The Korean Journal of Pathology 2006; 40: 439-47 자궁경부세포진검사이상과자궁경부종양소견을보인환자에게서제한효소질량다형성분석과 DNA chip을통한인유두종바이러스유전자형검사의유용성비교 정현재 김성남 1 이은희 1 지미선 1 김민아 2 황선영 조희정 김수옥홍선표 ( 주 ) 진매트릭스중앙연구소 1 녹십자의료재단진단검사의학과 2 서울대학교의과대학병리학교실 접수 : 2006년 9월 20일게재승인 : 2006년 11월 8일 책임저자 : 홍선표우 449-913 경기도용인시기흥구보정동 314 ( 주 ) 진매트릭스중앙연구소전화 : 031-260-9089 Fax: 031-260-9087 E-mail: sunphong@genematrix.net * 본연구과제는대한민국과학기술부 (MO- ST) 와한국과학재단 (KOSEF) 의특정연구개발사업프로그램 (M10640010000-06N4-001-00210) 의지원을받아이루어졌음. Comparison of Efficacy of Human Papilloma Virus enotyping Assays using Restriction Fragment Mass Polymorphism and DNA Chip Analysis in Patients with Abnormal Pap Smear and Uterine Cervical Cancer Hyun Jae Chung, Sung-Nam Kim 1, Eun Hee Lee 1, Mi Sun Jee 1, Min A Kim 2, Sun Young Hwang, Hee Jung Cho, Soo-Ok Kim and Sun Pyo Hong R&D Center, enematrix Inc., Yongin; reen Cross Reference Laboratory 1, Seoul; Department of Pathology 2, Seoul National University School of Medicine, Seoul, Korea Background : High-risk human papilloma virus (HPV) infection is the primary cause of cervical cancer; there is a need for more sensitive and reliable methods for HPV genotyping to use as screening tools for early detection and intervention. Methods : A novel MALDI-TOF MSbased assay, termed Restriction Fragment Mass Polymorphism (RFMP) was developed for multiple HPV genotyping. Its performance was compared with DNA chip technology. The study was based on 164 cases classified as normal (n=40), ASCUS (n=53) and invasive squamous cell carcinoma (SCC, n=71) by a PAP smear and/or cervical colposcopic biopsy. Results : High-risk genotypes were detected in 7.5%, 47.2% and 97.2% in normal, ASCUS and SCC groups by RFMP, and in 20.0%, 41.5% and 90.1% using DNA chip technology, respectively. The results showed substantial concordance, with a kappa coefficient of 0.688, between the methods. Diagnostic sensitivity and specificity for cervical cancer were found to be 97.2% and 92.2% with RFMP and 90.1% and 80.0% using DNA chip microarrays. Conclusions : RFMP and DNA chip technologies were shown to be reliable methods for HPV genotyping with a high concordance. The improved sensitivity and specificity should make RFMP a viable option for the management of women with cervical neoplastic lesions. Key Words : Human papillomavirus; enotype; Matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry 자궁경부암은전세계적으로유방암에이어두번째로흔한여성암이다. 한국에서는유방암, 위암, 대장암에이어네번째로많이발생하는암으로매년약 5,000명정도의환자가발생하고, 발병률은인구 100,000명당 15.3명으로보고되고있다. 자궁경부암의주된발생원인으로알려진인유두종바이러스 (HPV) 는게놈 (genome) 염기서열의유사성에따라현재 80종이상의유전자형이발견되었고, 이중 40여종이생식기를감염시키는것으로알려져있다. 1 HPV 유전자형은발암발생기전과관련하여크게고위험군 (high risk group) 과저위험군 (low risk group) 으로나뉜다. 고위험군에속하는아형으로는 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82이있고, 발암발생과관련이적은저위험군으로는 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 등으로보고된바있다. 2,3 HPV 감염여부를확인하기위한분자유전학적방법으로는 line probe assay, hybrid capture, HPV type-specific probe를이용한 southern blot, dot blot, filter in situ hybridization, type-specific PCR, general-primer PCR, DNA chip과 RFLP, sequencing 등이알려져있으며, 이중에서국 439
