 superoxide anion radical 등의활성산소종은세포막단백질및 DNA 를손상시킬뿐만아니라지질과산화를유발하는것으로알려져있다 [6]. 이러한활성산소를억제시키는항산화제는 superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase 등의효소계열의항산화제와 phenol 계화합물, tocopherol 류, flavone 유도체, phyllozurcin 류, gallic acid 유도체, catechin, nordihydroguaiaretic acid, gossypol, lignan 배당체등의천연항산화제 (natural antioxidants), butylated hydroxyanisole (BHA) 와 butylated hydroxytoluene (BHT), propyl gallate (PG) 등의합성항산화제가널리알려져있다 [7]. 또한피부노화로나타나는검버섯등의과색소침착을예방함으로써피부를맑고건강하게유지하기위한미백기능성화장품에대한관심이높아짐에

2 200 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(3): (2014) 따라미백에효과가있는화장품소재개발에대한연구가활발하게이루어지고있다. 특히인체에부작용이적은천연식물을이용한항산화와미백물질에대한연구가활발하게진행되고있는실정이다 [8,9]. 따라서본연구는식물에존재하며생리적, 약리적효능이있는 flavonoid 와 aucubin, tannin, plantaginin 등의성분을포함하고, 재배가용이한차전초중연구가미미한뿌리를추출하여항산화및미백작용에미치는영향을관찰함으로추후항산화, 미백과관련된기능성화장품의원료로의활용방안을모색하고자한다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 시약 Arbutin, Silica, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), L- DOPA, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 은 Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA) 로부터구입하였다. dihydroethidium (DHE), 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA), dihydrorhodamine (DHR) 는 Molecular Probe Co., (Eugene, OR, USA) 에서구입하였다. RAW cell, B16 F10 Melanoma cell은서울대학교세포주은행으로부터구입하였다 실험재료본연구의실험재료로사용한차전초는서울시서초동농원에서직접재배하여 1 kg 정도의전초를수세한다음차전초의잎, 뿌리, 씨를각각분리하여각시료에 95% ethanol 용액 4 배량을가한다음실온에서일주일동안침적시킨후 whatman No. 2 여과지로여과시킨후멸균필터지로필터링한다음동결건조하였다. Rotavapor (50~55 rpm) 를이용하여에탄올을제거하고 5.14 g 의추출액을얻어시료로사용하였다 세포배양 B16 F10 melanoma 세포와 RAW 세포는 10% fetal bovine serum 과 penicillin/streptomysin (100 IU/ 50 µg/ml) 을함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 용액으로 37 o C 로유지되는 5% CO 2 배양기에서배양하였다 MTT를이용한세포독성측정차전초뿌리추출물의세포독성을확인하기위하여 MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를하였다. 세포주는 B16 F10 melanoma를사용하였으며, 96 well plate에 well당 의세포수로분주하고시료를농도별로가한후 48시간동안 37 o C, CO 2 배양기에서배양하였다. 