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명민 평
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1 CANCER PREVENTION RESEARCH ORIGINAL ARTICLE 마우스악성흑색종세포에서 L-Arginine 이항산화작용과멜라닌생성에미치는영향 숙명여자대학교약학대학 송경희ㆍ김미지ㆍ유지선ㆍ김안근 The Effect of L-Arginine on Antioxidant Activity and Melanogenesis in Murine Melanoma Cells Kyung Hee Song, MiJi Kim, Ji Sun Yu and An Keun Kim College of Pharmacy, Sookmyung Women's University, Seoul , Korea Pigmentation protects cells from harmful effects of sunlight or oxidative stress. It is due to the synthesis and dispersion of melanin. Our study has shown to melanogenesis effect of L-arginine on B16F10 cells, murine melanoma cells. L-arginine (0 200 mm) exhibited effective cell growth inhibition dosedependently. L-arginine decrease level of ROS (reactive oxygen species). Further investigation revealed that L-arginine is a factor of melanogenesis. tyrosinase activity and Melanin contents increased dose dependent manner. Taken together, these findings suggest that L-arginine has to decrease the level of ROS, and increase tyrosinase activity and melanogenesis. (Cancer Prev Res 14, , 2009) Key Words: L-Arginine, Antioxidant activity, Melanogenesis, Murine melanoma cells, ROS 서 산소는지구상에서가장많은원소로서호기성생물은이렇게풍부한산소를전자수용체로하는호흡을통해에너지를획득하며대사과정의부산물로 hydroxyl radicals, superoxide anion, hydrogen peroxide와 nitric oxide를포함하는반응성이매우큰 reactive oxygen species (ROS) 를생산한다. 1) ROS는사실상산소를소비하는거의모든세포내부기관의일상적인대사과정에서발생하고따라서각각의기관은산화적스트레스의중요한표적이된다. 2) 많은연구에서산화적스트레스가다양한질병과환경적세포손상에공통요인임을지적하고있다. 또한이러한다양한생물학적그리고비생물학적스트레스가활 론 성산소종에의한것임을규명하고있다. 3) 자외선이나환경오염그밖의외부요인의자극에대해피부세포는방어기전으로포유동물의표피기저층에존재하는 melanocyte의 melanosome에서멜라닌을합성하며, melanocyte가멜라닌을형성할때 tyrosine이 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) 으로전환하는과정을거친다. 4) 이과정에서 tyrosinase가중요한역할을하며, 멜라닌생성의중요조절효소이다. 이러한멜라닌은생체내 cysteine과 glutathione이존재할때효소의작용에따라 eumelanin과 pheomelanin으로분류되며 (Fig. 1), 5) 이들의형성비율에의해동물들의피부, 눈동자, 머리카락의색결정에중요한요인이되고있다. 6) L-Arginine은모든생물체에존재하는아미노산이며특히어류의정자에많고발육기의동물에게는필수적 책임저자 : 김안근, , 서울시용산구청파동 52 번지숙명여자대학교약학대학 Tel: , Fax: akkim@sookmyung.ac.kr 접수일 :2009 년 9 월 3 일, 게재승인일 :2009 년 9 월 15 일 Correspondence to:an Keun Kim College of Pharmacy, Sookmyung Women's University, 52, Cheongpadong, Yongsan-gu, Seoul Korea Tel: , Fax: akkim@sookmyung.ac.kr 242