440 정현재 김성남 이은희외 6 인 내 HPV DNA 검사시에는 hybrid capture assay, HPV DNA chip (microarray) 등을주로사용하고있다. 4-12 Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) 는 analyte의고유질량을측정함으로써, 유전체학 (genomics), 단백질체학 (proteomics) 및진단 (diagnostics) 분야등다양한생물과학분야에서 유용성과정확성이장점으로보고된바있다. MALDI-TOF MS 를이용한유전자분석기법으로최근개발된 RFMP법은유전자내변이가밀집한부위 (genotype-specific motifs) 를직접절단해내고, 조각난유전자절편 (genotype-diagnostic fragments) 의질량을측정함으로써유전자형을파악하는범용적기술이다. RFMP 유전자분석방법은간염바이러스 (HBV, HCV) 임상진단분야에서정확도, 민감도, 대용량처리능력및광범위유전자형진단해상도등이뛰어나국내외에차세대유망신기술로소개된바있다. 13-19 이에본연구에서는 RFMP 방법을이용하여 HPV 유전자형진단법을확립함으로써조기에민감하고특이하게감염된 HPV의정확한유전형을분석하고, 기존의 DNA chip 법과비교분석함으로써임상적유용성과성능을평가하고자하였다. 연구재료 재료와방법 2003년 3월부터 12월사이에의료법인녹십자의료재단종합검진센터임상병리과를찾은 164명의여성을대상으로하였다 ( 평균연령 45.4세 ). 세포진검사 (Papanicolaou smear) 에서정상소견을보인 40명, 미확정비정형편평세포 (ASCUS) 의상피세포이상소견을보인 53명, 세포진검사에서양성소견을보인후질확대경조준하에서생검을시행하여자궁경부암으로진단된 71명의자궁경부조직검체로구성되었다. 검체채취 자궁경부세포진검사를위해환자의자궁경부내막 (endocervix) 을 360 로원을그리듯세차례회전시켜세포를채취하여검체를슬라이드에도말한다음 95% 에탄올에고정하였다. RFMP HPV 유전자형검사를위하여각각의 kit 내에들어있는 cytobrush를이용해자궁경부와외구의세포를충분히채취한다음수송배지 (transport medium) 에즉시담가검사실로이송하였다. 연구방법 RFMP 법을이용한 HPV 유전자형분석염기서열다정렬 (multiple alignment) 한후 HPV 유전자형 에따라염기서열이특이한 motifs (nucleotide number 6604-6625) 를선정하였다. 상기의 genotype-specific motifs의 flanking 부위에결합하고 type IIS 제한효소인지부위가삽입된두쌍의중합효소연쇄반응 (PCR) 프라이머를기존에보고된 RFMP 법을응용하여제작함으로써, 19 해당제한효소로 PCR 산물을절단할경우 genotype-specific motifs를포함하는 oligomers (genotype-diagnostic fragments) 가생산되도록하였다. RFMP를위한 PCR 반응에사용된 PCR 프라이머로는순방향 HPV-RFMP-F, 5 -CMCAHCAYAAATAA- T-3 (nucleotide number 6584-6603), 역방향 HPV-RF- MP-R, 5 -TACTDCKDTRTATCHACMACAT- TAACAAA-3 (nucleotide number 6657-6626) 를사용하여 PCR을시행하였다. 염기서열아래그어진밑줄은인위적으로삽입된 FokI (BstF5I의 isoschizomer) 의인지부위를표시한다. 염기번호는 NCBI enbank accession number AY686584를준용하였다. Qiagen 사의 QIAamp DNA Blood Mini kit (Cat. No.51106) 를사용하고제조사의매뉴얼을준수하여검체에서핵산을정제해냈다. Kwok & Higuchi의가이드라인을준수하여위양성을방지하였다. 20 HPV DNA는 QIAamp DNA Blood Kit (QIAEN Inc, Chatworth, CA, USA) 를이용하여제조사의방법대로분리하였다. 1차중합효소연쇄반응은 PMY09/11 시스템을이용하여증폭하였으며, 21 그후 2차중합효소연쇄반응은 Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbac, CA, USA) 0.4 units, 양방향프라이머각각 0.4 M, 0.2 mm dntp, 50 mm KCl, 20 mm Tris-HCl (ph 8.4) 이었다. PCR은 94 에서5분간초기변성을시킨후, 94 에서 15초, 45 에서 15초, 72 에서 30 초씩 50회반복하였다. 증폭된산물은제한효소절단반응액 10 L와혼합하였다. 반응액은 5 mm potassium acetate, 2 mm Tris-acetate, 1 mm magnesium acetate, 1 mm dithiothreitol 및각각의제한효소 1 unit으로만들었다. FokI 제한효소 (NEB, Boston, MA, USA) 에 37 에서 2시간반응시킨후, 연속하여 BstF5I 제한효소 (NEB, Boston, MA, USA) 에 45 에서 2시간반응시켰다. PCR 산물을제한효소로절단하면두쌍의 7 mer, 12 mer, 13 mer로구성된 genotype-diagnostic fragments가생성되는데 (Fig. 1), 제한효소절단산물을 well 당 5 mg polymeric sorbent를함유한 384-well sample preparation plate (Waters, Milford, MA, USA) 를이용해진공여과 (vacuum filtration) 하였다. 진공이부하된상태에서각 well을 1 M triethylammoniumacetate (TEAA, ph 7.6) 90 L로 equilibration하였다. Well마다 PCR/ 제한효소절단반응액 28 L와 1 M TEAA (ph 7.6) 70 L을가하였다. 0.1 M TEAA (ph 7.0) 85 L로 5회 rinse 한후 vacuum manifold에장착하고, 60% aqueous isopropanol 60 L로용출하여 collection plate (Waters, Milford, MA, USA) 에모았다. Collection plate를 heating block을이용