48시간후배양용액을버리고, Krebs 용액 (mm : NaCl 137, KCl 2.7, Na 2 HPO 4 0.4, MgCl 2 0.5, HEPES [ph 7.4] 10, CaCl 2 1.8, glucose 5) 에녹인 MTT 용액 500 µg/ml을각 well 에 200 µl씩가하고어두운곳에서 4시간배양후상층액을 버리고, DMSO 를각 well 에 200 µl 를가하여 MTT formazan 을용해시켰다. 실온에서 15 분간 MTT formazan 을완전히용해후 570 nm 에서흡광도를측정하였다 DPPH radical 소거정량 96 well plate 에에탄올에녹인 0.1 mm 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 용액 180 µl 와차전초뿌리추출물을농도별로 20 µl 씩가하고차광상태로 37 o C 에서 30 분간배양한후 FL 600 spectrofluorometer (Bio-Tek, U.S.A) 를이용하여 517 nm 에서흡광도를측정하였다 세포내 superoxide 생성측정세포내에서생성되는 superoxide 를측정하기위하여 dihydroethidium (DHE) 을이용하였다. RAW 세포를 10 ml 의 Krebs buffer (mm: NaCl 137, KCl 2.7, Na 2 HPO 4 0.4, MgCl 2 0.5, HEPES [ph 7.4] 10, CaCl 2 1.8, glucose 5) 에분산시킨후 10 µm dihydroethidium 을가하고 1 시간빛을차단한곳에서배양하였다. dihydroethidium 이없는 Krebs buffer 로한번세척한후 cells/ml 로분주하고시료를전처치한후 silica 1 mg/ml 을가하여 30 분간 superoxide 생성을유도하였다. 원심분리후 cell pellet 을 200 µl 의 Krebs 용액에분산시킨후형광도 (Ex: 480 nm/ Em: 586 nm) 를측정하였다 세포내 H 2 O 2 생성측정 2',7'-dichlorofluorecin diacetate (DCF-DA) 가 RAW 세포내로들어가서세포내생성된산소라디칼 (ROS) 에의해산화되어 deacetylation 되면서생성되는 DCF 가형광을내는물질로전환되는반응을이용하여형광도를측정하였다. RAW 세포를 10 ml 의 Krebs buffer 에 suspend 시킨후, 20 µm DCF-DA 를가하고 30 분간차광상태에서배양하였다. DCF- DA 가없는 Krebs buffer 로한번세척한후원심분리하여세포를추출하였다 cells/ml 로소분하고시료를농도별로전처치한후 silica 1 mg/ml 를가하여 30 분간 H 2 O 2 생성을유도하였다. 원심분리후 cell pellet 을 200 µl 의 Krebs buffer 에재분산시켜 96 well plate 에옮긴후형광도 (Ex: 485 nm/ Em: 535 nm) 를측정하였다 세포내 hydroperoxide 생성측정 Dihydrorhodamine (DHR) 이 RAW 세포내로들어가서세포내생성된 hydroperoxide 에의해산화되어형광을나타내는물질인 rhodamine 123 으로전환되는반응을이용하여형광도를측정하였다. RAW 세포를 10 ml 의 Krebs buffer 부유시킨후, 10 µm DHR 을가하고 30 분간차광장소에서배양하였다. DHR 이없는 Krebs buffer 로한번세척한후, cells/ml 로소분하고농도별로전처치한후 silica 1mg/mL 를가하고 30 분간 hydroperoxide 의생성을유도하였다. 원심분리후 cell pellet 을 200 µl 의 Krebs buffer 에재분산시켜 96 well plate 에옮긴후형광도 (Ex 488 nm/ Em 515 nm) 를측정하였다.