2 송경희외 3 인 : 마우스악성흑색종세포에서 L-Arginine 이항산화작용과멜라닌생성에미치는영향 243 인아미노산이다. L-arginine에의해형성된 nitric oxide (NO) 는혈관압축, 내피의기능장애, 백혈구정착, 스트레스에작용함으로서항동맥경화성작용에중요한역할을한다. 또한 L-arginine은항산화작용이있는것으로도알려져있다. Moncada 등의연구결과 7) 에서 L-arginine은생장호르몬의분비를촉진하고생체내에서여러가지생리조절기능을가지고있는 nitric oxide를합성하는효소의기질로이용되며, 또한유아의필수아미노산으로서근육에의한아미노산흡수를자극하고여러조직에서단백질합성을증가시키는 somatotrophin을유리하는데가장강력한아미노산자극물질로알려져있다. 본실험에서는마우스악성흑색종세포인 B16F10에서항산화작용과멜라닌생성과의관계를알아보기위하여 L-arginine이멜라닌생성에미치는영향을확인하기위해마우스의흑색종세포인 B16F10 세포에 L-arginine을처리하여그변화를검토하였다. 세포생존율을알아보기위하여 MTT assay, 항산화작용을검토하기위해서 ROS level의변화등을측정하였다. 또한멜라닌생성효과를알아보기위하여 tyrosinase 활성변화와 melanin 함량을측정하여 L-arginine이멜라닌생성미치는영향을살펴보고자하였다. 1. 시약및기기 재료및방법 RPMI 1640 powder medium, antibiotics (10,000 units/ml penicillin G sodium, 10,000μg/ml, streptomycin sulfate), trypan blue는 Gibco BRL life Technologies Inc. (Carlsbod, CA, USA) 제품을사용하였고, fetal bovine serum (FBS) 은 Bio Whittaker TM (Walkersville, MD, USA), protease inhibitor cocktail tablets은 Roche에서구입하여사용하였다. MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide], bicinchonic acid protein assay kit, β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form (β-nadph), glutathione reduced form, hematoxylin는 Sigma Co. (St. Louis, USA) 에서구입하여사용하였다. ELISA reader는 Bio-Tek instrument Inc. (Washington, USA), cytofluor 2,350 plate reader는 Millipore (Bedford, MA, USA), CO 2 incubator (Forma science), tabletop centrifuge (Hanil scienceindustrial Co. Ltd.) inverted microscope는 Olympus CK2 (Massachusetts, USA), UV/visible spectrophotometer 는 Ultraspec 2000 (Pharmacia Biotech.) 제품을사용하였다. 2. 세포배양 실험에사용한세포는 mouse melanoma로부터유래된 B16F10 cell로한국세포주은행 (Korean cell lines bank) 으 Fig. 1. Overall view of melanogenesis. 5)

3 244 Cancer Prevention Research Vol. 14, No. 3, 2009 로부터분양받았다. 10% FBS와항생제 (penicillin G 100 sodium 10,000 units/ml, streptomycin sulfate 10,000μg/ml), 1 mm sodium pyruvate를포함하는 RPMI 1640 배지를배양액으로하여 37 o C, humidified 5% CO 2 incubator에서배양되었다. 배양액의 ph는 10 mm HEPES와 2 mg/ml sodium bicarbonate를사용하여 로조정하였다. 25 cm 2 tissue culture flask나 75 cm 2 tissue culture flask에서계대배양하고 confluent 되었을때 trypsin-edta 용액을처리하여실험에사용하였다. 3. 세포생존율측정 본실험에서 B16F10 세포 (murine melanoma cell) 에처리할 L-arginine의농도를결정하기위해 MTT assay로측정하여검토하였다. 이분석법은노란색의수용성기질인 MTT가 mitochondria의 dehydrogenase 효소에의해 purple formazan crystal을형성하여진한보라색을띠는원리를이용한것이다. 생성된 formazan의양은살아있는세포수에비례한다. 1) MTT시약제조 : MTT 2.5 mg/ml를 DPBS에녹인후 clean bench에서 0.22μm filter로 filtration 하여사용하였다. 2) 시료처리 : B16F10 cell suspension을 cells/ml의농도로 96 well plate에 100μl씩가하여 24시간안정화시켰다. L-arginine은수용액상태로 mm의농도로처리하였다. Control은 sample 대신 DMEM 배지 20μl를넣었다. 그후 incubator에서 24시간배양하였다. 3) MTT측정 : 배양한 96 well plate에서 media를 suction 한후, MTT시약 50μl/well을넣고 4시간동안배양기에방치하였다. 그후상층액을제거하고 DMSO를 well당 100 μl씩가하여 1분간 shaking하여 formazan을완전히용해시킨후 ELISA pleate reader를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. 