인유두종바이러스유전자형검사를위한제한효소질량다형성분석과 DNA chip 의유용성비교 441 A T CATTTTTTAACCAACTA TAAACAACCCCATTTTAT PCR T A AT 7 mer TCATT 13 mer TTACCTAAACAA CATTTTTTAACCAACTA TAAACAACCCCATTTTAT Fok I, BstF5I cleavage 12 mer TTTTAAC 12 mer CCCCATTTTA MALDI-TOF Mass Spectrometry TA 13 mer CAACTATTTTTA 7 mer ATAAACA Fig. 1. Schematic diagram of the RFMP HPV genotyping strategy. PCR was performed with primers designed to introduce a type IIS restriction endonuclease recognition sequence (AT; FokI) ahead of the genotype-specific motifs on amplification. The enzymatic digestion of the products released a pair of 7 mer, 11 mer, 13 mer fragments representing nucleotide sequences shown in bold italic, and then masses of the resulting oligonucleotide fragments were analyzed by the mass spectrometer. Cleavage sites of FokI and BstF5I, an isoschizomer for FokI, are indicated by solid and open triangles, respectively. 해 115 에서 90 분간방치하였다. Desalted reaction mixture 를 50 mg/ml 3-hydroxy picolinic acid (Sigma, Saint Louis, MO, USA), 0.05M ammonium citrate picolinic acid (Sigma, Saint Louis, MO, USA), 30% acetonitrile picolinic acid (Sigma, Saint Louis, MO, USA) 를함유한 matrix solution과재현탁한후 3 L을 384-well anchorchip plate (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA) 에점적하였다. Linear MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics Biflex IV, Billerica, MA, USA) workstation을 이용해 mass spectra를 negative ion, delayed extraction mode로얻었다. 각 20-50개의 laser pulse로부터 time-offlight data를 transient digitizer에기록하였고, averaged spectra를 workstation에내장된 data processing software (Bruker DataAnalysis for TOF 1.6m) 를통해 mass로전환하였다. 얻어진각질량값을유전자형별로예상되는질량패턴 (Table 1) 과비교하여유전자형을결정하였다. HPV DNA Chip을이용한 HPV 유전자형분석 HPVDNAChip TM (Biomedlab, Korea) system은 22개의 type-specific probe를가지고있다. 11,12 15가지의고위험군 (HPV- 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 69) 과 7가지의저위험군 (HPV-6, 11, 34, 40, 42, 43, 44) 으로구성되어있다. 자궁경부검체를 HCⅡ에서사용한동일한 cytobrush를이용하여가검물을채취한후 1 ml의 1XPBS를첨가한다음 10 분간 1,200 rpm으로원심분리하였다. 10 L의 0.1N NaOH/2M NaCl을가하여 95 에서 10 분간중탕하였다. 그런다음 90 L의 TE buffer에녹여서 DNA 분리 kit (Bioneer, Daejeon, Korea) 를이용하여 HPV DNA를추출하였다. DNA를분리한다음 Pd5+/p6d+ primers (P5d+, 5 -TTTKTTACHTK- TDATACYAC-3 ; P6d+, 5 -AAAHATA AAYTY- AADTCATAYTC-3 ; K, /T; H, T/A/C; D, A/T/; Y, T/C) 를사용하여인유두종바이러스를증폭시켰다. DNA 증폭여부를판단하기위한 control로 beta-globin을이용하였고 PPC03/PC04 primers (PC03, 5 -ACACAACT- TTTCACTAC-3 ; PC04, 5 -CAACTTCATCCACTT- CACC-3 ) 로증폭하였다. 중합효소연쇄반응 (PCR) 은 94 에서 5분간초기변성을시킨후, 94 에서 1분, 50 에서 2분, 72 에서 30초간 5주기로수행하였다. 그런다음다시 94 에서 1 분, 50 에서 2분, 72 에서 15초간 30주기를수행하여 HPV DNA를증폭시켰다. 이증폭산물은 72 에서 5분간항온하여증폭을완료한후, 4 에서보관하여 HPV DNA를증폭시켰다. HPV PCR product 10 L, beta-globulin PCR product 5 L 와멸균수 25 L에 3N NaOH 4 L를첨가하여실온에서 5분간방치하였다. 그런다음 1M Tris-HCl 2 L와 3N HCl 4 L 를가한후얼음위에서 5분간방치하였다. 그러고나서 12X SS- PE 50 L와 10% SDS 0.5 L를첨가하여 40 에서교잡반 응후세척하였다. DNA Chip scanner (SI Lumonics, Ottawa, Canada) 를이용하여발색된소식자의종류에따라 HPV DNA 유전자형을확인하였다. HPV PCR 및염기서열분석 HPV PCR은 PMY09/11 primers 세트를이용하여증폭하였으며, 21 증폭된산물을동일한 primers 세트를이용하여 Big- Dye R Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, CA, USA) 로염기서열분석반응을시행하였다. 염기서열을해석, 비교하기위해 Los Alamos National Laboratories HPV Database (http://hpv-web.lanl.gov) 에서 HPV reference sequence를취하였다. 특히 L1 유전자에서잘보존된염기서열부분과유전자형에특이적인염기서열부분을 Clustal X