차전초뿌리추출물이항산화활성및피부미백작용에미치는영향 201 2.9. B16 melanoma 세포에서 tyrosinase 활성측정세포내 tyrosinase 활성에미치는영향을관찰하기위하여 B16 F10 melanoma 세포에시료처치후배양이끝나면 1% (w/v) Triton X-100 을함유한 10 mm sodium phosphate buffer (ph 6.

3 차전초뿌리추출물이항산화활성및피부미백작용에미치는영향 B16 melanoma 세포에서 tyrosinase 활성측정세포내 tyrosinase 활성에미치는영향을관찰하기위하여 B16 F10 melanoma 세포에시료처치후배양이끝나면 1% (w/v) Triton X-100 을함유한 10 mm sodium phosphate buffer (ph 6.8) 를 100 µl 를가하고 5 분간 shaking 한후에세포와용액을모두 eppendorf tube 로옮긴후원심분리하여상층액은 tyrosinase 활성에이용하고, cell pellet 은멜라닌정량에사용하였다. 96 well plate 에약물처치후얻은상층액 40 µl 를분주하고 0.1 M sodium phosphate buffer (ph 7.2) 에녹인 2mg/ ml L-DOPA 200 µl 를가하여 37 o C 에서 1 시간동안배양하였다. Tyrosinase 에의해생성된 DOPA chrome 은 475 nm 에서흡광도를측정하였다 B16 F10 melanoma 세포에서 melanin 생성억제측정 B16 F10 melanoma 세포를 6 well plate 에 3 ml 로분주한후 10% FBS 이함유된 phenol red-free DMEM 용액에서 12 시간동안배양하였다. 그리고시료를각각의농도로 37 o C 에서 10 분간배양하여전처치한후, 1 µm 의 MSH 를처치하여 37 o C 에서 72 시간동안배양하였다. 배양이끝나고난후 1% (w/v) Triton X-100 을함유한 10 mm sodium phosphate buffer (ph 6.8) 를 100 µl 를가하고 5 분간 shaking 한후 eppendorf tube 로옮기고이를 10,000 rpm 에서 5 분간원심분리하여얻은 cell pellet 에 1 N NaOH 100 µl 와증류수 200 µl 를가하고 60 o C 에서 1 시간배양하여멜라닌을완전히녹인후 96 well plate 에 200 µl 를옮기고 405 nm 에서흡광도를측정하였다. 멜라닌표준폼으로얻은검량선을이용하여각 well 에서생성된멜라닌양을산출하였다 자료분석및통계적검정실험결과는평균 ± 표준편차로표기하였으며, 실험성적은 non-paired Student's t-test 로검정하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 세포독성측정차전초뿌리추출물이세포독성에미치는영향을알아보기위하여 MTT assay 를통해세포독성을관찰하였다. B16 F10 melanoma cell 에차전초뿌리추출물 1, 10, 100 µg/ml 농도로처리하여관찰한결과농도에따라세포독성이미미하게나타났으며 (Fig. 1), 최고농도인 100 µg/ml 에서 71.1% 세포생존율을나타냄으로써인체에적용하였을때안전성에있어효과적인물질이라사료된다 시험관내에서의항산화작용식물화학물연구조사에의하면차전초에는 iridoid glycosides, phenylpropanoid glycosides, flavonoids 및 phenylcarboxylic acid 등의항산화및항염증작용이있는성분을함유하고 Fig. 1. The cytotoxicity of Plantago asiatica L. Root extract. Results are means±sd from 4 separate experiments. Fig. 2. Anti-oxidant activities of Plantago asiatica L. Root extract in the DPPH radical scavenging activity assay. Results are means±sd from 4 separate experiments. 있으며 [10], 차전초에다량함유하고있는 iridoid glycosides 인 aucubin 은항산화, 항염증작용에우수한성분으로알려져있다 [11]. 따라서다양한항산화물질을함유하고있는차전초뿌리추출물의자체적인항산화작용을알아보기위하여 DPPH radical 소거활성을측정하였다. 차전초뿌리추출물적용농도인 1 µg/ml 와 10 µg/ml 에서는미미한소거활성을나타내었으나 100 µg/ml 에서는 23.6% 항산화활성을나타내었다 (Fig. 2). 이러한결과는홍충의등의연구에서 Fe- NTA 에의해신장이손상된랫드에차전초추출물을투여한결과농도의존적으로산화스트레스를감소시킨연구결과와유사하다 [12]. 따라서차전초구성성분인 Phenylpropanoid glycoside 등의항산화물질의상호작용에의해활성산소에대한방어작용을나타내는것으로사료되며차전초뿌리추출물자체의항산화효능이있는것으로사료된다 RAW 세포에서 reactive oxygen species (ROS) 소거활성시험관내에서차전초뿌리추출물자체가항산화작용을나타내고있는것을확인하였고, 이실험에서는 DHE, DCF- DA, DHR 각각의형광물질을이용하여세포내에서생성되는 superoxide anion, hydrogen peroxide, hydroperoxide 를측

202 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(3): 199-204 (2014) Fig. 3. Effect of Plantago asiatica L. Root extract on intracellular superoxide generation in RAW 264.7 cells.