결과는 control (100%) 에대한 % 로나타내었다. 4. Reactive oxygen species level 측정 미리배양한 96 well plate (B16F10 cell suspension을 cells/ml) 에 L-arginine수용액을농도별로넣어처리하였다. Control은 DMEM배지 20μl를넣었다. Incubator에서 2시간배양후 96 well plate를꺼내어 PBS로 2번씻은후각 well당 3.6% DCFH-DA를가하고 30분동안차광한상태로 incubator에보관하였다. Cytofluor 2350 plate reader 로 5분마다흡광도를측정하였다. Emission 파장은 485 nm의 excitation wavelength와 530 nm의 emission wavelength 에서측정하였다. 8) 5. Tyrosinase 활성변화측정 Tyrosinase activity 측정은 tyrosinase 활성에의해 L-DOPA 가 dopachrome으로변하는원리를이용한것이다. 여기서활성이강할수록흡광도가높다. Protein preparation은 100π dish에세포를배양 ( cells/dish) 하여 L-arginine을각각 0.5, 25, 100 mm로했으며, control은 L-arginine 대신 media를넣어주었다. 24시간배양후 DPBS로 2회 washing 하고 scraper로 dish를긁어서세포를포합했다. 15 ml conical tube에농도별로세포를넣고원심분리한후 (1,500 rpm, 10분 ), 각 tube에 triton X-100가 1% (w/v) 로함유되고있는 10 mm sodium phosphate buffer (ph 6.8) 을넣어단백질을분해시키고, tube 에모아 17,000 rpm, 15 min, 4 o C에서원심분리하였다. 이때상층액에서는 tyrosinase activity를측정하고, pellet 에서는 melanin 함량을측정하였다. Protein의정량은 Bradford법을이용해측정하였다. Tyrosinase activity 측정은단백질정량후농도별로 96 well-plate에상층액을 40μl/well씩넣는다. 그리고 0.1 M sodium phosphate buffer (ph 7.2) 와기질인 2 mg/ml L- DOPA를합하여총 200μl가되게하여각 well에첨가하고 37 o C에서 1시간동안반응시켰다. 여기서생긴 dopachrome의양은 ELISA reader를이용하여 475 nm에서흡광도를측정하였다. 6. melanin contents 정량 96 well plate에농도별로 pellet에 1 N NaOH 100μl와증류수 200μl를넣은후, 60 o C에서 1시간동안배양시켰다. 이후 96 well plate에농도별로 200μl씩분주하여, 405 nm에서흡광도를측정하였다. 멜라닌표준품으로부터얻은표준검량선을이용하여생성된멜라닌양을산출하였다. 7. 통계처리본연구의그래프와표의모든수치는각실험횟수에대한평균과표준편차로표시하였으며, 모두 triplicate로세차례이상수행하였다. 각 sample의통계적유의성에대한검증은 student t-test를시행하여계산하였으며, p< 0.05인값에대해유의적인것으로처리하였다. 결과및고찰본연구에서는 L-arginine의항산화작용과멜라닌생성효과를알아보기위하여침습성이강하고전이가빠른

4 송경희외 3 인 : 마우스악성흑색종세포에서 L-Arginine 이항산화작용과멜라닌생성에미치는영향 245 마우스악성흑색종세포에서생존율과 ROS의억제효과, 그리고 tyrosinase 활성도와멜라닌생성효과를알아보았다. B16F10 세포에서생존율을알아보기위하여 MTT assay를실행하였고이때배양기간은 2일로고정하고, 농도는 50, 100, 150, 200 mm을각각투여하여실험하였다. 세포생존율을확인한결과 L-arginine의 50 mm, 100 mm에서는생존율이감소되지않았으나이 L- arginine의농도가증가함에따라농도의존적으로세포생존율이감소되어 150 mm에서는 15%, 200 mm에서는 40% 까지감소되는것으로나타났다 (Fig. 2). 본실험에사용한 L-arginine의농도는 50 mm 농도에서감소되지않았으므로이농도를최고농도로하여모든실험을실행하였다. 활성산소종 (ROS) 은 O 2 가전자전달계에의해물로환원되어가는동안에전자한개씩에의해순차적으로환원되면서생성되는 radical 등의파생물로, 과잉생성될경우세포에손상을촉진시키며, DNA 돌연변이를유발해다양한종류의암을비롯한난치질환의근원이된다고알려져있다. 9) 이러한 ROS의생성억제와제거는항산화능의지표가되므로 L-arginine도 B16F10 세포에서 ROS에어떠한영향을미치는지알아보고자실험을하였다. L-arginine를세포에처리하고 30분배양한후다음과같은측정한결과를얻었다. 25 mm 농도에서 ROS level 의농도를 30% 감소시키고, 50 mm에서는 70% 를감소시킴에따라 ROS도농도의존적으로억제됨을확인하였다 (Fig. 3). Melanin은 tyrosine으로부터 tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), dopachrome tautomerase (TRP-2) 에의해서합성되는데, 이중 tyrosinase는 L-DOPA (dihydroxyphenylalanine) 가 melanin으로형성되는 cascade 반응에관여하는효소로서전사인자인 MITF와도밀접한관련이있다. 