442 정현재 김성남 이은희외 6 인 Table 1. Expected masses of oligonucleotides resulting from restriction enzyme digestion of PCR products according to HPV genotypes Expected Molecular Weight (Da) enotype Expected Fragment Sequence Risk 7 mer 13 mer 12 mer 12 mer 13 mer 7 mer 16 A A T CA T T T T T T A AC C A A C T A T T T 2191.4 4006.6 3796.4 3692.4 4003.6 High 18 -----T----C---CA---T---T----- 2222.4 3991.6 3740.4 3715.4 4018.6 31 -----T-----------C--T--T----- 2206.4 3990.6 3796.4 3661.4 4034.6 33 -----T-----------C--T------- 2206.4 3990.6 3796.4 3637.4 4059.6 35 -----T---------A--------T---- 2206.4 3990.6 3780.4 3691.4 4034.6 2162.4 39 -----T--A------CA---T---T----- 2215.4 3981.6 3755.4 3715.4 4018.6 45 -----T---------CA---T--T- --- 2206.4 3990.6 3755.4 3700.4 4050.6 2162.4 51 -----------C---AAC--T---- T --- 2191.4 4022.6 3749.4 3707.4 4010.6 2186.4 52 --------A--------C--T--T- --- 2200.4 3997.6 3796.4 3661.4 4050.6 2162.4 56 -----------C--------T---T----- 2191.4 4022.6 3796.4 3660.4 4018.6 58 -----------C-----C--T--T----- 2191.4 4022.6 3781.4 3661.4 4034.6 59 -----T--A------CAC--T---T- --- 2215.4 3981.6 3740.4 3731.4 4034.6 2162.4 67 -----T--A--C--------T---A----- 2215.4 3997.6 3796.4 3651.4 4027.6 68 -----T---------CA---T---T----- 2206.4 3990.6 3755.4 3715.4 4018.6 69 -----------------C------T- --- 2191.4 4006.6 3781.4 3692.4 4034.6 2162.4 26 -----T--C--------C--T---T- --- 2191.4 4006.6 3796.4 3676.4 4034.6 2162.4 Intermediate 53 --------C------AAC--T--T----- 2176.4 4022.6 3764.4 3691.4 4034.6 66 --------A--C--------T------- 2200.4 4013.6 3796.4 3621.4 4059.6 70 ---------------CA------T- --- 2191.4 4006.6 3740.4 3716.4 4050.6 2162.4 MM4 -----------C---AA---T---- T --- 2191.4 4022.6 3764.6 3691.4 4010.5 2186.4 6 -----T--------------T-------- 2206.4 3990.6 3811.4 3676.4 4019.6 2162.4 low 11 -----T-----C-----A-----CT---- 2206.4 4006.6 3790.4 3692.4 4010.6 2162.4 34 -----------C---CA---T-------- 2191.4 4022.6 3740.4 3731.4 4019.6 2162.4 40 --------A----TT--C--T--T----- 2200.4 3997.6 3746.4 3709.4 4034.6 42 -----T--A--------A--T-------- 2215.4 3981.6 3820.4 3652.4 4019.6 43 -------------TT----T--T- --- 2191.4 4006.6 3786.4 3669.4 4050.6 2162.4 44 -----T-----------A--T--T----- 2206.4 3990.6 3820.4 3636.4 4034.6 54 -----T-----------C--T--- --- 2206.4 3990.6 3796.4 3676.4 4034.6 2162.4 55 -----T-------------T--T----- 2206.4 3990.6 3836.4 3621.4 4034.6 61 -----T---------TT---T--T---- 2206.4 3990.6 3761.4 3668.4 4074.6 2162.4 72 --------C------TT---T- -- T --- 2176.4 4022.6 3761.4 3669.4 4050.6 2186.4 7 ---------------TT---T- T----- 2191.4 4006.6 3761.4 3653.4 4074.6 13 -----T--A--------C--T--CT- --- 2215.4 3981.6 3796.4 3701.4 4010.6 2162.4 Unassigned 30 -----------------C---------- 2191.4 4005.6 3781.4 3653.4 4059.6 57 -----AT- C- ---CA- T- - TCT-- 2216.4 3998.6 3781.4 3637.4 4035.6 2202.4 62 -----T---------T T---T---- --- 2206.4 3990.6 3761.4 3684.4 4059.6 2162.4 64 -----A---------CA---T----- --- 2215.4 3981.6 3755.4 3731.4 4019.6 2162.4 74 -----T--------------T---T----- 2206.4 3990.6 3811.4 3660.4 4018.6 81 ---------------T T---T--A- --- 2191.4 4006.6 3761.4 3659.4 4083.6 2162.4 90 -----T--C--C--------T---- T --- 2191.4 4006.6 3796.4 3661.4 4010.6 2186.4 MM8 -----T--A--C---T T--- T---T- --- 2215.4 3997.6 3746.4 3708.4 4034.6 2162.4 와 enedoc 프로그램을이용하여분석하였다. 