4 202 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(3): (2014) Fig. 3. Effect of Plantago asiatica L. Root extract on intracellular superoxide generation in RAW cells. Results are means±sd from 4 separate experiments. Fig. 4. Effect of Plantago asiatica L. Root extract on intracellular H 2 O 2 generation in RAW cells. Results are means±sd from 4 separate experiments. Fig. 5. Effect of Plantago asiatica L. Root extract on intracellular hydroperoxide generation in RAW cells. Results are means±sd from 4 separate experiments. 정하였다. 인체는호흡과정을통해끊임없이활성산소가생성되고있으며활성산소에의해염증및노화의진행이가속화되고있다. 또한 ROS 는세포내 DNA 의변형, protein oxidation, lipid peroxidation 등의손상을나타내어암, 당뇨병, 동맥경화, 염증등의다양한질병을유발하고 [13,14] 최근연구에서 ROS 가비만과같은대사성질환에밀접한관계를갖 는것으로보고하였다 [15]. DHE 는 superoxide anion 과반응하여형광을내는물질로전환되는것을이용하여세포내생성되는 superoxide anion 을측정하였다. Silica 에의해생성된 ROS 는차전초뿌리추출물에의해농도의존적으로미약하게억제하는효과를나타내었으며최고농도에서 superoxide 는 22.1% 억제하였고 (Fig. 3), DCF-DA 를이용한세포내 H 2 O 2 생성은최고농도에서 27.2% 억제하였다 (Fig. 4). 세포의기능변화를촉진시키는 hydroperoxide 의생성억제는세포기능유지에있어서매우중요하다. DHR 을이용하여세포내에생성된 hydroperoxide 를측정한결과최고농도인 100 µg/ml 에서 19.1% 억제하였다 (Fig. 5). 이러한결과는차전초씨앗추출물에서얻어낸 polysaccharide 의항산화능을실험한연구에서농도의존적으로강한 radical scavenging rate 를나타내며특히 79.7% 의 superoxide 소거능을밝힌 Ye 등 [16] 의연구를뒷받침할수있다. 또한유민정등 [17] 의연구에서밝힌질경이추출물이 H 2 O 2 에의해발생되는산화적스트레스로부터세포보호효과를나타낸연구결과와유사하다. 따라서차전초가함유하고있는다양한성분중에항산화효능이있는 aucubin, phenylpropanoide 등유효한성분에의해활성산소를억제하는결과를나타낸것을알수있었으며차전초뿌리추출물을응용한항산화, 항노화화장품소재로써가능성이있는것으로사료된다 B16 F10 melanoma 세포에서 tyrosinase 활성차전초전초에는다량의 flavonoid 를비롯하여 phenylpropanoid glycoside acteoside 등의 tyrosinase inhibitor 를포함하고있으며 [18], 식물로부터분리된 acteoside 는 tyrosinase inhibitor 로알려져있는 arbutin 과유사하게 tyrosinase 효소활성을억제한다 [19]. 표피의과색소침착은과도한멜라닌합성에의해발생하며 tyrosinase 는멜라닌의형성에사용되는효소로써 tyrosinase inhibitor 는비정상으로침착된색소관리및피부미백화장품소재로사용되고있다. 차전초뿌리추출물이멜라닌합성에관여하는 tyrosinase 활성에미치는영향을알아보기위해 L-DOPA 를이용하여정제한 tyrosinase 활성을측정하였다. 대조약물로사용한 arbutin 100 µm 에서 42.2% 효소활성을억제하였으며차전초뿌리추출물농도의존적으로 tyrosinase 효소활성을억제하는경향을나타내었으며최고농도인 100 µg/ml 에서는 31.7% 활성을억제하였다 (Fig. 6). 따라서차전초뿌리추출물을활용한피부미백제개발이가능할것으로사료된다 멜라닌생성저해멜라닌은멜라닌세포에의해생성되며피부색을결정하는색소이다 [20,21]. 멜라닌은자외선으로부터피부를보호하는중요한기능을갖고있지만색소가과도하게생성하게되면기미, 주근깨등과색소침착이나타나게된다. 피부가자외선에노출되면 ROS 가생성되는데이러한활성산소는멜라닌생합성을촉진할뿐만아니라 DNA 를파괴하고멜라닌

차전초뿌리추출물이항산화활성및피부미백작용에미치는영향 203 Fig. 6. Effect of Plantago asiatica L. Root extract on L-dopa induced tyrosinase activity in MSH-stimulated in B16 F10 melanoma cells.

Results are means±sd from 4 separate experiments.