10) 따라서 L-arginine의 tyrosinase 활성에미치는영향을검토 Fig. 3. Measurement of reactive oxygen species (ROS) level after L-arginine treatment. The melanoma cells ( /well) were incubated with L-arginine at various concentration and then 5 μm was added as a substrate for ROS. After incubation for 30 min, ROS levels were measured by spectrofluoremeter (excitation: 485 nm, emission: 530 nm). Results are representative of three experiments and each performed in triplicates. Fig. 2. Cell viability of B16F10 cells after treatment with L-arginine. The cells were exposed to various concentrations of L-arginine for 24 hr. Percentage of cell viability was determined by using MTT assay. Results are expressed as percentage of control. Values are means±sd and were obtained from three different experiments. a p<0.05: Significantly different from untreated control cells. Fig. 4. Tyrosinase activity of L-arginine on B16F10 melanoma cells. Tyrosinase activity was measured after cells were exposed to various concentration of L-arginine for 24 hr. Results are expressed as percentage of control. Values are means± SD and were obtained from three different experiments.

5 246 Cancer Prevention Research Vol. 14, No. 3, 2009 작용과관련이있는것으로보고되어있으나 L-arginine 을투여한경우에는다르게나타났다. 즉농도의존적으로 ROS를감소시키나 ROS를제거시키는항산화작용효과와는달리 tyrosinase 활성측정실험결과는 L-arginine의농도가증가함에따라 tyrosinase 활성도높아짐을알수있었다. 이로인하여멜라닌생성도농도의존적으로촉진시키는것으로나타났다. 이러한결과는향후연구를진행하여멜라닌생성을필요로하는백반증이나의치료에도활용할수있는가능성이있는것으로생각된다. 결 론 Fig. 5. Melanin contents of B16F10 cells after treatment with L-arginine. The cells were treated with various concentration of L-arginine for 24 hr. Results are expressed as percentage of control. Values are means±sd and were obtained from three different experiments. a p<0.05: Significant different from untreated control cells. 하기위해 tyrosinase activity를측정하였다. Tyrosinase효소의활성정도에따라 dopachrome의생성에비례하여영향을주므로 L-arginine을투여하지않은 control에서의 dopachrome의양 (100%) 으로하여비교검토하였다. Tyrosinase activity 측정결과를보면 5 mm과 10 mm로처리하였을때는거의영향을주지않았으나 25 mm에서는 19%, 50 mm에서는 48% 가증가되었다 (Fig. 4). L-Arginine에의해영향을받은 tyrosinase activity는 melanin생성에도영향을미친다. Melanin 색소형성도 tyrosinase 활성과유사한양상을나타내었다. 저농도에서는 melanin 색소의형성에거의영향을미치지않았으나농도가높아지면서 melanin양도증가하여 25 mm에서는 control (100%) 대비 162%, 50 mm에서는 293% 가증가하였다 (Fig. 5). 멜라닌은산화적스트레스나 NO 등에의한자극에의해서도생성이되는데 10) NO는세포내 cgmp를합성하는 guanylate cyclase를활성화시키면서효과를나타낸다. 