22 결 과 통계학적분석통계처리는 SAS 통계패키지 version 8 (SAS Institute Inc., NC, USA) 을이용하였다. 각군별로 RFMP와 DNA chip 결과의유의성을 Mantel-Haenszel 카이제곱검정법, Kochen의 Kappa 일치도검정법등으로분석하였으며, p 값이 0.05 이하인경우를유의한것으로간주하였다. RFMP HPV enotyping 결과및유전자형빈도특정제한효소의인지부위를포함하며바이러스유전자형결정부위의 upstream이나 downstream에결합하는프라이머를이용하여 PCR 반응을하고, 해당제한효소로절단하면, 유전자형결정부위를포함하는 oligomers (genotype-diagnostic fragments) 가형성된다. RFMP법은이의질량을 MALDI-TOF MS에서측정함으로써유전자형결정부위의서열을파악하는
인유두종바이러스유전자형검사를위한제한효소질량다형성분석과 DNA chip 의유용성비교 443 Table 2. Comparison of HPV genotyping results of RFMP and DNA chip assays according to pathology Assays Normal (n=40) Pathology ASCUS (n=53) SCC (n=71) RFMP Positive 3 (7.5) 25 (47.2) 69 (97.2) Negative 37 (92.5) 28 (52.8) 2 (2.8) DNA chip Positive 8 (20.0) 22 (41.5) 64 (90.1) Negative 32 (80.0) 31 (58.5) 7 (0.9) ASCUS, Atypical squamous cells of undetermined significance; SCC, invasive squamous cell carcinoma. Table 3. Odds ratio of high-risk HPV genotypes for cervical lesions Assays results Normal (n=40) ASCUS (n=53) Odds ratio (95%CI) SCC (n=71) Odds ratio (95%CI) RFMP Positive 3 25 11.0 69 425.5 Negative 37 28 3.2-37.5 2 72.5-2444.8 DNA chip Positive 8 22 2.8 64 36.6 Negative 32 31 1.2-7.2 7 12.3-108.3 ASCUS, Atypical squamous cells of undetermined significance; SCC, invasive squamous cell carcinoma; CI, confidence interval. 원리를이용하는것이다 (Fig. 1). HPV genotyping을위해 HPV 의 L1 표면유전자내유전자형결정부위인 22 bp (nucleotide number 6604-6625) 의 upstream이나 downstream에 FokI 제한효소인지부위가포함된프라이머를제작하여 PCR하고 Fok과 Fok의 isoschizomer인 BstF5I로연속절단하면상기 22 bp가포함된 6개의 oligomer (7 mer, 12 mer, 13 mer 각 2조 ) 가도출된다. 주목할만한것은이때사용하는제한효소는 type IIS 제한효소로서인지부위와절단부위가다르다는점이다. 즉 FokI은인지부위 (AT) 의위쪽 DNA 가닥은 9 bp, 아래쪽 DNA 가닥은 13 bp, BstF5I은인지부위 (AT) 의위쪽 DNA 가닥은 2 bp, 아래쪽 DNA 가닥은 0 bp down stream을절단한다. 이와같이 TypeIIS 제한효소인지부위를사용함으로써유전자형결정부위의서열과무관하게다양한유전자형에공통적인프라이머를사용하는것이 RFMP법의특징이다. 이는유전자형종류에따라다양한프라이머나프로브를사용하는제한효소길이다형성 (RFLP) 법이나 DNA 교잡법 (hybridization-based assays) 과구별되는기술요소다. 유전자형결정부위를포함하는 oligomers의질량을 HPV 유전자형별로정리해본결과유전자형마다독특한질량패턴을보였으며서로중첩되는유전자형이나타나지않았다 (Table 1). 즉고위험군 (high risk) 15종 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, Relative intensity 2191.4 2176.4 2162.4 2200.4 2206.4 2222.4 2191.4 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 4,500 m/z 3781.4 3661.4 4022.6 4034.6 3764.4 3691.4 4022.6 4034.6 3796.4 3661.4 3997.6 4050.6 3796.4 3637.4 3990.6 4059.6 3715.4 3740.4 4018.6 3991.6 3692.4 3796.4 4003.6 4006.6 HPV58 HPV53 HPV52 HPV33 HPV18 HPV16 Fig. 2. Representative RFMP HPV genotyping results. RFMP results for high-risk group; HPV16, 18, 33, 52, 53, 58. X- and y- axes represent relative peak intensity and mass to charge ratio (m/z), respectively. 