5 차전초뿌리추출물이항산화활성및피부미백작용에미치는영향 203 Fig. 6. Effect of Plantago asiatica L. Root extract on L-dopa induced tyrosinase activity in MSH-stimulated in B16 F10 melanoma cells. Results are means±sd from 4 separate experiments. Fig. 7. Inhibitory activity of Plantago asiatica L. Root extract on melanin synthesis in MSH-stimulated in B16 melanoma cells. Results are means±sd from 4 separate experiments. 본연구는식물에존재하며생리적, 약리적효능이있는 flavonoid 와 aucubin, tannin, plantaginin 등의성분을포함하고, 재배가용이한차전초중연구가미미한뿌리를추출하여항산화및미백작용에미치는영향을관찰함으로써추후항산화, 미백과관련된기능성화장품의원료로써의활용방안을모색하고자하였다. 연구의결과는다음과같다. B16 F10 melanoma cell 을이용하여세포독성을실험한결과최고농도인 100 µg/ml 에서 71.1% 세포생존율을나타냄으로써인체에적용하였을때안전성에있어효과적인물질이라사료된다. 다양한항산화물질을함유하고있는차전초뿌리추출물의자체적인항산화작용을알아보기위하여 DPPH radical 소거활성을측정한결과적용농도인 1 µg/ml 와 10 µg/ml 에서는미미한소거활성을나타내었으나 100 µg/ml 에서는 23.6% 항산화활성을나타내었다. DHE, DCF-DA, DHR 각각의형광물질을이용하여세포내에서생성되는 superoxide anion, hydrogen peroxide, hydroperoxide 를측정한결과모두농도의존적으로 ROS 생성을억제하는것으로나타났다. 차전초뿌리추출물이멜라닌합성에관여하는 tyrosinase 활성에어떠한영향을미치는지알아보기위해 L-DOPA 를이용하여정제한 tyrosinase 활성에미치는영향을관찰한결과차전초뿌리추출물농도의존적으로 tyrosinase 효소활성을억제하는경향을나타내었으며최고농도인 100 µg/ml 에서는 31.7% 억제하였다. 차전초뿌리추출물이멜라닌생성에미치는영향에대해관찰한결과농도의존적으로멜라닌생성을억제하는경향을나타내었으나미미하게억제하는것으로나타났다. 이상의결과를종합해볼때차전초뿌리추출물은항산화와 tyrosinase inhibitor 로써기능이우수하므로기능성화장품소재개발에있어서효과적으로활용이가능할것으로사료된다. 세포의과도한증식과세포자멸사를유도한다 [22]. 따라서산화방지제와같은 ROS 소거와 ROS 생산억제는멜라닌색소에의한과색소침착을감소시키거나자외선에의한멜라닌생성을억제할수있다 [23]. 최근연구에서천연물을이용한멜라닌생성저해물질개발이활발하게진행되고있으며멜라닌생성저해효능이있는 flavonoid 를함유하고있는차전초뿌리추출물이멜라닌생성에미치는영향에대해관찰하였다. 대조군으로사용한 arbutin 100 um 에서는 31% 멜라닌생성을억제하였으며, 차전초뿌리추출물은농도의존적으로멜라닌생성을억제하는경향을나타내었으나최고농도엔 100 µg/ml 에서 7% 로미미하게억제하는것으로나타났다 (Fig. 7). 이러한결과는멜라닌생성에관여하는 tyrosinase 활성억제반응에서는효소활성이활발하게이루어지고있는반면멜라닌세포에는직접적으로영향을미치지않는것으로사료된다. 4. CONCLUSION REFERENCES 1. Sung, H. K., M. H. Park, and K. J. Jang (2008) Medicinal plants native to wild. 2nd de., p. 86. munyei press. Seoul. Korea. 2. Cha, N. H., E. J. Seo, and S. R. Sok (2012) Factors influencing the successful aging of older korean adults. Contemporary Nurse 41: Smith, J. R. and O. M. Pereira-Smith (1996) Replicative senescence: implications for in vivo aging and tumor suppression. Science 5: Allsopp, R. C., H. Vaziri, C. Patterson, S. Goldstein, and E. V. Younglai (1992) Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: Miquel, J. (1998) An update on the oxygen stress-mitochondrial mutation theory of aging: genetic and evolutionary implications. Exp. Gerontol. 33: Takahashi, H., M. Kosaka, Y. Watanabe, K. Nakade, and Y. Fukuyama (2003) Synthesis and Neuroprotective activity of bergenin derivatives with antioxidant activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: Shin, Y. S., J. E. Lee, I. K. Yeon, H. W. Do, J. D. Cheung, C. K.

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,