11) 실제로, NO가증가하게되면 tyrosinase gene expression가유도되고, NO 증가로 tyrosinase activity와 tyrosinase protein level이증가하게된다. Tyrosinase acitivity가증가하면시간에따라 tyrosinase protein level도상승하게된다. L-arginine이 L-citrulline으로전환되는과정에서 nitric oxide (NO) 가생성되는데 free radical gas로서세포내또는세포외의신호전달분자로서중요한역할을한것으로볼수있다. L- Arginine에서유도되는 NO 농도증가가 melanogenesis 활성화시켜 melanin 형성을촉진시킨것으로도볼수있다. 많은논문에서항산화작용이있는것이멜라닌억제 L-Arginine을마우스악성흑색종세포인 B16F10에처리하여세포생존율을확인한결과는농도가증가함에따라농도의존적으로감소하여 200 mm에서는세포생존율이 40% 까지감소됨을알수있었다. 마우스악성흑색종세포인 B16F10에서 L-arginine의항산화효과를알아보기위하여 ROS level을측정한결과농도가증가함에따라 ROS의형성이농도의존적으로억제됨을확인하였다. 멜라닌생성작용은 tyrosinase 활성과유사한양상을나타내어저농도에서는거의영향을미치지않았으나고농도에서는농도의존적으로상승하는것으로나타났다. 참고문헌 1) Boorish ET, Prior WA. Venuugopal SDNA synthesis is blocked by cigarette tar-induced DNA single-strand breaks. Carcinogenesis 8, , ) Halliwell B. Free radicals in biochemistry and medicine. Encyclopedia of Molecular Biology and Molecular Medicine 2, , ) Scandalios JG. Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses. Plainview, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pp , ) Ishikawa M, Kawase I, Ishii F. Glycine inhibits melanogenesis in vitro and causes hypopigmentation in vivo. Biol Pharm Bull. 30, , ) Furumura M, Sakai C, Potterf SB, Vieira WD, Barsh GS, Hearing VJ. Characterization of genes modulated during pheomelanogenesis using differential display. Proc Natl Acad Sci USA 95, , ) Janeke G, Siefken W, Carstensen St, Springmann G, Bleck O, Steinhart H, Hoger P, Wittern KP, Wenck H, Stab F, Sauermann G, Schrener V, Doering T. Role of Taurine Accumulation in Keratinocyte Hydration. J Invest Dermato. 121, , 2003.

6 송경희외 3 인 : 마우스악성흑색종세포에서 L-Arginine 이항산화작용과멜라닌생성에미치는영향 247 7) Moncada S, Palmer RM, Higgs EA, Nitric oxide; physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev 43, , ) Sattler M, Winkler T, Verma S, Byrne CH, Shrikhande G, Salgia R, Griffin JD. Hematopoietic growth factors signal through the formation of reactive oxygen species. Blood 93, , ) Vistica DT, Skehan P, Scudiero D, Monks A, Pittman A, Boyd MR. Tetrasodium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Res 51, , ) Joung HS, Song KH, Kim AK. Antimelanogenic effect of taurine in murine melanoma B16F10 cells. Yakhak Hoeji 51, , ) Minoru Sasaki, Toshio Horikoshi, Hideyo Uchiwa, Yoshiki Miyachi Up-regulation of tyrosinase gene by nitric oxide in human melanocytes. Pigment Cell Res 13, , 2000.

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untitled CANCER PREVENTION RESEARCH ORIGINAL ARTICLE Mouse 악성흑색종에서 Lipoic Acid 가항산화효소계에미치는영향 숙명여자대학교약학대학약학부 정수연ㆍ김안근 The Effect of Lipoic Acid on Antioxidant Enzyme System in Murine Melanoma Cells Suyeon Jung and