56, 58, 59, 67, 68, 69형 ), 중등도위험군 (intermediate risk) 5 종 (26, 53, 66, 70, MM4형 ), 저위험군 (low risk) 12종 (6, 11, 34, 40, 42, 43 44, 54, 55, 61, 72, MM7), 미결정위험군 (Unassigned risk) 9종 (13, 30, 57, 62, 64, 74, 81[CP8304], 90, MM8) 등총 41종의 HPV 유전자형을분별할수있는것으로나타났으며, 유전형별대표적인질량분석스펙트라는 Fig. 2와같다. 세포진검사에서정상소견을보인 40명을포함하여, 미확정비정형편평세포 (ASCUS) 의상피세포이상소견을보인 53명, 세포진검사에서양성소견을보인후질확대경조준하에서생검을시행하여자궁경부암으로진단된 71명으로구성된총 164 명의검체를대상으로 RFMP genotyping을실시하였다. 그결과총 127예에서 HPV 유전자형이검출되었으며, 이중 97예가고위험군양성 HPV 유전자형으로판정되었다. HPV 16형이 37.8% (48/127) 의빈도로가장흔한유전자형이었고, HPV 58 (7.9%), 33 (5.5%), 18 (4.0%), 52 (4.0%) 형의순으로빈발하였는데, 이들상위 5개의유전자형이전체 HPV 양성사례의 59.2% 에해당했다. HPV 양성사례의약 11% 인 14예에서 2개이상의유전자형이혼재되어나타나는중복유전자형으로판정되었는데, 13예가 2개유전자형, 1예가 3개유전자형이었다. 단일유전자형과마찬가지로 HPV 중복유전자형사례에서도 16 형이 57.1% (8/14) 로서가장많이검출되었다. 세포및조직학적소견별 RFMP 법과 DNA chip 을이용한 HPV genotyping 결과 세포및조직학적소견별로 HPV 고위험군에대한결과를보면정상군은전체 40명중 RFMP에서양성 3명 (7.5%), 음성 37명 (92.5%) 이었고 DNA chip에서는양성 8명 (20.0%), 음성 32명 (80.0%) 이었다. ASCUS 소견을보인그룹에서는 53명중 RFMP에서양성 25명 (47.2%), 음성 28명 (52.8%) 이었고, DNA
444 정현재 김성남 이은희외 6 인 RFMP Sequencing DNA Chip Relative intensity 2191.4 3692.4 3796.4 4003.6 4006.6 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 4,500 m/z enotype 16 enotype 16 enotype 16 Relative intensity 2222.4 3740.4 3991.6 3715.4 4018.6 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 4,500 m/z enotype 18 enotype 18 enotype 39 Fig. 3. Concordant and discordant results of HPV genotyping determined by RFMP and DNA chip assays. HPV genotype 16 identified by RFMP in Patient No. 2 with cervical carcinoma was shown to be genotype 16 by both DNA chip and direct sequencing (upper panel). HPV genotype 18 detected by RFMP in Patient No. 13 was found to be genotype 18 by direct sequencing but genotype 39 by DNA chip (low panel). Sequences in genotype-specific motifs were underlined in spectrogram of sequencing results. chip에서는양성 22명 (41.5%), 음성 31명 (58.5%) 이었다. 침윤성자궁경부암의 71예에서는 RFMP에서양성 69명 (97.2%), 음성 2명 (2.8%) 이었고, DNA chip에서는양성 64명 (90.1%), 음성 7명 (0.9%) 이었다. 이처럼두방법에서모두조직학적병변의악성도가심할수록 HPV 고위험군에높은양성률을보였다 (Table 2) (p<0.0001). HPV 고위험군양성과자궁경부이상소견의로짓-회귀분석에따르면, HPV 고위험군양성과 ASCUS 유병률의 Odds ratio (OR) 는 RFMP법이 11 (95% CI: 3.2-37.5), DNA chip이 2.8 (95% CI: 1.2-7.2) 이었고, HPV 고위험군양성과자궁경부암의연관성은 RFMP법이 425.5 (95% CI: 72.5-244.8), DNA chip 이 36.6 (95% CI: 12.3-108.3) 로서두방법에서모두통계적인유의성을보였으나, RFMP법이다소우수한것으로나타났다. RFMP법과 DNA chip 검사법간의 HPV 유전자형일치율 RFMP법과 DNA chip 검사법에서모두 HPV 고위험군양성으로분류된예는 82명, 모두음성인예는 57명으로전체 164 예중 139예가일치하여 84.8% 의일치율을보였다. 또 kappa 계수가 0.688 (95%CI, 0.0576-0.800; 표준오차, 0.057) 로서일치도도상당히의미있게높았다 (Table 4, Fig. 3). RFMP법에 Table 4. Concordance rate between RFMP and DNA chip assays for HPV genotyping DNA chip Assays Result, n (%) Total Negative Positive RFMP Negative 57 (34.8) 10 (6.1) 67 (40.9) Positive 15 (9.1) 82 (50.0) 97 (59.1) Total 70 (42.7) 94 (57.3) 164 Kappa, 0.688 (95%CI, 0.576-0.800; standard error, 0.057). 서는양성이나 DNA chip 검사법에서는음성인예를보면, AS- CUS가 7명, 자궁경부암이 8명이었다. RFMP법에서는음성이나 DNA chip 검사법에서는양성인예는정상소견이 5명, ASCUS 가 4명, 자궁경부암이 1명이었다. RFMP법과 DNA chip 검사법에서모두 HPV 고위험군양성으로분류되었지만유전자형수준에서차이가있는경우가 5예있었는데, RFMP법에서는 16, 18, 39, 52, 58형이었고 DNA chip 검사법에서는각각 39, 39, 68, 16, 59형으로서특이한경향성을보이지는않았다. 이중직접염기서열법이가능했던 3예는 RFMP법결과와같은결과를보여주었다 (Fig. 3).
인유두종바이러스유전자형검사를위한제한효소질량다형성분석과 DNA chip 의유용성비교 445 Table 5. Comparison of diagnostic accuracy between RFMP and DNA chip assays for HPV genotyping Screening Assays Sensitivity (%) (95% CI) RFMP 법과 DNA chip 검사법의진단정확성및임상적유용성비교 침윤성암소견을보인경우를양성으로하여분석했을때, RFMP와 DNA chip 검사법의민감도 (sensitivity) 는각각 97.2 %, 90.1%, 특이도 (specificity) 는각각 92.5%, 80.0%, 양성예측도 (positive predictive value, PPV) 는각각 95.8%, 88.9%, 음성예측도 (negative predictive value, NPV) 는각각 94.9%, 82.1 % 였다. 침윤성암을포함한 ASCUS 전암병변이상을양성으로간주할때, RFMP와 DNA chip 검사법의민감도는각각 75.8%, 69.4%, 특이도는각각 92.5%, 80.0%, 양성예측도 (PPV) 는각각 96.9%, 91.5%, 음성예측도 (NPV) 는각각 55.2%, 45.7% 였다 (Table 5). 고 Specificity (%) (95% CI) 초기자궁경부암과전암성병변 (precancerous lesion) 을선별하는검사인자궁경부세포진검사는 1943년 Papanicolaou 등이자궁경부암진단에처음으로이용하였다. 그후시행의편리성, 저비용등의장점때문에선별검사로가장널리사용되고있다. 3 하지만자궁경부세포를채취하여고정, 판독하는과정에서생기는오류로인한 6-55% 의높은위음성률 (false negative rate) 이문제로제기되고있다. 23 자궁경부암의위험인자로는성적배우자의숫자, 조기성경험, 흡연, 감염등이제시되고있다. 그렇지만최근분자생물학기술을이용한여러연구를통해자궁경부암발생과정에서인유두종바이러스 (HPV) 에의한감염이핵심역할을한다는사실이입증되었다. 1 HPV 감염은자궁경부편평상피내병변의주된원인으로편평상피내병변이진행될수록고위험 HPV의양성률은증가하는것으로알려져있다. 따라서자궁경부편평상피내병변과자궁경부암을진단, 처치하는데 HPV 검사가유용하다 찰 PPV (%) (95% CI) NPV (%) (95% CI) SCC RFMP 97.2 92.5 95.8 94.9 92.9-99.1 84.8-95.8 91.6-97.7 87.0-98.3 DNA chip 90.1 80.0 88.9 82.1 84.3-94.1 69.7-87.1 83.1-92.8 71.5-89.3 ASCUS & RFMP 75.8 92.5 96.9 55.2 SCC 72.3-77.4 81.8-97.4 92.5-98.9 548.8-58.1 DNA chip 69.4 80.0 91.5 45.7 65.3-72.3 67.3-89.0 86.1-95.3 38.5-50.9 PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value; CI, confidence interval. 고판단되었다. HPV DNA를검사하는방법으로는미국식품의약국의공인을받은 HPV DNA hybrid capture II system이있다. 이방법을이용한 HPV 검사의유용성에관한연구가보고되어왔는데, 이방법은신속하고정량이가능하다는장점이있으나감염된바이러스가고위험군에속하는지저위험군에속하는지만알수있고각각의유전자형은판별할수없다는단점이있었다. 특히, hybrid capture법은저위험군의바이러스유전자형이고위험군 probe cocktail에반응하는교차교잡반응 (cross-reactivity) 이문제점으로수차례지적된바있다. 24-26 Peyton 등은 HC II probe cocktail이 HPV 53형을비롯하여 66, 67, 73, CP6108 등과비특이적교잡반응을보여고위험군으로판독될수있다고보고하였으며, 24 Poljak 등도 HC 검사에서고위험군 probe cocktail이 6, 11, 26, 40, 42, 53, 54, 61, 66, 70, 73, 81형등의고위험군이아닌유전자형이고위험군으로판독될가능성이있다고보고한바있다. 25 최근에개발된 HPV DNA chip 검사는 PCR을이용하여매우높은민감도로 HPV 감염을확인할수있고각각의유전자형과중복감염 (multiple infection) 도구분할수있는유용한검사로알려져있다. 그러나연구자별, 병변의진행단계별로특이도에차이가있고, 검사가수작업으로이루어지기때문에대규모검체처리에는한계가있었다. 말디토프질량분석 (MALDI-TOF MS) 을이용한분석시스템은검출하고자하는분석자 (analyte) 의고유질량을측정함으로써, 유전체학 (genomics), 단백질체학 (proteomics), 진단 (diagnostics) 분야등다양한생물과학분야에서정확성이높은것으로보고된바있다. MALDI-TOF MS를이용한유전자분석기법은 PCR 이후더이상교잡반응과정없이 MALDI-TOF 이온화과정을거쳐, DNA가진공관에서날아가는속도차이로염기서열을알아내는것이다. MALDI-TOF MS를이용한유전자분석기법으로최근개발된 RFMP법은유전자서열을이루는 4개의염기가고유한질량값을가진다는점에착안하여 (A=331.2, C=307.2, =347.2, T=322.2), 유전자내변이가밀집한부위 (genotype-specific motifs) 를직접절단해내고, 조각난유전자절편 (genotype-diagnostic fragments) 의질량을측정함으로써유전자형을파악하는범용기술로서, MALDI-TOF MS 분석의특성상정확도, 민감도, 대용량처리능력및변이간 linkage 분석능력등이장점으로알려져있다. 또복수의유전자형을진단할때바이러스의혼합감염을정량적으로진단할수있으므로, 그임상적응용성이높아간염바이러스 (HBV, HCV) 진단분야에서이미차세대유망신기술로평가되고있다. 13-19 RFMP법은 TypeIIS 제한효소인지부위를사용함으로써유전자형결정부위의서열과무관하게다양한유전자형에공통적인프라이머를사용한다. 이는유전자형별로다른탐색자 (probe) 를이용하는 DNA 교잡법 (hybridization-based assays) 과구별되며, 유전자형간교차교잡반응이원천적으로배제되는특징이있다.
446 정현재 김성남 이은희외 6 인 본연구에서는 RFMP법으로 HPV genotyping assay는고위험군 (high risk) 15종 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 67, 68, 69 형 ), 중등도위험군 (intermediate risk) 5종 (26, 53, 66, 70, MM4 형 ), 저위험군 (low risk) 12종 (6, 11, 34, 40, 42, 43 44, 54, 55, 61, 72, MM7), 미결정위험군 (Unassigned risk) 9종 (13, 30, 57, 62, 64, 74, 81[CP8304], 90, MM8) 등총 41종의 HPV 유전자형을분별할수있는것으로나타났다. 정상군 40명, 미확정비정형편평세포 (ASCUS) 소견의 53명, 침윤성자궁경부암으로진단된 71명으로구성된총 164명의검체를대상으로한검사결과, 총 127 예에서 HPV 유전자형이검출되었으며, 이중 97예가고위험군양성 HPV 유전자형으로판정되었다. HPV 16형이 37.8% (48/127) 의빈도로서가장흔한유전자형이었고, HPV 58 (7.9%), 33 (5.5%), 18 (4.0%), 52 (4.0%) 형의순으로빈발하였는데, 이들상위 5개의유전자형이전체 HPV 양성사례의 59.2% 에해당했다. WHO는전세계적으로자궁경부암에빈발하는유전자형으로순위별로 HPV 16, 18, 45, 31, 33형을보고한바있으며, 한국, 중국, 싱가포르, 일본의연구자들도 HPV 16, 18, 58, 52형등을자궁경부암위험도를높이는보편적인유전자형으로지목한바있는데, 본연구결과의유전자형분포와큰차이가없었다. 11,12,27 세포및조직학적소견별로 HPV 고위험군에대한 RFMP법과 DNA chip법의결과를비교해보면, 두방법공히병변의악성도가심할수록 HPV 고위험군에높은양성률을보였다 (Table 2) (p<0.0001). Solomon 등 (2001) 의연구에따르면, ASCUS 환자의 56.6% 가 hybrid capture II 검사에양성을보였고 CIN 이상에서는민감도가 95.5% 라고하였다. 28 본연구에서 53명의 ASCUS 환자를대상으로검사를시행한결과, RFMP법검사에서는양성률이 47.2%, DNA chip 검사법에서는양성률이 41.5 % 였다. 또 71명의침윤성암환자를대상으로검사를한결과, RFMP법에서는양성률이 97.2%, DNA chip 검사법양성률이 90.1% 로서유사한결과를보였다. 따라서 ASCUS 세포진검사에서고위험 HPV 감염을진단하는것이세포진검사와질확대경검사의중간단계검사로서자궁경부암으로진행될위험성이높은여성을선별하는데유용하다는점을시사하였다. 한편 HPV 고위험군양성과자궁경부이상소견의로짓-회귀분석에따르면, HPV 고위험군양성과 ASCUS 유병률의 odds ratio (OR) 는 RFMP법이 11 (95% CI: 3.2-37.5), DNA chip 이 2.8 (95% CI: 1.2-7.2) 이었고, HPV 고위험군양성과자궁경부암의연관성은 RFMP법이 425.5 (95% CI: 72.5-244.8), DNA chip이 36.6 (95% CI: 12.3-108.3) 로서두방법에서모두통계적으로강한유의성을보였으나, RFMP법이다소우수한것으로나타났다. RFMP법과 DNA chip 검사법에서모두 HPV 고위험군양성으로판정된환자가 82명, 모두음성인환자가 57명으로전체 164 예중 139 예가일치하여 84.8% 의일치율을보였다. 또 kappa 계수가 0.688 (95% CI, 0.0576-0.800; 표준오차, 0.057) 로서일 치도도상당히의미있게높았다 (Table 4, Fig. 3). 침윤성암소견을보인예를양성으로판정하여분석하였을때, RFMP와 DNA chip 검사법의민감도 (sensitivity) 는각각 97.2%, 90.1%, 특이도 (specificity) 는각각 92.5%, 80.0%, 양성예측도 (PPV) 는각각 95.8%, 88.9%, 음성예측도 (NPV) 는각각 94.9%, 82.1% 였다. 침윤성암을포함한 ASCUS 전암병변이상을양성으로간주할때, RFMP와 DNA chip 검사법의민감도는각각 75.8%, 69.4%, 특이도는각각 92.5%, 80.0%, 양성예측도는각각 96.9%, 91.5%, 음성예측도는각각 55.2%, 45.7% 였다 (Table 5). 저등급자궁경부병변이나침윤성암을포암한고등급병변을대상으로한기존의연구결과를살펴보면, HBV DNA chip과 hybrid capture법에서민감도는각각 86.8-93.7%, 71.7-94.6%, 특이도는 34.7-89.5%, 71.4-81.3% 이다. 즉민감도면에서는 HBV DNA chip 검사법이 hybrid capture법과유사하거나다소우수하나, 특이도면에서는낮은성적을보이고있다. 11,12,29 본연구를통해 RFMP법은민감도와양성예측도면에서 DNA chip 검사법보다다소우수하거나유사하며특이도와음성예측도면에서는 DNA chip 검사법보다진전된성적을보여주어, 전반적으로자궁경부병변의진단정확성을높일수있을것으로생각된다. 결론적으로, 말디토프질량분석을토대로개발된 RFMP HPV 유전자형진단법은 40여종에이르는폭넓은유전자형을분별할수있는능력이있으며, 중복감염을진단할수있다. 기존의 DNA chip 검사법과비교해볼때, 매우높은일치율을보였고, 검사의민감도와특이도면에서정확도가높았다. 따라서 RF- MP법으로 HPV 유전자형을결정하는것은매우정확하며대용량자동화분석도쉽게적용할수있으므로임상선별검사로서유용한방법이라생각된다. 참고문헌 1. Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med 2003; 348: 518-27. 2. Stephen AL, Thompson CH, Tattersall MH, Cossart YE, Rose BR. Analysis of mutations in the URR and E6/E7 oncogenes of HPV 16 cervical cancer isolates from central China. Int J Cancer 2000; 86: 695-701. 3. Chow VT, Loh E, Yeo WM, Tan SY, Chan R. Identification of multiple genital HPV types and sequence variants by consensus and nested type-specific PCR coupled with cycle sequencing. Pathology 2000; 32: 204-8. 4. Laconi S, reco M, Pellegrini-Bettoli P, Rais M, Laconi E, Pani P. Onestep detection and genotyping of human papillomavirus in cervical samples by reverse hybridization. Diagn Mol Pathol 2001; 10: 200-6. 5. The atypical squamous cells of undetermined significance/low-grade
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